Прилад для аналізу біомолекулярних середовищ

Реферат: Прилад для аналізу біомолекулярних середовищ містить оптичний вузол, який складається з джерела р-поляризованого монохроматичного видимого світла, призми повного внутрішнього відбиття з нанесеним на її поверхню плівковим металевим робочим елементом та системи вимірювання інтенсивності відбитого від робочого елемента світла, а також пристрій механічного повороту призми з кроковим двигуном та системою передачі обертального руху від крокового двигуна до призми. Робочий елемент має верхній шар пористого оксиду кремнію товщиною 40÷120 нм, з поруватістю 10÷60 %. UA 87271 U (12) UA 87271 U UA 87271 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі оптоелектронних твердотільних сенсорних приладів на основі поверхневого плазмонного резонансу (ППР) для хімічного і біологічного аналізу, заснованого на реєстрації адсорбції або реакції взаємодії молекул у газовому і рідкому середовищах. Ці прилади дозволяють робити швидкий і економічний моніторинг навколишнього середовища, а також експресний аналіз рідин при медичних та клінічних дослідженнях, складу продуктів. Корисна модель може бути використана в харчовій, хімічній, фармацевтичній промисловості, сільському господарстві, медицині та екології. Відомий прилад на основі явища ППP [1] містить оптичний вузол, який складається з призми повного внутрішнього відбиття з металевою плівкою, джерела р-поляризованого монохроматичного випромінювання, що падає на металеву плівку з боку призми і систему вимірювання інтенсивності відбитого світла від металевої плівки. Принцип роботи приладу полягає у вимірюванні інтенсивності відбитого від металевої плівки монохроматичного світла при зміні кута падіння. При певному куті падіння за рахунок поглинання плазмоном металевої плівки енергії падаючої хвилі інтенсивність відбитого світла суттєво зменшується, що безпосередньо можна спостерігати як резонансний провал на характеристиці ППР в діапазоні кутів, більших критичного (кута повного внутрішнього відбиття матеріалу призми). Аналіз змін характеристик ППР в умовах адсорбції чи взаємодії молекул на протилежній стороні металевої плівки дозволяє вивчати взаємодію між біохімічними об'єктами, що досліджуються. У цьому приладі вимірювання кривої ППР здійснюється з використанням широкого світлового променя, що покриває певний інтервал кутів падіння і фокусується в одній точці на металевій поверхні. Відбите випромінювання попадає на лінійку фотодіодів і генерує електричний сигнал, що в подальшому аналізується. Процес адсорбції біологічних молекул на сенсорну поверхню аналогічний формуванню шару молекул з певним коефіцієнтом заломлення та товщиною. Форма резонансної кривої та положення мінімуму змінюється в процесі адсорбції. Таким чином, прилад дозволяє протягом кількох хвилин детектувати процеси адсорбції і взаємодії молекул, що відбуваються на сенсорній поверхні за рахунок визначення положення мінімуму резонансної кривої з плином часу при скануванні лінійкою фотоприймачів, що дозволяє проаналізувати процеси біохімічної взаємодії досліджуваних реагентів. Недоліками відомої сенсорної системи є малий кут сканування (5 кут. град.), який дозволяє досліджувати шари з коефіцієнтом заломлення в діапазоні 1,33÷1,38 та недостатня довговічність металевого чутливого шару на призмі, що обмежує перелік досліджуваних середовищ. Також є відомим прилад для детектування та визначення концентрації біомолекул [2]. Прилад містить оптичний вузол, який складається з джерела р-поляризованого монохроматичного світла, призми повного внутрішнього відбиття з нанесеним на її поверхню плівковим металевим робочим елементом завтовшки 45-60 нм, що містить у собі плівку золота з біомолекулярними рецепторами, та системи вимірювання інтенсивності відбитого від робочою елемента світла, а також пристрій механічного повороту призми з кроковим двигуном, поєднаний з системою передачі обертального руху від крокового двигуна до призми. Детектування та визначення концентрації біомолекул і молекулярних комплексів полягає в опроміненні металевої плівки з боку призми в широкому діапазоні кутів падіння світла, яке досягається механічним поворотом призми та реєстрації відбитого випромінювання для певного набору кутів падіння з подальшою математичною обробкою результатів вимірювань за спеціально розробленим алгоритмом. В результаті отримують характеристики поверхневого плазменного резонансу (ППР-криві) у вигляді залежності відбитого випромінювання від кута падіння світла. За формою ППР-кривої та кутовим положення мінімуму можна аналізувати характер біомолекулярних взаємодій для широкого ряду речовин. Механічне сканування кута падіння випромінювання в діапазоні 17 кутових градусів дозволяє досліджувати середовища з показником заломлення від 1,0 до 1,5, а також отримувати повну ППР-криву для подальшої математичної обробки на відміну від вищезгаданого сенсору без механічної розгортки по куту падіння випромінювання. Недоліком приладу є низька стабільність і мала довговічність робочого елемента, яка пов'язана з необхідністю промивки та протирання шару золота при дослідженні різних речовин (при зміні досліджуваних речовин). Найбільш близьким аналогом є прилад для аналізу біохімічних, рідких та газоподібних середовищ [3]. Прилад містить оптичний вузол, який складається з джерела р-поляризованого монохроматичного видимого світла, призми повного внутрішнього відбиття з нанесеним на її поверхню плівковим металевим робочим елементом та системи вимірювання інтенсивності відбитого від робочого елемента світла, а також пристрій механічного повороту призми з кроковим двигуном та системою передачі обертального руху від крокового двигуна до призми. 1 UA 87271 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На поверхню плівкового металевого робочого елемента нанесені біомолекулярні рецептори, що дозволяє досліджувати біомолекулярні та біохімічні реакції. Недоліком найближчого аналогу є низький рівень адгезії до поверхні металевого чутливого елемента біомолекулярних рецепторів та низький рівень відгуку (зсуву мінімуму ППР-кривої) приладу на перебіг біомолекулярних і біохімічних реакцій. Низький рівень адгезії під час нанесення біомолекулярних рецепторів на металевий чутливий елемент приладу призводить до нерівномірного заповнення поверхні чутливого елемента рецепторами, що спотворює вихідні дані результатів біомолекулярних досліджень за допомогою ППР. При багаторазовій промивці чутливого елемента спостерігається небажане відшарування біомолекулярних рецепторів від поверхні плівкового металевого робочого елемента, що вносить суттєві похибки в результат вимірювання зсуву мінімуму ППР-кривої, причому величина похибки з плином часу зростає, що негативно впливає на повторюваність вимірювань. В основу корисної моделі поставлена задача підвищення чутливості приладу на основі ППР. Поставлена задача вирішується тим, що пропонується прилад для аналізу біомолекулярних середовищ, який містить оптичний вузол, який складається з джерела р-поляризованого монохроматичного видимого світла, призми повного внутрішнього відбиття з нанесеним на її поверхню плівковим металевим робочим елементом та системи вимірювання інтенсивності відбитого від робочого елемента світла, а також пристрій механічного повороту призми з кроковим двигуном та системою передачі обертального руху від крокового двигуна до призми, який відрізняється тим, що робочий елемент має верхній шар пористого оксиду кремнію товщиною 40÷120 нм, з поруватістю 10÷60 %. Запропонований прилад, у якому робочий елемент має верхній шар пористого оксиду кремнію товщиною 40÷120 нм, з поруватістю 10÷60 %, за рахунок розвиненої морфології поверхні, у порівнянні з найближчим аналогом, забезпечує підвищення чутливості, точності і повторюваності вимірювань. При цьому мінімум ППР-кривої практично не змінює свого положення під час вимірювання та при повторних вимірюваннях після великого проміжку часу. Це означає, що при наявності такого шару не буде змінюватись кутове положення за тривалий час вимірювання, що і призводить до збільшення точності вимірювань. Вибраний діапазон товщини шару пористого оксиду кремнію обумовлений забезпеченням оптимальної форми ППР-кривої, що обумовлює рівень збільшення відгуку, у порівнянні з відгуком найближчого аналогу, при однакових умовах вимірювання. При товщині пористого оксиду кремнію менше 40 нм позитивний ефект при вимірюванні не проявляється, а при товщині більшій 120 нм суттєво збільшується поглинання, що негативно впливає на чутливість вимірювання. Тому діапазон вибраної товщини пористого оксиду кремнію складає 40÷120 нм. При поруватості пористого оксиду кремнію менше 10 % позитивний ефект при вимірюванні не проявляється, а при поруватості більшій 60 % спостерігається спотворення ППР-кривої, що негативно впливає на достовірність результатів вимірювання. Вибраний діапазон поруватості дозволяє керувати селективністю біомолекулярних рецепторів до різних за розміром біомолекул. Таким чином запропонована корисна модель має корисний ефект. На фіг. 1 приведена блок-схема ППР приладу, робота якого заснована на дослідженні кутової залежності інтенсивності відбитого від робочого елемента приладу світла, де 1 джерело р-поляризованого монохроматичного видимого світла, 2 - призма повного внутрішнього відбиття, 3 - адгезійний шар хрому плівкового металевого робочого елемента, 4 активний шар плівкового металевого робочого елемента (переважно Au, Ag), у якому відбувається збудження поверхневих плазмонів, 5 - проточна кювета для подачі досліджуваної проби, 6 - верхній шар пористого оксиду кремнію, 7 - система вимірювання інтенсивності світла, відбитого від межі поділу призма/металева плівка. Пристрій працює наступним чином: призма (2) дискретно (під дією крокового двигуна) змінює своє положення в діапазоні кутів повного внутрішнього відбиття від межі поділу призмаметал відносно напрямку розповсюдження р-поляризованого монохроматичного видимого світла; під дією світла поверхневі плазмони збуджуються в металевому шарі (4). нанесеному на поверхню скляної призми, на яку попередньо нанесений адгезійний шар хрому (3); шар пористого оксиду кремнію (6) за рахунок розвиненої поверхні підсилює адсорбцію аналіту, його зовнішня сторона контактує з досліджуваною пробою через кювету (5), яка має патрубки для введення та виведення досліджуваної речовини. При резонансі частот фотонів джерела рполяризованого монохроматичного світла (1) і електронної плазми на зовнішній поверхні металу відбувається суттєве поглинання енергії фотонів. Проявом цього є зменшення інтенсивності відбитого світла при певному куті падіння світла, яке фіксується системою детектування світла (7), що відповідає певним характеристикам досліджуваних речовин або результату взаємодії їх компонентів. Форма кривої плазмонного резонансу і, зокрема, 2 UA 87271 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 положення мінімуму, залежать від: оптичних параметрів і товщини шару, що контактує з металевим робочим елементом при фіксованих значеннях показника заломлення призми, оптичних констант і товщини металевої плівки, у якій збуджується поверхневий плазмонний резонанс. Фіксуючи зміну ППР-кривої, тобто досліджуючи зміну положення мінімуму кутової залежності відбитого р-поляризованого випромінювання у часі, можна зробити висновки про динаміку процесів адсорбції та взаємодії молекул, що відбуваються на розглянутій межі поділу та характеризувати їх кількісно. Аналіз кутового положення і форми резонансної ППР-кривої реєструється керуючою програмою, що дозволяє одержувати в реальному масштабі часу кінетику явища (сенсограму), яка свідчить про процеси адсорбції та взаємодії біологічних молекул, присутніх у досліджуваній рідкій або газоподібній пробі. Результати вимірювань математично обробляються за спеціально розробленим алгоритмом. За рахунок механічної розгортки по куту падіння випромінювання на робочий елемент сенсор забезпечує діапазон по куту падіння - 17 кутових градусів. Це дозволяє отримувати повну ППР-криву та за допомогою спеціального програмного забезпечення вираховувати оптичні константи та товщини шарів, що входять у склад системи. А також працювати з середовищам, які мають показник заломлення від 1,0 до 1,5. Приклад реалізації. Для реалізації корисної моделі було зібрано прилад згідно зі схемою, наведеною на фіг. 1. Як джерело р-поляризованого монохроматичного світла було використано напівпровідниковий GaAs лазер з довжиною хвилі 650 нм, призма була виконана з оптичного силікатного скла Ф1 з показником заломлення 1,61, на робочу грань призми за допомогою термічного випаровування у вакуумі було нанесено спочатку шар хрому товщиною від 4 нм, потім на шар хрому нанесено шар золота товщиною 50 нм, потім було нанесено верхній шар пористого оксиду кремнію товщиною 55 нм з поруватістю 60 %. Системою вимірювання інтенсивності відбитого від робочого елемента світла був фотоелектричний чутливий приймач (фотодіод), сигнал від якого підсилювався та виводився на систему реєстрації даних (дисплей персонального комп'ютера), що давало змогу отримати графічне зображення залежності інтенсивності відбитого світла від кута падіння р-поляризованого випромінювання. Зміну кутового положення призми задавали кроковим двигуном з кроком 10 кутових секунд. Для порівняння точності вимірювань паралельно проводили вимірювання мінімуму ППР кривої на приладі, який був вибраний як найближчий аналог, з чутливим елементом без верхнього шару пористого оксиду кремнію. Проводили дослідження на зразках двох рідин з різним показникам заломлення: дистильована вода (n=1,33153) та 0,6 % розчин хлориду калію (КСl) в воді (n=1,33241). Виконували почергову заміну двох рідин в кюветі. Фіксували зміну показника заломлення з часом в момент, коли в кюветі була присутня дистильована вода і після заміни її на розчин солі. Після 2-х процедур заміни рідини впродовж 20 хвилин вимірювання при використанні найближчого аналогу суттєво змінився показник заломлення рідин у порівнянні з початковим її значенням (Фіг. 2, крива 1). Для корисної моделі, що заявляється, показник заломлення дистильованої води та розчину солі майже не змінилися за час вимірювання (Фіг. 2, крива 2), крім того відгук був приблизно в 1,4 разу більший за відгук найближчого аналогу. Такі ж вимірювання були виконані для зразків з товщиною пористого оксиду кремнію 40, 70, 85, 100 та 120 нм. Для решти значень товщини шару пористого оксиду кремнію від 40 до 120 нм відгук був більший за відгук найближчого аналогу в 1,36 разу. Таким чином, результати вимірювань показують, що при використанні приладу з чутливим елементом, який відповідає запропонованій корисній моделі, суттєво зростає стабільність роботи та довговічність цього елемента, зростає чутливість приблизно в 1,4 разу в порівнянні з найближчим аналогом. Джерела інформації: 1. United States Patent: 6.480.282. МПК G01N 021/05. Capillary surface plasmon resonance sensor and multisensors / Chinowsky T.M., Yee S.S.; November 12. 2002 2. Ширшов Ю.М., Венгер Є.Ф., Прохорович Д.В., Ушенін Ю.В., Мацас Є.П., Чегель В.І., Самойлов А.В., Спосіб детектування та визначення концентрації біомолекул та молекулярних комплексів та пристрій для його здійснення; Патент України номер 46018, опубл. 15.05.2002; бюл. № 5 3. Дорожинський Г.В., Ушенін Ю.В., Самойлов А.В., Христосенко Р.В., Громовой Ю.С., Зиньо С.А., Маслов В.П. Прилад для аналізу біохімічних середовищ, патент України на корисну модель № 76774 від 10.01.2013, бюл. № 1. 3 UA 87271 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Прилад для аналізу біомолекулярних середовищ, який містить оптичний вузол, який складається з джерела р-поляризованого монохроматичного видимого світла, призми повного внутрішнього відбиття з нанесеним на її поверхню плівковим металевим робочим елементом та системи вимірювання інтенсивності відбитого від робочого елемента світла, а також пристрій механічного повороту призми з кроковим двигуном та системою передачі обертального руху від крокового двигуна до призми, який відрізняється тим, що робочий елемент має верхній шар пористого оксиду кремнію товщиною 40÷120 нм, з поруватістю 10÷60 %. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4