Засіб для попередження та лікування хвороб печінки, що містить похідну піразолопіримідинону

1. Інгібітор фіброзу печінки, що містить похідну піразолопіримідинону, представлену наступною хімічною формулою 1, як активний інгредієнт: 2 3 N NH O N O O S 4 5. Фармацевтична композиція для попередження та лікування ускладнення, спричиненого портальною гіпертензією, за п. 4, де ускладнення вибрано з групи, що включає варикоз стравоходу, гіпертрофію селезінки, гіперспленізм, асцит, спонтанний бактеріальний перитоніт, гепаторенальний синдром, гепатопульмонарний синдром або гепатичну енцефалопатію. CH3 O N 86528 N H N CH3 . (1) Даний винахід стосується фармацевтичної композиції для попередження та лікування хвороби печінки, що містить похідне піразолопіримідинону у якості активного інгредієнту, а саме, фармацевтичної композиції для попередження та лікування фіброзу печінки, цирозу печінки, спричиненого фіброзом печінки, портальної гіпертензії та різних ускладнень, спричинених портальною гіпертензією, що містить похідну піразолопіримідинону у якості активного інгредієнту. Печінка виконує більше біохімічних функцій, ніж будь-який інший орган. Вона є важливим органом, крізь який проходять абсорбовані їжа, ліки та інші чужорідні матеріали, також печінка виконує функцію видалення отриманих або утворених токсичних матеріалів після перетворення цих токсичних матеріалів на розчинну у воді форму. Вона звичайно залучена до метаболічних функцій різних органів. Тканини печінки синтезують та запасають незамінні білки, такі як альбумін, для організму людини, та у той самий час, утворюють та виділяють активні матеріали in vivo. Як пояснювалося вище, печінка є важливим органом, що регулює метаболічні функції людини, де відбуваються чисельні хімічні процеси. Встановили, що за короткий період часу в печінці відбувається приблизно 500 хімічних процесів. Гепатоцити є головними функціональними клітинами печінки, та кожний окремий гепатоцит в діаметрі 15-30 мікрон. Печінка людини містить приблизно 250 міліардів гепатоцитів. Пошкодження гепатоцитів призводить до некрозу клітин. Однак, після некрозу гепатоцити регенеруються завдяки їх відмінній уродженій здатності регенеруватися. Однак, повторення некрозу та регенерація викликає фіброз печінки, та, як результат, виникають цироз печінки, портальна гіпертензія та, у зв'язку з ними, ускладнення. Після фіброзу печінки розвивається ряд споріднених хвороб. Фіброз печінки спричиняється накопиченням колагену, фіброгенної речовини в печінці. Клітини печінки складаються з гепатоцитів, синусоїдальних ендотеліальних клітин (SEC), клітин Купера та зірчастих клітин печінки (HSC), та серед цих 4 типів клітин зірчасті клітини печінки відіграють найбільш важливу роль у фіброзі печін ки [American Journal of Physiology. Gastrointestinal & Liver Physiology, 279 (1), G1, 2000]. Зірчасті клітини печінки складають 15% загальної кількості клітин печінки та у нормі виконують функцію зберігання ретиноїду, який є попередником вітаміну А. Однак, як тільки гепатоцити пошкоджуються, клітини Купера починають поглинати пошкоджені гепатоцити та секретувати цитокіни (TGF-бета (транс формуючий фактор росту-бета), PDGF (фактор росту тромбоцитів), FGF (фактор росту фібробластів), HGF (фактор росту гепатоцитів), PAF (фактор активізації тромбоцитів) та ЕТ-І (ендотелін-І)) для проліферації зірчастих клітин печінки. Зірчасті клітини печінки диференціюють на міофібробласти. Міофібробласти синтезують колаген, який накопичується в позаклітинному матриксі та спричиняє фіброз печінки. Це означає, що активація зірчастих клітин печінки відіграє важливу роль у розвитку фіброзу печінки. А саме, активація зірчастих клітин печінки відбувається в три наступних стадії - стадія передзапалення, стадія запалення та стадія післязапалення. На стадії передзапалення пошкодження гепатоциту індукує секрецію ранового гормону, стимулятору проліферації зірчастих клітин печінки або проліферації зірчастих клітин печінки редукуванням аргінази, інгібітору клітинної проліферації. У більшості випадків спирт спричиняє утворення ацетальдегіду або ліпідного пероксиду, що веде до стимуляції експресії гена-матриці. На стадії запалення зірчасті клітини печінки проліферують за допомогою цитокінів (TGF-бета, PDGF, FGF, HGF, PAF та ЕТ-І), що секретуються активованими клітинами Купера та тромбоцитами, які потім диференцюють на міофібробласти, здатні утворювати фіброцити [Seminars in Liver Disease, 16 (4), 357, 1996; Journal of Hepatology, 26(6), 1220, 1997]. На стадії післязапалення цитокіни та фактори росту секретуються цілком диференційованими міофібробластами для активації недиференційованих зірчастих клітинпечінки та секретування позаклітинного матриксу. Міофібробласти, активовані та диференційовані від зірчастих клітин печінки, синтезують колаген, який потім накопичується 5 у позаклітинному матриксі. Мономер колагену дуже нестабільний і легко розкладається при температурі тіла, а розложені мономери полімерізуються та індукують фіброз печінки [American Journal of Physiology, 264 (4 Pt 1), G589, 1993]. Цироз печінки приписують фіброзу печінки, який розвився через полімеризацію колагену, який постійно накопичується, шляхом перетворення накопиченого колагену на нерозчинне волокно. Цироз печінки також може бути індукованим тривалим запаленням в печінці, що супроводжується руйнуванням гепатоцитів, регенерацією та рубцюванням, спричиняється тривалим зловживанням алкоголю, гепатитом, впливом токсичних речовин та подібним. Як результат, розмір печінки зменшується, а поверхня печінки стає нерівною. Тяжкий цироз печінки є важкою хворобою, що спричиняє летальні ускладнення, такі як портальну гіпертензію, геморрагію (особливо у стравоході та шлунку), гепатому, інтоксикацію через накопичення шлаків, кому та подібне [N. Engl. J. Med.350: 1646-1654]. Портальна гіпертензія тісно пов'язана з активацією зірчастих клітин печінки, фіброзом печінки та цирозом печінки. Міофібробласти, диференційовані активацією зірчастих клітин печінки, знижують еластичність гепатоцитів, та тим самим відбувається підвищення внутрішньопечінкової стійкості та розвивається портальна гіпертензія [Semin Liver Dis 2001; 21:337-349]. У відмінності від інших органів тканина печінки характерно має подвійний шлях кровотоку, де артеріальна кров з великою кількістю кислороду протікає у тканину печінки через артерію печінки, а венозна кров, що містить поживні речовини, абсорбовані із шлунку або кишок, протікає крізь портальну вену печінки. Кількість крові, що протікає крізь артерію печінки, складає близько 400мл у хвилину, а кількість крові, що протікає крізь портальну вену печінки, складає близько 1200мл у хвилину, це означає, що 1/4 усієї крові, що протікає у печінку, протікає через артерію печінки, тоді як останні 3/4 протікають через портальну вену печінки. Портальний тиск крові, подібно до іншого венозного тиску, складає тільки близько 1/10 артеріального тиску, та це може легко призвести до розладів у циркуляції крові. Повторення пошкодження та регенерація гепатоцитів шляхом тривалого запалення призводить до накопичення волокнистих матеріалів та розвитку регенераційних вузлів. Регенераційні вузли тиснуть на кров'яне русло в тканині печінки або безпосередньо стискають кров'яний сосуд, спричиняючи порушення циркуляції крові. Оскільки потік крові крізь портальну вену не змінюється, потік крові крізь тканину печінки знижується через розлад у циркуляції крові. Як результат, портальний тиск крові підвищується, спричиняючи портальну гіпертензію. Портальна вена є різновидом вени без антирефлюксного клапану, таким чином, рефлюкс крові може відбуватися будь-який час, коли портальний тиск крові підвищується розладом циркуляції, та потім кров шукає обхід у циркуляції. Як результат, у травному тракті (зокрема стравоході та шлунку) розвиваються колатеральні судини, що, таким чином, 86528 6 спричиняє гіперспленізм. Колатеральні судини звичайно розвиваються на ділянках з низьким тиском, таких як підслизова оболонка стравоходу, передньолатеральна абдомінальна стінка, пряма кишка, тощо, з наступними симптомами варикозу стравоходу, асцитичної рідини, гемороїв та гіпертрофії селезінки. Найбільш загальним ускладненням портальної гіпертензії є варикоз стравоходу, який потребує тиску, щонайменш, 12мм Hg. Приблизно одна третина пацієнтів з цирозом печінки має варикоз стравоходу та шлунку, що складає близько 30% причин смерті [American Family Physician, 55(5), 1851, 1997]. Дотепер, фактори, залучені у кровотечу варикозом стравоходу та варикозом шлунку, повністю не зрозумілі, але, думають, що розмір варикозу пов'язаний з тяжкістю портальної гіпертензії [Pharmacotherapy: a phathophysiologic approach, 1996]. Для лікування портальної гіпертензії, виконали хірургічні операції, такі як видалення селезінки або портокавальний анастомоз для зниження портального кровотоку. Ліки для портальної гіпертензії представлені вазопресином, який звичайно застосовують при гострій варикозній геморрагії, соматостатином, неспецифічним бета-адренергічним блокатором, альфа-адренергічним блокатором та нітратними препаратами. Ці ліки знижують тиск портальної вени шляхом зменшення артеріального потоку крізь печінку. Як результат, весь портальний кров'яний потік до печінки, яка вже важко уражена, далі погіршується. Тому, багато років існує потреба у розробці речовин, які селективно знижують тиск портальної вени. Довели, що інгібітор фосфодіестерази типу-5 (далі назівають як PDE 5), вже відомий у якості активного інгредієнта у лікарському препараті для еректильної дисфункції, також ефективний у лікуванні портальної гіпертензії та пов'язаних з нею хвороб. Наприклад, застосування інгібіторів PDE 5 для попередження та лікування портальної гіпертензії розкрито в РСТ/ЕР2004/006014. А саме, інгібітори PDE 5, силденафіл та варденафіл, мають профілактичні та терапевтичні ефекти на портальну гіпертензію та її ускладнення через зниження портального тиску крові шляхом збільшення діаметру портального кров'яного сосуду та портального потоку крові. Однак, розслаблення портальної вени не означає автоматично збільшення потоку крові крізь печінку та зменшення портального тиску крові, та, фактично, вплив специфічного інгібітора PDE 5 на потік крові крізь печінку та портальний тиск крові є непередбаченим. За більш раннім повідомленням дослідження впливу силденафіла на системну та вісцеральну гемодинаміки на експериментальних моделях цирозу, силденафіл знижує середній артеріальний тиск, спричиняючи системну гіпотензію, та збільшує потік крові крізь мезентерію та залежний від дози портальний тиск крові [Liver International, 24 (1), 63, 2004; Digestive Disease Week, Abs SI 553, 2003]. Таким чином, дослідники, які виконують зазначені експерименти, з'ясували, що потрібні до 7 даткові дослідження для призначення силденафілу пацієнту з цирозом, тому що підвищення портального тиску крові силденафілом може призвести до ускладнень з кровотечею. У випадку цирозу печінки, спостерігали вісцеральне васкулярне розслаблення надпродукуванням локального NO. За цим повідомленням силденафіл посилює ефект NO, що призводить до зниження ангіомезентеріальної тонічності та підвищує портальний потік крові [Liver International, 24(1):63, 2004; Digestive Disease Week, Abs SI 553, 2003]. Більш-менш, метаболічна функція печінки знижується у пацієнтів з хворобою печінки, такою як цироз печінки, портальна гіпертензія і т. і., так що площа під кривою концентрація-час (AUC) та період напіввиведення лікарського препарату збільшуються [Alimentary Pharmacology Therapeutics, 20(1), 29, 2004; Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 25(8), 625, 2003]. Однак, пацієнт з хронічною хворобою печінки потребує тривалого введення та багатьох призначень. Якщо пацієнту призначено лікарський засіб, що має короткий період напіввиведення, це знижує ступінь дотримання пацієнтом режиму лікування та перешкоджає ефективному лікуванню. Тому, провели дослідження за виготовленням лікарського засобу для лікування хронічної хвороби печінки, що проявляє свій фармацевтичний ефект постійно та сприяє дотриманню пацієнтом режиму лікування. Повідомили, що коли синтетичний, подібний соматостатину, октреотид вводили один раз на день як препарат тривалого вивільнення, ефект зниження портального тиску крові був тривалим [Hepatology Research, 19(2), 108, 2001]. Крім того, коли лантреотид тривалого вивільнення вводили один раз на день внутрішньом'язовою ін'єкцією мишам з портальною гіпертензією, індукованою гепатопортальним склерозом, відсрочили периферійну вазодилатацію та надмірну циркуляцію крові, та попередили портальну гіпертензію та вісцеральну конгестию на додаток до портал-системного шунтування [Journal of Hepatology, 31(3), 482, 1999]. Вищезгадані проблеми свідчать про те, що існує потреба у розробці нового лікарського засобу, що може збільшити потік крові через печінку без побічних ефектів, знизити портальний тиск крові та сприяти режиму лікування лікарським засобом з тривалим періодом напіввиведення. Синтезовано нову сполуку, похідну піразолопіримідинону 5-[2-пропілокси-5-(1-метил-2піролідинілетиламідосульфоніл)феніл]-1-метилпропіл-1,6-дигідро-7Н-піразоло(4,3-d)піримідин-7он, та повідомлено про її PDE 5 інгібуючий ефект у попередньому дослідженні [патент Кореї №377782]. Потім, було досліджено похідну піразолопіримідинону, як інгібітора PDE 5, та виконаний даний винахід підтверджує, що похідна піразолопіримідинону має відмінний інгібіторний ефект синтезу колагена, та може посилити режим лікування лікарським засобом пацієнтів з хронічною хворобою печінки, оскільки похідна піразолопіримідино 86528 8 ну має тривалий період напіввиведення та знижує портальний тиск крові. Об'єктом даного винаходу є забезпечення фармацевтичної композиції для попередження та лікування хвороби печінки, що містить похідну піразолопіримідинону як активний інгредієнт. Іншим об'єктом даного винаходу є забезпечення інгібітора фіброзу печінки. Наступним об'єктом даного винаходу є забезпечення фармацевтичної композиції для попередження та лікування цирозу печінки інгібуванням фіброзу печінки. Також об'єктом даного винаходу є забезпечення інгібітора портальної гіпертензії. Іншим об'єктом даного винаходу є забезпечення фармацевтичної композиції для попередження та лікування ускладнень, що утворюються розвитком портальної гіпертензії. Для досягнення зазначених об'єктів даний винахід забезпечує фармацевтичну композицію, що містить похідну піразолопіримідинону у якості активного інгредієнту, для попередження та лікування фіброзу печінки, цирозу печінки, портальної гіпертензії та спричинених ними ускладнень. Нижче даний винахід описаний детально. Даний винахід забезпечує фармацевтичну композицію для попередження та лікування фіброзу печінки, цирозу печінки, портальної гіпертензії та спричинених ними ускладнень, що містить похідну піразолопіримідинону (5-[2-пропілокси-5(1метил-2-піролідинілетиламідосульфонил)феніл]-1метил-пропіл-1,6-дигідро-7Н-піразоло(4,3d)піримідин-7-он), представлену наступною хімічною формулою 1, у якості активного інгредієнту. Хімічна формула 1 Похідна піразолопіримідинону є різновидом інгібітору PDE 5. Він має відмінну активність та селективність інгібітора PDE 5. Похідна піразолопіримідинону швидко абсорбується через її посилену розчинність та має високу біодоступність та значне біорозподілення. Крім того, вона характеризується, щонайменш, у три рази довшим періодом напіввиведення, ніж у силденафіла та варденафіла. Фізико-хімічні властивості похідної піразолопіримідинону наступні: вона нерозчинна у воді, але розчинна в оцтовій кислоті, метанолі та хлороформі. її точка плавлення складає 158-161°С, та вона має значення рKа1 та рKа2 6,5 та 12,5, відповідно. Вона являє собою білий або блідо-жовтий порошок, який не є ані гідратом, ані сольватом. 9 Похідну піразолопіримідинону можна синтезувати наступними трьома етапами, як пояснено нижче. На етапі 1 отримують 4-[2-пропілокси-5(хлорсульфоніл)бензамідо]-1-метил-3-пропіл-5карбамоїл-піразол. А саме, необхідну кількість 4[2-пропілокси-бензамідо]-1-метил-3-пропіл-5карбамоїл піразолу додають до розчину необхідної кількості хлорсульфонової кислоти, охолодженої до 0°С. Суміш збовтують, фільтрують, промивають та сушать для отримання 4-[2-пропілокси-5(хлорсульфоніл)бензамідо]-1 -метил-3-пропіл-5карбамоїл піразолу. На етапі 2 4-[2-пропілокси-5-(1-метил-2піролідинілетил-амідосульфоніл)-бензамідо]-1метил-3-пропіл-5-карбамоїл-піразол отримують зі сполуки піразолу, утвореної на етапі 1 вище. А саме, необхідну кількість 2-(2-аміноетил)-1-метилпірролідину додають при 0°С до розчину дихлорметану, що містить необхідну кількість 4-[2пропілокси-5-(хлорсульфоніл)бензамідо]-1-метил3-пропіл-5-карбамоїл-піразолу етапу 1 з наступним збовтуванням. Після завершення реакції, реакційний розчин розбавляють дихлорметаном. Органічні шари промивають, сушать, концентрують та фільтрують для отримання 4-[2-пропілокси-5-(1метил-2-піролідинілетиламідосульфоніл)бензамідо]-1-метил-3-пропіл-5карбамоїл-піразолу. На етапі 3 5-[2-пропілокси-5-(1-метил-2піролідинілетил-амідосульфоніл)феніл]-1-метил-3пропіл-1,6-дигідро-7Н-піразоло(4,3-d)піримідин-7он, який є похідною піразолопіримідинону за даним винаходом, отримують зі сполуки, отриманої на етапі 2. А саме, необхідну кількість піразольної сполуки, синтезованої на етапі 2, розчиняють в tбутанолі, до якого додають необхідну кількість калію t-бутоксиду, потім нагрівають із зворотним холодильником протягом необхідного часу. Після завершення реакції реакційний розчин охолоджують, розбавляють, промивають та сушать. Потім, дистиляцією при зниженому тиску, елімінацією розчину та колонковою хроматографією на силікагелі отримують нову похідну піразолопіримідинону за даним винаходом. Даний винахід стосується фармацевтичної композиції для попередження та лікування хвороби печінки та описаний наступним чином. 1) Даний винахід забезпечує інгібітор фіброзу печінки. 2) Даний винахід також забезпечує фармацевтичну композицію для попередження та лікування цирозу печінки, яка інгібує фіброз печінки. 3) Даний винахід додатково забезпечує інгібітор портальної гіпертензії. 4) Даний винахід також забезпечує фармацевтичну композицію для попередження та лікування ускладнень, спричинених портальною гіпертензією. Із збільшенням колагену, відкладеному в зірчастих клітинах печінки в печінці, розвивається фіброз печінки. Тоді, клітини печінки, що залишаються між волокнами, починають проліферувати для підтримування функцій печінки з утворенням регенераційних вузлів. Центральна вена печінкової долі стискається таким фіброзом та регенераційними вузлами, що призводить до блокування 86528 10 потоку крові крізь портальну вену в печінку, спричиняючи портальну гіпертензію. Таким чином, портальний тиск крові можна знизити інгібуванням фіброзу печінки. Потік крові крізь печінку можна збільшити із зниженням портального тиску крові та збільшенням портального потоку крові, що призводить до захисту печінки. Як згадано вище, регулювання фіброзу печінки та портального тиску крові тісно пов'язано із захистом печінки. Композиція даного винаходу, що містить похідну піразолопіримідинону у якості активного інгредієнту, може попереджувати розвиток фіброзу печінки інгібуванням синтезу колагену в зірчастих клітинах печінки, має захисний ефект на печінку, може знижувати портальний тиск крові, впливаючи безпосередньо на портальну вену, та збільшувати потік крові крізь портальну вену, усе свідчить, що даний винахід має значний терапевтичний вплив на хронічну хворобу печінки, пов'язану з фіброзом печінки та портальною гіпертензією. Похідна піразолопіримідинону даного винаходу проявляє в 10-16 разів більш значний ефект інгібування синтезу колагену у порівнянні з іншими традиційними інгібіторами PDE 5. Такий значний ефект підтверджує, що похідна піразолопіримідинону за даним винаходом може інгібувати фіброз печінки, спричинений відкладанням колагену в зірчастих клітинах печінки в печінці та захищати печінку (див. Таблицю 1). Крім того, похідна піразолопіримідинону за даним винаходом знижує портальний тиск крові в залежності від дози, але збільшує портальний діаметр та портальний потік крові. На відміну від силденафілу, який, як повідомляли, швидше підвищує портальний тиск крові, похідну піразолопіримідинону за даним винаходом можна ефективно застосовувати для лікування портальної гіпертензії та різних ускладнень, індукованих нею (див. Таблицю 2). Хронічна хвороба печінки включає різні ускладнення, спричинені цирозом печінки, що є результатом фіброзу печінки та портальної гіпертензії [Rubin Farber Pathology, 1999]. Такі ускладнення представлені варикозом стравоходу [American Family Physician, 55(5), 1851, 1997], гіпертрофією селезінки та гіперспленізмом, асцитом, гепаторенальним синдромом [Gastroenterology Vol.120, No.3], спонтанним бактеріальним перитонітом [Curr Opinion In Gastroenterology 2004, 20: 254263], гепатопульмонарним синдромом [Dig Dis Sci 2003, 48: 556-560], енцефалопатією печінки [Neuroreport 2003, 14:2379-2382], подібне. Такі ускладнення детально описані нижче. Варикоз стравоходу означає утворення ненормальних вен у стравоході або шлунку. Коли стан ускладнюється, наступає погіршення, такі вени лопаються та кровоточуть. Високий портальний тиск крові викликає порушення в потоці крові, підвищуючи розмір клітин селезінки, через що розвивається гіпертрофія селезінки, інша причина внутрішньої кровотечі. Асцит служить ознакою абдомінальної водянки. Високий портальний тиск збільшує гідростатичний тиск в плазмі крові та лімфі, що призводить до лімфатичного застою, 11 який викликає відтік вологи в абдомінальну порожнину. Асцит тисне на легеню, спричиняючи ускладнення дихання, а тривалий тиск на легеню навіть викликає летальний сепсіс. Ідіопатичний (аутогенний) бактеріальний перитоніт, також викликаний високим портальним тиском крові, часто спостерігається у пацієнтів з асцитом, на відміну від іншого перитоніту (вторинного перитоніту), який має попередчасну причину, таку як внутрішній ентеророзрив та гастророзрив або травма. Гепаторенальний синдром вказує на серйозне пригнічення нирки цирозом печінки, спричиненим нестійкістю рідини організму. Гепатопульмонарний синдром є хворобою гіпоксії, що спостерігається у пацієнтів з хронічною хворобою печінки, хоча такі пацієнти не мають специфічної хвороби серця або легені. Подібно до цирозу печінки енцефалопатія печінки є іншим тяжким ускладненням, що розвивається при порушенні основної функції печінки в перетворенні аміака, внутрішнього токсичного матеріалу, тим самим вражається нейрональна система та навіть наступає летальна кома. Як пояснювали вище, порушення у циркуляції крові тисне на портальні вени, та тому відбувається рефлюкс крові у портальні вени, таким чином потік крові знаходить обхід, не проходячи крізь печінку. Як результат, колатеральні судини утворюються зокрема на ділянках травного тракту з низьким тиском, таких як ділянки під слизовою оболонкою стравоходу, перед латеральними абдомінальними стінками та в прямій кишці і т.і. Таким чином, похідну піразолопіримідинону за даним винаходом можна ефективно застосовувати як фармацевтичну композицію для попередження та лікування інших зазначених ускладнень шляхом суттєвої супресії підвищеного портального тиску. Фармацевтичну композицію для попередження та лікування хвороби печінки, що містить похідну піразолопіримідинону у якості активного інгредієнту за даним винаходом, можна вводити орально або парентерально, та застосовувати в загальних формах фармацевтичної формуляції. За даним винаходом переважним є оральне введення. Фармацевтичну композицію за даним винаходом можна виготовити для орального або парентерального введення змішуванням із звичайно застосовуваними наповнювачами, добавками, зв'язувачами, засобами, що зволожують, засобами, що дезінтегрують, розріджувачами, такими як сурфактант, або носіями. Тверді формуляції для орального введення являють собою таблетки, пігулки, присипки, гранули та капсули. Такі тверді формуляції готують змішуванням одного або більше придатних носіїв, таких як крохмаль, карбонат кальцію, сахароза, лактоза, желатин та подібне. За виключенням простих носіїв, можна застосовувати засоби, що змазують, наприклад, стеарат магнію, тальк та подібне. Рідкими формуляціями для оральних введень є суспензії, розчини, емульсії та сиропи, та вищезгадані формуляції можуть містити різні носії, такі як засоби, що зволожують, підсолоджувачі, ароматизатори та консерванти на додаток до звичайно застосовуваних простих розріджувачів, таких як 86528 12 вода та рідкий парафін. Формуляціями для парентерального введення є стерильні водні розчини, нерозчинні у воді носії, суспензії, емульсії та супозиторії. Нерозчинні у воді носії та суспензії можуть містити на додаток до активної сполуки або сполук пропіленгліколь, поліетиленгліколь, рослинну олію, таку як маслинову олію, ін'єкційні ефіри, такі як етилоат та подібне. Супозиторії можуть містити на додаток до активної сполуки або сполук, вітепсол, макрогол, твін 61, масло какао, лауринове масло, гліцерожелатин та подібне. Ефективним дозуванням композиції, що містить похідну піразолопіримідинону у якості активного інгредієнту, за даним винаходом, можна визначити за вагою, віком, статтю, станом здоров'я, дієтою, частотою введення, способом введення, виділенням та тяжкістю хвороби. Переважним дозуванням та частотою введення для дорослого є 50~200D на день та один-три або чотири разів на день. Короткий опис графічних матеріалів Фіг.1-4 являють собою набір мікрофотографій, що показують інгібіторні ефекти синтезу колагену за Прикладом 2 даного винаходу, контролю дикого типу (Фіг.1), контролю розчинника (Фіг.2), групи, обробленої силденафілом (Фіг.3) та групи, обробленої похідною піразолопіримідинону (Фіг.4). Переважні варіанти здійснення винаходу Практичні та переважні на теперішній час варіанти здійснення даного винаходу проілюстровані у наступних Прикладах. Однак, буде оцінено, що фахівець в даній галузі на основі даного опису може виконати модифікації та удосконалення у межах та об'ємі даного винаходу. Приклад 1 Дослідження інгібіторного ефекту похідної піразолопіримідинону на синтез колагену із застосуванням зірчастих клітин печінки Наступні експерименти виконали для дослідження ефекту інгібування похідної піразолопіримідинону за даним винаходом на синтез колагену. Зірчасті клітини печінки виділяють у самців білих щурів лінії Спраг Доулі (вагою близько 300г, n=10). Спочатку, роблять ін'єкцію кетаміну в абдомінальну порожнину для анестезії щурів. Живіт розтиняють та роблять ін'єкцію гепарину у портальну вену. Потім, буферний розчин Хенкса, що містить 0,02% пронази та 0,015% колагенази, перфузують крізь печінку необхідний час для препарування печінки на сектори. Виділену печінку здрібнюють у стерильній чашці Петрі, потім поміщають у буферний розчин, що містить проназу та ДНКазу, а потім здрібнену печінку гомогенізують у стерильній чашці Петрі. Підготовлений зразок фільтрують зі 100D нейлонового сита в 50D пробірці. Центрифугують при 50g протягом 2 хвилин для відділення непаренхімних клітин у супернатанті. Центрифугування виконують знову при 450g при 4°С протягом 10 хвилин. Осад флотують у буферному розчині, що містить 25D/D ДНКази, потім центрифугують при 450g при 4°С протягом 10 хвилин, причому повторюють двічі. Фінальний осад флотують в 21D буферного розчину, який потім змішують із 17D 25% OptiPrep для виготовлення фінального розчину 11,2% 13 86528 OptiPrep (1,058г/D). Розчин клітинної суспензії змішують з OptiPrep, обережно розподіляють на чотири 15D пробірки, що містять 3D 17% OptiPrep, до якого додають 1D буферного розчину. Центрифугування виконують при 1400g при 4°С протягом 17 хвилин, та, як результат, отримують чисті зірчасті клітини печінки з непрозорого шару між буферним розчином та 11,8% OptiPrep. Виділені зірчасті клітини печінки суспендують в DMEM (модифіковане Дюльбеко середовище Ігла) з наступним промиванням. Клітини знову суспендують в DMEM, доповненому 10% FBS (ембріональна сироватка бика) та антибіотиками, потім інокулюють в культуральну посудину, яку інкубують при 37°С в 5% CO. Культуральне середовище спочатку заміняють через 24 години, а потім заміняють кожні 48 годин для пересівання. 14 Зірчасті клітини печінки, пересіяні 8 разів, групують по 2´105, які обробляють 25нг/D PDGF (тромбоцитарний фактор росту) протягом 24 годин. У цей час додають похідну піразолопіримідинону, силденафіл та варденафіл при різних концентраціях 0,3, 5 та 10нг/D для реакції. Загальну РНК екстрагують та виконують RT-PCR (Зворотна Транскриптаза - Полімеразна Ланцюгова Реакція) для колагену. Цільовий матеріал порівнюють з іншими аналізованими зразкам за відносною концентрацією до бета-актину. Для визначення інгібіторного ефекту цільового зразка на синтез колагену досліджують інгібіторну концентрацію 50% (ІС50), результат наведений в Таблиці 1. Таблиця 1 Інгібіторний ефект інгібіторів PDE 5 на синтез колагену ІС50 а Похідна піразолопіримідинону 0,8±0,2а Силденафіл 13,1±2,3 Варденафіл 7,8±1,7 Означає ± Стандартне відхилення Як показано в Таблиці 1, ІС50 похідної піразолопіримідинону складала 0,8±0,2нМ, що було у 16 разів та 10 разів більше інгібіторного ефекту на синтез колагену, ніж у силденафіла та варденафіла, відповідно. Тому, підтверджено, що похідна піразолопіримідинону за даним винаходом має більш значний інгібіторний ефект на синтез колагену, ніж інші інгібітори PDE 5, силденафіл та варденафіл, та, відповідно, вона також проявляє значний силденафіл та варденафіл, та, відповідно, вона також проявляє значний інгібіторний ефект на фіброз печінки, утворений від надмірного відкладання колагену, та значний захисний ефект печінки. Приклад 2 Дослідження захисного ефекту печінки похідної піразолопіримідинону із застосуванням тваринної моделі фіброзу печінки Наступні експерименти виконують для дослідження in vivo інгібіторного ефекту на синтез колагену похідної піразолопіримідинону за даним винаходом. Самців білих щурів лінії Спраг Доулі (вагою близько 300г) розподіляють на 4 групи (5 щурів на групу), та індукують фіброз печінки в дослідних групах, за виключенням контрольної групи дикого типу (Toxicology, 2001). DMN (диметилнітрозамін) вводять в абдомінальну порожнину дозою 10мг/кг періодично протягом 2 тижнів з частотою дози три рази на тиждень. Похідну піразолопіримідинону та силденафіл у триазольному буфері (Merch) орально вводять по 10мг/кг/день протягом 2 тижнів (DMN індукуючий період). Контрольній групі вводять тільки триазольний буфер - розчинник. Через два тижні печінку екстрагують, фіксують в 10% нейтральному формаліні, заливають парафіном та нарізають 4m. Кожний сегмент обробляють ксиленом для видалення парафіну, потім обробляють спиртом та 0,1% перекисом водню (Н2О2). Після обробки PBS сегменти обробляють поліклональною антисироваткою (Chemicon) на колаген типу І, розчиненою 1:500, та поліклональною антисироваткою (BioGenesis) на колаген типу III, розчиненою 1:100, при 37°С протягом години. Після промивання зразки обробляють розчиненим 1:200 кон'югованим з біотином антитілом кози до IgG кроля. Імуногістологічне фарбування зразків виконують з авідин-біотиновим комплексом (Vector Laboratories), потім комплекс антиген-антитіло обробляють 3-аміно-9-етилкарбазолом (АЕС), мікроскопічне зображення чого наведено на Фіг.1-4. Контрольну групу обробляють сироваткою неімунізованого коня замість первинного антитіла. Як показано на Фіг.1-4, високий рівень синтезу колагену спостерігають в портальних венах печінки та навколо портальних вен контрольної групи з розчинником у порівнянні з тваринами дикого типу, що вказує на те, що синтез колагену помітно інгібується похідною піразолопіримідинону та силденафілом. Інгібування синтезу колагену в групі, обробленій похідною піразолопіримідинону, більше ніж в групі, обробленій силденафілом. Приклад 3 Дослідження ефекту похідної піразолопіримідинону на тваринних моделях з портальною гіпертензією Наступні експерименти виконують для дослідження ефекту похідної піразолопіримідинону на портальну гіпертензію. 12 собак породи бігль вагою близько 10кг розподіляють на чотири групи (довільновідбирають по 3 собаки на групу) та накладають їм лігатуру жовчних протоків. Через два тижні після операції орально вводять похідну піразолопіримідинону, силденафіл та варденафіл дозою 10D/D/день, а 3 з них вводять тільки розчинник. Протягом 4 годин 15 86528 тваринам не дають їжу, потім внутрішньовенно вводять пентобарбітал для анестезії. Через брижову вену вставляють трубку до портальної вени для вимірювання портального тиску крові. Для вимірювання діаметру портальної вени також виконують доплерівську ультрасонографію. Потік крові крізь портальну вену виміряють, засто 16 совуючи наступну математичну формулу 1, результат наведено у Таблиці 2. Математична формула 1 Швидкість потоку крові = pR2´V´60 (R: діаметр портальної вени/2, V: середня швидкість потоку крові) Таблиця 2 Ефект похідної піразолопіримідинону на портальну гіпертензію Група, оброблена розчинником Тиск портальної вени (kРа) Діаметр портальної вени (мм) Швидкість потоку крові (мл/хвилина) а Група, оброблена похіГрупа, оброблена дною піразолопіримідисилденафілом нону Група, оброблена варденафілом 3,13±0,31а 2,50±0,20* 2,93±0,25 2,87±0,25 7,07±0,15 7,70±0,26 7,47±0,21 7,43±0,21 584,26±159,97 932,31±89,83* 754,47±80,24 729,29±83,23 Означає ± Стандартне відхилення, * Статистично значимий (р