Спосіб експресного визначення рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та важких металів в об’єктах довкілля

Реферат: Спосіб експресного визначення рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та важких металів в об'єктах довкілля, шляхом вимірювання біолюмінесценції бактерій, після змішування їх із зразком рідини, який, вірогідно, містить токсичну речовину, та фіксування рівня пригнічення інтенсивності біолюмінесценції бактеріальних клітин сенсорного елемента, причому визначення забруднювача проводять в одну стадію без використання буферного розчину для регідратації бактерій; реєструють пригнічення або підвищення рівня люмінесценції в присутності забруднювача залежно від типу використаного сенсорного елемента, за який використовують тест-штами природних та/або генетично сконструйованих мікроорганізмів, які мають природну або індуковану біолюмінесценцію. UA 86175 U (12) UA 86175 U UA 86175 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до технології визначення рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та важких металів в об'єктах довкілля і може бути застосована для постійного експресного моніторингу рівня інтегральної забрудненості та вмісту особливо токсичних для живих організмів органічних сполук і важких металів в об'єктах довкілля, що дозволяє оцінити сукупну та специфічну (якісну та кількісну) токсичну дію органічних та неорганічних забруднювачів і їх сумішей. Відомо спосіб визначення рівня інтегральної забрудненості об'єктів довкілля за показником "індексу токсичності" проби, що враховує сукупний вплив токсичних органічних сполук та важких металів [1], який включає визначення змін інтенсивності біолюмінесценції генно-інженерних бактерій при дії токсичних речовин, присутніх в пробі, що аналізується, порівняно з контролем. Цей спосіб, як правило, використовують для визначення гострої хімічної токсичності питної, ґрунтової, стічної і очищеної стічної води, ґрунтів, атмосферного повітря, лікарських препаратів та продуктів харчування в лабораторних та польових умовах. Відомо спосіб визначення рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та важких металів в об'єктах довкілля [2], вибраний як найближчий аналог згідно з яким, як і в способі, що заявляється, як сенсорний елемент використаний ліофілізат біолюмінесцентних бактерій; як аналітичний сигнал фіксується рівень пригнічення інтенсивності біолюмінесценції бактеріальних клітин сенсорного елемента. Цей спосіб ефективний у випадку, визначення рівня інтегральної забрудненості. Але при специфічному якісному та кількісному визначенні токсичних органічних речовин і важких металів спосіб виявляється неефективним через його низький рівень специфічності та слабку чутливість. Головною перевагою використання біосенсорних систем у визначенні рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та важких металів, порівняно з традиційними методами, є перш за все визначення саме токсичних для живих систем забруднювачів, в той час як традиційні методи дозволяють визначити лише їх загальний вміст без урахування біологічної токсичності. Тому надзвичайно важливим є постійний експресний моніторинг рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та важких металів саме біосенсорними аналізаторами в об'єктах довкілля. В основу способу, що заявляється, поставлено задачу створення способу експресного визначення рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та важких металів в об'єктах довкілля на основі біосенсорних систем. Поставлена задача вирішується тим, що в способі, що заявляється, використовують тестштами природних та/або генетично сконструйованих мікроорганізмів, які мають природну або R R індуковану біолюмінесценцію: Alcaligenes eutrophus Т1 [5], Pseudomonas fragi Т2(5) [Тс Zn + lux ], Vibrio fisheri F1, Photobacterium phosphoreum В 7071, Vibrio harvei Ms1, Alcaligenes eutrophus 1239 [6] як сенсорні елементи біолюмінесцентного аналізатора. Зазначені штами специфічно гасять або збуджують рівень природної чи індукованої біолюмінесценції під дією токсичних забруднювачів, що дає змогу визначати рівень інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та/або важких металів в об'єктах довкілля з високою специфічністю, високим рівнем чутливості для металу, можливістю використання нативного досліджуваного зразка; фіксувати біологічно токсичну компоненту з загального рівня вмісту забруднювачів. Спосіб, що заявляється, забезпечує визначення рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук, а також якісногота кількісного вмісту важких металів в об'єктах довкілля, високий рівень чутливості для важких металів, високу специфічність, використання нативного досліджуваного зразка, можливість визначення кількості токсичних металів в загальному вмісті їх у зразку, відмічається простотою та швидкістю проведення вимірювань (3-5 хв), економічністю, можливістю проведення аналізу в польових умовах, не вимагає висококваліфікованого персоналу. Згідно з способом, що заявляється, визначення рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та важких металів в об'єктах довкілля проводять наступним чином. Наведені вище тест-штами мікроорганізмів зберігають в ліофілізованому стані при температурі (-20±1) °С, під час зберігання витримують короткотривалий перепад температур до +30 °C без втрати властивостей, придатні до використання протягом не менше ніж 1 року, працюють в інтервалі температур від +4 °C до +35 °C. Приклад 1. Загальна схема біосенсорного аналізу експресного визначення рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та важких металів в об'єктах довкілля. Об'єктами довкілля для визначення рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та важких металів є зразки ґрунтів, природної та стічної води. Готують до 1 UA 86175 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 роботи контрольні зразки сенсорних елементів: витримують флакони з сенсорними елементами при температурі вимірювань протягом 30 хв, отримують показник інтенсивності люмінесценції 3 контрольного зразка, для чого знімають укупорку з флакону, додають до вмісту флакону 10 см дистильованої води, температура якої відповідає температурі вимірювань, та розчиняють вміст флакону, витримують флакон 5 хв при температурі вимірювань, поміщають флакон у фіксатор портативного біолюмінометра, що заявляється, закривають кришкою, проводять вимірювання за інструкцією до вказаного біолюмінометра, записують отримане значення інтенсивності біолюмінесценції, потім отримують показник інтенсивності біолюмінесценції дослідного зразка, для чого проводять операції, як описано вище, отримані показники контрольного та дослідного зразків порівнюють за схемою, наведеною в паспорті сенсорних елементів, відповідно до параметру забруднювача, що визначається. Приклад 2. Порівняння рівня інтегральної забрудненості, визначеного способом, що заявляється, з даними, отриманими класичними сертифікованими методами. Аналіз води виконують класичними сертифікованими методами [7-10] (фіг. 1) та результати порівнюють з даними, отриманими способом, що заявляється, за Прикладом 1 (фіг. 2). Проведені випробування засвідчують кореляцію даних щодо рівня інтегральної забрудненості, отриманих класичними хімічними сертифікованими методами (фіг. 1, приведені дані перераховані відносно гранично допустимої концентрації (ГДК)) та рівнем інтегральної забрудненості, визначеним за допомогою портативного біолюмінесцентного аналізатора (фіг. 2). Приклад 3. Визначення вмісту важких металів в об'єктах довкілля способом, що заявляється. Аналіз води проводять способом, що заявляється, за Прикладом 1. Як сенсорний елемент + використовують штам Photobacterium phosphoreum В7071 (lux ). Визначають вміст важких металів - цинку, кобальту та золота у різних концентраціях за характером впливу на сенсорний елемент. Проведені випробування засвідчують, що іони важких металів (цинку, кобальту та золота) виявляють інгібуючий вплив на біолюмінесценцію клітин сенсорного елемента. При цьому найбільш виражена концентраційно-залежна здатність інгібувати інтенсивність люмінесценції бактеріальних клітин притаманна іонам золота: чутливість сенсорного елемента + штаму Photobacterium phosphoreum В7071 (lux ) до дії золота в іонному стані в концентраціях 1 та 2,5 мкМ значно більш виражена, ніж чутливість до дії іонів цинку та кобальту у максимально діючих концентраціях - 100 мкМ (фіг. 3). Вже при концентрації 0,6 мкМ (0,12 мкг/мл) іонів золота спостерігається інгібування люмінесценції бактеріальних клітин сенсорного елемента більш ніж у три рази порівняно з контролем (фіг. 4). Кінетичні криві гасіння інтенсивності біолюмінесценції сенсорного елемента іонами золота при двох різних концентраціях (фіг. 5) свідчать про "швидку" кінетику цього процесу: протягом 10 хв рівень гасіння біолюмінесценції досягає максимального значення і подальше збільшення часу інкубації не впливає на хід кривих. Приклад 4. Визначення кількісного вмісту цинку в об'єктах довкілля способом, що заявляється. Аналіз води проводиться способом, що заявляється, за Прикладом 1. Як сенсорний елемент R + використовується штам Ps. fragi T2(5) (Zn lux ). Результати аналізу свідчать про чітко виражену дію іонів цинку на клітини сенсорного елемента: прямолінійна залежність підвищення інтенсивності біолюмінесценції від концентрації цинку зберігається в діапазоні 1-100 мкМ за металом (фіг. 6, крива 1). Хід кривих 2-6 свідчить про незначний рівень чутливості клітин штаму R + Ps. fragi T2(5) (Zn lux ) до інших важких металів. Відношення максимального сигналу (фіг. 6, крива 1) до фонового (фіг. 6, крива 7) становить біля трьох порядків. Приклад 5. Визначення кількісного вмісту талію в об'єктах довкілля способом, що заявляється. Аналіз вмісту талію в об'єктах довкілля проводиться способом, що заявляється, за Прикладом 1. Сенсорним елементом виступає штам Alcaligenes eutrophus Т1, клітини якого здатні високоспецифічно реагувати підвищенням біолюмінесценції на присутність іонів талію в ґрунтах та інших зразках у концентраціях, які перевищують гранично допустимі. Зразок ґрунту, який містить іони талію, викликає світіння сенсорного елемента з інтенсивністю 1280 RLU при вихідній величині (без додавання ґрунту) - 50 RLU (фіг. 7). Привабливість використання такого методу визначення іонів важких металів полягає не тільки в високій його вибірковості (індуктором світіння виступає певний метал), але й у можливості реєстрації кількості токсичного для організму металу, оскільки інтенсивність світіння пропорційна його концентрації в біологічному об'єкті. На фіг. 8 приведена залежність інтенсивності біолюмінесценції клітин штаму Alcaligenes eutrophus ТІ від кількості ґрунту, що містить талій. Прямолінійна ділянка такої залежності 2 UA 86175 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 зберігається при наявності до 500 мг ґрунту в інкубаційній пробі. Для розрахунку кількісного вмісту біодоступного металу в ґрунті використовується калібрувальна крива залежності інтенсивності біолюмінесценції від вмісту талію в пробі (фіг. 9). Наведені дані демонструють ефективність використання способу, що заявляється, у визначенні інтегральної забрудненості, токсичних органічних речовин, а також специфічного якісного та кількісного вмісту важких металів в об'єктах довкілля. Спосіб експресного визначення рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та важких металів в об'єктах довкілля, що заявляється, має ряд переваг перед традиційними хімічними способами та забезпечує: визначення рівня інтегральної забрудненості; вмісту токсичних органічних сполук;визначення якісного та кількісного вмісту важких металів в об'єктах довкілля; високу специфічність визначень; високий рівень чутливості для важких металів; використання нативного досліджуваного зразка; можливість визначення кількості токсичних металів в загальному вмісті їх у зразку; швидкість проведення вимірювань (3-5 хв); економічність; простоту вимірювань і можливість проведення аналізу в польових умовах; відсутність необхідності в висококваліфікованому персоналі. Перелік фігур креслень 1. Дані класичного аналізу рівня забрудненості природної води. 2. Біосенсорний аналіз рівня інтегральної забрудненості (ІЗ) природної води. 3. Ступінь інгібування природної люмінесценції клітин Photobacterium phosphoreum B7071 + (lux ) іонами важких металів: 1) іони Au концентрації 0,2 мкг/мл (1,0 мкМ); 2) іони Au концентрації 0,5 мкг/мл (2,5 мкМ); 3) іони Zn концентрації 100 мкМ; 4) іони Co концентрації 100 мкМ. 4. Вплив іонного золота на інтенсивність біолюмінесценції штаму Ph. phosphoreum B7071. 5. Кінетика гасіння біолюміиесценції Ph. phosphoreu. і іонами золота при концентраціях (мкг/мл):0,12 ( ) та 0,3 (●) 6. Інтенсивність специфічної біолюмінесценції (СРS-Хі кількість фотонів за секунду) клітин R + штаму-біосенсору Ps. fragi T2(5) (Zn lux ) в присутності іонів важких металів: 1 - Zn; 2 - Ni; 3 Co; 4 - Cd; 5 - Сu; 6 – Ag. Фоновий рівень біолюмінесценції (середовище виміру) відображено на кривій 7. 7. Інтенсивність біолюмінесценції (RLU) мутантних клітин Alcaligenes eutrophus Т1 після контакту із зразками ґрунту (1-4). Концентрація ґрунту в пробі: - контроль, 0 мг; 100 мг; - 200 мг; - 500 мг. Тут та на рис. 8, 9 об'єм інкубаційної проби – 5мл; 8 концентрація клітин біосенсору - 2∙10 кл/мл; час контакту 5 год. 30 хв. 8. Зміна інтенсивності біолюмінесценції мутантних клітин Alcaligenes eutrophus Т1 в залежності від кількості ґрунту, що містить талій. 9. Залежність інтенсивності біолюмінесценції мутантних клітин Alcaligenes eutrophus Т1 від концентрації талію в пробі (калібрувальна крива). Джерела інформації 1. Методические рекомендации № 11-1/133-09 "Методика экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста "Эколюм". Методические рекомендации. (Утв. МЗ РФ 08.06.2000). 2. PCT/GB94/02224.-20.04.95. 3. Колекція штамів Біотехнологічного центру VITO, Бельгія. 4. Колекція штамів Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів, м. Київ. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 55 1. Спосіб експресного визначення рівня інтегральної забрудненості, вмісту токсичних органічних сполук та важких металів в об'єктах довкілля, шляхом вимірювання біолюмінесценції бактерій, після змішування їх із зразком рідини, який, вірогідно, містить токсичну речовину, та фіксування рівня пригнічення інтенсивності біолюмінесценції бактеріальних клітин сенсорного елемента, який відрізняється тим, що визначення забруднювача проводять в одну стадію без використання буферного розчину для регідратації бактерій; реєструють пригнічення або підвищення рівня люмінесценції в присутності забруднювача залежно від типу використаного сенсорного елемента, за який використовують тест-штами природних та/або генетично сконструйованих мікроорганізмів, які мають природну або індуковану біолюмінесценцію. 3 UA 86175 U 5 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що дозволяє високоспецифічно визначати вміст токсичних органічних сполук та важких металів. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що дозволяє кількісно визначати вміст токсичних органічних сполук та важких металів. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що поріг чутливості при визначенні вмісту токсичних органічних сполук та важких металів в об'єктах довкілля складає 0,1 мкМ. 4 UA 86175 U 5 UA 86175 U 6 UA 86175 U 7 UA 86175 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8