Засіб для зменшення концентрації глюкози в крові і фармацевтичний препарат на його основі

1. Применение антиэстрогенного 2-фенил-3ароилбенз[b]тиофена общей структурной формулы C2 (54) ЗАСIБ ДЛЯ ЗМЕНШЕННЯ КОНЦЕНТРАЦIЇ ГЛЮКОЗИ В КРОВI I ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ ПРЕПАРАТ НА ЙОГО ОСНОВI 34441 вы. Как таковые, длительные сахарные диабеты, даже при лечении инсулином, приводят к слепоте. Известны два типа диабетов. Диабеты I типа являются юношескими, связаны с кетозом, развиваются в ранний период жизни, имеют тяжелые симпто мы и в близкой перспективе поражение сосудов. Регуляция такого ти па диабетов затруднена и требует экзогенного введения инсулина. Сахарные диабеты ти па II свойственны взрослым, устойчивы к кетозу, развиваются в поздний период жизни, проте кают мягче и более медленно. Один из наиболее значительных успехов в истории медицинской науки пришел в 1922 году, когда Бэнтинг и Бест продемонстрировали терапевтические эффекты инсулина на больных диабетом собаках. Однако, даже сегодня ясная картина основных биохимических нарушений, вызванных заболеванием, не ясна и диабеты остаются важной проблемой медицины. Полагают, что 2% населения США поражено разными формами диабета. Пероральное введение гипогликемических средств ста ло важным достижением в лечении гипергликемии. Пероральные гипергликемические средства обычно используют для лечения диабетов вз рослых людей. Наблюдение метаболизма глюкозы у модельных животных и у людей, больных диабетом типа II, наводит на мысль, что половые стероиды играют разрешающую роль в фенотипной экспрессии гипергликемии. Эти наблюдения побудили изучение влияния андрогенов и эстроге нов на уровень глюкозы в крови. Введение тестостерона нормальным самкам крыс или самкам крыс с удаленным яичником приводит к заметной устойчивости к инсулину, которая коррелирует с морфологическими изменениями в мышцах, Холман и др., Am. J. Physiol., 259, Е555–560 (1990); там же, 262, Е851–855 (1992). У стрептозотоциновых диабетических крыс имплантированный тестостерон является антагонистом способности остаточного инсулина поддерживать гликемический контроль, Ле и др., Endocrinology, 116, 2450–2455 (1985). Напротив, глюкозурия исчезает у кастрированных диабетических КК мышей и появляется вновь, при замещении андрогенов у эти х мышей, Нонака и др. Jpn. J. Vet. Sci., 50, 1121–1123 (1988); Хигуи чи и др., Exp. Anim., 38, 25–29 (1989). Результа ты вве дения эстрогенов также подтверждают ги потезу о том, что равновесие между андрогенами и эстроге нами является решающим факто ром для развития гипергликемии. Ежедневное введение эстрадиола диабетическим КК мышам нормализует уровень глюкозы в крови и устраняет глюкозурию, Тоширо и др., Jpn. J. Vet. Sci., 51, 823–826 (1989). Эстрадиол также понижает уровень глюкозы в крови у мышей С57ВL/6J-ob/ob, Дюбюк, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 180, 468–473 (1985) и C57BL/KsJ-db/db, Гаррис, Anatomical Record, 225, 310–317 (1989). Настоящее изобретение предлагает способ уменьшения концентрации глюкозы в крови млекопитающи х, нуждающи хся в уменьше нии концентрации глюкозы в крови, который заключается во введении терапевтически эффективно го количества антиэстрогенного соединения или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата. Термин "антиэстроген", используемый в этом описании и формуле изобретения, обозначает неэндогенное, нестероидное химическое соединение, которое показывает антиэстрогенную активность (как дополнительно определено ниже), но в то же самое время обладает гормональной или эстрогенной активностями в некоторых селективных тканях и органах. Исто рически литература говорит об антиэстрогенах как о соединениях, которые связываются с рецепторами эстрогенов (например, конкурируют с эстрадиолом за эти рецепторы) и ингибируют реакцию матки или груди на эстроген, in vivo. Многие из этих соединений, как было показано, применимы в качестве средств против оплодотворения, противораковых средств или средств против др угих патологических состояний, для которых полезно ингибирование эстрогенной активности. Многие из этих сое динений, как было отмечено, являются смесью агонисты-антагонисты, то есть при некотором уровне дозы ведут се бя как агонисты эстрогена, в то время как при более высоких дозах являются антагонистами эстрогена. Способы определения классических антиэстрогенов хорошо известны опытным специалистам, например, описаны в работе: Хэйис и др., J.A. Endocrinology, 1981, 108, 164–172. Недавно было обнаружено, что некоторые химические классы исто рически установленных антиэстрогенов имеют способность действовать благоприятно на некоторые ткани и органы, реагирующие на эстроген, в то время как являются анта гонистами эстрогенной реакции у других (тканей и органов).Не ясно, можно ли это различие объяснить количественным действием смеси агонист-антагонист или качественно отличным механизмом действия. Примером благоприятного диффе ренциального действия является Ралоксифен, обладающий способностью снижать уровень липидов сыворотки и уменьшать резорбцию костей без нежелательных маточных эффектов у постклимактерических женщин. Следуе т заметить, что не все соединения, которые могут быть антиэстрогенами согласно классическому определению, сделанному выше, могут обладать активностью и полезностью, описанными в изобретении. В общем, антиэстрогенные соединения, заявленные в этом изобретении, являются теми соединениями, которые являются антиэстрогенными в классическом смысле, и которые обладают полезными эстрогенными свойствами. Наиболее обычными соединениями являются хи мический класс триарилэтилена или Z-триарилпропенонамины. Другие антиэстрогенные химические классы базируются на их достоинствах. Предпочти тельными и наиболее предпочтительными соединениями этого изобретения являются те, которые демонстрируют наибольший гипогликемический эффект, и которые также показывают наименьший нежелательный эстрогенный побочный эффект в ор ганах, та ких как груди и матка, Джонс и др., J. Med. Chem. 1984, 27, 1057–1066. Дополнительно, предпочтительные 2 34441 соединения этого изобретения, кото рые имеют весьма пониженную активность агонистов эстрогена, должны быть наиболее полезны при лечении мужских особей, чтобы избежать побочных эффектов феминизации, таких как гинекомастия. Антиэстрогены, рассматриваемые в рамках настояще го изобрете ния, являются соединениями, имеющи ми очевидное связывающее сродство к рецепторам эстрогена, обычно обозначаемое величиной Кi, значение которой больше 0,05 нМ и меньше 5000 нМ, рассчитанное из ингибирующей величины IC50 с помощью уравнения Ki=IC50/[I+(L/Kd)], где L – концентрация меченого лиганда и Kd – константа диссоциации комплекса лиганд-рецептор, определенная в условиях насыщения или из ингибирования связывания "холодного" лиганда. Ме тодики выполнения анализа на связываемость для определения антиэстрогенной и эстрогенной активности известны опытным специалистам, например, Блэк и Гуд, Life Sciences, 26, 1453–1458 (1980); Блэк и Гуд, Endocrinology, 109, 987–989 (1981); Блэк и др., Life Sciences, 32, 1031–1036 (1983). Также известна взаимосвязь между кажущимся (относительным) сродством связывания и ингибирующим значением IC50, концентрацией меченого лиганда и диссоциацией комплекса лиганд-рецептор, приведенными в формуле вы ше. Предпочти тельный метод определения эстрогенной/антиэстрогенной активностей изложен в методиках, приведенных далее. В настоящем изобретении предложены следующие классы антиэстрогенов, полезных, как полагают, в методах изобретения: 1) триарилэтилены; 2) 2,3-диарил-2Н-1-бензопираны; 3) 1-аминоалкил-2-фенилиндолы; 4) 2-фенил3-ароилбензтиофе ны; 5) 1-замещенные-2-арилдигидронафта лины; и 6) 2-замещенные-3-арилбензофураны. Каждый из этих классов ниже описан подробно. Общий хи мические термины, используемые в описании соединений этого изобрете ния, имеют свое обычное значение. Например, термин "алкил" сам по себе или как часть другого заместителя обозначает алкильный радикал с нормальной или разветвленной цепью, имеющий установленное число атомов углерода, такой как метил, этил, пропил, изопропил и высшие гомологи и изомеры, если указано. Термин "алкокси" обозначает алкил с установленным числом атомов углерода, связанный с основной молекулой атомом кислорода, например, метокси-, этокси-, пропокси-, бутокси-, пентилокси- и гексилоксигруппа и также включает структуры с разветвленной цепью, например, изопропокси- и изобутоксигруппу. Термин "С1–С7-алканоилокси" обозначает груп пу -O-C(O)-Ra, где Ra – водород или С 1–С6алкил и включает формилокси-, ацетокси-, пропаноилокси-, бутаноилокси-, пента ноилокси- и гексаноилоксигруппу и им подобные группы и также включает изомеры с разветвленной цепью, например, 2,2-диметилпропаноилокси- и 3,3-диметилбутаноилоксигруппа. Аналогично, термин "С4–С7-циклоалканоилокси" обозначает гр уппу -О-С(О)-С3–С6-циклоал кил, где С3–С6-циклоалкил включает циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил. Термин "С1–С6-алкокси-С 1–С7-алканоилокси" обозначает гр уппу -O-C(O)-R b-O-C1–C6-алкил, где Rb – связь, С1–С6-алкоксикарбонилоксигруп па или С1–С6-алкандиил, и включает, например, метоксикарбонилокси-, этоксикабонилокси-, пропоксикарбонилокси-, бутоксикарбонилокси-, метоксиацетокси-, метоксипропаноилокси-, метоксибутаноилокси-, метоксипентаноилокси-, метоксигексаноилокси-, этоксиацетокси-, этоксипропаноилокси-, этоксибутаноилокси-, этоксипентаноилокси-, этоксигексаноилокси-, пропоксиацетокси-, пропоксипропаноилокси- и пропоксибутаноилоксигруппу и им подобные группы. Термин "незамещенный или замещенный ароилокси" обозначает группу -О-С(О)-арил, где арил – фенил, нафтил, тиенил или фурил, причем каждая группа незамещенная или монозамещенная гидроксигруппой, галогеном, С1–С3-алкилом или С 1–С3-алкоксигруппой. * Термин "галоген" обозначает хлор, фтор, бром или иод. * Термин "незамещенный или замещенный арилкосикарбонилокси" обозначает груп пу -О-С(О)-О-арил, где арил – фенил, нафтил, тиенил или фурилгруппа, причем каждая группа замещенная или незамещенная гидроксигруппой, галогеном, С1–С3-алкил или С1–С3-алкокси. Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям соединений вышеприведенных классов, которые практически нетоксичны для живых организмов. Типичные фармацевтически приемлемые соли включают соли, полученные реакцией соединений вышеприведенных классов с фармацевти чески приемлемыми неорганическими или органическими кислота ми или фармацевтически приемлемыми щелочными металлами или органическими основаниями, в зависимости от типа присутствующего в соединении замести теля. Примеры фармацевти чески приемлемых неорганических кислот, которые можно использовать для получения фармацевти чески приемлемых солей, включают хлористоводородную, фосфорную, серную, бромистоводородную, иодистоводородную и фосфо ристую кислоты и им подобные кислоты. Примеры фармацевтически приемлемых органических кислот, которые можно использовать для получения фармацевтически приемлемых солей, включают алифа тические моно- и дикарбоновые кислоты, щавелевую, угольную, ли монную и янтарную кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, алифа тические и ароматические сульфо кислоты и другие кислоты. Фармацевтически приемлемые соли, полученные из неорганических и органических кислот, включают, та ким образом, хлоргидраты, бромгидраты, нитраты, суль фаты, пиросульфаты, бисульфа ты, сульфи ты, бисульфи ты, фосфа ты, моногидрофосфа ты, дигидрофосфаты, метафосфаты, пирофосфаты, иодгидраты, фторгидраты, ацетаты, пропионаты, формиаты, оксалаты, цитраты, лактаты, п-то луолсульфо наты, метансульфо наты, малеаты и другие. Многие соединения из вышеприведенных классов, которые содержат карбоксигруп пу, кар 3 34441 бонил, гидроксигруппу и сульфоксидную группу, можно превратить в фармацевтически приемлемые соли реакцией с фармацевтически приемлемым щелочным металлом или органическим основанием. Примеры фармацевтически приемлемых органических оснований, которые можно использовать для получения фармацевтически приемлемых солей, включают аммиак, амины, такие как триэтаноламин, триэтиламин, этиламин и другие. Примеры фармацевтически приемлемых оснований щелочных металлов включают соединения формулы MOZ, где М – щелочной металл, например, натрий, калий или литий, и Z – водород или С1–С4-алкил. Следуе т понимать, что отдельно взятый анион или катион, образующий часть любой соли этого изобретения не является опасным, пока соль, как целое, фар макологически приемлема и пока анион или катион не вносят нежелательного качества. В дополнение, некоторые из соединений, предложенные как полезные в методах настояще го изобретения, могут образовывать сольваты с водой или обычными органическими растворителями. Такие сольваты нахо дятся в рамках настоящего изобретения. Первый класс антиэстрогенов представляет собой триарилэтилены. Эти соединения широко известны, предложены и получены по методикам, описанным в патентах США 4536516 и 2914563; Огава и др., Chem. Pharm. Bull., 39 (4), 911 (1991), которые все включены в качестве ссылок. Характерные показательные соединения этого класса включают Тамоксифен, Кломифен и (Z)-4-{1-[4-(2- диметиламино)этокси)фенил]-2-(4изопропилфе нил)-1- бутенил}фенилмонофосфат. Триарилэтилены охватывают соединения формулы I и его фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты и сольваты и способы его получения. Также патент США № 2914563 описывает триарилэтилены формулы II, в которой R – основная эфирная группа формулы -OCnН2n А, где n = 2, 3 или 4 и А – диалкиламиногруппа, где алкильные группы независимо содержат 1–4 атома углерода, или циклическая группа, такая как N-пиперидинил, N-пирролидинил или N-морфо линил. Группа -OCnН2nА свя зана с фенилом в п-положении относительно углерода, связанного с этиленом. Каждая из R1 независимо является водородом, гидроксигруп пой, галогеном или метоксигруппой; Х – галоген, и их фармацевтически приемлемые соли и сольваты. Там же предложены способы получения таких соединений. Огава и др., предложили триарилэтилены формулы III, в которой R2 и R3 независимо выбирают из водорода или метила; R4 – изопропил, изопропен-2ил, моно- или дигидроксиизопропил; R5 – гидроксигруппа или фосфат (-ОРО3Н2), и и х фармацевтически приемлемые соли и сольваты. Эта статья также предлагает способ получения таких соединений. Второй класс антиэстрогенов представляет собой 2,3-диарил-2Н-1- бензопираны. Эти соединения предложены и получены по мето дикам, описанным в ЕР 470 310А1 и в статьях Шарма и др., J. Med. Chem. 33, 3210, 3216, 3222 (1990), которые включены в качестве ссылки во всей полноте. Характерные соединения этого класса включают 2-{4-[2-(1-пиперидинил)этокси]фенил}-3(4-гидроксифенил)-2Н-1-бензопиран; 2-{4-/2-(1-пиперидинил)этокси/фенил}-3-фенил-7-метокси-2Н-1бензопиран; 2-{4-/2-(1-пиперидинил)этокси/фенил}3-(4-гидроксифенил)-7-гидрокси-2Н-1-бензопиран. в которой R – основная эфирная группа формулы -OCnН2n А, где n= 2, 3 или 4 и А – диалкиламиногруппа, где алкил содержит 1–4 атома углерода, или циклическая группа, выбранная из N-пиперидинила, N-пирролидинила, N-морфо линила и Nгексаметилениминогруппы; каждый из R1 независимо является водородом, гидроксигруппой, галогеном или метоксигруппой, и их фармацевтически приемлемые соли и сольваты. Патент США № 4536516 описывают Та моксифен – триарилэтилен формулы Ia 4 34441 ЕР 470310А1 описывает бензопираны формулы IV, 2-Фенил-3-ароилбензо/b/тиофены приведены в патенте США № 4133814 и имеют формулу VI, в которой R6 и R7 (могут быть одинаковыми или различными) – водород, гидроксигруппа, С1–С17алкоксигруппа или С2–С18-алкоксикарбонил; R8 – в которой R16 – водород, гидрокси-, С1–С5-алкокси, С1–С7-алканоилокси-, С3–С7-циклоалканоилокси-, С1–С6-алкокси- С1–С7-алканоилокси-, замещенная или незамещенная ароилокси- или замещенная или незамещенная арилоксикарбонилоксигруппа; R17 – водород, хлор, бром, гидрокси-, С1– С5-алкокси-, адамантоилокси-, С1–С7-алканоилокси-, С3–С7-циклоалканоилокси-, С1–С6-алкоксиС1–С7-алканоилокси-, замещенная или незамещенная ароилокси- или замещенная или незамещенная арилоксикарбонилоксигруппу; R18 – группа -OCH2CH2-X'-NR19R20 , где Х' – связь или -CH2-, R19 и R20 – С1–С4-алкил или вместе с атомом азота образуют пирролидинил, пиперидинил, гексаметилениминил или морфолинил, и их фармацевтически приемлемые соли и сольваты. Способы получения этих соединений предложены в патенте США № 4133814. Ралоксифен и способ его получения описаны в патенте США № 4418068. Пятый класс антиэстрогенов представляет собой 1-замещенные-2- арилдигидронафталины. Эти соединения были предложены и получены по мето дикам, описанным в патентах США № 4400543, 4323707, 4230862 и 3274213, которые полностью включены в качестве ссылки. Характерными соединениями этого класса являются Нафоксиден и Триоксифен. Примеры 1-замещенных-2-арилдигидронафталинов приведены в патенте США № 4230862, который описывает соединения формулы VII, и их фармацевтически приемлемые соли и сольваты, а также способы их получения. Третий класс антиэстрогенов представляет собой 1-аминоалкил-2-фенилиндолы. Эти соединения предложены и получены по мето дикам, описанным фон Анжерером и др., J. Med. Chem., 33, 2635 (1990), которые включены сюда в качестве ссылки во всей полноте. 1-Аминоалкил-2-фенилиндолы, описанные фон Ан жерером и др., это соединения формулы V, в которой R9 – водород или метил; R10 и R11 - метокси- или гидроксигруппа; n = от 4 до 8; Y – группа NR12R13, где R12 и R13 независимо являются водородом, мети лом или этилом или один из R 12 или R13 – водород, а другой – бензил, или вместе с атомом азота образуют пирролидинил, пиперидинил или морфо линил, и их фар мацевтически приемлемые соли и сольваты. Способы синте за этих соединений известны из ссылок или предложены здесь. Четвертый класс антиэстроге нов представляет собой 2-фенил-3-ароилбензо/b/тиофены; (Zтриарилпропеноны). Эти соединения предложены и получены по методикам, описанным в патентах США № 4133814 и 4418068 и в статье Джонса и др., J. Med. Chem., 27, 1057–1066 (1984), которые включены сюда в качестве ссылки во всей полноте. Ха рактерные соединения этого класса включают Рaлоксифен {6-гидрокси2-(4-гидроксифенил)бензо/b/тиен-3-ил}{4[2-(1пиперидинил)этокси]фенил}метанон хлоргидрат, ранее кеоксифен и /6-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-бензо/b/тиен-3-ил/-/4-(2-/1-пирролидинил/этокси)фенил/мета нон хлоргидрат. в кото рой Z – СH2-CH2- или -СН=СН-; R16 – водород, гидрокси- или С 1–С5-алкоксигруппа; R17 – водород, хлор, бром, гидрокси-, С1–С5-алкокси-, С1– С5-ацилокси-, С1–С5-алкоксикарбонилокси-, бензилокси- или адамантоилоксигруппа; R18 – С1–С5алкоксигруппа или группа -OCH2-CH2 NR19R20, где R19 и R20 независимо являются С 1–С4-алкилом 5 34441 или вместе с атомом азота, с которым они связаны, образуют пирролидинил, пиперидинил, гексаметилениминогруппу или морфо линил, с тем ограничением, что если R17 – водород, то R16 – водород, гидрокси- или С 1–С5-алкоксигруппа и по меньшей мере один из R16 и R17 отличен от водорода, и и х фармацевтически приемлемые кислоаддитивные соли и сольваты, а также способы получения таких соединений. Примеры 1-замещен ных-2-арилдигидронафталинов также приведены в патенте США № 3274213, который описывает соединения формулы VIII, ляются бензтиофены. Наиболее предпочтительными являются бензтиофены формулы Х, Х в которой Х1 – связь или метилен; R16 – гидрокси-, метокси-, С1–С7-алканоилокси-, С3–С7-циклоалканоилокси-, С1–С6-алкокси- С1–С7-алканоилокси-, замещенная или незамещенная ароилокси-, или замещенная или незамещенная арилоксикарбонилоксигруппа; R17 – водород, хлор, бром, гидрокси-, метокси-, С1–С7-алканоилокси-, С3–С7-циклоалканоилокси-, С1–С6-алкокси-С 1–С7алканоилокси-, замещенная или незамещенная ароилокси-, или замещенная или незамещенная арилоксикарбонилоксигруппа; Y1 – гетероциклическое кольцо, выбранное из пирролидинила, пиперидинила или гексаметилениминила, и их фармацевтически приемлемые соли и сольваты. Особенно предпочтителен Ралоксифен и его пирролидиниловый аналог. Настоящее изобретение предлагает способ понижения уровня глюкозы в крови млекопитающи х, заключающий ся во введении терапевтически эффективного количества антиэстрогенного соединения или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата. Термин "терапевтически эффективное количество", принятый в описании, обозначает количество соединения, необходимое для достижения гипогликемического эффекта после введения, предпочтительно людям, страдающим или восприимчивым к диабетам взрослых. Гипогликемический эффект, рассматриваемый в настоящем способе, включает как медицинское терапевтическое, так и (или) профилакти ческое лечение. Также в рамках настоящего изобретения рассматривают сопутствующее лечение пероральными гипогликемическими средствами, инсулином или производными инсулина. Такие дополнительные терапевтические средства должны определяться лечащим врачом с уче том обстоятельств. Гипогликемическую активность соединений настояще го изобретения определяли тестированием эффективности in vivo на самцах жизнеспособных желтых мышей с диабетом тучных. Ме тодика теста описана ниже. Использовали 5–6-месячных самцов, жизнеспособных желтых мышей (VY/WfL-AVY/a, с врожденным диабетом тучных, далее называемых диабетическими мыша ми) из колонии фирмы Лилли. Штамм VY, не сущий мутацию АVY, был передан доктором Волфом исследовательской лаборатории Лилли около 20 лет назад. Колония поддерживалась скрещиванием сестра х брат между мышами AVY и a/a. Самцы жизнеспособных желтых мышей являются тучными, гипергли в кото рой R19 и R20 – С1–С8-алкил или вместе с атомом азота, с кото рым они связаны, образуют 5–7-членный насыщенный гетероциклический радикал, выбранный из пирролидинила, 2-метилпирролидинила, 2,2-диметилпирролидинила, пиперазинила, 4-метилпиперазинила, 2,4-диметилпиперазинила, морфо линила, пиперидинила, 2метилпиперидинила, 3-метилпиперидинила, гексаметилениминила, гомопиперазинила и гомоморфолинила; q = 2–6; p = 1–4; R21 – С1–С8-алкоксигруппа, и их фармацевтически приемлемые соли и сольваты. Способы получения этих соединений описаны в том же патенте. Шестой класс антиэстрогенов представляет собой 2-замещенные-3- арилбензофураны. Эти соединения предложены и получены по методикам, описанным в статье Тео и др., J. Med. Chem., 35, 1330–1339 (1992), которая включена сюда в качестве ссылки. Предложенные Тео и др., J. Med. Chem., 35, 1330–1339 (1992) 2-замещенные-3-арилбензофураны включают соединения формулы IX, где Х2 – галоген; Y2 – связь или метилен; R22 – водород или метил; R23 – группа -NR19R20, где R19 и R20 независимо являются С 1–С4-алкилом или вместе с атомом азота, с которым они связаны, образуют пирролидинил, пиперидинил, гексаметилениминил или морфолинил, и их фармацевтически приемлемые соли и сольваты. Там же предложены способы получения этих соединений. Предпочти тельным классом соединений, полезных в методах настояще го изобретения, яв 6 34441 кемическими, гиперинсулинемическими и устойчивыми к инсулину. Мы шей содержали по 6 в пластмассовой клетке с подстилкой, водой и кормом Пурина Формулаб 5008 (Пурина Миллс, Сент-Луис, МО) сколько угодно. Температуру в комната х для животных поддержива ли 23 ± 2оС. Свет в комнатах с животными был 600–1800 часов.мым опытом и через неделю после начала опыта. Концентрацию глюкозы в крови определяли методом глюкозоксидазы на быстропоточном анализаторе 300 Алпкем (Клэкэмаус, OR). Цифры, приведенные в таблицах 1–3, являются средними значениями, полученными в каждом опыте, в то время как каждая таблица описывает отдельный опыт. Дозы являются средними дозами, основанные на факти ческом потреблении пищи и на массе тела. Таблица 2 описывает результаты, полученные с ICI 164384 – антиэстрогеном, не имеющим эстрогенной активности, и выпадающие из рамок настояще го изобретения. Статистический анализ данных был выполнен методом значащей разницы, основанном на анализе вариаций. Антиэстрогены испытывали в различных дозах как примеси к пище. Каждую дозу антиэстрогена испытывали на 6 мышах, содержащихся в одной клетке. Соединения подмешивали в измельченный корм, который затем гранулировали. Контрольным мышам давали гранулированный корм без какого-либо испытываемого соединения. Образцы крови отбирали из хвостовой вены перед са Таблица 1 Гипогликемическая активность соединений, испытываемых на мышах с диабетом тучных Испытываемое Доза соединение (мг/кг/день) 0 дней 7 дней 14 дней 0,08 483±15 280±42 288±28 0,20 466±31 194±29 196±23 0,74 533±16 450±39 240±32 183±22 188±20 207±26 0,27 483±20 501±13 223±26 192±27 234±32 164±14 0,88 471±32 186±27 158±12 2,0 501±32 154±24 141±4 0,02 543±31 457±27 434±9 Тамоксифен Концентрация глюкозы в крови (мг/дл) 2,30 Триоксифен 0,09 Контрольные необработанные мыши Таблица 2 Гипогликемическая активность соединений, испытываемых на мышах с диабетом тучных Испытываемое Доза соединение (мг/кг/день) 0 дней 7 дней 14 дней 0,03 366±17 326±21 317±30 0,30 381±17 388±16 327±14 2,80 383±27 292±26 297±15 0,03 354±13 161±14 318±15 0,24 1,95 327±20 379±18 250±33 185±44 210±26 163±32 0,02 400±17 108±3 105±2 ICI 164384 Концентрация глюкозы в крови (мг/дл) N-n-бутил-N-метил-11-(3,17b дигидроксиэстра-1,3,4(10)триен-7a-ил)-ундекамид [6-гидрокси-2-(4гидроксифенил)-бенз[b]тиен-3ил][4-[2-(1-пирролидинил)этокси] фенил]метанон хлоргидрат 17a -этинилэстрадиол 7 34441 Таблица 3 Гипогликемическая активность соединений, испытываемых на мышах с диабетом тучных Испытываемое Доза соединение (мг/кг/день) 0 дней 7 дней 14 дней 0,01 363±23 354±16 357±11 0,28 406±20 378±17 314±11 0,84 0,24 373±34 407±14 239±39 231±34 196±35 165±32 7,36 390±10 210±26 177±25 0,025 399±10 186±10 151±14 Ралоксифен 17a -этинилэстрадиол Концентрация глюкозы в крови (мг/дл) Следующие методики описывают предпочтительные методы определения эстрогенной/антиэстрогенной активности соединений, описанных вы ше. Плотность бедренной кости. Семидесяти пятидневные самки крыс Спрэг Доули (интервал массы 225–275 г) были получены из Чарльз Ривер Лаборато рии (Портэдж, МI). Крыс содержали груп пами по 3 и давали сколько угодно пищи (содержание кальция приблизительно 1%) и воды. Температуру в комнате поддерживали 22,2 ± 1,7оС при минимальной относительной влажности 40%. Световой период в комнате был 12 часов све та и 12 часов темноты. Через одну неделю после прибытия крыс подвергали двустороннему уда лению яичников (овариектомия) под анестезией (44 мг/кг Кетамина и 5 мг/кг Ксилазина (Батлер, Индианаполис, IN) внутримышечно). Лечение носителем, эстрогеном или испытываемым соединением начинают в день хирургического вмеша тельства после восстановления от анестезии. Пероральную дозировку осуществляют зондовым питанием в 0,5 мл 1% карбоксиметилцеллюлозе или 20% циклодекстpине. Массу те ла определяют во время хирургической операции и неделей после и дозировку согласуют с из менением массы тела. Свариэктомизированных (овекс) крыс и неовариэктомизированных (интактных) крыс, обработанных носителем или эстрогеном, оценивают параллельно в каждой группе для негативного и позитивного контроля. Крыс обрабатывают ежедневно в течение 35 дней (6 крыс на обрабатываемую группу) и умерщвляют асфиксией диоксидом углерода на 36 день. Период времени в 35 дней достаточен для максимального уменьшения плотности костей у овариэктомизированных крыс, измеренного как описано здесь. При умерщвлении, матки удаляют, свободными от посторонних тканей, и жидкое содержимое удаляют перед определением мокрой массы для подтверждения недостаточности эстрогена, связанной с полной овариэктомией. Масса матки обычно уменьшается на 75% в ответ на овариэктомию. Матки затем помещают в 10% нейтральный буферный формалин для последующего гистологического анализа. Правые бедренные кости ампути руют и сканируют при дистальном метафи зе 1 мм из фиссуры надколенника однофотонной абсорбциометрией. Результаты денситометрических из мерений представляют расчет плотности кости в зависимости от содержания минералов и ширины кости. Овариэктомия крыс вызывает уменьше ние плотности бедренной кости на 25% по сравнению с интактной контрольной группой, обработанной носителем. Эстроген, вве денный в перорально активной форме этинилэстрадиола (ЭЭ 2), предотвращает эти потери кости в зависимости от дозы, но он также проявляется стимулирующее действие на матку, приводящее к тому, что масса матки приближается к массе матки интактных крыс при дозе 100 мкг/кг. Гистологические параме тры ма тки. Увеличение высоты эпителия является признаком эстрогенности терапевтических средств и может быть связано с повышенным распространением рака матки. Принято сравнивать уве личение высоты эпителия относительно овариэктомизированной контрольной группы. Лечение эстрадиолом уве личивает вы соту эпи телия до толщи ны, большей чем у интактных крыс. Эстрогенность также определяют, оценивая неблагоприятную реакцию проникновения эозинофила в слой стромы матки. Эстрадиол, как ожидали, вызывает большое уве личение проникновения эозинофи ла. Измеряли также толщину стромы и миометрия. Эстроген вызывает уве личение обоих этих параметров. Полное определение эстрогенности возможно по сумме всех четы рех параметров. Некоторые данные можно описать как процент ингибирования потерь кости и процент прироста массы матки, которые рассчитываются следующим образом: Процент ингибирования потерь кости равен (плотность кости обработанных овекс животных – плотность кости необработанных овекс животных) + (плотность кости леченых эстрогеном овекс животных – плотность кости нелеченных овекс животных) х 100. процент прироста массы матки равен (масса матки обработанных овекс животных – масса матки овекс животных) + (масса матки леченых эстрогеном овекс животных – масса матки овекс животных) х 100. Уровень липидов в сыворотке. Семидесяти пятидневных самок крыс Спрэг Доули (интервал массы 200–225 г) получали из Чарлз Ривер Лэборэторис (Портэдж, МI). Животных подвергали либо двусторонней овариэктомии 8 34441 (OVX), либо хирургической процедуре Шэма в Чарлз Лэборэторис и перевозили через одну неделю. После прибытия животные содержались в висячих металлических клетках группами по 3 или 4 в клетке и получали сколько угодно пищи (содержание кальция приблизительно 0,5%) и воды в течение одной недели. В комнате поддерживали температуру 22,2 ± 1,7оС с минимальной относительной влажностью 40%. Световой режим в комнате составлял 12 часов света и 12 часов темноты. Режим дозировки/Сбор тка ней. По прошествии однонедельного периода акклиматизации (две недели после OVX) на чинали ежедневную дозировку испытываемого соединения. Все соединения вводили перорально в количестве 1 мл/кг массы те ла. 17 b-Эстрадиол вводили подкожно в 20% растворе полиэтиленгликоля как носителе, 17 a-этинилэстрадиол и испытываемое соединение давали перорально в виде суспензии в 1% карбоксиметилцеллюлозе или 20% циклодекстрине. Животным давали дозы ежедневно в течение 4 дней. Вслед за режимом дозировки животных взвеши вали и анестезировали смесью Кетамин : Ксилазин (2:1 об/об) и образец крови собирали пункцией сердца. Животных затем умерщвляли асфикцией дикосидом углерода, матку уда ляли через разрез и определяли мокрую массу. Ана лиз холестерина. Образцам крови позволяли свертываться при комнатной температуре в те чение 2 часов и сыворотку получали последующим центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин. Холестерин сыворотки определяли, используя высокохарактеристический анализ холестерина Берингер Манхайм Дайэгностикс. Вкратце, холестерин окисляли до холест-4-ен-3-она и пероксида водорода. Пероксид водорода затем вводили в реакцию с фенолом и 4-аминофе назоном в присутствии пероксидазы для получения п-хинониминового красителя, который легко определить спектрофотометрически при 500 нм. Концентрацию холестерина затем рассчитывали по стандартной кривой. Весь анализ автоматизируют с применением прибора Виомек Аутомэйтед Уоркстэйшн. Ана лиз эозинофилпероксидазы (ЭПО) матки. Матки выдерживают при 4оС до времени ферментативного анализа. Матки гомогенизируют в 50 объемах буфера 50 мМ Трис (рН 8,0), содержащем 0,005% Тритона Х-100. После добавления 0,01% пероксида водорода и 10 мМ о-фенилендиамина (конечная концентрация) в буфер Трис в течение одной минуты наблюдают увеличение поглощения при 450 нм. Наличие эозинофила в матке является указанием на эстрогенную активность соединения. Максимальную скорость в 15 секундном интервале установили на начальном, линейном участке реакционной кривой. Экспериментальные группы. Все экспериментальные группы содержали 5–6 животных. Овариэктомия у крыс вызывала уве личение холестерина в сыворотке по сравнению с интактными контрольными животными, обработанными носителем. Эстроген, введенный в перорально активной форме этинилэстрадиола (ЭЭ 2), вызывает уменьшение холестерина в сы воротке в зависимости от до зы, но он также оказывает стимулирующую активность на матку, приводящую к тому, что масса матки приближается к массе матки интактных крыс при дозе 100 мкг/кг/день. Гистологические параме тры. Гистологические оценки выполняют как описано выше. Ингибирующую активность соединений на эстрогензависимые опухоли млекопитающих, оценивают согласно методам, описанным в патентах США №№ 4133814 и 4418068. Соединения, используемые в методах настоящего изобретения, эффективны в ши роких интервалах доз. Например, ежедневные дозы будут нахо диться в интервале 10–1000 мг/кг массы тела. Для лечения взрослых людей предпочти телен интервал 50–600 мг/кг в виде единой или разделенной доз. Однако, следуе т понимать, что количество факти чески вводимых соединений будет определяться врачом в зависимости от обстоятельств, включающи х излечиваемое состояние, выбор вводимого соединения, возраст, массу и реакцию индивидуального пациента, серьезность симпто мов у пациента и выбранный путь введения. Таким образом, выше указанные интервалы доз не ограничивают рамки изобретения. В то время как настоящие соединения предпочтительно вводят перорально, их можно также вводить различными другим путями, такими как трансдермальный, подкожный, интранасальный, внутримышечный и внутривенный пути. Хо тя возможно применение соединений изобретения непосредственно, но предпочтительно использовать их в фор ме фармацевтических препаратов, со держащи х фар мацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель и соединение изобретения. Такие препараты будут содержать от 0,01 до 99% соединения изобретения. При изго товлении препаратов настояще го изобретения активный компонент будут обычно смешивать с по меньшей мере одним носителем или разбавлять по меньшей мере одним носителем или помещать внутри носителя в форме капсулы, мешочка, бумажки или другого контейнера. Если носитель служит разбавите лем, то он может быть твердым, полутвердым или жидким материалом, действующим как носитель, наполнитель или среда для активного компонента. Та ким образом, препараты могут быть в форме таблеток, гранул, пи люль, порошков, лепешек, мешочков, крахмальных капсул, эликсиров, эмульсий, растворов, сиропов, суспензий, аэрозолей (твердых или в жидкой среде) и мягких и жестких желатиновых капсул. Примеры подхо дящи х носителей, разбавителей и наполнителей включают лактозу, декстрозу, саха розу, сорбит, маннит, крахмалы, гуммиарабик, фосфат кальция, альги наты, жидкий парафин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, трагакант, желатин, патоку, метилцеллюлозу, метил- и пропилгидроксибеноаты, растительные масла, такие как оливковое масло, пригодные для инъекций органические эфиры, такие как этилолеат, тальк, стеарат магния, воду и минераль 9 34441 ные масла. Препараты также могут включать смачиватели, смазывающие, эм ульгирующие и суспендирующие средства, консерванты, подслащи вающие средства, отдушки, стабилизаторы и вкусовые средства. Препараты могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечить быстрое, пролонгированное или замедленное выделение активного компонента после введения пациенту с помощью хорошо известных методик. Для перорального введения соединение этого изобретения можно идеально смешать с носителями и разбави телями и сформовать в таблетки или заключить в желатиновые капсулы. Препараты предпочтительно составляют в форме стандартной дозы, причем каждая доза содержит 1–500 мг, обычно 5–300 мг, активного компонента. Термин "форма стандартной дозы" относится к физическим дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для человека и других млекопитающих, причем каждая единица содержит предопределенное количество активного материала, рассчитанного для произведения желаемого терапевтического эффекта, в смеси с подходящим фармацевтическим носителем, разбавителем или наполнителем. Для более полной иллюстрации изобретения приведены следующие примеры препаратов. Примеры имеют только иллюстративное значение и не ограничивают рамки изобретения. Препараты могут использовать в качестве активных соединений любое из антиэстрогенных соединений, описанных вы ше. Препарат 1. Твердые желатиновые капсулы получают, используя следующие компоненты: Активный компонент, целлюлозу, крахмал и стеарат магния смеши вают, просеивают через сито № 45 меш США и помещают в твердые желатиновые капсулы. Препарат 3. Капсулы, каждая из которых со держит по 100 мг активного компонента, получают следующим образом: Количество на капсулу Массовая концентрация (%) 100 мг 29,0 50 мг 0,02 250 мг 71,0 250,05 мг 100,02 Активный компонент Полиоксиэтиленсорбитан моноолеат Крахмал порошок Приведенные компоненты тща тельно перемешивают и помещают в п устую желатиновую капсулу. Препарат 4. Таблетки, каждая из которых содержит 10 мг активного компонента, получают следующим образом: Активный компонент 10,0 45 мг 45,0 35 мг 35,0 4 мг 4,0 4,5 мг 4,5 Магния стеарат Активный 10 мг крахмал Массовая концентрация (%) Массовая концентрация (%) Крахмал Количество на капсулу Количество на капсулу 0,5 мг 0,5 1 мг 1,0 компонент 250 мг 55,0 Микрокристалличес Крахмал сухой 220 мг 43,0 кая целлюлоза Магния стеарат 10 мг 2,0 Поливинилпирроли 460 мг 100,0 дoн (в фор ме 10% раствора в воде) Вышеприведенные компоненты смешивают и помещают в твердую желати новую капсулу в количестве 460 мг. Препарат 2. Капсулы, каждая из которых со держит по 20 мг медикамента, делают сле дующим образом: Количество на капсулу 89 мг 44,5 Магния стеарат 2 мг 200 мг 100 мг 10,0 44,5 целлюлоза Тальк Массовая концентрация (%) 20 мг 89 мг Натрийкарбоксиэтил 1,0 100,0 Ак тивный компонент, кра хмал и целлюлозу про сеивают че рез сито № 45 меш США и тща тельно перемеши вают. С образующим ся порошком смеши вают раствор поливи нилпирролидона и смесь просеивают че рез сито № 14 меш США. Образующие ся гра нулы вы сушивают при 50–60оС и просеивают че рез сито № 18 меш США. За тем к гра нулам добавляют натрийкарбоксиметилк рахмал, стеа рат магния и тальк, предва рительно просеянные через сито № 60 меш США, пе ремеши вают и прессуют на таблеточной маши не, получая таблетки массой 100 мг. Активный компонент Крахмал 100,0 Микрокристаллическая 10 34441 Препарат 5. Таблетитированные препараты можно получать, используя приведенные ниже компоненты: Количество на капсулу Активный компонент 38,0 400 мг 60,0 10 мг сколько понадобится до 5 мл Ме дикамент просеивают через сито № 45 меш США и смеши вают с натрийкарбоксиметилцеллюлозой и патокой до образования однородной пасты. Раствор бензойной кислоты, вкусовое средство и краситель разбавляют некоторым количеством воды и добавляют при перемеши вании. Затем добавляют достаточное количество воды для достижения требуе мого объема. 1,5 Целлюлоза микрокристаллическая Кремния диоксид пылевидный Стеариновая кислота 5 мг Препарат 7. Приготавливают аэрозольный раствор, содержащий следующие компоненты: 0,5 665 мг 100,00 Массовая концентрация (%) Компоненты смешивают и прессуют в форме таблеток, каждая массой 665 мг. Препарат 6. Суспензии, каждая из которых содержит 5 мг медикамента в до зе 40 мл, получают сле дующим образом: Активный компонент Этанол (хлордифторметан) Патока Вкусовое средство 70,00 Активное соединение смеши вают с этанолом и смесь добавляют к части пропеллента 22, охлаждeнной до –30оС, и переносят в наполняющее устройство. Требуе мое количество загружают затем в контейнер из нержавеющей ста ли и разбавляют дополнительно оставшимся количеством пропеллента. За тем контейнер снабжают клапаном. 50 мг 1,25 мл Бензойная кислота раствор 29,75 100,00 5 мг Натрийкарбоксиметилцеллюлоза 0,25 Пропеллент 22 На 5 мл суспензии Активный компонент смотри сколько вберет Вода Массовая концентрация (%) 250 мг Краситель 0,10 мл смотри сколько вберет Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 – 72 – 89 (03122) 2 – 57 – 03 11