Спосіб одержання біопрепарату “дельтацид” для захисту рослин від хвороб, викликаних фітопатогенними грибами

Реферат: Спосіб одержання біопрепарату "Дельтацид" для захисту рослин від хвороб, викликаних фітопатогенними грибами включає посів клітин бактерій-антагоністів фітопатогенних грибів, культивування їх у поживному середовищі, яке містить в собі всі необхідні мікроелементи, мінеральні солі, вітаміни й стимулюючі добавки, вирощування біомаси на поживному середовищі з одержанням у промисловому варіанті цільового продукту у вигляді суспензії встановленого титру, визначення активності препарату під час пригнічення фітопатогенів на різних сільськогосподарських культурах. Для одержання біопродукту використовують препарат на основі активних штамів бактерій "Pseudomonas aureofaciens" шт. 111 i "Pseudomonas aureofaciens" шт. 306. Культивування штаму-продуцента проводять на збалансованому поживному середовищі з наступним співвідношенням компонентів у кількості г/л: меляса бурякова 20-22 кукурудзяний екстракт 10-12 амоній сірчанокислий 1,0-1,1 калій фосфорнокислий 0,4-0,5 однозаміщений магній сірчанокислий 0,2-0,25 натрію борат 0,003-0,004 марганець сірчанокислий 0,005-0,0055 цинк сірчанокислий 0,004-0,005 залізо сірчанокисле 0,025-0,03 кобальту хлорид 0,0001-0,00015 молібдат натрію 0,0001-0,00015 калію йодид 0,0003-0,00035 трилон В (ЕДТА) 0,008-0,009 вода 1л. Одержання цільового продукту здійснюють у такий спосіб: стерилізують 100г поживного середовища протягом 1,5 години при температурі 120 °C, охолоджують до 30-32 °C, поміщають 10 мл стерилізованого середовища в пробірку, поміщають туди початкову культуру, вирощують UA 90413 U (12) UA 90413 U її протягом 36-40 годин при температурі 26-28 °C, потім стерилізують 10 л поживного середовища протягом 2-х годин при температурі 120 °C, охолоджують до 30-35 °C, визначають титр біомаси, поміщають у міні-ферментер на 50 л, засівають середовище 10 мл біомаси, отриманої в пробірці, вирощують культуру в міні-ферментері протягом 34-36 годин при температурі 30-32 °C при постійному перемішуванні й подачі стерильного повітря, проводять перевірку матеріалу на стерильність, визначають титр біомаси, проводять визначення рН середовища; 10 л напрацьованої біомаси поміщають у стерилізоване поживне середовище того ж складу, розміщене у ферментері на 1 тонну, виконують засів ферментера через посівний штуцер у зоні полум'я. Біомасу вирощують 46-48 годин при температурі 30-32 °C при подачі 10 повітря тиском до 0,8 атм і одержують біомасу з титром 9·10 . У період культивування, для контролю процесу розвитку бактерій в біомасі, з апарата відбирають проби: першу - через 2 години після засіву, другу - наприкінці вирощування культур, третю - через 4 години після закінчення вирощування. UA 90413 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області сільськогосподарської мікробіології, а саме способу одержання бактеріальних препаратів для біологічного захисту рослин, і може бути використаний в мікробіологічній промисловості, а також у дослідницькій практиці. Відомий спосіб одержання препаратів для біологічного захисту рослин на основі штаму бактерій Bacillus Subtilis ЦМПМ В-2895 (див. наприклад, препарат для обмеження поширення й шкідництва збудника сірої гнилі полуниці - Botrytis Cinerca, патент України № 12939). Недоліком даного способу є те, що він використовується як ліофільно висушена маса спороутворюючих бактерій; робоча суспензія препарату, яка призначена для обприскування рослин досить легко седиментується, внаслідок чого рослини нерівномірно покриваються препаратом, крім того, відсутність властивостей прилипання, змочування антиоксидантів є наслідком недостатньої фізичної й біологічної стабільності препарату, що обумовлює його незначний контакт із рослинами. Відомий спосіб одержання препарату для біологічного захисту рослин на основі штаму бактерій Bacillus Subtilis 26 D, на основі якого виготовляють фітоспорин - мікробний препарат проти бактеріальних і грибкових хвороб (див., наприклад, мікробний препарат проти бактеріальних і грибкових хвороб по а.с. СРСР № 1717156). Культура ферментує глюкозу, арабінозу, лактозу, манніт, сахарозу з одержанням кислоти, не розкладає дульцит, дає позитивну реакцію Форрес-Проскауера, гідролізує крохмаль, утилізує цитрат. Культура не росте в анаеробних умовах, не робить індол, сірководень. Штам не патогенний. Значним недоліком даного способу є те, що штам Bacillus Subtilis 26 D інгібує ріст деяких сімбіотичних вільноіснуючих і асоціативних азотофіксуючих бактерій, тобто проявляє бактерицидну або бактеріостатичну дію стосовно деяких виробничих штамів, що ускладнює технологію використання фітоспорину з азотофіксуючими фосфоромобілізуючими біопрепаратами. Недоліком даного біопрепарату є також його висока токсична активність як стосовно патогенної, так і агрономічно дорогої мікрофлори, що ускладнює технологію використання фітоспорину. Відомий спосіб одержання препарату Агат 25 К для підвищення врожаю рослин (див. Патент Російської Федерації № 2111196 від 20.05.98 г.), який містить інактивованні бактерії Pseudomonas aureofaciens шт. Н16 у вигляді пасти. Препарат використовується для обробки насінь і обприскування посівів ячменя, пшениці, цукрового буряка. Він гальмує розвиток кореневих гнилей, септоріоза, фузаріоза, бурої іржі, підвищуючи тим самим урожайність сільськогосподарських культур. Однак цей препарат містить лише один штам бактерій з обмеженим спектром антифунгальної активності, спрямованим проти декількох видів грибних патогенів. Відомий спосіб одержання препарату для біологічного захисту рослин (див. Патент України № 53187А від. 15.01.2003 г. "Спосіб одержання препарату на основі азотофіксуючих бульбочкових бактерій"), який включає вирощування азотофіксуючіх бактерій, підготовку стерильного вермикулітного субстрату-наповнювача, уведення у наповнювач азотофіксуючих бактерій і живильних речовин, вирощування бактерій за відомими технологіями. Одержують 9 титр (5-6)×10 кл/кг. Препарат поліпшує мінеральне харчування сільськогосподарських культур і підвищує їх продуктивність. Однак є й суттєві недоліки такого способу, а саме: вермикуліт, як носій характеризується нестандартністю, нерідко в ньому є токсичні речовини, які є інгібіторами для росту рослин, його доставка й підготовка вимагає додаткових витрат; є проблеми зі стерилізацією самого субстрату, яка потрібна для усунення грибів і бактерій, здатних знизити титр життєдіяльних клітин, суспензія яких змішується зі стерильним носієм. Відомі способи одержання препаратів для біологічного захисту рослин на основі штамів Streptomyces griseovirides ATCC 39271-39273 (див. наприклад, спосіб захисту рослин від зів'янення, викликаного фітопатогенними грибами. Патент СРСР № 1477231- прототип). Даний спосіб ефективний для боротьби з хворобами (чорна ніжка, аскохітоз, сіра гнилизна), що ушкоджують такі рослини як капуста, огірки, салат, суниця, і передбачає одержання біопрепарату шляхом культивування зазначеного штаму на агаровому або рідкому поживному середовищі, що містить солодовий екстракт, дріжджовий екстракт, казеїновий гидролізат, глюкозу або лактозу, агар з наступним культивуванням вихідного продукту на рідкому середовищі в колбах, що періодично струшуються, з наступним витримуванням його без струшування протягом одного тижня, у результаті чого утворюється шар міцелію з виниклими на поверхні середовища повітряними спорами, які декантують, гомогенізують у стерильній воді; суспензію центрифугують, вологу спорову масу зберігають у пластмасових мішках і перед уживанням суспензують у воді. 1 UA 90413 U 5 10 15 20 25 30 35 Недолік даного способу полягає в тому, що застосування мікроорганізмів p. Streptomyces як агентів біологічної боротьби із сірою гнилизною, аскохітозом, чорною ніжкою має ряд технологічних труднощів для нарощування біомаси, пов'язаних з необхідністю застосування дорогих живильних, середовищ у т.ч., тих, що є харчовою сировиною (солодовий екстракт, казеїновий гідролізат, глюкоза або лактоза), необхідністю трикратної обробки; отриманий біопрепарат недостатньо ефективний у боротьбі зі шкідниками, що вражають зернові й зернобобові культури (фузаріозні, гельмінтоспоріозні, кореневі гнилі), виноград (оїдіум, мілдью), плодові культури (борошниста роса, парша). До недоліків зазначеного способу слід також віднести порівняльну тривалість циклу одержання біопродукту, викликану недостатньою збалансованістю поживного середовища, що знижує продуктивність культури, а також виникнення проблем, пов'язаних зі зберіганням спорової маси в пластикових мішках в умовах негативної температури. Крім того, відомо, що представники зазначеної групи мікроорганізмів - стрептоміцети можуть в окремих випадках спричинити захворювання теплокровних. Завданням корисної моделі є одержання у виробничому варіанті необхідної кількості біопродукту, що забезпечує ефективний захист сільськогосподарських культур, у тому числі, зернових, зернобобових, томатів, плодових (яблунь, груш) від грибних бактеріальних хвороб, що не є фітотоксичними й не токсичними для людини, теплокровних тварин, риб. В основу корисної моделі поставлено задачу створення способу одержання у виробничому варіанті з мінімальними енергетичними витратами необхідної кількості біопродукту встановленого титру, що забезпечує захист сільськогосподарських культур (зокрема зернових, зернобобових, томатів, яблунь, груш) від шкідників. Поставлена задача вирішується тим, що в способі одержання біопрепарату "Дельтацид" для захисту рослин від хвороб, що включає посів клітин бактерій-антагоністів фітопатогенних грибків, культивування їх у поживному середовищі, яке містить в собі всі необхідні мікроелементи, мінеральні солі, вітаміни й стимулюючі добавки, вирощування біомаси на поживному середовищі з одержанням у промисловому варіанті цільового продукту у вигляді суспензії встановленого титру, визначення активності препарату при пригніченні фітопатогенів на різних сільськогосподарських культурах, - для одержання біопродукту використовують препарат на основі активних штамів бактерій "Pseudomonas aureofaciens" шт. 111 і "Pseudomonas aureofaciens" шт. 306, які здатні створювати біологічно-активні речовини (БАР) різноманітної природи й специфіки дії в т.ч. з пестицидними властивостями. Вихідні культури шт.111 і шт.306 задепоновані в Депозитарії Інституту мікробіології й вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України; культивування штаму-продуцента проводять на збалансованому поживному середовищі з наступним співвідношенням компонентів у кількості г/л: меляса бурякова 20-22 кукурудзяний екстракт 10-12 амоній сірчанокислий 1,0-1,1 калій фосфорнокислий 0,4-0,5 однозаміщений магній сірчанокислий 0,2-0,25 натрію борат 0,003-0,004 0,005марганець сірчанокислий 0,0055 цинк сірчанокислий 0,004-0,005 залізо сірчанокисле 0,025-0,03 0,0001кобальту хлорид 0,00015 0,0001молібдат натрію 0,00015 0,0003калію йодид 0,00035 трилон В (ЕДТА) 0,008-0,009 вода 1л, а одержання цільового продукту здійснюється в такий спосіб: мелясу бурякову розводять дистильованою водою до досягнення 15 % кількості в розчині, уводять у готовий сироп інгредієнти в такій послідовності: 2 UA 90413 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 кукурудзяний екстракт амоній сірчанокислий калій фосфорнокислий однозаміщений магній сірчанокислий натрію борат марганець сірчанокислий цинк сірчанокислий залізо сірчанокисле кобальту хлорид молібдат натрію калію йодид трилон В (ЕДТА), стерилізують 100 г поживного середовища протягом 1,5 години при температурі 120 °C, охолоджують до 30-32 °C, поміщають 10 мл стерилізованого середовища в пробірку, поміщають туди вихідну культуру, вирощують її протягом 36-40 годин при температурі 26-28 °C, потім стерилізують 10 л поживного середовища протягом 2-х годин при температурі 120 °C, охолоджують до 30-35 °C, визначають титр біомаси, поміщають у міні-ферментер на 50 л, засівають середовище 10 мл біомаси, отриманої в пробірці, вирощують культуру в мініферментері протягом 34-36 годин при температурі 30-32 °C при постійному перемішуванні й подачі стерильного повітря, проводять перевірку матеріалу на стерильність, визначають титр біомаси, проводять визначення рН середовища; 10 л напрацьованої біомаси поміщають у стерилізоване поживне середовище того ж складу, розміщене у ферментері на 1 тонну, виконують засів ферментера через посівний штуцер у зоні полум'я, біомасу вирощують 46-48 годин при температурі 30-3 2 °C при подачі повітря тиском до 0,8 атм і одержують біомасу з 10 титром 9·10 ; у період культивування, для контролю процесу розвитку бактерій в біомасі, з апарата відбирають проби: першу - через 2 години після засіву, іншу - наприкінці вирощування культур, третю - через 4 години після закінчення вирощування. 3 3 Визначення рН біопрепарату здійснюють шляхом розведення його 5 см в 40 см дистильованої води, суспензію розмішують на магнітній мішалці й проводять вимір рН по інструкції до приладу. Дослідним шляхом установлено, що оптимальне нарощування біомаси відбувається при рН 7,3-7,6, в оптимальному інтервалі температур - від 32-35 °C. Техніко-економічна ефективність корисної моделі полягає в підвищенні ефективності технологічності виробництва бактеріального препарату, в одержанні у виробничому варіанті необхідної кількості біопродукту для захисту сільськогосподарських культур від патогенних мікроорганізмів за рахунок раціонального вибору поживного середовища для вирощування 10 біомаси й підвищення її титру до 9·10 , а також використання міні-ферментера і ферментера на проміжній и кінцевих стадіях одержання біопродукту. Новизна способу характеризується використанням як продуцента активних штамів бактерій "Pseudomonas aureofaciens" шт. 111 і "Pseudomonas aureofaciens" шт. 306, здатних створювати біологічно-активні речовини різної природи й специфіки дії, а також уведенням у біопрепарат мікроелементів: цинку, заліза, кобальту, молібдену, які відіграють важливу роль у всіх процесах життєдіяльності рослин: у розподілі клітин, синтезу білків, підвищують активність ферментів, каталізуючих необхідні біохімічні процеси, що підвищують стійкість рослин відносно до хвороб, знімають стрес у рослин після посухи, заморозку, внесення пестицидів, а також уведенням у біопрепарат комплексоутворювача В (ЭДТА). 10 Усе це забезпечило найбільший вихід біомаси з підвищенням її титру до 9·10 і дозволило використовувати те ж живильне середовище на всіх стадіях виробництва біомаси; крім того, використання для засіву й вирощування біомаси на проміжній стадії міні-ферментера замість традиційних колб і качалок, дозволило при кращому перемішуванні середовища повітрям і 10 збільшенні часу її вирощування одержати культуру з необхідним титром 9·10 . Порівняльний аналіз способу, що заявляється, з іншими, відомими з науково-технічної і патентної літератури, дозволяє виявити ознаки, що відрізняють спосіб, який заявляється, від прототипу, що дає можливість авторам зробити висновок про відповідність ознак, які заявляються, критерію "істотні відмінності", що визначає новизну корисної моделі. Базовим показником, по якому йшла оптимізація поживного середовища, був титр препарату при закінченні кожної стадії його одержання. Статистичній обробці підлягала біомаса після вирощування у пробірці, на виході з мініферментера й у процесі вирощування в ферментері. 3 UA 90413 U 5 10 Визначення титру препарату проводили методом, заснованим на підрахунку колоній, що виросли на поживному агарі, при засіві в чашки Петрі суспензії різних концентрацій препарату у вигляді послідовних десятикратних розведень, виготовлених на середовищі МЛА. Склад середовища: пептон, г 10 натрій хлористий, г 5 агар мікробіологічний, г 13 3 м'ясний бульйон, см 1000 рН середовища 7,4 Усі компоненти середовища поміщали в колбу, рН середовища доводили до 7,4 і стерилізували протягом 30 хв. при температурі 120 °C. Із середньої проби препарату готували ряд послідовних розведень за загальноприйнятою методикою. Використовували стерильну дистильовану воду. 3 При проведенні випробувань стерильною піпеткою 1 см суспензії -8 -7 -6 розведень 10 , 10 , 10 був нанесений на поверхню середовища (МПА) трьох чашок Петрі. Засіяні чашки витримували в термостаті при температурі (26+1)°С протягом 20-24 годин. 3 Число життєздатних бактеріальних клітин (Т), млрд/см обчислювали по формулі: T 15 20 a  10n V , де T - титр препарату, до 10/см3 a - число колоній (середнє арифметичне, підрахувавши колонії у трьох чашках Петрі), штук 10 - коефіцієнт розведення n - порядковий номер розведення, з якого сіяли "Дельтацид" V - обсяг суспензії, яку брали для висівання, см3 Приклад 1. Результати визначення титру культури після її вирощування представлено в таблиці 1. Таблица 1 Компоненти поживного середовища г/л Калій Амоній Магній Марганець Меляса Кукурудзяний фосфорноНатрію сірчаносірчаносірчанобурякова екстракт кислий одно борат кислий кислий кислий заіщении 18 7 08 0,3 0,1 0,002 0,0004 22 9 1,0 0,5 0,2 0,0003 0,0005 27 11 1,2 0,7 0,3 0.0005 0,0006 Компоненти поживного середовища г/л Цинк Залізо Кобальту сірчанокислий сірчанокисле хлорид 0,003 0,004 0,006 25 0,02 0,026 0,031 0,0006 0,00012 0,00016 рН Титр, 3 млрд/см 7,4 9·10 3 9·10 2 9·10 2 Молібдат Калію йодид Трилон Б натрію рн 0,0001 0,000012 0,000016 7,4 0,0002 0,0003 0,0004 0,007 0,009 0,01 Титр, млрд/ 3 см 2 9·10 3 9·10 2 9·10 У міні-ферментер проводився засів культурою, вирощеної в пробірці зі співвідношенням 3 компонентів, що забезпечили її вихід з максимальним титром 9·10 . Приклад 2. Результати визначення титру культури після вирощування її в міні-ферментері при різних годинних інтервалах і оптимальній температурі 30 °C представлено в таблиці 2. 4 UA 90413 U Таблиця 2 Поживне середовище Час вирощу3 Титр, млрд/м Кількість, Температура, °C вання, година г/л 10 Меляса бурякова 21 26 9·10 Кукурудзяний екстракт 10 Амоній сірчанокислий 1,0 Калій фосфорнокислий однозаміщений 0,4 Магній сірчанокислий 0,2 Натрію борат 0,003 10 Марганець сірчанокислий 0,005 30 30 9·10 Цинк сірчанокислий 0,004 Залізо сірчанокисле 0,025 Кобальту хлорид 0,0001 Молібдат натрію 0,0001 10 Калію йодид 0,0003 31 9·10 Трилон Б 0,008 Вода 1л РН 7,4 Компоненти 10 5 10 15 20 25 30 35 40 У ферментері проводився засів культури з міні-ферментера з титром 9·10 . У процесі культивування біомаси у ферментері відбиралися проби: перша - через 2 години після засіву, друга - наприкінці вирощування культури, третя - через 4 години після закінчення вирощування. Визначення титру препарату проводилося за вищенаведеною методикою. Величина титру продукту із проби, узятої у ферментері через 2 години культивації, наприкінці її й через 4 години 10 після культивації становила 9·10 . Біопрепарат має наступну характеристику. Зовнішній вигляд, колір і запах препарату "Дельтацид" визначають у момент узяття проб органолептично. "Дельтацид" по зовнішньому вигляду й кольору представляє суспензію темно-коричневого кольору із запахом поживного середовища. Культурально-морфологічні особливості біопрепарату. Біопрепарат вирощений при температурі 30 °C протягом 32 годин на МЛА утворює однорідну суміш і слабкий дрібнодисперсний осад. Перегляд на предметному склі суспензії з добової культури, пофарбованої по Граму (перегляд при збільшенні 15×40 не менш 10 полів зору по діагоналі) показав, що бактерії "Pseudomonas aureofaciens" - добре розвинені грам-негативні, пофарбовані в темно-коричневий колір палички середньої довжини й товщини з округлими полями розміром від 0,4 до 4-9 мк; бактерії добре ростуть на печінково-пептоновому бульйоні й інших середовищах, що мають нейтральну або злегка лужну реакцію (рН 7,3-7,6) в аеробних умовах при температурі 34 °C. Фізіолого-біохімічні характеристики. Факультативний гриб, каталізонегативний, не відновлює нітрити й нітрати, не розріджує желатини, слабко гідролізує ескулін, не утворює аміак з аргеніну, не виживає після прогрівання при температурі 62 °C, росте при температурі від 28 до 50 °C; оптимальна температура росту 35-37 °C, оптимальне рН 7,3-7,6. Як джерело вуглецю використовують мелясу бурякову, як джерело азоту використовують NH4NO3; культура добре росте на концентрованих середовищах, що містять до 20 г/л меляси бурякової, культура резистентна до кисню, не втрачає свою активність при зберіганні біопрепарату тривалий час. Біопрепарат не токсичний для людини, теплокровних, у застосовуваній концентрації не має фітотоксичності, не впливає на запах і смак одержуваної продукції. Після вирощування біопрепарату на культуральному середовищі (МБП із відповідними добавками) протягом 2-х тижнів при температурі 32 °C у термостаті одержують фільтрат і досліджують його токсичність у дослідах на білих мишах вагою 18-20 г. Фільтрат уводять перорально через зонд або внутрішньоочеревинними ін'єкціями. Спостереження за тваринами проводили щодня протягом двох тижнів після закінчення ін'єкції або перорального введення. 5 UA 90413 U 5 10 15 У період спостереження всі тварини були активні, добре поїдали харчові раціони, фізіологічні відправлення в них не порушувалися, поведінкові реакції були звичайними, змін з боку вовняного покриву не відзначалося. Усі піддослідні миші після закінчення строку спостереження були убиті, розітнуті і їх органи піддані мікроскопічному вивченню. Результати розтину показали: серце - звичайної форми й величини, легені в обсязі не збільшені, долі легко відділяються одна від одної, поверхня гладка, спайок не відзначається. Шлунок, петлі тонкого й товстого кишечнику зовні представляються звичайними. При розтині малюнок слизової не змінений. Печінка темно-червоного кольору, середнього наповнення, не збільшена. Долі відділені одна від одної, поверхня гладка. Нирки звичайних розмірів і форми. Поверхні гладкі, на розрізі чіткий малюнок коркової й мозкової речовини. Селезінка не збільшена, щільної консистенції, на розрізі пульпа помірно повнокровна, темно-червоного кольору. Результати дослідження токсичності фільтрату культури "Pseudomonas aureofaciens шт. 111, "Pseudomonas aureofaciens" шт. 306, після росту на середовищі Гауза № 2 представлено в таблиці 3 Таблиця 3 Кількість мишей у досліді 10 10 10 10 20 25 30 35 Доза, мл Шлях уведення 0,5 0,5 0,5 0,5 Внутрішньочеревинне Підшкірно Підшкірно Перорально Курс уведення 1 4 1 4 Занедужало Загинуло Вижило 0 0 0 0 0 0 0 0 10 10 10 10 Таким чином, уведення мишам фільтрату культури "Pseudomonas aureofaciens шт. 111, "Pseudomonas aureofaciens" шт. 306, не викликало у тварин патологічного процесу, який реєструвався клінічно або при мікроскопічному вивченні внутрішніх органів тварин. Наведені дані дають підставу вважати, що біопрепарат "Дельтацид" нетоксичний, тобто не є патогенним для теплокровних тварин. Визначення біологічної активності препарату "Дельтацид". Готують розчин препарату з розрахунку норми витрати на обробку 1 га площі посіву. Частку сільськогосподарської культури із захворюванням поміщають у чашку Петрі, наносять на неї препарат, поміщають в автоклав і витримують у заданій концентрації: - яблуню - протягом 45 годин - пшеницю, жито, овес, ячмінь - протягом 25 годин - помідори, перець - протягом 35 годин Після чого визначають відсоток знищення хвороботворних організмів за певний інтервал часу. "Дельтацид" застосовують методом обприскування сільськогосподарських культур, їх насінь водною суспензією препарату. Приклад 3. Результат знищення хвороботворних організмів за певний інтервал часу представлений в таблиці 4. 6 UA 90413 U Таблиця 4 Культура Об'єкт впливу Яблуня Пшениця Ячмінь Жито Овес 10 Насіння, коренева система, стебло, колосся Томати Перець 5 Деревина, листи Поверхня, коренева система Досліджуваний вид хвороби Норма витрати Час Знищення препарату, обробки, хвороботворних л/га година мікроорганізмів, % Мілдью, Оїдіум сірі плями листу гроноподібна гнилизна Чорна головня, борошниста роса, коренева й стеблова гнилизна, стеблова їржа Фітофтороз, парша, аскохітоз, борошниста роса, чорна ніжка 2,0 2,0 2,5 3,0 0,5 0,5 2,5 3,0 3,0 2,0 84-86 82-85 88-92 86-92 0,5 2,0 2,5 3,0 3,0 90-95 85-86 86-90 85-88 85-88 84-86 88-90 90-94 З таблиці 4 видне, що оптимальними концентраціями біопродукту для максимального знищення хвороботворних мікроорганізмів на різних сільськогосподарських культурах є: - для яблунь - 2,5 л/га - для пшениці, ячменя, жита, вівса - 3 л/га - для томатів, перцю - 3 л/га Як показало тривале спостереження за рослинами, остатня кількість хвороботворних мікроорганізмів, що залишилися при зазначеному часі й числі обробок, не виявляють негативного впливу на величину врожайності наведених сільськогосподарських культур. Приклад 4. Вплив обробки сільськогосподарських культур розчином препарату представлено в таблиці 5. Таблиця 5 Культура Яблуня Пшениця Ячмінь Жито, овес Томати Перець 15 Площа обробки, га 100 Кількість Число обробок препарату, л/га за сезон 3,0 4-5 Підвищення врожайності після обробки препаратом, % 25-28 200 2,5 2 28-35 100 2 5-6 21-26 Таким чином, отриманий пропонованим способом біопрепарат "Дельтацид" дозволяє забезпечити ефективний захист сільськогосподарських культур від патогенних мікроорганізмів, значно підвищити їх врожайність без токсичного навантаження на навколишнє середовище. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 30 Спосіб одержання біопрепарату "Дельтацид" для захисту рослин від хвороб, викликаних фітопатогенними грибами, що включає посів клітин бактерій-антагоністів фітопатогенних грибів, культивування їх у поживному середовищі, яке містить всі необхідні мікроелементи, мінеральні солі, вітаміни й стимулюючі добавки, вирощування біомаси на поживному середовищі з одержанням у промисловому варіанті цільового продукту у вигляді суспензії встановленого титру, визначення активності препарату під час пригнічення фітопатогенів на різних сільськогосподарських культурах, який відрізняється тим, що для одержання біопродукту використовують препарат на основі активних штамів бактерій "Pseudomonas aureofaciens" шт. 111 i "Pseudomonas aureofaciens" шт. 306, культивування штаму-продуцента проводять на збалансованому поживному середовищі з наступним співвідношенням компонентів у кількості г/л: 7 UA 90413 U 5 10 15 меляса бурякова 20-22 кукурудзяний екстракт 10-12 амоній сірчанокислий 1,0-1,1 калій фосфорнокислий 0,4-0,5 однозаміщений магній сірчанокислий 0,2-0,25 натрію борат 0,003-0,004 марганець сірчанокислий 0,005-0,0055 цинк сірчанокислий 0,004-0,005 залізо сірчанокисле 0,025-0,03 кобальту хлорид 0,0001-0,00015 молібдат натрію 0,0001-0,00015 калію йодид 0,0003-0,00035 трилон В (ЕДТА) 0,008-0,009 вода 1л, а одержання цільового продукту здійснюють у такий спосіб: стерилізують 100 г поживного середовища протягом 1,5 години при температурі 120 °C, охолоджують до 30-32 °C, поміщають 10 мл стерилізованого середовища в пробірку, поміщають туди початкову культуру, вирощують її протягом 36-40 годин при температурі 26-28 °C, потім стерилізують 10 л поживного середовища протягом 2-х годин при температурі 120 °C, охолоджують до 30-35 °C, визначають титр біомаси, поміщають у міні-ферментер на 50 л, засівають середовище 10 мл біомаси, отриманої в пробірці, вирощують культуру в міні-ферментері протягом 34-36 годин при температурі 30-32 °C при постійному перемішуванні й подачі стерильного повітря, проводять перевірку матеріалу на стерильність, визначають титр біомаси, проводять визначення рН середовища; 10 л напрацьованої біомаси поміщають у стерилізоване поживне середовище того ж складу, розміщене у ферментері на 1 тонну, виконують засів ферментера через посівний штуцер у зоні полум'я, біомасу вирощують 46-48 годин при температурі 30-32 °C при подачі 10 повітря тиском до 0,8 атм і одержують біомасу з титром 9·10 ; у період культивування, для контролю процесу розвитку бактерій в біомасі, з апарата відбирають проби: першу - через 2 години після засіву, другу - наприкінці вирощування культур, третю - через 4 години після закінчення вирощування. Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8