Застосування ектеїнасцидину в комбінованій терапії для лікування саркоми

1. Застосування ектеїнасцидину (ЕТ-743) для виготовлення лікарського препарату для ефективного лікування пухлини за допомогою комбінованої терапії, яка включає застосування ЕТ-743 в комбінації з іншим протипухлинним засобом, де і) пухлина являє собою саркому, і іі) інший лікарський засіб являє собою антрациклін або протипухлинний лікарський засіб на основі платини. C2 2 (19) 1 3 79926 таксотер, доцетаксел), подофілотоксини або алкалоїди барвінку (вінкристин, вінбластин); b) антиметаболічні лікарські засоби, такі як 5фтор урацил, цитарабін, гемцитабін, пуринові аналоги, такі як пентостатин, метотрексат); c) алкілуючі агенти, такі як азотистий іприт (такі як циклофосфамід або іфосфамід); d) лікарські засоби, які націлені на ДНК, такі як антрациклінові лікарські засоби адріаміцин, доксорубіцин, фарморубіцин або епірубіцин; e) лікарські засоби, які націлені на топоізомерази, такі як етопозид; f) гормони і агоністи або антагоністи гормонів, такі як естрогени, антиестрогени (тамоксифен і родинні сполуки) і андрогени, флутамід, лейпрорелін, гозерелін, ципротрон або октреотид; g) лікарські засоби, які націлені на сигнальну трансдукцію в пухлинних клітинах, включаючи похідні антитіл, такі як герцептин; h) алкілуючі лікарські засоби, такі як лікарські засоби на основі платини (цисплатин, карбонплатин, оксаліплатин, параплатин) або нітросечовини; і) лікарські засоби, що потенційно впливають на метастази пухлин, такі як інгібітори металопротеїназ матриксу; j) засоби генної терапії і десенсибілізуючі агенти; k) терапевтичні антитіла; l) інші біологічно активні сполуки морського походження, особливо дидемніни, такі як аплідин; m) стероїдні аналоги, зокрема, дексаметазон; n) протизапальні лікарські засоби, зокрема, дексаметазон; і о) протиблювотні лікарські засоби, зокрема, дексаметазон. Як частина опису даного патенту заявники включають серію прикладів і з даного моменту будуть посилатися на них. Дані приклади демонструють підвищену е фективність ЕТ-743, коли його застосовують в комбінації з іншими лікарськими засобами, і відноситься до різних комбінацій з використанням ЕТ-743. Приклад 1 відноситься до ефективних комбінацій ЕТ-743 і доксорубіцину відносно інгібування пухлинного зростання у безтимусних мишей при саркомах морських видів тварин і людини. Приклад 2 показує, що ектеїнасцидин 743 (ЕТ743) і доксорубіцин надають синергічну цитотоксичну дію на лініях саркоми м'яких тканин НТ-1080 і HS-18. Вказані два приклади показують більш ніж сумарні ефекти комбінації ЕТ-743 з антрациклінами (зокрема, доксорубіцином), яка є більш ефективною відносно пухлин людини (в даних конкретних прикладах - проти саркоми), ніж кожний з них окремо; даний ефект спостерігається незалежно від послідовності введення. Дані результати вселяють ясні надії в тому, що стосується лікування пацієнтів. Приклад 3 показує синергічний цитотоксичний ефект ЕТ-743 і цисплатину. Приклад 4 представляє послідовну оцінку ЕТ743 в комбінації з хіміотерапевтичними агентами проти ряду клітинних ліній пухлин людини, зокре 4 ма, комбінацій ЕТ-743 з доксорубіцином, таксолом, SN-38, цисплатином і гемцитабіном. Вказані два приклади показують більш ніж сумарні ефекти комбінації ЕТ-743 з платиновими протипухлинними сполуками (зокрема, з цисплатином), з нуклеозидним аналогом гемцитабіном і з інгібітором топоізомерази II (SN38, який являє собою активний агент, що отримується з проліків СРТ-11, лікарського засобу групи камптотецину). І знов дані комбінації с більш ефективними відносно пухлин людини ніж кожен з лікарських засобів окремо (в даних конкретних прикладах - проти різних пухлинних клітин: яєчника, товстого кишечнику, легенів, молочної залози, кісткової саркоми); їх ефекти в деяких випадках залежали від послідовності введення. І знов, дані результати вселяють ясні надії в тому, що стосується лікування пацієнтів. Цікаво, що синергічна дія не була чітко спрогнозована: приклад 4 показує, що у більшості перевірених комбінацій синергізм не спостерігався (дійсно, в деяких випадках спостерігався антагонізм). Приклад 5 відноситься до оцінки комбінацій ЕТ-743 з доксорубіцином або триметрексатом або паклітакселом. Він показує більш ніж сумарні ефекти комбінації ЕТ-743 з антрациклінами (зокрема, з доксорубіцином), яка є більш ефективною відносно пухлин людини ніж кожен з лікарських засобів окремо (в даних конкретних прикладах - проти саркоми); їх ефекти не залежали від послідовності введення. Дані результати вселяють ясні надії в тому, що стосується лікування пацієнтів. Приклади 6-8 підтверджують і доповнюють попередні приклади, і, особливо, показують синергізм ЕТ-743 і доксорубіцина, а також ЕТ-743 з цисплатином. Приклад 9 показує ефективність різного роду при використанні комбінацій згідно з даним винаходом, коли дексаметазон у високих дозах захищає від гепатотоксичності ектеїнасцидину-743 (ЕТ743). Загалом, даний винахід, таким чином, відноситься до композицій, способів лікування, способів виготовлення композицій і до пов'язаних з ними варіантів здійснення даного винаходу. Даний винахід відноситься також до сполук згідно з даним винаходом для застосування в способі лікування, і до застосування сполук для виготовлення композиції для лікування злоякісної пухлини. Таким чином, даний винахід відноситься до способу лікування будь-якого ссавця, особливо людини, страждаючої злоякісною пухлиною, який включає введення ураженому індивідууму терапевтично ефективної кількості сполуки згідно з даним винаходом або її фармацевтичної композиції. Даний винахід відноситься також до фармацевтичних препаратів, що включають фармацевтично прийнятний носій, які містять в якості активного інгредієнта сполуку або сполуки згідно з даним винаходом, а також до способів їх виго товлення. Приклади фармацевтичних композицій включають будь-яку тверду форму (таблетки, пілюлі, 5 79926 капсули, гранули і т.п.) або рідку форму (розчини, суспензії або емульсії) відповідного складу, для перорального, місцевого або парентерального введення, і вони можуть містити чисту сполуку або її комбінацію з будь-яким носієм або іншими фармакологічно активними сполуками. Дані композиції можуть потребувати стерильності, якщо їх вводять парентерально. Введення сполук або композицій згідно з даним винаходом можна здійснювати будь-яким відповідним способом, таким як внутрішньовенна інфузія, оральне, інтраперитонеальне і внутрішньовенне введення. Заявники вважають за необхідне, щоб час інфузії складав до 24 годин, більш переважно, 2-12 годин, найбільш переважно, 2-6 годин. Особливо бажані короткочасні інфузії, які дозволяють здійснювати лікування, не залишаючи пацієнта в клініці на ніч. Однак, інфузія може продовжуватися від 12 до 24 годин, і навіть довше, якщо це необхідно. Інфузію можна здійснювати з відповідними інтервалами, наприклад, від 2 до 4 тижнів. Фармацевтичні композиції, що містять сполуки згідно з даним винаходом, можна доставляти з допомогою ліпосом або наносфер, композицій з уповільненим вивільненням або за допомогою будь-яких інших звичайних засобів доставки. Правильне дозування сполук буде змінюватися в залежності від конкретної композиції, способу введення і конкретного місця, пацієнта і пухлини, з приводу якої проводиться лікування. Також потрібно брати до уваги інші чинники, такі як вік, маса тіла, стать, характер харчування, час введення, швидкість виведення, стан пацієнта, комбінації лікарських засобів, реакції чутливості і тяжкість захворювання. Введення можна здійснювати безперервно або періодично, в межах максимально переносимої дози. Комбінації згідно з даним винаходом можна застосовувати у пацієнтів, що погано піддаються лікуванню. [W00069441] містить інформацію з приводу схем дозування ЕТ-743 і іншу ін формацію щодо застосування комбінованої терапії згідно з даним винаходом. Приклади даного винаходу Приклад 1 Ефективні комбінації ЕТ-743 і доказдубідину для інгібування пухлинного зростання відносно мишачої і людської саркоми у безтимусних мишей. У ЕТ-743 є підтверджена клінічна активність відносно пацієнтів з саркомою м'яких тканин і кістки, які не піддавалися попередній хіміотерапії, що включає доксорубіцин (Dx) і ізосфамід. З точки зору потенційної клінічної цінності комбінування ЕТ-743 з Dx, заявники вивчали дану комбінацію проти мишачої фібросаркоми UV2237, її mdrрезистентної сублінії UV2237/ADR і людського ксенотрансплантату рабдоміосаркоми ТЕ671. Як ЕТ-743, так і Dx по окремості були ефективні проти мишачої фібросаркоми UV2237, в той час як кожний з них не був активний або маргінально активний проти UV2237/ADR і ТЕ671. Однак, комбінація ЕТ-743 і Dx була ефективною відносно всіх трьох моделей. Синергізм був частково виражений у відношенні людської рабдоміосаркоми ТЕ671 і 6 виявлявся незалежно від послідовності введення або комбінації лікарських засобів. Після однократних в/в введень, виконаних, коли пухлина ТЕ671 становила приблизно 100мг, величини інгібування маси пухлини (TWI) і log 10 убити х клітин (LCK) становили, відповідно, 46% і 0,132 для ЕТ-743 (0,1мг/кг) нарізно, 50% і 0,33 для Dx (10мг/кг) нарізно, 77% і 0,924 для ЕТ-743 (0,1мг/кг) і Dx (10мг/кг) при одночасному введенні, 82% і 1,12 для комбінації ЕТ-743 (0,1мг/кг), введеного за 1 годину до Dx (10мг/кг), і 75% і 0,85 для комбінації ЕТ-743 (0,1мг/кг), введеного через 1 годину після Dx (10мг/кг). Приведені дані наводять на думку про те, що комбінація ЕТ-743 і Dx може також бути ефективною відносно пухлин, які є нечутливими або недостатньо чутливими до даних ліків нарізно, що дає підставу для клінічних досліджень з використанням даної комбінації. Приклад 2 Ектеїнасцидин 743 (ЕТ743) і доксорубіцин надають синергічну цитотоксичну дію відносно ліній саркоми м'яких тканин НТ-1080 і HS-18. Дві клітинні лінії саркоми, НТ 1080, клітинну лінію фібросаркоми, чутливу до ЕТ-743 (IC 50=10пм), і HS-18, клітинну лінію ліпосаркоми, менш чутливу до ЕТ-743 (IC 50=270пм), оцінювали на токсичність до ЕТ-743 в комбінації з доксорубіцином, триметрексатом або паклітакселом. Коли ЕТ-743 використовували в комбінації з кожним з даних лікарських засобів при постійному молярному співвідношенні і аналізували способом Chou і Talalay, були отримані синергічні ефекти (72год. інкубації) з комбінацією ЕТ-743 - доксорубіцин, але не з комбінацією ЕТ-743 з триметрексатом або паклітакселом. Коли клітини піддавали впливу ЕТ-743 протягом 72год., і доксорубіцину, триметрексата або паклітакселу протягом останніх 48год. інкубації, синергічні ефекти також були отримані з доксорубіцином проти обох клітинних ліній саркоми. Цікаво, що послідовність паклітаксел, а потім - ЕТ-743 була більш ефективною, ніж зворотна послідовність. Дані результати подають надію відносно клінічних випробувань доксорубіцину в комбінації з ЕТ-743 для лікування пацієнтів з саркомою м'яких тканин, оскільки обидва вказаних лікарських засоби показали активність відносно даного захворювання. Приклад 3 Синергічний цитотоксичний ефект ЕТ-743 і цисплатину. Ектеїнасцидин 743 (ЕТ743) продемонстрував відмінну протипухлинну активність на декількох доклінічних системах і обіцяє бути активним в клінічних умовах. ЕТ-743 зв'язує N2 гуаніни в малій борозенці і впливає на транскрипцію [Minuzzo et al., RNAS, Vol.97, 6780-84, 2000]. Дослідження, які проводилися раніше вказують, що чутливість до ЕТ-743 дефіцитних клітин після репарації за рахунок помилкового спаровування основ (MMR) і профіцитних клітин є однаковою. NER дефіцитні клітини, вельми чутливі до цисплатину, в 6-8 раз менш чутливі до ЕТ-743. На основі різних механізмів, що беруть участь в репарації ЕТ-743 і цисплатину, і внаслідок потенційної клінічної зацікавленості в даній комбінації, заявни 7 79926 ки здійснили дослідження для оцінки цитотоксичних ефектів ЕТ-743 і цисплатину на декількох клітинних лініях пухлин людини. У даному дослідженні використали клітинну лінію раку яєчника людини Igrove-1, сублінію, резистентну до ЕТ-743 (IG/PSC/ET), клітинну лінію раку товстого кишечнику людини НСТ 116, (MMR дефіцитн у) і HCT11-ch3 (MMR профіцитну). На клітини впливали протягом 1 або 24год. різними концентраціями ЕТ-743 або цисDDР, окремо або в комбінаціях, і оцінювали цитотоксичність за допомогою колориметричного аналізу після фарбування сульфородаміном В. У всіх клітинних лініях спостерігався синергічний ефект як при 1годинній, так і при 24-годинній експозиції. Цікаво, що у НСТ116, резистентних до цисDDP, ЕТ-743 був виразно здатний реверсувати чутливість навіть при концентраціях ЕТ-743, які по окремості були мало ефективними. Всі разом ці дані дають підставу для проведення клінічних досліджень, що комбінують ЕТ-743 з цисDDP. Приклад 4 Комбінації ЕТ-743 з доксорубіцином, таксолом, SN-38, цисплатином і гемцитабіном. ЕТ-743 оцінювали в комбінації з доксорубіцином, таксолом, Sn-38, цисплатином і гемцитабіном проти ряду клітинних ліній пухлин людини. Дані дослідження були сплановані таким чином, щоб визначити тип лікарської взаємодії між ЕТ-743 і звичайними хіміотерапевтичними агентами, а також вплив послідовності впливу на протипухлинну активність. Для опису типу лікарської взаємодії використовувалися множинні комбінації ЕТ-743 із звичайними цитотоксичними агентами при вільному виборі моделей [Laska, et al., Biometrics 50:834, 1994]. Дані дослідження передбачають, що незалежно від експозиції, найбільш типово спостерігався сумарний характер лікарської взаємодії. Синергічна лікарська взаємодія спостерігалася, коли ЕТ-743 комбінували проти пухлинних клітинних ліній недрібноклітинного раку легенів (з попередньою експозицією SN-38), остеосаркоми (з попередньою експозицією ЕТ-743, а потім - цисплатином), раку молочної залози (з попередньою експозицією ЕТ-743, а потім - гемцитабином), раку товстого кишечнику (з попередньою експозицією ЕТ-743, а потім - SN-38 і одночасною експозицією SN-38). Спостерігався сумарний/синергічний характер лікарської взаємодії (з попередньою експозицією ЕТ-743, а потім - SN-38 проти NSCL; з попередньою експозицією SN-38 проти раку товстого кишечнику і NSCL; одночасна експозиція з цисплатином проти остеосаркоми і SN-38 проти ліній NSCL). Були відмічені свідоцтва антагонізму, коли таксол застосовували одночасно проти двох ліній NSCL, і доксорубіцин - проти клітинної лінії рабдоміосаркоми. Вказані дослідження наводять на думку про те, що ЕТ-743, який знаходиться на II фазі клінічних випробувань, можна було б комбінувати з декількома цитотоксичними агентами проти великого ряду типів пухлин. Матеріали і методи Культура клітин: 8 Пухлинні клітинні лінії раку молочної залози людини (MDA-435, MD A-231, Т-470), недрібноклітинного раку легенів (NCI-H522, NC1-H226, NCIH23), раку товстого кишечнику (НСТ-116, НТ-29, СоIо-320), остеосаркоми (HOS, U-2, OS, SaOS-2), рабдоміосаркоми (RH1, RH30, RD) вирощували в середовищі RPMI-1640 з доданням 10% фетальної бичачої сироватки і 2мМ L-глутаміну. Всі маточні j культури підтримували у флаконах 75см при 37°С в термостатах із зволоженням в атмосфері з 5% СО2 - 95% повітря. Аналіз IC50: Заздалегідь визначену кількість пухлинних клітин в стадії експонентного зростання інокулювали в 96-ямкові планшети для клітинних культур і залишали стабілізуватися на 24 години. Після цього до клітин додавали планшет з лікарськими засобами, що складається з серійних розведень ЕТ743 або звичайних хіміотерапевтичних агентів. Клітини 24-годинної експозиції інкубували протягом трьох днів, після чого додавали МТТ на 4 години. Отримані кристали формазану потім солюбілізували кислотою/спиртом і визначали поглинання (570нм для тесту/630нм для стандарту) з використанням мікропланшет-рідера. Результати виражали як процент убитих пухлинних клітин в порівнянні зі середовищними контролями. Вивчення комбінацій: Для вивчення комбінацій використали схему концентрацій (виражених як процент від ІС 50 окремих агентів), щоб охарактеризувати тип взаємодії, показаний нижче: Концентрація лікарського засобу (виражена як процент від ІС50) ЕТ-743 Звичайні агенти 100 0 75 25 60 40 50 50 40 60 25 75 0 100 0 0 Статистичний аналіз вивчення комбінацій: Статистичні порівняння здійснювали з кожною випробуваною комбінацією (75:25 ЕТ743/звичайні агенти) і кінцевою точкою (100:0 - ЕТ743 і 0:100 звичайні агенти). Статистично значущі спостереження вимагають, щоб існувала різниця між величиною поглинання комбінації (ЕТ-743 і звичайних агентів) і обома кінцевими точками (ЕТ743 і звичайних агентів по окремості). Якщо більшість величин (³3 з 5) знаходилися статистично вище або нижче даної лінії, то це визначається, відповідно, як антагонізм або синергізм. В іншому випадку характер взаємодії більш є схожим на сумарну взаємодію. Інтерпретація є дуже важкою, якщо є значний нахил до лінії, що з'єднує кінцеві точки. Якщо нахил кривих ІС50 для окремих агентів ідентичний (малоймовірно), то можна, згодом, визначити тип взаємодії. 9 Тип пухлини/клітинна лінія Остеосаркома NOS U2-OS SaO6 79926 10 Послідовна комбінація ЕТ-743 з хіміотерапевтичними агентами Лікарські взаємодії, що споУмови експозиції/агенти стерігаються 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу цисплатином 24 години цисплатину, потім 24 години впливи ЕТ-743 24 години одночасного впливу ЕТ-743/цисплатином 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливи цисплатином 24 години цисплатину, потім 24 години впливу ЕТ-743 24 години одночасного впливу ЕТ-743/цисплатином 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливи цисплатином 24 години цисплатину, потім 24 години впливу ЕТ-743 24 години одночасного впливу ЕТ-743/цисплатином Синергічний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний/Синергічний 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливи таксолом 24 години таксолу, потім 24 години впливу ЕТ-743 24 години одночасного впливу ЕТ-743/таксолом 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливи SN38 24 години SN38, потім 24 години впливи ЕТ-743 24 часу одночасного впливу ЕТ-743/SN-38 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу таксолом 24 години таксолу, потім 24 години впливу ЕТ-743 24 часу одночасного впливу ЕТ-743/таксолом 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу SN38 24 години SN38, потім 24 години впливу ЕТ-743 24 години одночасного впливу ЕТ-743/SN-38 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу таксолом 24 години таксолу, потім 24 години впливу ЕТ-743 24 години одночасного впливу ЕТ-743/таксолом 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу SN38 24 години SN38, потім 24 години впливу ЕТ-743 24 години одночасного впливу ЕТ-743/SN-38 Сумарний Сумарний Анатгоністичний Сумарний/Синергічний Сумарний/Синергічний Сумарний Сумарний Сумарний Антагоністичний Сумарний/Синергічний Сумарний/Синергічний Сумарний Сумарний/ Антагоністичний Сумарний Антагоністичний Сумарний Синергічний Сумарний/Синергічний 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу гемцитабіном 24 години гемцитабіну, потім 24 години впливу ЕТ-743 24 години одночасного впливу ЕТ-743/гемцитабіном 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу гемцитабіном 24 години гемцитабіну, потім 24 години впливу ЕТ-743 24 години одночасного впливу ЕТ-743/гемцитабіном 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу гемцитабіном 24 години гемцитабіну, потім 24 години впливу ЕТ-743 24 години одночасного впливу ЕТ-743/гемцитабіном Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу SN-38 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу SN-38 24 години одночасного впливу ЕТ-743/SN-38 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу SN-38 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу SN-38 24 години одночасного впливу ЕТ-743/SN-38 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу SN-38 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу SN-38 24 години одночасного впливу ЕТ-743/SN-38 Синергічний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний Сумарний/Синергічний Синергічний Недрібноклітинний рак легенів NCB-H226 NCB-N522 NCB-N23 Рак молочної залози MD A-435 MD A-231 T47-8 Рак товстого кишечнику МСТ-116 ν NT-29 Colo-320 рабдоміосаркома RN1 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу доксорубіцином Сумарний 24 години доксорубіцину, потім 24 години впливу ЕТ-743 Сумарний 24 години одночасного впливу ЕТ-743/доксорубіцином Антагоністичний 11 RD RN30 79926 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу доксорубіцином 24 години доксорубіцину, потім 24 години впливу ЕТ-743 24 години одночасного впливу ЕТ-743/доксорубіцином 24 години ЕТ-743, потім 24 години впливу доксорубіцином 24 години доксорубіцину, потім 24 години впливу ЕТ-743 24 години одночасного впливу ЕТ-743/доксорубіцином Висновки-Резюме Дані дослідження передбачають, що, незалежно від послідовності впливу ЕТ-743 і звичайних хіміотерапевтичних агентів, найчастіше спостерігається лікарська взаємодія за принципом сумарного. Свідоцтва синергізму спостерігалися, коли клітинні лінії NSCL NC1-H522 й NC1-H23 піддавали попередньому впливу SN-38, попередньому впливу ЕТ-743 з цисплатином проти остеосаркоми HOS, гемцитабіном проти клітинної лінії раку молочної залози Т-470, SN-38 проти раку товстого кишечнику НСТ-116 і одночасному впливу SN-38 проти клітинної лінії раку товстого кишечнику СоІо320. Свідоцтва антагонізму спостерігалися, коли таксол застосовували одночасно проти клітинних ліній NSCL NC1-H522 і NC1-H23, і доксорубіцин проти пухлинної клітинної лінії рабдоміосаркоми RHI. Приклад 5 Взаємодія між ЕТ-743 і іншими антинеопластичними агентами Хоча ЕТ-743 в цей час проходить клінічні випробування відносно злоякісних пухлин людини, механізми протипухлинної активності ЕТ-743 ще не до кінця зрозумілі. Метою даного дослідження була оцінка природи взаємодії між ЕТ-743 і іншими антинеопластичними агентами (доксорубіцином; DXR, триметрексатом; TМTX і паклітакселом; таксолом) з використанням індексу комбінації (СІ) за способом Chou і Talalay. Для того, щоб краще зрозуміти, яким чином ЕТ-743 можна було б використати клінічно, в даному дослідженні використали аналізи SRB для вивчення цитотоксичності, що викликається комбінуванням ЕТ-743 з трьома іншими антинеопластичними агентами, при різних схемах введення, на двох клітинних лініях саркоми м'яких тканин, НТ-1080 і HS-18, in vitro. DXR був єдиним агентом, який демонстрував синергізм, незалежно від послідовності введення, при комбінуванні з ЕТ-743. Одночасний вплив ЕТ-743 з DXR приводив до синергічних взаємодій на обох клітинних лініях. СІ (середні) по схемі становили 0,86, 0,83, 0,84 і 0,85 при 50, 75, 90 і 95% загибелі клітин, відповідно, на клітинах НТ-1080, і 0,89, 0,74, 0,64 і 0,60 при 50, 75, 90 і 95% загибелі клітин, відповідно, на клітинах HS-18. Послідовне введення з ЕТ-743 за 24 години до DXR являло собою найбільш ефективний режим проти обох клітинних ліній; це приводило до стійко низького СІ приблизно до рівня загибелі клітин 90% для обох клітинних ліній. Вплив таксолом до впливу ЕТ-743 також являв собою ефективний режим. Дані результати передбачають, що комбінацію ЕТ-743 і DXR необхідно 12 Сумарний Сумарний Сумарний/Антагоністичний Сумарний Сумарний Антагоністичний далі вивчати в клінічних випробуваннях для лікування саркоми м'яких тканин. Матеріали і методи Хімічні реактиви ЕТ-743 отримували від компанії Pharma-Mar S. A (Tres Cantos, Мадрид, Іспанія) і виготовляли з нього 2мМ маточний розчин в диметилсульфоксиді. Паклітаксел і DXR отримували від компанії Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). TMTX отримували від компанії Warner-Lambert (Parke-Davis, Ann Arbor. Mich.). Культура клітин Клітинні лінії саркоми м'яких тканин, НТ-1080 і HS-18 підтримували у вигляді моношарових культур в RPMI-1640, що містить 10% фетальної бичачої сироватки. Аналіз цитотоксичності з використанням SRB Цитотоксичність лікарських засобів визначали за допомогою аналізу цитотоксичності з використанням SRB, який виконували на 96-ямкових мікротитраційних планшетах, як описано. Клітини засівали в дві дублюючі ямки (5000 клітин на ямку) і піддавали впливу лікарських засобів при різних концентраціях. Клітини фіксували 50% розчином ТСА протягом 1год., і в кожну ямку додавали 0,4% SRB (Sigma). Після 30хв. інкубування планшет промивали 1% оцтовою кислотою і прочитували на 570нм на мікропланшет-рідері Biowhitaker 2001. Ямки з клітинами, що не містили лікарських засобів, і зі середовищем і лікарськими засобами, але без клітин, використали як позитивний і негативний контролі, відповідно. Одночасний вплив ЕТ-743 і DXR, TMTX або паклітакселом Клітини засівали в 96-ямкові планшети, як описано раніше. На клітини впливали сімома різними концентраціями лікарських засобів окремо або комбінованою сумішшю при молярному співвідношенні 1:100 (ЕТ-743: інші лікарські засоби). Після 72 годин впливу інгібування зростання визначали за допомогою аналізу SRB. Послідовний вплив ЕТ-743 і DXR, TMTX або паклітакселом Використовуючи ті ж умови експерименту, які описані вище, заявники піддавали клітини впливу трьох різних концентрацій лікарських засобів, які представляють ІС 25, ІС50, ІС75, ЕТ-743, D XR, TMTX і паклітакселу, відповідно. Після 24 годин попереднього впливу ЕТ-743 або комбінованим лікарським засобом, у відповідні ямки додавали другі лікарські засоби на 48 годин. Інгібування зростання визначали за допомогою аналізу SRB. Аналіз клітинного циклу На клітини в фазі експонентного зростання впливали лікарськими засобами протягом декількох годин або залишали їх без впливу лікарських засобів. Потім клітини збирали і фіксували в кри 13 79926 жаному 70% метанолі. ДНК забарвлювали йодидом пропідію, як описано раніше. Десять тисяч забарвлених клітин аналізували на клітинному сортері із збудженням флюоресценції Becton Dickinson (FACS). Визначення синергізму і антагонізму і побудова ізоболограм Величини СІ розраховували з допомогою рівняння Chou-Talalay, яке враховує як активність (Dm або IC50), так і форму кривої доза-ефект (величину m). Загальне рівняння для класичної ізоболограми (СІ=1) виводять таким чином: CI=(D)1/(Dx) 1+(D)2/(D x)2 (A) де (Dx)1 і (Dx)2 в знаменниках являють собою дози (або концентрації) для D1 (ЕТ-743) і D2 (інший лікарський засіб) по окремості, що дає Х% інгібування, в той час як (D)1 і (D)2 в чисельниках являють собою дози ЕТ-743 і іншого лікарського засобу в комбінації, які також інгібували Х% (тобто, ізоефективні). СІ1 означають синергізм, сумарний ефект і антагонізм, відповідно. 14 (Dx)1 або (Dx)2 можна легко розрахувати по рівнянню медіана-ефект Chou і Chou et al: Dx=Dm[fa/(l-fa)]1/m (В) де Dm являє собою дозу медіана-ефект, яку отримують з антилогарифма X-відрізка, що відсікається на осі ординат графіка медіана-ефект, Xlog (D) проти Y-log[fa/(1-fa)] або Dm=10-(Y-відрізок )/m, a m являє собою нахил графіка медіана-ефект. Комп'ютерна програма Chou і Chou дозволяє виробляти автоматичні розрахунки величин m. Dm, Dx і СІ. З (Dm)1, (Dm)2 і D1+D2 легко побудува ти ізоболограми, автоматично засновані на рівнянні А. Для консервативних взаємно не виключаючих ізоболограм двох агентів до рівняння А додають третю умову, (D1)(D2)/(DX)1(D X)2. Для простоти третю умову звичайно опускають, і, таким чином, позначають взаємно виключаюче припущення або класичну ізоболограму. У таблицях «результат 2 і 3» приводяться величини СІ, отримані за допомогою класичних (взаємно виключаючих розрахунків). Результат 2 ЕТ-743 DXR ТМТХ Паклітаксел Цитотоксичність чотирьох лікарських засобів на НТ-1080 і S-18 ІС50 для клітин саркоми м'яких тканин НТ-1080 (нМ) 0,01 (нМ) 25 (нМ) 6 (нМ) 1,3 HS-18 0,27 225 70000 10 Дана таблиця показує, що обидві клітинні лінії, і НТ-1080, і S-18, були більш чутливими до ЕТ-743, чим до інших антинеопластичних агентів. Вплив кожного агента на розподіл клітинного циклу проти клітин HS-18 через 24 і 72год. після впливу дози приблизно ІС 50 Лік. засоби Доза Години %G1 %S фази %G2-M Контроль 76,3 11,2 12,5 24 32,4 47,6 20,0 ЕТ-743 270пМ 72 86,7 8,4 4,9 24 10,1 64,9 25,0 DXR 225нМ 72 1,3 63,8 34,9 24 44,2 53,8 1,9 ТМТХ 70мкМ 72 35,5 57,6 7,0 24 32,8 52,5 15,5 Паклітаксел 10нМ 72 23,5 58,7 26,2 Вплив кожного агента на розподіл клітинного циклу проти клітин НТ-1080 через 24 і 72 год. після впливу дози приблизно ІС 50 Лік. засоби Доза Години %G1 %S фази %G2-M Контроль 47,5 35,8 16,7 24 42,6 36,1 21,3 ЕТ-743 10пМ 72 83,1 10,2 6,7 24 36,1 17,5 46,4 DXR 25нМ 72 46,2 5,3 48,5 24 31,9 56,8 11,3 ТМТХ 6нМ 72 32,0 53,7 14,4 24 45,4 37,3 17,3 Паклітаксел 1,3нМ 72 86,0 9,0 5,0 15 79926 Таблиця "Результат 2" показує величини СІ для клітин НТ-1080 і HS-18, відповідно, які одночасно зазнавали впливу ЕТ-743 й одного з неопластичних лікарських засобів, таких як DXR, ТМТХ або паклітаксел, в комбінованій суміші з молярним співвідношенням від 1 до 100. Коли на клітини впливали ЕТ-743 й DXR, величини СІ усі були менші 1, що вказує на синергічний ефект на обох клетинних лініях. СІ (середні) при цій схемі становили 0,86, 0,83, 0,84 і 0,85 при 50, 75, 90 і 95% загибелі клітин, відповідно, для клітин НТ-1080, і 0,89, 0,74, 0,64 і 0,60 при 50, 75, 90 і 95% загибелі клітин, відповідно, для клітин HS-18. Це результат показує, що одночасний вплив ЕТ-743 і DXR приводив до появи синергічного цитотоксичного ефекту. Навпаки, коли на клітини впливали ЕТ-743 і ТМТХ або паклітакселом, спостерігався антагоністичний цитотоксичний ефект. Графік СІ отримували для обох клітинних ліній, які спочатку піддавали впливу ЕТ-743 протягом 24год., а потім - DXR протягом 48год. В обох клітинних лініях послідовний вплив ЕТ-743 і DXR приводив до появи синергічного цитотоксичного ефекту, величина СІ для НТ-1080 при рівні загибелі клітин 80% становила 0,64±0,12, а та ж величина для HS-18 при рівні загибелі клітин 88% становила 0,24±0,06. Навпаки, послідовний вплив DXR і ЕТ-743 (результат 3а, нижня фігура) показав, на перший погляд, хорошу величину СІ, однак величина СІ для НТ-1080 при рівні загибелі клітин 80% становила 1,00±0,03, що вказувало на сумарний ефект двох агентів, крім того, СІ при самій високій фракції загибелі була гірше, чим при середній фракції загибелі для обох клітинних ліній. Коли клітини піддавали впливу ЕТ-743, а потім ТМТХ, величини СІ для НТ-1080 показували близько одиниці або більше за одиницю, що вказує на антагоністичний або сумарний характер ефекту двох даних агентів. Навпаки, ті ж величини для HS-18 всі були менші за 0,6, що вказує на синергічний ефект двох даних агентів. Коли на клітини впливали спочатку ТМТХ, а потім - ЕТ-743, спостерігався сумарний ефект в обох клітинних лініях, НТ-1080 і HS-18. Послідовний вплив паклітакселом і ЕТ-743 здійснював синергічну цитотоксичну дію. Коли на клітини впливали паклітакселом, а потім - ЕТ-743, величина СІ для НТ-1080 при рівні загибелі клітин 89% становила 0,92±0,06, а та сама величина для HS-18 при рівні загибелі клітин 78% становила 0,38±0,13. Висновок ЕТ-743 був високоактивним агентом проти клітин саркоми м'яких тканин людини, особливо, проти клітинної лінії злоякісної фібросаркоми НТ-1080. DXR при комбінуванні з ЕТ-743 демонстрував синергізм, незалежно від послідовності впливу, однак, послідовність ЕТ-743, а потім - DXR була більш ефективною проти обох клітинних ліній. Вплив паклітакселом, а потім - ЕТ-743 також було ефективним режимом проти клітин саркоми м'яких тканин людини, в той час як одночасний вплив був антагоністичним. Приклад 6 16 Комбінації хіміотерапевтичних агентів з ектеїнасцидином 743 (ЕТ743) проти солідних пухлин in vi vo. Декілька унікальних механізмів дії було описано для ЕТ-743, включаючи зв'язування з малою борозенкою ДНК, алкілування N2 гуаніну, інгібування транскрипції гена MDR1 [Jin et al., PNAS 97, 6775, 2000; Minuzzo et al., PNAS 97, 6780, 2000] і протидія активації нуклеарного рецептора SXR [Synold et al., Nature Med. 7, 584, 2001]. Як єдиний агент, ЕТ-743 інгібує зростання пухлини in vivo, досягаючи повних ремісій (CR), проти декількох пухлинних ліній людини [Hendriks et al., Ann. Oncol. 10, 1233, 1999], включаючи меланому (MEXF 989), NSCL (LXFL 529), рак яєчника (HOC 22) і рак молочної залози (МХ-1). Ефективність ЕТ-743 в комбінації з лікарськими засобами, які діють за допомогою інших механізмів, може надати можливості для зниження токсичності лікарського засобу або потенціювати ефективність лікарського засобу при резистентних або рецидивуючих злоякісних пухлинах. Для вказаної оцінки декілька агентів, включаючи доксорубіцин (DOX; 8мг/кг), цисплатин (DDP; 12мг/кг) і вінбластин (VINB; 6мг/кг) вводили до/після ЕТ-743 (0,2мг/кг), з 1 годиною попереднього впливу qdx5, в одну або більше з наступних пухлин: хондросаркому (CSHA), остеосаркому (OSA-FH), фібросаркому (SW684), яєчника (MRI-H1834), NSCL (LX-1) і нирки (MRI-H-121), з активністю, що визначається як