Пом’якшуюча композиція на основі вазеліну, гліцерину та вазелінового масла

Реферат: Даний винахід стосується пом'якшуючої композиції для місцевого застосування, що містить як активний початок комбінацію гліцерину, вазеліну й вазелінового масла у формі емульсії типу масло-у-воді або вода-у-маслі. Винахід також стосується: її застосування для виготовлення лікарського засобу для лікування станів сухої шкіри, асоційованих з певними видами дерматозу, такими як атопічний дерматит, іхтіозні стани та псоріаз; її застосування для виготовлення лікарського засобу для лікування невеликих поверхневих опіків; та її застосування для виготовлення лікарського засобу для попередження та/або лікування та/або зниження частоти виникнення та інтенсивності загострень екзематозного процесу, спостережуваних у пацієнтів, що страждають від атопічного дерматиту. UA 101035 C2 (12) UA 101035 C2 UA 101035 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі лікування патологій та станів, асоційованих із захисною функцією ураженої шкіри. Епідерміс є шаруватим епітелієм ектодермального походження, що постійно оновлюється. Він захищає організм від зневоднювання, механічних стресів та атак деяких патогенних мікроорганізмів. Він складається з декількох шарів клітин: більш ніж на 90 % з кератиноцитів, але також із клітин Лангерганса, клітин Меркеля та меланоцитів. У напрямку від внутрішнього боку до зовнішнього боку можна розрізнити окремі шари різної морфологічної природи та клітинного складу: базальний шар, що є клітинним шаром, кератиноцити якого мають здатність до дуже сильної проліферації, що забезпечує самовідновлення епідермісу, далі надбазальні шари (зернистий шар, шипуватий шар), та наприкінці роговий шар (SC). Однією з фундаментальних функцій шкіри є забезпечення бар'єра між організмом та зовнішнім середовищем, який перешкоджає, в одному напрямку, проникненню до епідермісу грибків, бактерій та алергенів з навколишнього середовища, і в іншому напрямку - втраті води. Якість захисної функції оцінюють in vivo, у людини шляхом вимірювання відчутної втрати води та швидкості гідратування, а у миші на підставі ембріональної смертності внаслідок зневоднювання, на підставі проникності шкіри для барвників, або за зменшенням маси тіла. Цілісність позаклітинного цементу ліпідної природи, а також усіх клітинних елементів рогового шару, та рівновага між проліферацією й диференціюванням кератиноцитів є істотними для підтримання функціональної захисної функції епідермісу. Градієнт pH регулює активності різних ферментів, і таким чином вносить вклад у рівновагу даного бар'єра. Шляхом регуляції секреції шаруватих тілець у зернистому шарі, концентрація іонів кальцію впливає на склад позаклітинного цементу рогового шару, і таким чином - на рівновагу епідермального бар'єра (Lee et al., Calcium and potassium are important regulators of barrier homeostasis in murine epidermis, J. Clin. Invest., 89, 530-538, 1992). Існування водного градієнта, що змінюється в діапазоні від 70 % у видимих шарах епідермісу до 30 % у нижчих шарах SC, і до 15 % у найбільш зовнішніх клітинних шарах епідермісу (Warner et al., Electron probe analysis of human skin: determination of the water concentration profile, J. Invest. Dermatol., 90, 218-224, 1988) говорить про те, що певна кількість води утримується в місці контакту між зернистим шаром та роговим шаром. Одна з функцій води в роговому шарі полягає у забезпеченні можливості реакцій ферментативного гідролізу, необхідних для еластичності шкіри та нормального відшарування (рогового шару епідермісу). Якщо кількість води, присутньої в SC, зменшується нижче критичного порогу, ферментативні реакції порушуються, що призводить до адгезії корнеоцитів та акумуляції клітин на поверхні шкіри. Це виявляється у помітній сухості та шкірній сверблячці, відшаровуваннях шкіри та лущінні. Гідратування шкіри базується на двох явищах: забезпеченні водою за рахунок трансепідермального потоку з кровотоку, та утриманні води в епідермісі, що задіює захисну функцію шкіри. Однак бар'єр у плані втрати води не є абсолютним. Нормальний рух обмінюваної води між зовнішнім середовищем та внутрішнім середовищем крізь роговий шар називається TEWL (трансепідермальна втрата води), та є частиною невідчутної втрати води. Захисна функція шкіри порушується при більшості шкірних патологій, найпоширеніших у населення, і часто супроводжується запальним компонентом (псоріазом, атопічним дерматитом, іхтіозом, сухістю шкіри і т.д.). Вона також порушується з часом при великій кількості фізіологічних станів (старіння шкіри) або під дією навколишнього середовища (УФ випромінювання, рівень вологості, забруднення, опіки). Порушення захисної функції, хронічне або гостре, робить організм чутливішим до зовнішніх атак та зневоднювання. Це може бути пов'язане з порушенням відшарування та з гіперпроліферацією (Jackson et al., Pathobiology of the stratum corneum, West J. Med., 158, 279285, 1993). Заявка на патент FR 2847467 стосується застосування щонайменше одного модулятора активності оксистерол-7α-гідроксилази для виготовлення косметичної композиції для попередження та/або лікування розладів шкіри та/або слизової, що порушують належне функціонування шкірного бар'єра. Заявка на патент FR 2831443 стосується застосування щонайменше одного екстракту гінгко білоба (Gingko biloba) або маслини європейської (Olea europaea) для виготовлення композиції для поліпшення захисної функції шкіри. Заявка на патент FR 2905857 стосується застосування композиції, що містить екстракт 1 UA 101035 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 м'якоті плода ріжкового дерева для гідратування шкіри та/або захисту шкіри від висихання. Існує необхідність у лікуванні патологій та станів, асоційованих із захисною функцією ураженої шкіри. Авторами винаходу було помічено, що дивним та несподіваним чином комбінація гліцерину, вазеліну й вазелінового масла у формі емульсії типу масло-у-воді або вода-у-маслі може лікувати сухі стани шкіри. Автори винаходу продемонстрували, що ця комбінація відновлює захисний та функціональний стан шкірного бар'єра. Автори винаходу оцінювали зволожуючу активність цієї комбінації та подальше поліпшення захисної функції шкіри, використовуючи модель індукованого зневоднювання шкіри ex vivo. Крім того, вони стежили за експресією молекулярних епідермальних маркерів, потенційно залучених у гомеостаз епідермальної захисної функції, використовуючи кількісну ПЛР та імуногістохімічний аналіз. Крім цього, автори винаходу відслідковували активність серинових протеаз, використовуючи зимографію in situ, та функціональність шкірного бар'єра, використовуючи флуоресцентні зонди. Результати показують, що комбінація гліцерину, вазеліну й вазелінового масла у формі емульсії типу масло-у-воді або вода-у-маслі відновлює активність серинових протеаз та пригнічує стресіндуковане запалення. Автори винаходу також продемонстрували, що конкретно вибір вазеліну у цій комбінації є особливо ефективним для досягнення наведених вище результатів. Вазелін як засіб, що викликає оклюзію, та пом'якшуючий засіб, є особливо важливим у композиції. Дійсно, формуючи захисну плівку на шкірі, він допомагає компенсувати недолік порушеної захисної функції. Якість утвореної на шкірі плівки дуже сильно залежить від реологічних властивостей вазеліну, використовуваного у виготовленні. Таким чином, задачею даного винаходу є композиція для місцевого застосування, що містить як активний інгредієнт комбінацію гліцерину, вазеліну та вазелінового масла у формі емульсії типу масло-у-воді або вода-у-маслі. У контексті даного винаходу "активна комбінація" означає комбінацію гліцерину, вазеліну й вазелінового масла у формі емульсії типу масло-у-воді або вода-у-маслі. Краще, коли гліцерин, вазелін та вазелінове масло задовольняють критеріям, описаним та установленим згідно з "Європейської фармакопеї" 6-го видання. Краще, коли вазелін активної комбінації має температуру краплепадіння від 35 °C до 70 °C, краще, від 51 °C до 57 °C, і ще краще - приблизно 54 °C. Температуру краплепадіння вимірюють відповідно до методу 2.2.17, описаного у "Європейській фармакопеї" 6-го видання. Краще, вазелін активної комбінації має консистенцію від 175 1/10 мм до 195 1/10 мм, краще, приблизно 185 1/10 мм (конусна пенетрація при 25 °C). Краще, вазелін активної комбінації має в'язкість від 4 сСт до 5 сСт при 100 °C, краще приблизно 4,8 сСт при 100 °C. Краще, вазелін активної комбінації характеризується спектром ЯМР (ядерного магнітного 13 -1 резонансу) вуглецю-13 ( C) (500 МГц), що має пік при 24,55 млн , площа якого відносно контролю, 1 %-го тетраметилсилану (TMS), становить 4-8. У композиціях за винаходом частка активної комбінації становить від 10 % до 50 %, і краще від 20 % до 30 % маси, у порівнянні із загальною масою композиції; концентрація гліцерину становить від 5 % до 30 %, краще від 10 % до 20 %, і ще краще - становить приблизно 15 % маси, у порівнянні із загальною масою композиції; концентрація вазеліну становить від 3 % до 20 %, краще від 5 % до 10 %, і ще краще - становить приблизно 8 % маси, у порівнянні із загальною масою композиції, а концентрація вазелінового масла становить від 0,5 % до 5 %, краще від 1 % до 3 %, і ще краще - приблизно 2 % маси, у порівнянні із загальною масою композиції. У водній фазі вода складає від 30 % до 80 % по масі у порівнянні із загальною масою композиції. Краще, композиція за винаходом складається приблизно з 15 % гліцерину, приблизно 8 % вазеліну та приблизно 2 % вазелінового масла по масі у порівнянні із загальною масою композиції. Дерматологічна композиція за винаходом додатково містить стандартні дерматологічно сумісні ексціпієнти. Дерматологічна композиція за даним винаходом може бути виготовлена у вигляді емульсії типу масло-у-воді (W/O) або вода-у-маслі (O/W), у вигляді множинної емульсії, такої як, наприклад, емульсія типу вода/масло/вода (W/O/W) або емульсія типу масло/вода/масло (O/W/O), або також у формі гідродисперсії або ліподисперсії, гелю або аерозолю. Дерматологічно сумісними ексципієнтами може бути будь-який ексціпієнт з ексципієнтів, 2 UA 101035 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відомих фахівцю в даній галузі техніки, для виготовлення композиції для місцевого застосування у формі крему, лосьйону, гелю, мазі, емульсії, мікроемульсії, спрею і т.д. Зокрема, композиція за винаходом може містити домішки та допоміжні речовини до композицій, такі як емульгатори, загусники, гелеутворюючі агенти, вологоутримуючі агенти, агенти, що підсилюють розтікання, стабілізатори, барвники, запашні речовини та консерванти. Придатні емульгатори включають стеаринову кислоту, троламін та ПЕГ-40-стеарат. Краще, композиція за винаходом містить приблизно 5 % емульгатора по масі у порівнянні із загальною масою композиції. Краще, композиція за винаходом містить від 1 % до 5 % стеаринової кислоти, краще, приблизно 3 % мас., у порівнянні із загальною масою композиції. Краще, композиція за винаходом містить від 0 % до 2 % троламіну, краще, приблизно 0,5 % мас., у порівнянні із загальною масою композиції. Краще, композиція за винаходом містить від 0 % до 2 % ПЕГ-40-стеарату, краще, приблизно 0,5 % мас., у порівнянні із загальною масою композиції. Придатні загусники включають гліцерину моностеарат та ПЕГ 600. Краще, композиція за винаходом містить приблизно 5 % загусників по масі у порівнянні із загальною масою композиції. Краще, композиція за винаходом містить від 2 % до 10 % гліцерину моностеарату, краще, приблизно 5 % мас., у порівнянні із загальною масою композиції. Краще, композиція за винаходом містить від 2 % до 10 % ПЭГ 600, краще, приблизно 5 % мас., у порівнянні із загальною масою композиції. Придатні консерванти включають пропіл-парагідроксибензоат та хлоркрезол. Краще, композиція за винаходом містить приблизно 0,1 % консервантів по масі у порівнянні із загальною масою композиції. Краще, композиція за винаходом містить від 0,05 % до 1 % пропіл-парагідроксибензоату, краще, приблизно 0,1 % мас., у порівнянні із загальною масою композиції. Придатні агенти, що посилють розтікання, включають диметикон та полідиметилциклосилоксан. Краще, композиція за винаходом містить приблизно 2 % від маси агентів, що посилюють розтікання, у порівнянні із загальною масою композиції. Краще, композиція за винаходом містить від 0,2 % до 2 % диметикону, краще, приблизно 0,5 % мас., у порівнянні із загальною масою композиції. Краще, композиція за винаходом містить від 1 % до 3 % полідиметилциклосилоксану, краще, приблизно 2,5 % мас., у порівнянні із загальною масою композиції. Придатні вологоутримуючі агенти включають поліетиленгліколь, краще, поліетиленгліколь 600. Краще, композиція за винаходом містить приблизно 8 % вологоутримуючих агентів по масі у порівнянні із загальною масою композиції. Краще, композиція за винаходом містить від 2 % до 10 % поліетиленгліколю, краще, приблизно 5 % мас., у порівнянні із загальною масою композиції. Водою, використовуваною для водної фази емульсії, може бути дистильована або термальна вода, що має дермато-косметичні властивості. У кращому випадку, композиція за винаходом складається з: - приблизно 15 % гліцерину, - приблизно 8 % вазеліну, - приблизно 2 % вазелінового масла, та як ексципієнтів: - приблизно від 1 % до 5 % стеаринової кислоти, - приблизно від 2 % до 10 % гліцерину моностеарату, - приблизно від 1 % до 3 % полідиметилциклосилоксану, - приблизно від 0,2 % до 2 % диметикону, - приблизно від 2 % до 10 % поліетиленгліколю 600, - приблизно від 0 % до 2 % троламіну, - приблизно від 0,05 % до 1 % пропіл-парагідроксибензоату, - до 100 % води. Крім того, задачею даного винаходу є застосування композиції за винаходом для виготовлення лікарського засобу для лікування станів сухої шкіри, асоційованих з певними видами дерматозу, такими як атопічний дерматит, іхтіозні стани та псоріаз. Задачею даного винаходу також є застосування композиції за винаходом для виготовлення лікарського засобу для лікування невеликих поверхневих опіків. Крім того, задачею даного винаходу є застосування композиції за винаходом для 3 UA 101035 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виготовлення лікарського засобу для попередження та/або лікування та/або зниження частоти виникнення та інтенсивності загострень екзематозного процесу, спостережуваних у пацієнтів, що страждають від атопічного дерматиту. Даний винахід проілюстрований прикладами, які наведені далі. Графічні матеріали Фіг. 1: спектр ЯМР вуглецю-13 (500 МГц) для 5 г зразка вазеліну Syntadex A (Synthéal) та композиції A. ПРИКЛАДИ Приклад 1. Композиції Композиція A - 15 г гліцерину, - 8 г вазеліну, - 2 г вазелінового масла, - 0,5 г троламіну, - та як ексципієнти: стеаринова кислота, гліцерину моностеарат, полідиметилциклосилоксан, диметикон, поліетиленгліколь (ПЕГ) 600, пропіл-парагідроксибензоат, - вода до 100 г. Композиція A' - 15 г гліцерину, - 8 г вазеліну, - 2 г вазелінового масла, - 1,5 г стеаринової кислоти, - 5 г гліцерину моностеарату, - 1,5 г полідиметилциклосилоксану, - 0,5 г диметикону, - 5 г поліетиленгліколю 600, - 0,15 г троламіну, - 0,1 г пропіл-парагидроксибензоату, - вода до 100 г. Композиція B - 15 г гліцерину, - 8 г вазеліну, - 2 г вазелінового масла, - 0,5 г ПЕГ-40-стеарату, - та як ексципієнти: стеаринова кислота, гліцерину моностеарат, полідиметилциклосилоксан, диметикон, поліетиленгліколь 600, хлоркрезол, - вода до 100 г. Композиція B' - 15 г гліцерину, - 8 г вазеліну, - 2 г вазелінового масла, - 3 г стеаринової кислоти, - 5 г гліцерину моностеарату, - 2 г полідиметилциклосилоксану, - 0,5 г диметикону, - 0,1 г троламіну, - 3 г поліетиленгліколю 600, - 0,5 г ПЕГ-40-стеарату, - 0,075 г хлоркрезолу, - вода до 100 г. Приклад 2: Аналіз регуляції індукованого зневоднювання шкіри Тут автори винаходу оцінюють зволожувальну активність композиції A і подальше поліпшення захисної функції шкіри, використовуючи модель індукованого зневоднювання шкіри ex vivo. Автори винаходу спостерігають за експресією різних молекулярних епідермальних маркерів за допомогою кількісної ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) та імуногістохімічного аналізу. Крім цього, автори винаходу відслідковують активність ферментів - серинових протеаз, використовуючи зимографію in situ, і деградацію десмосомальних білків рогової оболонки, використовуючи вестерн-блотинг. Функціональність шкірного бар'єра аналізують, використовуючи флуоресцентні зонди. 4 UA 101035 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Матеріали та методи I. Моделі тканини 1. Підготовка експлантатів шкіри Лабораторія отримує зразки шкіри з відходів після операцій пластичної хірургії (по зменшенню молочної залози). Використання цих зразків підпадає під "Декларацію про діяльність з консервації та препарування елементів людського тіла для потреб наукової програми групи П'єра Фабра" ("the declaration of an activity for preserving and preparing elements of the human body for the needs of a research program of the Pierre Fabre group"), затверджену міністерством вищої освіти та наукових досліджень Франції. Ці зразки промивають шляхом 10 промивань PBS, і потім за допомогою штампувального преса вирізують диски діаметром 2 см. Експлантанти шкіри розстелюють на сітці в чашці Петрі та, щоб обмежити площу оброблення, на шкіру накладають кільце діаметром 1 см. 2. Кінетики моделей Для індукування моделі зневоднювання шкіру висушують протягом 2 годин у витяжній шафі для клітинних культур у чашці без кришки, і потім поміщають до інкубатора на 2 години для місцевого оброблення у присутності, або за відсутності, активної комбінації. Негативний контроль зневоднювального стресу піддають такій самій кінетиці у закритій чашці Петрі. 3. Зразки для аналізу Після оброблення відбирають 2 зразка біоптату діаметром 6 мм для аналізу експресії РНК, а біоптат діаметром 4 мм поміщають до полімерного блоку Tissue Tek (Sakura Finetek) для гістологічного дослідження. Для аналізу білків шкіру піддають тепловому шоку у водяній бані при 60 °C протягом 5 хвилин, і потім у бані при 4 °C протягом 2 хвилин, щоб відокремити епідерміс від дерми. Біоптати й зразки епідерміса заморожують у рідкому азоті та зберігають при -80 °C до проведення аналізу. II. Аналіз транскриптому за допомогою кількісної ПЛР Шкірні біоптати подрібнюють у ступці, заздалегідь охолодженій рідким азотом, і РНК екстрагують, використовуючи набір RNeasy (QIAGEN) відповідно до рекомендацій постачальника. Потім РНК аналізують із використанням Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) на РНК-чипах 6000 Nano LabChip. кДНК отримують з 1 мкг РНК шляхом ферментативної реакції ретротранскрипції, що проводиться з використанням набору Access RT-PCR Core Reagents (Promega) з оліго-dT-праймерами. Рівні експресії генів аналізують шляхом кількісної ПЛР у флуоресцентному термоциклері iCycler iQ (Biorad), використовуючи набори для ПЛР iQ з барвником супермікс зеленим SYBR (Biorad), відповідно до протоколу з 40 циклів, що включають денатурацію при 95 °C (15 с) та елонгацію при 60 °C (1 хв). Накопичення продукту ПЛР, пропорційне емісії флуоресценції (інтеркалюючий барвник SYBRGreen), спостерігають цикл за циклом, використовуючи програмне забезпечення iCycler. Аналітичне програмне забезпечення iCycler, версія 3.1, видає наближені величини CT (порогового циклу) - циклу, з якого починається реєстрація ампліфікації кДНК. Паралельно виконують аналіз експресії декількох генів порівняння, використовуючи програму Genorm, версію 3.4, що дозволяє відібрати найстабільніший ген порівняння для кожного зразка. Потім цей ген використовують як порівняння для нормування результатів, розраховуючи CT=CT гена, що становить інтерес - CT гена порівняння. Потім розраховують фактор індукції (IF) для кожної обробки порівняно з відповідним -CT контрольним станом. IF=2 , де CT=CT після обробки - CT контролю. Експресію мРНК оцінюють у двох повторах для п'яти експериментів для 5 різних індивідуумів. Якщо фактор індукції порівняно з контролем становить більше 2, вважається, що експресія гена є індукованою, а якщо менше 0,5, то вважається, що експресія є репресованою. Вплив активного начала на відповідь на стрес, викликуваний у моделі, оцінюють як відсоток інгібування, розрахований за такою формулою: (% інгібування відповіді на стрес) = 100((((IF після стресу) - (IF контролю за відсутності стресу)) - ((IF після обробки) - (IF контролю за відсутності стресу)))/((IF після стресу) - (IF контролю за відсутності стресу)). У рамках досліджуваної моделі стан "контроль за відсутності стресу" відповідає контролю за відсутності сушіння; стан "після стресу" відповідає шкірному біоптату, який сушили протягом 2 годин, і який потім перебував 2 додаткових години в умовах контролю (тобто без місцевого оброблення); і нарешті стан "після обробки" стосується шкіри, яку протягом 2 годин піддавали сушінню, потім протягом 2 годин місцевій обробці пом'якшуючим засобом. III. Аналіз білкової експресії вестерн-блотингом Піддані обробці зразки епідермісу подрібнюють у ступці, охолодженій рідким азотом, і білки 5 UA 101035 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 екстрагують у лізуючому буфері RIPA (50 мМ Трис HCl, pH 8; 150 мМ NaCl; 1 % Тритону X 100; + 1 % дезоксихолату Na ; 0,1 % SDS (додецилсульфату натрію); 5 мМ EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота); 100 мМ DTT (дитіотриїт); коктейль інгібіторів протеаз (P8340, SIGMA). Потім білки аналізують, використовуючи метод аналізу білків у присутності відновлювальних агентів та детергентів (RC-DC Protein Assay) (Biorad), і аналізують вестерн-блотингом. Для кожного стану на гелі (7,5 %-й поліакриламід, трис-гліцин) наносять по 25-40 мкг загального білка. Суміш білків розділяють електрофорезом, використовуючи систему Mini Protean II (Biorad), і білки переносять на мембрану PVDF (полівініліденфторид) (Hybond-P, Amersham). Білок, що становить інтерес, виявляють, використовуючи специфічне до нього антитіло й набір ECL+ (Amersham). Кількість білків і частку деградованої форми обчислюють, використовуючи програмне забезпечення Image Master TotalLab, версію 1.11 (Amersham) після нормування на βактин (білок порівняння). IV. Гістологічні методики Шкірні біоптати розрізають, використовуючи кріотом (Leica CM 3050s), на зрізи товщиною 5 мкм, і поміщають на предметні стекла для вивчення (Starfrost). 1. Імуногістохімічний аналіз Кріозрізи фіксують протягом 10 хвилин в ацетоні при 20 °C, і потім регідрують PBS перед проведенням аналізу за допомогою імуногістохімічного мічення. Після фіксації та регідрування проводять насичення шкірних зрізів 3 %-м розчином BSA (бичачого сироваткового альбуміну) та інкубують протягом 1 години з первинним антитілом до білка, що становить інтерес. Далі їх інкубують протягом 1 години з вторинним антитілом, кон'югованим із флуорохромом Alexa-488 або Alexa-555, і остаточно закріплюють у мовіолі (Mowiol), що містить DAPI (4',6-діамідино-2феніліндол) для мічення ядер. 2. Зимографія in situ Після фіксації протягом 10 хвилин в ацетоні при -20 °C зрізи промивають у промивному розчині (1 % Твін 20 у воді) та інкубують протягом 2 годин при 37 °C з розчином, що містить специфічний субстрат ферментів, що становлять інтерес, кон'югований з флуорофором (вторинний). Коли фермент активний, флуорофор відщеплюється, випускаючи сигнал флуоресценції, який можна спостерігати під мікроскопом. Потім мічені предметні стекла розглядають під мікроскопом з епіфлуоресценцією (Nikon Eclipse 50i) або під інвертованим конфокальним мікроскопом Zeiss Axiovert 100. 3. Флуоресцентний зонд Після зневоднювального оброблення експлантати шкіри додатково інкубують протягом двох годин в інкубаторі при 37 °C із флуоресцентним зондом дилітієвою сіллю карбокси-гідрозиду люциферового жовтого барвника (Invitrogen) у концентрації 1 мМ у буфері HBSS (збалансований сольовий розчин Хенка). Після цього шкіру промивають у ванночці з HBSS протягом 1 хвилини, й потім відбирають зразки біоптатів діаметром 4 мм, і поміщають до маси, що полімерізується, Tissue Tekr (Sakura Finetek) (Matsuki et al., 1998). Потім шкіру розрізають на секції, ядра забарвлюють за допомогою DAPI і предметні стекла розглядають під флуоресцентним мікроскопом з довжиною хвилі 450 нм, як описано вище. Результати I. Модель порушення захисної функції індукованим висушуванням 1. Вимірювання проникності шкіри з використанням флуоресцентного зонда Перший аналіз полягав у вивченні фундаментального функціонального параметра захисної функції шкіри: проникності верхніх шарів епідерміса. Інкубація шкіри з флуоресцентним зондом (люциферовим жовтим) після експерименту з висушуванням дозволила охарактеризувати зміни проникності шкіри. Для контрольного стану включення мітки є дуже слабким та поверхневим; зонд слабко проникає крізь роговий шар та видаляється під час промивання. Після двох годин висушування включення мітки спостерігається у глибших шарах рогового шару. Висушування робить шкіру більш проникною; її захисна функція погіршується. Місцеве оброблення композицією A після двох годин висушування відновлює непроникність SC для зонда; включення мітки знову слабке й поверхневе, як і для контрольного стану. Тому можна зробити висновок, що зволожуюча обробка виявляє відновлюючий ефект на висушену шкіру та на захисну функцію шкіри, спостережувану в даній моделі тканини. 2. Вплив на регуляцію транскриптому та протеому Експресію різних генів, потенційно залучених у гомеостаз епідермальної захисної функції, вимірювали з використанням кількісної ПЛР у різних стресових станах або при різній обробці в моделі сушіння. Імуногістохімічний аналіз показав наявність перебудови експресії деяких білків у плані локалізації, наприклад, білків міжклітинних контактів. Аналіз деградації десмосомальних 6 UA 101035 C2 5 білків рогової оболонки проводили, використовуючи вестерн-блотинг. Мішені, досліджені з використанням цих різних підходів, поєднували в групи відповідно до їх фізіологічної ролі (див. Таблицю 1). Ціль цього дослідження полягає у виявленні спостережуваної відповіді на стрес, та корекції даного ефекту стресу шляхом місцевого застосування композиції A. У виконаній роботі також продемонстровані різні рівні регуляції певних мішеней. Таким чином, відзначається, що ферменти, які обумовлюють відшаровування, не регулюються на рівні транскрипції, а конкретніше, регулюються на рівні їх активності (порівн. Результати 3). 10 Таблиця 1 Короткий опис мішеней та фармакологічної відповіді, дослідженої у моделі з висушуванням Y = так; мішень дає відповідь у моделі, N = ні; мішень не дає відповіді у моделі. Об'єкт Проникність шкіри Десмоглеїн 1 CDSN (корнеодесмозин) Десмоколін Плакоглобін KLK5 (калікреїн 5) KLK7 KLK8 Серинові протеази Катепсин D ABC A12 (АТФ-зв'язувальна касета, член 12 підсімейства A) ABC G1 (АТФ-зв'язувальна касета, член 1 підсімейства G) B-GC DES 2 Філагрин Інволюкрин TG1 TG3 Каспаза 14 Elox-3 (епідермальна ліпоксигеназа 3) 12R-LOX (12R-ліпоксигеназа) HAS 2 CD44 (фактор діференціювання 44) AQP3 (аквапорин 3) NHE1 (Na+/H+ обмінник типу 1) IL-1α (інтерлейкін-1a) Оклудин Клаудин 1 Клаудин 4 ZO-1 (zonula occludence-1) E-Кадгерин β-Катенін Y Y N Y Y Y N N Y N Відповідь на стрес у присутності композиції A Y Y N Y N N N N Y N Y Y N N N N Y N N N N N N Y N N N N Y N N N Y N N N Y Y Y Y Y Y N N N Y Y Y Y Y Y N N N Відповідь на стрес 3. Вимірювання ферментативної активності, що має відношення до відшаровування Активність серинових протеаз оцінювали з використанням зимографії in situ на моделі зневоднювання, й спостерігали з допомогою конфокального мікроскопа у контрольному стані 7 UA 101035 C2 5 10 15 20 25 після двох годин висушування, та після двох годин висушування з подальшою інкубацією з композицією A протягом двох годин. Включення мітки є найбільш інтенсивним у контрольному стані; воно відповідає нормальній сильній активності. Це включення мітки зменшується й стає нерівномірним уздовж рогового шару після двох годин висушування, у той час як його інтенсивність посилюється та локалізація активності перетворюється після двох годин інкубації з композицією A. Висушування впливає на зменшення та порушення ферментативної активності. Ці результати узгоджуються зі зменшенням деградації десмосомальних білків рогової оболонки, спостережуваної при висушуванні, і підтверджують вплив висушування на зменшення відшаровування, спостережуване у розробленій моделі. Композиція A є здатною відновлювати ферментативну активність зневодненої шкіри, що підтверджує вплив цієї композиції на відновлення гомеостазу відшаровування. Ці результати показують, що застосування композиції A відновлює рівень експресії молекулярних мішеней, експресія яких підвищується під дією стрес-індукованого зневоднювання шкіри. За допомогою композиції A також можливе відновлення активності серинової протеази. Крім того, місцеве застосування композиції A дозволяє усунути стресіндуковане запалення. В цілому ці результати дозволяють припустити, що композиція A при місцевому застосуванні відновлює захисну функцію шкіри, обмежує… Приклад 3. Характеристика вазеліну Syntadex A методом ЯМР 5 г зразка солюбілізують у дейтерованому хлороформі для вимірювання методом ЯМР вуглецю-13 (500 МГц). Вазелін Syntadex A (Synthéal) демонструє характерний спектр ЯМР вуглецю-13 (500 МГц), -1 який, зокрема, має пік при 24,55 млн , площа якого відносно контролю 1 %-го тетраметилсилану (TMS) становить 4-8. Такий саме аналогічний пік виявлений у композиції A. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 35 40 45 50 55 60 1. Композиція для місцевого застосування, що містить як активний інгредієнт комбінацію гліцерину, вазеліну й вазелінового масла у формі емульсії типу масло-у-воді або вода-у-маслі, де вазелін має температуру краплепадіння від 51 °C до 57 °C, консистенцію від 175 1/10 мм до 195 1/10 мм (конусна пенетрація при 25 °C) та в'язкість від 4 сСт до 5 сСт при 100 °C. 2. Композиція за п. 1, де вазелін характеризується спектром ЯМР-спектроскопії вуглецю-13 (500 -1 МГц), що має пік при 24,55 млн , площа якого відносно контролю 1 % тетраметилсилану (TMS) становить від 4 до 8. 3. Композиція за п. 1 або 2, де вазелін має температуру краплепадіння 54 °C. 4. Композиція за будь-яким з пп. 1-3, де вазелін має консистенцію приблизно 185 1/10 мм (конусна пенетрація при 25 °C). 6. Композиція за будь-яким з пп. 1-5, яка містить приблизно 15 % гліцерину, приблизно 8 % вазеліну та приблизно 2 % вазелінового масла. 7. Композиція за будь-яким з пп. 1-6, яка містить один чи більше ексципієнтів, вибраних з групи, що складається зі стеаринової кислоти, гліцерину моностеарату, полідиметилциклосилоксану, диметикону, поліетиленгліколю 600, троламіну, пропіл-парагідроксибензоату, хлоркрезолу, ПЕГ40-стеарату, дистильованої води. 8. Застосування композиції за будь-яким з пп. 1-7 для виготовлення ліків для лікування станів сухої шкіри при певних видах дерматозу, таких як атопічний дерматит, іхтіозні стани та псоріаз. 9. Застосування композиції за будь-яким з пп. 1-7 для виготовлення ліків для лікування невеликих поверхневих опіків. 10. Застосування композиції за будь-яким з пп. 1-7 для виготовлення ліків для попередження та/або лікування, та/або зниження частоти виникнення й інтенсивності загострень екзематозного процесу, спостережуваних у пацієнтів, які страждають від атопічного дерматиту. 11. Застосування вазеліну з температурою краплепадіння від 51 °C до 57 °C для виготовлення композиції для місцевого застосування, що містить як активний інгредієнт комбінацію гліцерину, вазеліну й вазелінового масла у формі емульсії типу масло-у-воді або вода-у-маслі. 12. Застосування вазеліну, який характеризується спектром ЯМР-спектроскопії вуглецю-13 (500 -1 МГц), що має пік при 24,55 млн , площа якого відносно контролю 1 %-го тетраметилсилану (TMS) становить від 4 до 8, для виготовлення композиції для місцевого застосування, що містить як активний інгредієнт комбінацію гліцерину, вазеліну й вазелінового масла у формі емульсії типу масло-у-воді або вода-у-маслі. 8 UA 101035 C2 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9