Спосіб одержання alрha-інтерферона людини

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и к а с а е т с я способа получения (/-интерферона. Целью изобретения является,повышение выхода конечного продукта. Способ з а ключается в том, что бактерии Escher i c h i a coli HB (01 трансформируют плазмидами, содержащими промотор) операторную область триптофанового оперона S e r r a t i a m a r c e s c e n s , с и н т е тическую рибосомсвязывающую последовательность и ген о1—интерферона ч е ловека. 2 з . п . ф - л ы . СО 00 О» 1 1366064 2 отсасывают в вакууме, затем добавляИзобретение относится к биотехноют по 0,5 мл толуола и ТГФ и снова логии, генной инженерии и касается выпаривают, остается бесцветное вспеспособа получения (У—интерферона. ненное твердое вещество. Этот про— Целью изобретения является повышение выхода конечного продукта за ь счет присоединения структурного гена дукт не анализируют на его чистоту, зрелого о/ —интерферона через новое а растворяют в 10,0 мл абсолютного рибосомное связывание через линкерпиридина. Раствор хранят под аргоном ную последовательность с вектором при ~20°С вплоть до дальнейшего при— pBR 322. Ю менения (в течение одной недели). П р и м е р 1. Получение олигоАналогично получают раствор нукпе— нуклеотидов (DMTN - п,п-диметоксиозидфосфорохлоридита в 10,0 мл пиритрифенилметил; ibu - изобутнрил; дина из 640,0 мг (1,0 ммоль) 5' - д и be j - бензоил на основном а з о т е , Р^, метокситритил-N -изобутилудезоксигаполимерный материал-носитель; В - — 15 уноэина. тимин или Іі[ 5 -изобутирилгуанин, или Аналогично получают раствор нукле— 4 С. озидфосфорохлоридита в 10,0 мл пириN -бензоилпитозин, или N -бензоиладенин; ТГФ - тетрагидрофуран). дина из 683,7 мг ( 1 , 0 ммоль) 5 -димеФункционализацию полимерного мате-20 дина токситритил-^-бензоил-дезоксицити5 -Диметокситритил-її -бензоилриала-носителя осуществляют по и з в е —дезоксиаденозин—3 —хлорметоксифос— стным способам, при этом в качестве фат. Аналогично получают раствор э т о материала-носителя служит HPLC-сили— го нуклеозндфосфорохлоридита в кагель (macherey 5 Nagel, размер з е 10,0 мл пиридина из 657,7 мг рен 20 ммк, размер пор 200 А). Его ( 1 , 0 ммоль) 5' -диметокситритил-N^дериватизируют известным методом з а -бензоил-дезоксиаденозйна. исключением того, что стадию сукцини— П р и м е р 2. Синтез d-TCCTTA. лирования осуществляют с помощью а н 50 мг (5 мкмоль) содержащего гидрида янтарной кислоты в безводном 17 пиридине. Защищенные нуклеозиды с в я - 30 flMTrdA* полимерного носителя (пример 1) вносят в стеклянную-фритту. зывают ковалентно с силикагелем с о Затем добайляют различные раствориответственно следующей формуле: тели и растворы реактивов, носитель в ней кратковременно встряхивают, . . раствор после требуемого взаимодействия снова удаляют, с помощью тока аргона его вытесняют вверх через 2Vco-o. фритту. Далее синтез идет в несколько с т а Удельная нагрузка составляет 68 - 40 дий: а) отщепление ДМТг-группы с помо104 ммоль нуклеозида на 1 г материащью 3 мл раствора из 70 г бромида ла-носителя . цинка, 500 мл нитрометана и 5 мл в о Полностью защищенные нуклеозид—3— ды (время реакции 10 м и н . ) ; —хлорметоксифосфаты синтезируют по известным способам. 544,6 г (1,0 ммоль) 45 і 5' -диметокситритшг-тимидина (DMTrdT) б) 4 промывки по 3 мл смесью нрастворяют в 1,0 мл абсолютного ТГФ -бутанол удутидин:ТГФ ( 4 : 1 : 5 ) ; и этот раствор при -78 ° С в течение в) 4 промывки по 4 мл абсолютным 15 мин в атмосфере аргона прикапывапиридином; ют к перемешиваемому раствору 0 5 г} наконденсация ближайшей нукле0,9 ммоль метил-дихлорфосфита в отидной единицы,для чего 1 мл пири{ 0,5 мл абсолютного пиридина и динового раствора 5'-диметокситритил2,0 мл абсолютного ТГФ. После 10 мин -дез окситимидин-3 -хлорметоксифосфиреакционный раствор нагревают до комта (примерно 100 цмоль) под аргоном натной температуры и центрифугируют. 55 добавляют в фритту к полимерному ноНадосадочную жидкость переносят с сителю и встряхивают его в растворе, помощью пипетки в сухую заполненную (время реакции 10 м и н . ) ; аргоном колбу со шлифом (25 м л ) . При д) 3 промывки по 3 мл абсолютным комнатной температуре растворитель пиридином; у н 366064 4 на стадии г требуемого для определене) окисление сложным триэфиром ной последовательности нуклеотидного фосфористой кислоты с помощью 100 мг структурного элемента. йода, растворенного в 3 мл смеси из После наконденсации последнего ТГФ, лутидина и воды (2:2:1) (время реакции 7 мин); нуклеотидного структурного элемента материал носителя высушивают в вакуж) 3 промывки по 4 мл ТГФ; уме масляного насоса, пробу взвешиз) ацетилирование непревращенных вают с точностью до 1 мг и смешивают 5 -ОН—групп с помощью раствора 150 мг 4—диметиламинопиридина, 0,3 мл Ю с 10,0 мл 0,1 М раствора толуолсульколлидина, 0,25 мл ацетангидрида и фокислотьі в ацетонитриле. Путем про2,5 мл ТГФ (время реакции 5 мин); исходящего при этом отщепления димеи) 4 промывки по 3 мл нитрометатокситритил-катиона получают оранженом. Цикл от стадии а до стадии и во—красный раствор, абсорбция которо— повторяют четырежды с использованием 15 го измеряется при 498 нм. По формуле 448 , . (абсорбция ) (фактор разбавления) нагрузка Ымоль/г) = • —- / „ \ , l ' ИНГ вес Н П Г М Т Р П Й I МГ I носителя r r f v 14,3 1 можно рассчитать загрузку материала- 20 носителя диметокситритильными защитными группами. Получают 43 \л. моль/г, что соответствует среднему выходу 85% на стадию конденсации. Отщепление метильных остатков от триэфирных групп фосфорной кислоты осуществляют следующим образом. Материал носителя в течение 45 мин встряхивают в 4 мл раствора тиофено— ла, триэтиламина и диоксана (1:1:2), 3 0 затем промывают метанолом, после этого — эфиром. Отщепление защитных для оснований групп и одновременно отщепление гек— -с саннуклеотидной цепи от полимерного носителя проводят следующим образом. Материал носителя в течение 14 ч нагревают с 10 мл концентрированного аммиака при 50°С, водный раствор з а тем отсасывают и фильтрат концентри- 4Q руют в вакууме примерно до 2 мл. Таким образом, полученный сырой продукт, который на Ъ' -конце содержит еще диметокситритильную защитную группу, подвергают воздействию обра- 4 тимой фазы HPLC. Колонна Bondapah C 1 t фирмы Waters. Элюент: 0,1 М триэткламмонийацетатный буфер рН 7 с 25Z ацетонитрила, истечение 2 мл/мин, время удерживания 14 мин. Объединен- 50 ные (собранные) фракции после элюи— рования концентрируют примерно до объема 1 мл, смешивают с I0 мл 80%ной уксусной кислоты и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Затем концентрируют в вакууме при 50°С досуха, остаток растворяют в 25 мл воды к отщепленный ди^етокситританол экстрагируют 3 раза по 15 мл эфиром. Водную фазу снова концентрируют досуха, остаток растворяют в 2,5 мл воды, обессоливают на биогеле Р 2 (колонна 60 х 1,7 см) и диофилизуют. В качестве контроля чистоты служит аналитическая HPLC-диаграмма (колонна 300 х 3,8 мм /и. Bondapah С фирмы W a t e r s , элюенты 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер рН 7 с I2% ацетонитрила, истечение 1,5 мл/мин; ! время удерживания — 3,7 мин). П р и м е р 3, Синтез d-TAAGGAGGTTTA. Получают аналогично примеру 2, исходя из 300 мг С30^ моль) ДМТгйА ^Р HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 х 3,9 мм, К Bondapah Cffi фирмы Waters; элюент 0,І М триэтиламмонийацетатный буфер рН 7 с 12% ацетонитрила; истечение - 1,5 мл/мин; время удерживания — 4,4 мин. П р и м е р 4. Синтез d-AGGTTAAACC. Получают аналогично примеру 2, исходя из 200 мг ( і ь ^ м о л ь ) t2 flMTrdc P. HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 х 3,9 мм, /л Bondapah Сів фирмы Waters; элюент 0,1 М триэтиламмоний— ацетатный буфер рН 7 с 12% ацет.онит— рила, истечение - 1,5 мл/мин, время удерживания — 3,4 мин. ° П р и м е р 5 . Синтез d-CATCTTA. Получают а н а л о г и ч н о примеру 2, исходя из 150 мг ( 1 , 3 2 ( ц м о л ь ) HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 х 7,8 мм, ju Bondapah С fa фирмы Waters; элюант 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер рН 7 с 20% ацетонит 1366064 р и л а , и с т е ч е н и е - 1 , 5 мл/мин, время удерживания - 7,7 м и н . П р и м е р 6 . Синтез d-AGCTTAAAGATG Получают а н а л о г и ч н о примеру 2 , исходя из 200 мг ( 16, 2 f-t моль) 1 элюируют из геля. Этот фрагмент затем переваривают с помощью Нае I I I , оба продукта переваривания разделяют на 6%-ном полиакриламидном геле, и фрагмент длиной 90 Ър (промотор/оператор снова выделяют из г е л я . RBS составлена из трех синтетичесHPLC-диаграмма продукта: колонна ких олигонуклеотидов: 6-мера 300 х 7,Ь мм, д 3ondapah С , фирмы вании в растворе устанавливают рН 7,6 с помощью 50 ммоль NaCl и 50 ммоль трис-ЇЇСІ и ДНК обрабатывают 300 единицами Есо НІ. Спустя 2.ч инкубации 40 рестрикционный фермент денатурируют при нагревании и ДНК отделяют элек— трофоретически в 1,4%—ном геле а г а розы. Содержащий par-Lokus отрезок ДНК примерно длиной 400 Ър электро4 5 элюнруют из г е л я , очищают путем экстракции фенолом и осаждения из эта— нольного раствора и растворяют в 50 мкл воды. Этот отрезок ДНК имеет специфические выступы на своих кон- 50 цах Есо RI. Примерно 2 мкг pER 33 обрабатывают с помощью рестрикционного фермента Есо RI. Затем добавляют щелочную фосфатазу, чтобы удалить 5 •^фосфат55 ные остатки. Примерно 5300 Ър длины линейную D S путем электрофореза в M 1,2%-ном геле агарозы и электроэлюи1. Способ получения of-интерферона рования очищают от остаточного не человека, предусматривающий констру— 15 1366064 16 ирование рекомбинантной плазмидой конечного продукта, конструируют реДНК, содержащей ген d-интерферона, комбинантную плазмидную ДНК в п л а з 1 трансформацию E s c h e r i c h i a c o l i д а н миду рВК 322, расщепленную эндонук " ной плазмидой с последующим культилеазами Eco RI и Hind I I I , встраивав ют фрагмент, характеризующийся с л е вированием и выделением конечного дующей нуклеотидной последовательнопродукта, о т л и ч а ю щ и й с я стью: тем, что, с целью повышения выхода 5'AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3 GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAC Promoter GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCAAATTCGA Promotor/Operator ~ RBS Hind I I I к Hind I l l - к о н ц у которого присоединен синтетический линкер К Linker \~*\ I AGCTTAAAGATGTGT! ' AVa I I размером 34 Ър и 143 Ър той же плазмиды, отбирают клоны,, содержа* 25 щие рекомбинантные плазмидные ДНК, ,далее выделяют плазмиду pER 3 3 , к о торой трансформируют штамм E . c o l i KB 101. —і АТТТСТАСАСАСТАСІ— зо 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что конструируют рекомбинантную плаэмиэную ДНК p a r рЕК 3 3 , для чего в Eco RI сайт Scw3A плазмиды pER 33 встраивают фрагмент и ген зрелого of—интерферона без ц и с - 3 5 длиной 400 Ър, кодирующий р^г-локус, теина на Ш 7 - к о н ц е , при этом промокоторый получают обработкой плазмиды тор/операторную область триптофаноРМ 31 эндонуклазой AVa I с последуюв.ого оперона получают перевариванищим присоединением Есо RI-линкеров. ем 25 мг,. плазмиды pBR 101 эндонукле— 3 . Способ по п. 1, о т л и ч а азами Eco RI и Нае I I I и выделением 40 ю щ и й с я тем, что конструируют фрагмента длиной 90 Ьр, последова- ' рекомбинангную ДНК pER 2 J / 1 , для тельность рибосомального связывания чего в Eco RI сайт плазмиды pER 33 конструируют из синтетических ноли~ встраивают ген IEN-o'-А, который п о нуклеотидов 6-мера 5-ТССТТА, 10-мера лучают обработкой Eco RI-Валі 'НІ 45 5'-AGGTTAAACC и 12-мера 5'~ фрагмента плазмиды pER 33 размером TAAGGAGGTTTA, а последовательность 1300 Ър двумя единицами Klenow фраго