Застосування 2,5-дигідроксибензолсульфонової кислоти для виготовлення ліків, які застосовують для лікування хвороб, залежних від ангіогенезу

1. Застосування 2,5дигідроксибензолсульфонової кислоти або будьякої з її фармацевтично прийнятних солей для виготовлення ліків, які застосовують для лікування хвороб, залежних від ангіогенезу. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що залежна від ангіогенезу хвороба також є пов'язаною зі зниженням апоптозу. 3. Застосування за будь-яким з пп. 1 або 2, яке відрізняється тим, що виготовлені ліки призначаються для застосування у лікуванні від раку. 4. Застосування за п. 3, яке відрізняється тим, що виготовлені ліки застосовуються для збільшення антипроліферативного впливу цитостатичних ліків у лікуванні від раку. 5. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, яке відрізняється тим, що сіль, якій віддають перевагу для виготовлення ліків, є калієвою сіллю 2,5дигідроксибензолсульфонової кислоти. 6. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, яке відрізняється тим, що сіль, якій віддають перевагу для 2 (19) 1 3 30 % рідкого вазеліну, 30 % білого м'якого парафіну, Даний винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає 2,5дигідроксибензолсульфонову кислоту, та її застосування у приготуванні ліків для лікування хвороб, які характеризуються інтенсивною проліферацією клітин, васкуляризацією (залежних від судин хвороб), точніше, залежних від судин хвороб, які також є пов'язаними зі зниженням апоптозу, яке відбувається, наприклад, у разі раку або псоріазу. Злоякісні пухлини характеризуються, крім неконтрольованої клітинної проліферації, їхньою здатністю до вторгнення у нормальні навколопухлинні тканини. Інвазія пухлин є складним процесом, який розвивається згідно з такими послідовними етапами: а) прилипання пухлинних клітин до білків позаклітинного матриксу; b) розщеплення білків позаклітинного матриксу протеазами, які створюють позаклітинні проміжки, що використовуються пухлинними клітинами, с) міграція через динамічний і складний механізм, який вимагає синтезу нових частин цитоплазматичної мембрани та реорганізації цитоскелета [Giese A, Westphal Μ. Neurosurgery 1996; 39: 235-252]. У клітин, які з пухлинної маси вторгаються у нормальну навколопухлинну тканину, генетична програма смерті клітин не діє, і тому пухлинні клітини, які мігрують для вторгнення у навколопухлинні інтактні тканини, уникають апоптозу [Магіапі І et al. Clin Cancer Res 7:2480-2489, 2001]. Коли група пухлинних клітин досягає об'єму від 2 до 3 мм3, пухлинні клітини синтезують велику кількість ангіогенних факторів для протидії гіпоксичній ситуації цієї первинної пухлини [Folkman J. N. Engl J Med 285: 1182-1186, 1971; Carmeliet Ρ, Jain RK. Nature 407: 249-257, 2000; Yancopoulos GD et al. Nature 407: 242-248, 2000], які активізують навколопухлинні кровоносні судини таким чином, що вони утворюють нові кровоносні судини (ангіогенез), які проникають у пухлину для постачання кисню та поживних речовин і видаляють продукти катаболізму пухлини. Такі самі клітинні процеси, які трапляються під час інвазії пухлин (рухливість та відсутність апоптозу), відбуваються відцентрово й під час ангіогенезу пухлин. Таким чином, інгібування інвазивної здатності пухлинних клітин та ендотеліальних клітин має забезпечувати затримку росту пухлин шляхом інгібування поширення пухлини, зниження ангіогенезу та сприяння апоптозові. Таким чином, ефективне лікування від раку має інгібувати міграцію, ангіогенез і збільшувати апоптоз без створення цих ефектів у нормальних клітинах. Існує багато протипухлинних і протиангіогенних агентів на різних стадіях клінічних розробок в онкології [Brem S. Cancer Control 6: 436-458, 1999], серед яких значну кількість складають пептиди, які використовуються організмом для протидії впливу позитивних регуляторів ангіогенезу [Hagerdorn Μ, Bikfalvi A. Crit Rev One Hemat 34: 89-110, 2000]. Однак, якщо ці пептиди порівняти зі сполуками зі 86399 4 5 % Span (сорбітолеату), q.s 100 г дистильованої води. значно нижчою молекулярною масою, стають явними їхні незручності з фармакологічної точки зору. З іншого боку, було доведено, що різні синтетичні сполуки, які містять ароматичні кільця в своїй молекулярній структурі й діють як інгібітори мітогенної активності, викликаної факторами росту, є цитотоксичними для нерухомих або непухлинних клітин [Lozano RM J Мої Віоі 281: 899-9115, 1998]. Таким чином, продовжує існувати потреба у сполуках з протипухлинною, протиангіогенною та проапоптозною активністю з низькою токсичністю для інтактних, нерухомих, непухлинних клітин. Нині існує великий інтерес до пошуку нових терапевтичних показань для старих ліків. У цьому зв'язку нещодавно було доведено, що різні антибіотики, крім їхньої протимікробної активності, мають антипроліферативний вплив, наприклад, як у разі рапаміцину [Morice MC et al. N Engl J Med 346: 1773-1780, 2002] або неоміцину [Cuevas P. et al. Neurol Res 224: 389-391, 2002]; або застосовуються як транквілізатори, такі як норфлоксацин (фторохінолон) [Johnstone ТВ et al. Nat Med 10; 3132,2004]. Псоріаз є ангіозалежною хронічною хворобою, якою уражено 2-3% населення світу і яка характеризується епідермічною гіперплазією, дермальноепідермальною інфільтрацією запальних клітин та Τ лімфоцитів і дуже вираженим розвитком васкуляризації, разом зі зниженням відмирання клітин через апоптоз [Косак Μ et al. Int J Dermatol 42: 789793, 2003]. На даний час не існує засобу, який дозволяє вилікувати псоріаз. Протипсоріазне лікування може бути місцевим або системним, залежно від поширення та тяжкості хвороби. Найбільш поширений спосіб протипсоріазної місцевої терапії включає застосування різних типів кортикоїдів, але тривале застосування цих сполук є пов'язаним з атрофією шкіри, слідами розтягнень та телеангіектазією [Baker BS, Fry L. Cutis 1999; 64: 315-318]. Системна терапія з застосуванням імунодепресантних засобів викликає дуже важкі побічні ефекти [Wolina V. et al. Clin Rheumatol 2001: 20: 406-410]. Наприклад, застосування циклоспорину для лікування від псоріазу може викликати ниркову токсичність (інтерстиціальний фіброз та тубулярну атрофію), гіпертонію, гіпомагніємію, гіперкальціємію та печінкову дисфункцію [Travis L, Weinberg JM. Drugs of Today 2002; 38: 847-865]. Постійне застосування іншого імунодепресантного засобу для лікування псоріазу, такролімусу, може викликати гіпертонію, ниркову токсичність та пригнічення імунітету [Jegasothy BV et at. Arch Dermatol 1992; 128: 781-785]. Нещодавно було описано, що місцеве нанесення такролімусу прискорює канцерогенез у шкірі мишей [Niwa Y, Terashima T, Sumi Η. Β J Dermatol 2003; 149: 960-967]. Таким чином, існує потреба в нових протипсоріазних сполуках, які виявляють свою ефективність без викликання явних побічних ефектів, таких як ті, що є пов'яза 5 86399 6 ними з найпоширенішими протипсоріазними сподигідроксибензолсульфонова кислота та/або її луками. солі виявили свою здатність до інгібування росту 2,5-дигідроксибензолсульфонова кислота є та міграції і викликання апоптозу в пухлинних кліпохідною 2,5-дигідроксибензойної кислоти, яку тинах in vitro, а також здатність до інгібування ангіфармакологічно застосовують у формі різних соогенезу in vivo, викликаного фактором росту фіблей (головним чином, солей кальцію, калію та магробластів (FGF). Таким чином, завдяки поєднанню нію) і яка забезпечує стійкість. 2,5таких можливостей, вищезгадані сполуки стають дигідроксибензолсульфонову кислоту застосовукорисними для лікування злоякісних пухлин та ють з 70-х років як пероральний васкулотропний гематологічних неопластичних хвороб, а також для засіб. лікування інших важких пов'язаних з васкуляриза2,5-дигідроксибензолсульфонова кислота інгіцією патологій (залежних від судин хвороб). бує агрегацію тромбоцитів, збільшення проникнос2,5-дигідроксибензолсульфонова кислота, реті капілярів та в'язкості крові у пацієнтів з діабетицептована у формі солі, є комерційним продуктом чною ритинопатією [Bayer J. et al. Dtsch. Mod (наприклад, сіль калію можна придбати у Merck Wschr 1980; 46: 160-1608; Banarroch I.S. et al. OphFarma у Quimica SA, Mollet del Valles, Barcelona) з thalmic Res 1985; 17; 131-138; Michal M, Giessinger такою молекулярною формулою: N. Thromb Res 1988; 51: 593-605]. Про метаболізм та фармакокінетику цієї сполуки в людському організмі відомо з 1974 року [Benakis A. et al. Therapie 1974; 29: 211-219]. Останні експерименти довели, що 2,5-дигідроксибензолсульфонова кислота підвищує активність ендотеліальної ізоформи синтази оксиду азоту [ендотеліальна синтаза оксиду азоту (eNOS)] в ендотеліальних клітинах щура без створення цитотоксичних ефектів [Suscheck С. et al. Bt J Pharmacol 1997; 122: 1502-1508]. Крім того, 2,5-дигідроксибензолсульфонова кислота сприяє релаксації артерій статевого члена людини in vitro [Angulo J et al. Br J Pharmacol 2003; 139: 854-862]. Існує експериментальне підтвердження того, що 2,5-дигідроксибензолсульфонова кислота (рецептована у формі солей кальцію або магнію) в якій Met = метал, і η є показником валентномає антиоксидантну активність in vitro [Brunet J et сті металу, що використовується у солі. Зазвичай al. Fundam Clin Pharmacol 12:205-212, 1998]. η дорівнює 1 або 2 для катіона металу, який утвоВ основі даного винаходу лежить виявлення рює сіль, одновалентного (К) або двовалентного нових видів активності 2,5(Са або Mg). дигідроксибензолсульфонової кислоти та/або її Нова біологічна активність 2,5 дигідроксибенсолей, пов'язаної з їх антипроліферативною, прозолсульфонової кислоти не залежить від зв'язку тиміграційною, протиангіогенною та проапоптозкатіона з бензольним кільцем, оскільки 2,5ною здатністю у рухомих клітинах, видів активносдигідроксибензолсульфонова кислота, рецептоваті, які у поєднанні виправдовують застосування на з будь-якою сіллю, має схожий вплив при інгіцієї сполуки як корисної для лікування залежних буванні проліферації міграції та ангіогенезу клітин. від судин хвороб, таких як рак, які характеризуУ цьому винаході описано лише активність 2,5ються гіперпроліферацією, вторгненням клітин та дигідроксибензолсульфонової кислоти, рецептонадмірним ангіогенезом, разом з недостатнім відваної як сіль калію та кальцію, але не слід забувамиранням клітин через апоптоз, без викликання ти, що обсяг цього винаходу охоплює будь-яку токсичності для непухлинних інтактних або неруфармацевтично прийнятну сіль сполуки. Термін хомих клітин. В експериментах використовували "фармацевтично прийнятні солі" включає солі мегліомні пухлинні клітини, оскільки гліоми є дуже талів або адиційні солі, які можуть застосовуваінвазивними пухлинами зі значною ангіогенною тись у фармацевтичних формах. Фармацевтично здатністю та значним дефіцитом апоптозу [Merzak прийнятні солі 2,5-дигідроксибензолсульфонової A, Pilkington GJ. Cancer Metastasis Rev 16: 155-177, кислоти одержують з органічних або неорганічних 1997]. кислот або основ традиційними способами, шляВ основі даного винаходу також лежить довехом піддавання відповідної кислоти або основи дений факт, що 2,5-дигідроксибензолсульфонова реакції зі сполукою. кислота та/або її солі мають, у комбінованій формі, Фармацевтичні композиції, які містять 2,5антипроліферативний, протиангіогенний та проадигідроксибензолсульфонову кислоту, можуть бупоптозний вплив і, таким чином, було оцінено її ти представлені у будь-якій формі, придатній для терапевтичну ефективність у хронічних псоріатичвведення, наприклад, для системного, пероральних бляшках, які характеризуються епідермічною ного, парентерального, уретрального, ректального гіперпроліферацією, гострим дермальним ангіогеабо місцевого застосування, до якої можуть бути незом та дефіцитом апоптозу [Karasek MA, Cutis включені необхідні фармацевтично прийнятні на64: 319-322,1999]. повнювачі для утворення потрібної форми ввеТаким чином, цей винахід стосується нових дення. способів лікування від раку та інших залежних від судин хвороб і ґрунтується на тому, що 2,5 7 86399 8 Представлені нижче приклади пояснюють і менти, детально описані у представленому нижче підтверджують винахід і не повинні розглядатись прикладі: як такі, що обмежують обсяг винаходу. Приклад 2: Пояснювальний аналіз проапоптоПриклад 1: Пояснювальний аналіз антипролізної здатності 2,5-дигідроксибензолсульфонової феративної здатності 2,5кислоти. дигідроксибензолсульфонової кислоти. Цей аналіз здійснювали з клітинами С6 згідно Це in vitro дослідження здійснювали у трьох різ процедурою, описаною у прикладі 1. Для демонзних триразових експериментах з клітинами гліоми страції проапоптозного впливу підданих аналізові щура (С6 line). Клітини культивували у середовисполук авторами було застосовано два різні спощі, яке складалося з DMEM - модифікованого способи, які виявляють внутрішньоклітинну фрагменсобом Дульбекко середовища Ігла (Gibco. Paisley тацію ДНК та апоптозні ядра in situ. UK), 7,5% ембріональної сироватки (Gibco) 10 Виявлення внутрішньоклітинної фрагментації одиниць/мл пеніциліну (Gibco) та 10 мкг/мл стрепДНК. томіцину (Gibco). Культури тримали у вологій атСпособи ферментного імуноаналізу для вимосфері при 37°С. Для оцінки впливу 2,5значення кількості фрагментів ДНК, пов'язаних з дигідроксибензолсульфонової кислоти на пролігістонами, можуть вважатися прийнятними для визначення початку апоптозу [Aragane Y et al. J ферацію клітин 2 ´104 С6 клітин на лунку висівали Cell Biol 1998; 140: 171-182]. Цей спосіб дозволяє у 24-лункові (діаметр 15 мм) планшети. Експеривідрізняти смерть через некроз від смерті через ментальні культури обробляли протягом 48 годин апоптоз, оскільки при некрозі цитоплазматична різними мікромолярними концентраціями (мкМ) мембрана фрагментується, і ДНК виходить у кульсполуки (кальцієвої або калієвої солі 2,5туральне середовище, тоді як при апоптозі фрагдигідроксибензолсульфонової кислоти). Контрольментована ДНК залишається всередині клітини, ні культури жили протягом 48 годин, без додаваноскільки мембрана плазми залишається інтактною ня сполуки. Фотографії культур робили через 48 [Aragane Y et al. J Cell Biol 140: 171-182,1998]. годин, застосовуючи інвертований мікроскоп, а Застосовуючи комплект для виявлення відмипотім культури забарвлювали кристалічним фіолерання клітин ELISAplus (Boehringer Mannheim, товим (Merck Farma у Quimica SA. Mollet del Valles, Mannheim, Germany) згідно з інструкціями виробBarcelona) і обробляли для визначення кількості ника, авторами було визначено фрагментацію ДНК клітин на лунку, застосовуючи спектрофотометрію. у культурах клітин С6 (2 ´ 103) через 4, 16, 24 та 48 Як показано на Фігурі 1, обробка різними концентраціями сполуки викликає залежне від дози інгібугодин. Контрольні культури нічим не обробляли, вання проліферації клітин, з забезпеченням 88% тоді як до експериментальних культур додавали інгібування при концентрації 100 мкМ кальцієвої від 50 до 200 мкМ (Фігура ЗА) калієвої солі 2,5солі 2,5-дигідроксибензолсульфонової кислоти (А). дигідроксибензолсульфонової кислоти. Також При такій самій концентрації калієвої солі 2,5проводили експерименти з додаванням від 25 до дигідроксибензолсульфонової кислоти досягали 100 мкМ кальцієвої солі 2,574% інгібування (В). Показник ІС50 становить блидигідроксибензолсульфонової кислоти (Фігура ЗВ). зько 25 мкМ для кальцієвої солі і від 40 до 50 мкМ Усі експерименти здійснювали по тричі у трьох для калієвої солі. При порівнянні Фігури 1А з Фігурізних експериментах. рою ЇВ спостерігали, що для досягнення такого На Фігурах ЗА та ЗВ показано: а) антипролісамого відсотка інгібування проліферації клітин феративний вплив 2,5після обробки кальцієвою сіллю сполуки для досядигідроксибензолсульфонової кислоти опосередгнення такого самого ефекту необхідна подвійна ковується, головним чином, проапоптозною активконцентрація порівняно з кількістю калієвої солі. ністю; Ь) катіон, зв'язаний з молекулою, не визнаЦе відбувається завдяки тому, що кальцієва сіль чає активності сполуки, оскільки проапоптозний сполуки містить два молі активної складової (2,5вплив є майже однаковим при застосуванні кальдигідроксибензолсульфонової кислоти), які відоцієвої або калієвої солі сполуки; с) найвищий прокремлюються від солі у водному розчині. На Фігурі апоптозний вплив досягається у клітинах, які об2 показано зображення культури клітин С6 через робляли сполукою протягом 48 годин; d) 48 годин без обробки (А), інше зображення відпомаксимальний ефект досягається при концентрації відає культурі клітин С6, які обробляли протягом 25 мкМ для кальцієвої солі і 50 мкМ для калієвої 48 годин концентрацією 50 мкМ кальцієвої солі солі, ідентичний ІС50 У дослідженнях клітинної 2,5-дигідроксибензолсульфонової кислоти (В), а проліферації. Щойно довівши, що антипроліфератретє зображення відповідає культурі клітин С6, тивний механізм 2,5-дигідроксибензолсульфонової які обробляли протягом 48 годин 100 мкМ калієвої кислоти бере участь у відмиранні клітин через солі кислоти (С). Це дослідження показує, що обапоптоз, автори кількісно визначили такий вплив робка сполукою інгібує проліферацію неопластичшляхом мікроскопічного дослідження гліомних них клітин і підтверджує антипроліферативний клітин із застосуванням представленого нижче вплив сполуки, який спостерігали у нормальних способу. судинних клітинах гладенького м'яза, стимульоваВиявлення апоптозних ядер in situ (спосіб них in vitro мітогенними факторами [Pares-Herbute TUNEL) N et al. Int J Angiol 8: S5-S10, 1999]. Для того, щоб Здійснювали три незалежні експерименти, ковизначити, чи є антипроліферативна активність жен з яких повторювали тричі. Клітини С6 з конт2,5-дигідроксибензолсульфонової кислоти опосерольних культур та клітини з культур, які обробляредкованою цитотоксичним або проапоптозним ли протягом 24 годин (50 мкМ та 100 мкМ впливом, авторами було проведено різні експерикальцієвої та калієвої солей, відповідно) приклею 9 86399 10 вали на предметні скельця і фіксували 4% параЩойно було продемонстровано проапоптозформальдегідним буферним розчином (рН 7,4) ний вплив 2,5-дигідроксибензолсульфонової киспротягом однієї години при лабораторній темпералоти, авторами було оцінено здатність цієї сполуки турі. Після цього клітини промивали і піддавали до збільшення антипроліферативного впливу різпермеабілізації 0,1% розчином Triton X-100. Потім них цитостатичних ліків. Представлений нижче клітини промивали перед застосуванням способу приклад демонструє, яким чином 2,5TUNEL [(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)дигідроксибензолсульфонова кислота може підmediated dUTP nick and labeling [Gavrieli Y, вищувати терапевтичну ефективність різних цитоSherman Y, Bensasson SA. J Cell Biol 119: 493-501, статичних сполук, які застосовуються в онкології, 1992]. Застосовували комплект для виявлення таких як цисплатин, вінкристин, паклітаксел та 5апоптозних ядер in situ (комплект для виявлення фторурацил. відмирання клітин in situ від Boehringer Mannheim, Приклад 3: Пояснювальний аналіз здатності Mannheim, Germany). Різні етапи способу викону2,5-дигщроксибензолсульфонової кислоти до повалися згідно з інструкціями виробника комплекту. силення ефективності хіміотерапії І нарешті, клітини забарвлювали зеленим (Fluka, Для цього дослідження автори застосовували AG, Швейцарія). Реакція TUNEL виявляється лише клітини С6, які культивували in vitro за таких самих в апоптозних ядрах. умов, як описано у прикладі 1. їх 103 клітин на лунХоча дуже схожі результати отримували з ку культивували у 24-лункових планшетах. Здійскальцієвою та калієвою сіллю сполуки, яка є об'єкнювали три типи обробки: а) через 24 години після том винаходу, показано лише результати, отримависівання клітини окремо обробляли кожним з нині для калієвої солі сполуки. Клітини підраховуважчезазначених препаратів: цисплатином (5 ли на 6 різних ділянках на дванадцяти скельцях, мкг/мл), вінкристином (0,1 мкг/мл), паклітакселом на які було наклеєно клітини з 6 контрольних куль(5 мкг/мл) та 5-фторурацилом (100 мкг/мл); Ь) четур та 6 культур, оброблених 2,5рез 24 години після висівання клітини разом обродигідроксибензолсульфоновою кислотою (100 бляли 2,5-дигідроксибензолсульфоновою кисломкМ). Загальна кількість неапоптозних та апоптозтою (калієва сіль, 100 мкМ) та кожним з них клітин була такою: нижчезазначених препаратів: цисплатином (5 Нормальні мкг/мл) вінкристином (0,1 мкг/мл), паклітакселом Клітини С6 Апоптозні ядра ядра (5мкг/мл) та 5-фторурацилом (100 мкг/мл); с) під Контрольні час висівання (0-й день) клітини попередньо обро138 5954 клітини бляли 2,5-дигідроксибензолсульфоновою кислоОброблені тою (калієва сіль, 100 мкМ). Наступного дня куль3846 354 клітини тури також обробляли кожним з нижчезазначених Загальна кількість оброблених клітин є нижпрепаратів: цисплатином (5 мкг/мл) вінкристином чою, ніж загальна кількість контрольних клітин че(0,1 мкг/мл), паклітакселом (5 мкг/мл) та 5рез антипроліферативний вплив сполуки. фторурацилом (100 мкг/мл). Контрольні культури Зображення з Фігури 4 показують ділянку ексне піддавали обробці протягом 2 днів. Через 48 перименту контрольної культури (А та В) та іншої годин (2-й день) клітини, які мали форму, ідентичкультури, яку обробляли сполукою (С та D), в якій ну з тими, які використовували у прикладі 1, оцібуло застосовано спосіб TUNEL. Як показано на нювали в усіх культурах. Це дослідження здійснюзображеннях, лише два апоптозні ядра спостерівали у трьох незалежних експериментах, які гали на контрольних клітинах, тоді як у клітинах, повторювали тричі. оброблених сполукою згідно з винаходом, існує Фігура 5 (А, В, С та D) показує гістограми екс107 апоптозних ядер і лише 8 нормальних ядер периментів, які виконували для визначення впливу (неапоптозних). 2,5-дигідроксибензолсульфонової кислоти при Ці дані показують, що 2,5посиленні дії різних цитостатичних препаратів. дигідроксибензолсульфонова кислота є сполукою Лікування цисплатином, вінкристином та 5зі значною проапоптозною активністю, яку викорифторурацилом забезпечує 50% інгібування пролістовують для викликання апоптозу пухлин. Врахоферації клітин С6, тоді як лікування паклітакселом вуючи те, що було доведено, що 2,5забезпечує 67% інгібування клітинної проліферадигідроксибензолсульфонов кислота інгібує апопції. Комбіноване лікування 2,5тоз у нормальних людських клітинах [Braber R. дигідроксибензолсульфоновою кислотою + цитосFarine JC, Lora GA. Apoptosis 4: 4111-49, 1998], ця татичними препаратами (цисплатином, вінкристисполука має потенціал як засіб лікування раку. ном та 5-фторурацилом) забезпечує інгібування Одним з механізмів, через які хіміотерапія та 84% клітинної проліферації. Комбіноване лікуванрадіотерапія виявляються терапевтично невдалиня 2,5-дигідроксибензолсульфоновою кислотою + ми, є неефективність цих способів у викликанні паклітакселом забезпечує 86% інгібування клітинсмерті клітин через апоптоз, головним чином, ченої проліферації. Коли клітинні культури поперерез гіперекспресію протиапоптозних білків у пухдньо обробляють 2,5линних клітинах [Sellers WR, Fisher DE. J Clin Inдигідроксибензолсульфоновою кислотою, а потім vest 104: 1655-1661, 1999; Branch P. et al. цитостатичними препаратами цисплатином, вінкOncogene 19: 3138-3145, 2000]. Таким чином, прористином та 5-фторурацилом, досягається інгібуапоптозні сполуки можуть мати велике клінічне вання 90% проліферації клітин. При застосуванні застосування як ад'юванти при лікуванні шляхом паклітакселу інгібування клітинної проліферації хіміотерапії та радіотерапії. досягає 92%. 11 86399 12 Вищезгадані результати демонструють, що ембріонів обробляють 5 мкл розчину 3 мкг bFGF + одночасне лікування з застосуванням 2,50,1% гепарину, яким просочували нітроцелюлоздигідроксибензолсульфонової кислоти та засобів ний паперовий диск. Після цього шкаралупу герхіміотерапії посилює їх терапевтичну ефективність метично заліплювали парафіновою плівкою. Наі, крім того, цей ефект посилення є вищим, коли ступного дня у половини ембріонів (п =10) клітини є попередньо обробленими 2,5шкаралупу відкривають для повторного просочудигідроксибензолсульфоновою кислотою. Ці дані вання нітроцелюлозного паперового диска 100 підтверджують доцільність застосування 2,5мкМ калієвої солі 2,5дигідроксибензолсульфонової кислоти як ад'ювандигідроксибензолсульфонової кислоти, розчиненої та в лікуванні, пов'язаному з хіміотерапією та рау фізіологічному розсолі (5 мкл). Отвір у шкаралупі діотерапією. знову закривали парафіновою плівкою. На сімнадПриклад 4: Пояснювальний аналіз протиміграцятий день експеримент закінчують, фотографуюційної здатності 2,5-дигідроксибензолсульфонової чи фрагмент нітроцелюлози для порівняльного кислоти дослідження. Цей аналіз здійснювали у трьох різних трираНа Фігурі 8 представлено два зображення, які зових експериментах. Для оцінки здатності 2,5стосуються ембріона, який обробляли 3 мкг bFGF дигідроксибензолсульфонової кислоти до інгібу+ 0, 1% гепарину (А), та іншого ембріона, до якого вання клітинної міграції використовували клітини наступного дня додавали 100 мкМ розчину калієвої солі 2, 5-дигідроксибензолсульфонової кислоти С6 2 ´105, культивовані in vitro у 20 мм планшетах. (В). На Зображенні А показано, яким чином у нітСтерильною мікропіпеткою здійснювали подовжнє роцелюлозний диск проникають кровоносні судипошкодження (0-й день) контрольних культур та ни, тоді як на Зображенні В показано дуже незначкультур, оброблених 100 мкМ калієвої солі 2,5не вторгнення судин у диск. Морфометрична дигідроксибензолсульфонової кислоти. Робили оцінка зображень нітроцелюлозних дисків із застоцифрові фотографії, застосовуючи фотографічну суванням комп'ютерної системи (Moticam Motic. систему, сполучену зі світловим мікроскопом, і Barcelona) показує протиангіогенний вплив сполувизначали межі ділянки пошкодження за допомоки (площа диска, вкрита кровоносними судинами в гою комп'ютерної морфометричної програми ембріонах, оброблених bFGF + гепарином = 35 + (Moticam. Motic. Barcelona). Знову робили фото8,6% порівняно з площею диска, вкритого кровографії через 24 години, і межі пошкодження мітиносними судинами в ембріонах, оброблених bFGF ли, накладаючи перші два фото (0-й день) на + гепарином + калієвою сіллю 2,5отримані через 24 години для розрахунку відсотка дигідроксибензолсульфонової кислоти = 2 + 1,5%; ураженої площі, вкритої мігруючими клітинами. Ці ρΟ,ΟΟΟΙ; непарний t-тест Ст'юдента). Подібних значення було представлено як відсоток регенерезультатів досягали з застосуванням 50 мкМ рації, досягнутої завдяки обробці. Фігура 6 показує кальцієвої солі сполуки. Цей експеримент показує, типовий приклад контрольного експерименту (А) що сполука згідно з цим винаходом має протиангіта іншого експерименту, в якому клітини обробляогенну активність через здатність до нейтралізації ли протягом 24 годин сполукою згідно з винаходом ангіогенного впливу, викликаного bFGF. (В). Як можна побачити на цій Фігурі, необроблені Приклад 6: Аналіз на псоріатичних ушкодженклітини повністю регенеруються у місці пошконях дження (Фігура 6А), тоді як клітини, оброблені споДля цього дослідження автори використовувалукою, не здатні мігрувати та вкривати всю площу ли калієву сіль 2,5-дигідроксибензолсульфонової пошкодження (Фігура 6В). Фігура 7, яка представкислоти, рецептовану в кількості 2,5 та 5% у кремі ляє відсоткові дані всіх експериментів, показує, що для здійснення звичної для такого типу композицій 2,5-дигідроксибензолсульфонова кислота інгібує процедури місцевого лікування шкірних хвороб. до 64% міграції пухлинних клітин. Вибрана концентрація солей 2,5Приклад 5: Пояснювальний аналіз протиангіодигідроксибензолсульфонової кислоти перебуває генної здатності 2,5-дигідроксибензолсульфонової в діапазоні концентрацій, які застосовують для кислоти лікування діабетичних ретинопатій: 6 таблеток на Для цього аналізу автори використовували ходень з 500 мг кальцієвої солі 2,5ріоалантоїсну мембрану ембріона курчати для дигідроксибензолсульфонової кислоти (Benakis A випробування активності протиангіогенних речоet al. Therapie 1974; 29: 211-219). Як водну фазу вин in vivo [Zilberberg L. et al. J Biol Chem 2003; крему, автори використовували дистильовану во278: 35564-35573]. Автори використовували проду. Жирову фазу може складати цетиловий спирт, ангіогенну сполуку, основну форму фактора росту стеариновий спирт або вазелін. Ефективним емуфібробластів (bFGF) [Meghna U et al. Blood 2003; льгатором у приготуванні крему є Span. Хоча оби102: 2108-2114]. дві композиції (2,5 та 5%) продукту виявляються Запліднені яйця тримають в інкубаторі при клінічно ефективними, найкращої терапевтичної 37°С з вологістю 80%. Через 4 дні роблять отвір у переваги досягають при концентрації 5%. Таким найвужчому кінці шкаралупи яйця для забирання 1 чином, автори представляють результати, одермл альбуміну. Після цього отвір закривають паражані з 5% кількістю кислоти у композиції крему. фіновою плівкою (Parafilm Μ Laboratory Film ChiПредставлений нижче приклад пояснює рецептуcago IL. USA). Ця процедура дозволяє створити вання ефективного крему для місцевого лікування повітряну камеру, яка перешкоджає прилипанню псоріазу, і цей приклад не обмежує обсягу винахоембріона до верхньої частини шкаралупи. На 13-й ду. день інкубації шкаралупу розколюють на рівні повітряної камери для здійснення обробки. Двадцять 13 86399 14 І. - Активна частина (калієва сіль 2,5ядро. А та В представляють контрольні клітини, С дигідроксибензолсульфонової кислоти у кількості та D клітини, оброблені 2,55,6%) дигідроксибензолсульфоновою кислотою. ФотоII. - Неактивна частина (як наповнювачі викографії В та D відповідають збільшеному масштаристовували цетиловий спирт (2,5%), стеариловий бові виділених фрагментів з фотографій А та С, спирт (2,5%), рідкий вазелін (30%), білий м'який відповідно. парафін (20%), сорбітолеат (5%) та дистильовану 5. Гістограми, які демонструють посилюючий воду (c.s.p. 100 г). вплив на хіміотерапію (визначений як антипроліКлінічну ефективність лікування оцінювали згіферативний вплив) 2,5дно з покажчиком, який дозволяє кількісно визнадигідроксибензолсульфонової кислоти, з різними чати ознаки десквамації (D), еритему (Е) та інфільцитостатичними сполуками: А) цисплатином (5 трацію (І), до яких застосовують таку оцінку: (0) мкг/мл); В) вінкристином (0,1 мкл/мл); С) паклітаквідсутні; (1) легкі; (2) помірні та (3) важкі [Freeman селом (5 мкг/мл) та D) 5-фторурацилом (100 AK et al. J Am. Acad Dermat 2003; 48: 564-568]. На мкг/мл). Вісь ординат: оптична густина 595 нм; вісь Фігурі 9 показано три зображення: до лікування, абсцис: біла гістограма (контроль); крапчаста (цичерез шість та тринадцять днів після лікування тостатик; день 1); заштрихована гістограма (2,5однієї хронічної псоріатичної бляшки, розташовадигідроксибензолсульфонов кислота + цитостатик; ної у виступаючій ділянці лівого ліктя, обробленої день 1); клітчаста гістограма (2,5калієвою сіллю 2,5-дигідроксибензолсульфонової дигідроксибензолсульфонов кислота (0-й день) + кислоти у кількості 5%. Як можна спостерігати, цитостатик; день 1). місцеве лікування двічі на день із застосуванням 6. Фотографічні зображення клітинної міграції крему, що містить калієву сіль 2,5у контрольному експерименті та інших експеримедигідроксибензолсульфонової кислоти, забезпечує нтах, у яких клітини обробляли 2,5раннє (6 днів) дуже помітне "усунення" бляшки з дигідроксибензолсульфоновою кислотою (В). Конмайже повним зникненням гіперкератозу. Терапетрольні клітини повністю регенерують пошкодженвтична ефективність крему є більш вираженою ня, зроблене в культурі, тоді як міграція клітин, наприкінці другого тижня лікування. Лікування заоброблених 2,5-дигідроксибензолсульфоновою безпечує суттєве зниження загальних значень покислотою, була не здатна повністю відновити ураказника DEI (DEI global pre-treatment = 6 ± 1,57 жену ділянку культури. Горизонтальні лінії обмепорівняно з DEI global post-treatment = l±0,58; жують первісне подовжнє пошкодження, зроблене ρΟ,ΟΟΟΙ; непарний t-тест Ст'юдента). в культурах. Коментарі до фігур 7. Гістограма, яка представляє міграційну зда1. Гістограма, яка показує антипроліферативтність клітин С6 у контрольних культурах (біла ний вплив лікування різними концентраціями (А) гістограма) та культурах, оброблених 2,5кальцієвої та (В) калієвої солей 2,5дигідроксибензолсульфоновою кислотою (чорна дигідроксибензолсульфонової кислоти у культурах гістограма). Міграційну здатність виражено (вісь клітин С6 після 48 годин обробки. Вісь ординат: ординат) як відсоток регенерації (відсоток площі оптична густина при 595 нм; вісь абсцис: концентподовжнього пошкодження, зробленого в культурація: мкМ. рах). 2. Панель А показує вигляд контрольної куль8. Зображення двох ембріонів курчат з 17тури клітин С6 через 48 годин. Панель В показує денною інкубацією. Панель А показує ембріон, зображення культури клітин С6, які обробляли оброблений 3 мкг bFGF + 0,1% гепарину. Панель В протягом 48 годин 50 мкМ 2,5показує вигляд ембріона, обробленого 3 мкг bFGF дигідроксибензолсульфонової кислоти (кальцієва + 0,1% гепарину + 100 мкМ калієвої солі 2,5сіль). Панель С показує культуру клітин С6, які дигідроксибензолсульфонової кислоти. Панель А обробляли протягом 48 годин 100 мкМ калієвої показує протиангіогенний вплив 2,5солі 2,5-дигідроксибензолсульфонової кислоти. дигідроксибензолсульфонової кислоти, оскільки 3. Зразки гістограм, на яких спостерігається, нітроцелюлозний диск, який застосовували як нощо антипроліферативний вплив 2,5сій речовини, майже не має судин. дигідроксибензолсульфонової кислоти зумовлю9. Зображення гіперкератозної псоріатичної ється не некрозом (біла гістограма), а апоптозом бляшки, розташованої у задній ділянці лівого ліктя. (заштрихована гістограма). А: обробка кальцієвою Зображення А представляє вигляд псоріатичної сіллю 2,5-дигідроксибензолсульфонової кислоти. бляшки перед початком лікування. Зображення В є В: обробка калієвою сіллю 2,5виглядом тієї самої бляшки після шести днів лікудигідроксибензолсульфонової кислоти. Вісь ордивання кремом, який містив 5% активного компоненат: оптична густина при 405 нм; вісь абсцис: час у нта калієвої солі 2,5годинах. дигідроксибензолсульфонової кислоти. Зображен4. Зображення гліомних клітин С6, оброблених ня С показує вигляд псоріатичної бляшки після способом TUNEL для виявлення апоптозних клітин двох тижнів лікування калієвою сіллю 2,5in-situ. Апоптозні ядра показано темним кольором, дигідроксибензолсульфонової кислоти у кількості а ядро та цитоплазма неапоптозних клітин показа5%. Цифри, показані на зображенні, означають но світлим кольором. Стрілки показують апоптозне день, у який було зроблено фотографії. 15 86399 16 17 86399 18 19 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков 86399 Підписне 20 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601