Лікувальний засіб “ліварекс” на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти

1. Лікувальний засіб на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти, який відрізняється тим, що представлений у вигляді супозиторію, причому він додатково містить сухий екстракт чистотілу великого, гермогран та основу при такому співвідношенні компонентів, мас.%: A (54) ЛІКУВАЛЬНИЙ ЗАСІБ "ЛІВАРЕКС" НА ОСНОВІ ДИМЕТОКСІУРЕЇДОФОСФОРНОЇ КИСЛОТИ 38889 Використання полірибонуклеотидів чи "ослаблених" вірусів [4] для прискорення виділення інтерферону можливо лише для експериментальної практики та є вкрай небезпечним для здоров'я. Аналогом за протипухлинною дією є натулан (прокарбазін) [1]. Його використовують для лікування пухлинної хвороби, але він здатний викликати ускладнення (блювання, запаморочення, інколи алергози). Найближчим аналогом є диметоксіуреїдофосфорна кислота ефективному лікуванні онкологічних захворювань та їх інфекційних та запальних ускладнень. Наступні приклади ілюструють даний винахід і не повинні розглядатися як такі, що обмежують даний винахід, викладений в наведеній формулі винаходу. Приклад 1. Виготовлення лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти. Лікувальний засіб "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти виготовлений відповідно до вимог XI Державної Фармакопеї СРСР, том 2, стор. 151-153. Для виготовлення 100 супозиторіїв "Ліварекс" необхідно використати компоненти у такій кількості: диметоксіуреїдофосфорна кислота 5,0 г; сухий екстракт чистотілу великого 1,0 г; гермогран (ТУ-У-15.054.-94) 50,0 г; желатина медична 46,0 г; гліцерин 183,7 г; спирт етиловий 95% 4,8 г; вода дистильована 92,0 г. Перший склад. Для його утворення 46,0 г желатини медичної змішували з 70,0 г дистильованої води та ставили на 120 хвилин для набухання при температурі 20°С. Потім додавали 183,7 г гліцерину, при температурі 55-60°С ретельно перемішували до однорідної маси і додавали гермогран 50,0 г. Другий склад готували паралельно. Для цього у залишку води (22,0 г) з 4,8 г спирту етилового 95% розчиняли 5,0 г диметоксіуреїдофосфорної кислоти і 1,0 г сухого екстракту чистотілу великого. Все перемішували до повного розчинення при температурі до 50°С. Перший та другий склади змішували до однорідної, гомогенної маси при температурі не вище 60°С. Потім суміш у теплому вигляді розливали у форми для виготовлення супозиторіїв. Маса одного супозиторію не повинна перевищувати 3,825±0,021 г, що відповідає дозі 55 мг на 1 кг маси тіла Отримані супозиторії зберігалися у вакуумній упаковці при температурі + 4-5°С. Приклад 2. Вивчення гострої токсичності лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти. Вивчались основні параметри токсикометрії запропонованого, відповідно до винаходу, лікувального засобу при різних шляхах аплікації супозиторію відповідно до вимог ГОСТ 12.1.007-76. Згідно із "Методичним рекомендаціям..." [6], гостра токсичність повинна вивчатись на "не менше ніж на 3-х видах тварин, але обов'язково на гризунах та негризунах". Оцінка безпечності впливу "Ліварексу" була розпочата з вивчення його відповідності вимогам ГОСТ 12.1.007-76. Використані для вивчення дози чи концентрації лімітувались технічними умовами введення потенційного лікувального засобу. Зразки супозиторію розігрівали до 30-32°С у стерильній мірній колбі об'ємом 50 мл та набирали у стерильний, теплий на дотик шприц. Після цієї операції супозиторії були застосовані для парен , яка описана в Патенті України 21453 А від 16.12.1997 p. Вона виявляє протипухлинну, інтерфероногенну, противірусну дію та характеризується низькою токсичністю. Недоліками зазначеного засобу є недостатня ефективність протипухлинної дії, незначно виражені інтерфероногенна та противірусна дії, та відсутність протизапальної дії, що перешкоджають широкому використанню в клінічній практиці. Задача, яка була поставлена в основу винаходу, стосується розробки нового лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти, який представлений у вигляді супозиторію і виявляє протипухлинну, інтерфероногенну, противірусну, та протизапальну дії. Поставлена задача досягається тим, що запропонований лікувальний засіб містить диметоксіуреїдофосфорну кислоту і, відповідно до винаходу, додатково містить сухий екстракт чистотілу великого, гермогран та основу при такому спів відношенні компонентів, мас.%: диметоксіуреїдофосфорна 1,25-1,37 кислота сухий екстракт чистотілу великого 0,25-0,27 гермогран 12,45-13,75 основа решта. Сухий екстракт чистотілу великого був одержаний з Herba chilidonii majoris відповідно до вимог XI Державної фармакопеї СРСР, т. 2, ст.. 47, с. 309-311 та с. 160-161 (ст. "Екстракти"), та виявляє протизапальну дію. Гермогран (ТУ-У-15.054.-94) був одержаний з зародку пшениці. Він дозволений до використання у ве теринарній медицині. Згідно рішення Державного науково-експертного центру лікарських засобів МОЗ України (Протокол № 3 від 7.03.2000 p.) дозволений до клінічних випробувань як лікувальний засіб з адаптогенними та біостимулюючими властивостями. Для формування лікувального засобу "Ліварекс" у вигляді супозиторію як основа (допоміжні речовини) введені вода (X Державна фармакопея СРСР, стаття 73, Вода дистильована, стор. 107108), спирт етиловий 95% (X Державна фармакопея СРСР, ст. 631. Спирт етиловий. - С. 644-646), желатина (X Державна фармакопея СРСР, ст. 309. Желатина медична. - С. 331-333) та гліцерин (X Державна фармакопея СРСР, ст. 309. Гліцерин. - С. 876). Запропонований лікувальний засіб відносно відомих препаратів має переваги, які полягають в 2 38889 терального (внутрішньом'язевого і внутрішньочеревинного), нашкірного, перорального, ректального і вагінального введення за стандартними операційними процедурами. Підготовлені для використання супозиторії вводили інгаляційне тваринам за допомогою ежекторного пристрою ЭГВ-ПАУ-м, що був розроблений у ГОСНІОХТ (Москва - Шихани, 1979 p.) для інгаляції у статичних та динамічних умовах. Пристрій придатний для введення загущених рецептур речовин, які мають здатність змінювати агрегатний стан (з рідини до гелю) та "залипати" на поверхнях. Результати експерименту фіксувались на 7 та 14 добу спостереження. В узагальненому вигляді показники гострої токсичності наведені у табл. 1. Таким чином, можна констатувати, що при вивченні гострої токсичності лікувальний засіб "Ліварекс", незалежно від шляху аплікації при виконанні досліджень за ГОСТ 12.1.007-76, має властивості БАР 3-го класу небезпеки. В подальшому у всіх випадках вивчення ефектів дії лікувального засобу "Ліварекс" та засоби порівняння вводились ректально. Всі дози визначались у частках від показника середньолетальної дії (0,5; 0,25; 0,1; 0,01 чи Lim ac) при спостереженні за тваринами протягом 14 діб (ЛД50h336). При цьому використовувались ректальні ефективні дози супозиторію для білих щурів: при значенні 0,5 ЛД50 дорівнювало 205 мг "Ліварекс" на кг маси тіла тварини; для 0,25 ЛД50 - 102,5 мг "Ліварекс" на кг маси тіла тварини; 0,1 ЛД50 - 41 мг "Ліварекс" на кг маси тіла тварини; 0,01 ЛД50 - 4,1 мг "Ліварекс" на кг маси тіла тварини. Ефективні дози для білих мишей при значенні 0,5 ЛД50, 0,25 ЛД50, 0,1 ЛД 50 та 0,01 ЛД50 становили відповідно 250 мг "Ліварекс" на кг маси тіла тварини; 125 мг "Ліварекс" на кг маси тіла тварини; 50 мг "Ліварекс" на кг маси тіла тварини та 5 мг "Ліварекс" на кг маси тіла тварини. Для порівняння вираженості специфічних ефектів дії лікувального засобу "Ліварекс" та засобу порівняння диметоксіуреїдофосфорної кислоти використовувались значення доз 0,1 ЛД50 та 0,01 ЛД50, які становили відповідно 47 та 4,7 мг засобу на кг маси тіла щура. Приклад 3. Випробування лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти у вигляді супозиторію на токсичність. Виготовлені відповідно до винаходу супозиторії "Ліварекс" призначаються для введення у пряму кишку або вагіну. Відповідно до вимог Державної фармакопеї СРСР XI випуску (вона залишається директивним документом в Україні при контролі якості лікувальних засобів) випробування лікувального засобу на токсичність проводяться на білих мишах обох статей після відповідного карантинного утримання з метою визначення стану їх здоров'я. Перевага надається перевірці при внутрішньочеревинному введенні чи введенні тим шляхом, яким препарат вводиться для використання у хіміотерапевтичній практиці. Експерименти проводились на білих мишах з масою тіла від 19 до 21 г. Кожна серія супозиторіїв випробовувалась на різних групах тварин, що кількісно складались з 5 мишей. За добу до проведення випробування тварини переносились у кімнату для виконання дослідів, де вони знаходились в умовах постійної температури та вологості. Після зважування тварини протягом 2-4 год не отримували корм та воду. Зразки 3-х серій супозиторіїв розігрівались до 30-32°С. Далі готували тест-дозу за умов, що наведені у прикладі 2. Час, необхідний для внутрішньочеревинного введення, має становити не більше 7-10 хвилин. Кожна з білих мишей у групах тварин (табл. 2) отримувала рівну за масовими показниками тестдозу, що виго товлена з різних зразків супозиторію "Ліварекс", які передавались на токсикологічне випробування. Приготовані об'єми тест-доз вводились у ректальну порожнину мишей у кількості 0,2 мл на одну тварину. Спостереження за білими мишами тривало 48 год з моменту аплікації. На 24 та 48 годину візуально оцінювався стан інтегральних показників здоров'я мишей (активність, охайність, відношення до води та їжі, реакції на дотик, тургор м'язів). Тварини виводились з досліду на 72 годину з моменту аплікації. На основі вивчення гострої токсичності (приклад 2), такі зразки лікувального засобу, які не приводили до загибелі білих щурів протягом 2-х діб з моменту ректального введення, вважаються такими, що пройшли випробування. Таким чином, зразок лікувального засобу "Ліварекс", виготовленого відповідно до винаходу, може вважатись таким, що витримав випробування на токсичність, оскільки при ректальному введенні 0,2 мл протягом 48 годин спостереження не загинула жодна з піддослідних білих мишей масою 20 г. Приклад 4. Вивчення впливу лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на меланому В16. Протипухлинні властивості запропонованого лікувального засобу вивчали на перевивних моделях пухлин за загальноприйнятими методами [5]. Досліди in vivo були розпочаті з використання експериментальних пухлин на моделі трансплантованої метастазуючої меланоми В16. Штам метастазуючої меланоми В16 підтримували на мишах лінії СС57ВІ шляхом вн утрішном'язевого перещеплювання суспензій пухлинних клітин. В підготовчій стадії експерименту було проведене повторне пасивування штаму в умовах, які дозволяли досягати 100% розвитку пухлин. Ректальне введення супозиторію "Ліварекс" в усі х дослідах здійснювалось у дозі 0,01 ЛД50. Введення розпочинали наступної доби після перещеплення пухлини і проводили 4 рази з інтервалом в 1 добу. Маса пухлин після введення "Ліварексу" мала вигляд некробіотичних утворень. Враховуючи це, результати досліду аналізували через 2 тижні після перещеплення пухлини. П ухлини перепарували, ретельно відділяючи тканину меланоми від неушкодженої м'язової тканини, після чого визначали масу пухлин. Результат експерименту наведені у табл. 3. Як бачимо з наведених даних, введення лікувального засобу "Ліварекс", призводить до зменшення маси первинних пухлин меланоми В16 (59,73%). При цьому слід також зазначити, що у контрольній групі у 3 тварин з 8 на момент закін 3 38889 чення досліду було виявлено по 2 метастатичних вузли в легенях, в той же час як у дослідній групі, де використовували "Ліварекс", ознак додаткової токсичності чи метастатичних вузлів у паренхіматозних органах не виявлено у жодної миші. Приклад 5. Вивчення впливу лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на саркому Уокера та лімфалейкоз L1210. Дослідження протипухлинної активності лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти проводилось на тваринах, яким перевивалась саркома Уокера або лімфалейкоз L-1210. Експеримент проводився на 80 мишах. При проведенні досліду враховувалось виживання тварин, термін їх загибелі, загальний стан, поведінка та маса тіла тварин. Результати ефективності впливу "Ліварексу" на пухлини оцінювали за відсотком гальмування росту п ухлини (у випадку пухлини саркома Уокера) та за тривалістю життя (у випадку лімфосаркоми L-1210). Саркома Уокера трансплантувалась білим безпородним мишам підшкірно 20-25% гомогенатом пухлинної тканини в фізіологічному розчині об'ємом 0,25 мл. Для лікування тварин "Ліварекс" вводили через добу після перевивки пухлин, щоденно, протягом 10 діб. Після закінчення курсу лікування тварин забивали, пухлини виділяли та зважували. Штам лімфолейкозу L-1210 перевивали мишам лінії ДБА-2 внутрішньочеревинно, пухлинною суспензією в концентрації 106 лейкемічних клітин в об'ємі 0,1 мл. Інокулят розводили стерильним середовищем 199. Лікування мишей з лейкозом L1210 починали через добу після перевивання. Курс складався з 5 щоденних введень супозиторію "Ліварекс". Після закінчення лікування тварин залишали під наглядом для визначення тривалості життя. Результати виконаних in vitro експериментів свідчать про те, що лікувальний засіб "Ліварекс" гальмує ріст культури лімфомних клітин людини. Зокрема, експериментально показано, що тривалість життя збільшувалась на 25,5% при лімфосаркомі L-1210, а при саркомі Уокера маса пухлин зменшувалась на 29% через 12 діб введення "Ліварексу". Середня тривалість життя дослідних тварин при лімфосаркомі L-1210 була: без лікування - 12,0 діб, а при використанні лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти збільшувалась до 17,2 доби. Приклад 6. Порівняння ефективності впливу на карциноми Герена лікувального засобу "Ліварекс" та диметилуреїдофосфорної' кислоти. Були проведені порівняльні дослідження ефективності протипухлинної активності супозиторіїв "Ліварекс" та диметилуреїдофосфорної кислоти на моделі карциноми Герена. Експеримент проводили на 60 білих щурах з масою 210±23 г, яким підшкірно в ділянці правого стегна (задня кінцівка) перевивали карциному Герена у вигляді 20% суспензії на фізіологічному розчині, яку отримували з 10-денної пухлини. Останню попередньо звільняли від капсули, судин, сполучнотканинних прошарків. Тварин розподіляли на 3 групи по 20 щурів в кожній. В першій групі (контроль) тварини не отримували лікування. В другій групі на 9 добу після перевивання пухлини, в момент появи пальпаторно визначеної пухлини, починали вводити лікувальний засіб "Ліварекс" ректальне у дозі 0,1 ЛД50 щоденно протягом 7 діб. Третю групу складали тварини, яким з 9 доби після перевивання вводили ректально розчин диметилуреїдофосфорної кислоти у дозі 0,1 ЛД50 щоденно терміном 7 діб. Порівнюючи результати застосування еквітоксичних доз супозиторію "Ліварекс" та диметилуреїдофосфорної кислоти в модельному досліді на карциному Герена. Експериментально було встановлено, що застосування лікувального засобу "Ліварекс" виявляло кращу протипухлинну дію, ніж використанням диметилуреїдофосфорної кислоти (табл. 4). Найбільшого позитивного ефекту дії досягнуто в другій групі, де використовували лікувальний засіб "Ліварекс". Повне розсмоктування було зафіксоване при введенні "Ліварексу" у 11 щурів з 20, що є високим результатом. Приклад 7. Дослідження впливу лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на клінічні показники при лікуванні пухлин прямої кишки людини, раку шийки і тіла матки та раку яєчника (підкапсульний тест). Проведені дослідження щодо вивчення впливу супозиторію "Ліварекс" на ріст пухлин прямої кишки людини, раку шийки та тіла матки та раку яєчника (підкапсульний тест). Імплантація матеріалу злоякісних пухлин прямої кишки людини, раку шийки та тіла матки та раку яєчника під капсулу нирки мишей лінії СВА здійснювалась інокулятами з масою в 1 мг. Супозиторії "Ліварекс" вводили у дозі 0,1 ЛД50 per rectum протягом 3-х днів, починаючи з 4-ї доби після трансплантації пухлинної тканини. В дослідах використані тварини СВА (СВА a , СВ7, ВС/0, F1), що були розведені у розпліднику НАН України (м. Глеваха), які отримували звичайний харчовий раціон. Маса тіла тварин складала 18±2 г. Миші забивались евентерацією - гільйотинна дислокація. В клініко-експериментальних дослідженнях на ксенограмах пухлин хворих людей (операційний матеріал) був використаний метод Богдена і співавторів (підкапсульний тест). Ефективність використаних супозиторіїв оцінювали через 7 діб після введення інокуляту. Регресію пухлини визначали як відношення зміни маси пухлини у дослідних гр упах щодо контролю ("Ліварекс" не використовували) у відсотках. Пухлина вважалась чутливою до введення супозиторію, якщо її маса під впливом лікування була на 25% менше відносно контрольних тварин. Показником активності супозиторію був відсотком гальмування росту гетеротрансплантантів пухлини людини під капсулою нирки мишей лінії СВА при критерії значущості більше або на рівні 25%. В табл. 5-9 наведені експериментальні дані про вплив "Ліварексу" на тканину пухлин. Таким чином, застосування лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти в дозі 0,1 ЛД50 per rectum зменшувало масу пухлини у порівнянні з контролем, гальмувало ріст пухлини прямої кишки людини, раку шийки та тіла матки та раку яєчника (підкапсульний тест). 4 38889 Приклад 8. Вивчення протизапальної дії лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти. Протизапальні властивості заявлено засобу вивчали на моделях карагенінового та формалінового набряку, які моделювали шляхом субплантарного введення щурам 0,1 мл 1% розчину карагеніну чи 0,1 мл 10% розчину формаліну. Лікувальний засіб "Ліварекс" вводили ректально в дозі 0,1 ЛД50 або 0,01 ЛД50. Як препарат порівняння використовували вольтарен в терапевтичній дозі. Критерієм оцінки був відсоток інгібування набряку, який вимірювали волюметрично. Дослідження проведено на білих нелінійних мишах та щурах з масою відповідно 20±2 г та 140±20 г. Тварини утримувались на стандартному харчовому раціоні і одержували їжу та питво ad libitum. Первинна оцінка анальгізуючої дії препарату досліджена на моделях хімічної ("корчі", що викликані оцтовою кислотою) та термічної (метод "гарячої пластики") ноцицептивної стимуляції при ректальному введенні супозиторію "Ліварекс" мишам. Критеріями оцінки служили відсотки інгібування кількості "корчів" та відсоток зміни до вихідного латентного періоду реакції облизування задньої лапки. Жарознижуючі властивості лікувального засобу "Ліварекс" оцінювались на моделі пірогеналової лихоманки, яку викликали шляхом внутрішньовенного введення пірогеналу із розрахунку 500 МПД/кг маси тварин. Порівнювали температуру тіла тварин до і у різні строки після введення супозиторію "Ліварекс". Отримані результати наведені в табл. 10. Проведені дослідження, результати яких наведені в табл. 10, свідчать, що лікувальний засіб "Ліварекс" виявляє протизапальну активність. В табл. 11 наведені результати оцінки протизапальної дії лікувального засобу "Ліварекс" залежно від дози та у порівнянні з вольтареном. Отримані результати узгоджуються з результатами розгляду результатів антипроліферативної дії (табл. 12) та результатами оцінки анальгезуючої (табл. 13-14) та жарознижуючих властивостей на моделі пірогеналової лихоманки (табл. 15). Як показали проведені дослідження, лікувальний засіб "Ліварекс" виявляє статистично достовірні жарознижуючі властивості, що найбільш виражено при застосуванні препарату в дозі 1,54 мг/кг через 60 хвилин після введення. При використанні зазначеної дози зниження температури тіла при пірогеналовій лихоманці реєструється вже через 30 хвилин і становить - 0,7°С. Пік жарознижуючої дії припадає на 60 хвилину (зниження температури становить 1,14°С). Необхідно зазначити, що жарознижуючий ефект препарату має короткочасний характер. Вже через 1,5 години після застосування наведена різниця температур відсутня. Приклад 9. Вивчення інтерфероногенної активності лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти. Спочатку було досліджено інтерференогенну активність в системі суспензійних культур Тлімфоцитів-STM. Вивчення проводилось порівняно з гама-інтерфероном (табл. 16). Було встановлю но, що запропонований лікувальний засіб "Ліварекс" є активним індуктором інтерферону. При поглибленому вивченні інтерференогенних властивостей супозиторію "Ліварекс" при введенні його мишам у дозі 55 мг/кг вміст у сироватці крові досягав 640 од/мл. Тому для з'ясування рівня оптимальної дози ввели по 0,2 мл в кількості від 25 до 125 мг/кг маси тіла тварини (табл. 17). З наведених даних видно, що оптимальна доза індукції інтерферону у мишей за допомогою "Лівареску" може знаходитись в межах 50100 мг/кг. Оптимальна доза для досягнення позитивного ефекту в культурі клітин лімфоцитів людини є 1 мг/кг при вмісті інтерферону 640 од/мл.акт. 50 дослідів було проведено у порівнянні з відомим індуктором Полі І:ПоліЦ. Концентрація інтерферону у надосадковій рідині сягала 640 од/мл.акт. Таким чином, індукований інтерферон був типовим в реакції нейтралізації моноклональних антитіл до альфа-інтерферону. Приклад 10. Вивчення впливу лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на модель герпетичного менінгоенцефаліту. Для вивчення антивірусної дії супозиторію "Ліварекс" була використана модель герпетичного менінгоенцифаліту. Ця модель зручна для оцінки вираженності симптоматики, відмічається 100% відтворюваність. Розвиток клінічних симптомів герпетичного менінгоенцефаліту починається на 56 добу з моменту інфікування. Максимального прояву зміни досягають на 13-14 добу, а далі відмічається зменшення проявів симптоматики з наступним клінічним одужанням тварин, що вижили. Наявність гострої герпетичної інфекції підтверджується за допомогою імунофлюоресценції. Летальність тварин, що були інфіковані вірусом герпесу простого наближається без лікування до 100%. Для моделювання експериментальної герпетичної інфекції використовували вірус герпесу простого 1 типу. До введення у дослід він зберігався у 50% розчині гліцерину на фосфорному буферному розчині при температурі 15°С. В досліді були використані білі безпородні миші вагою 14-16 г. Вірус герпесу простого 1 типу вводили мишам у мозок в об'ємі 0,03 мл. Величина заражаючої дози в досліді дорівнювала 0,1 ЛД50 (мишиних летальних доз). В досліді використовували "Ліварекс" у вигляді свічок ректального або вагінального введення. Як референс-препарат використовувався препарат Віралекс фірми Wellcome (Великобританія) відповідно до стандартної схеми лікування. Кожний дослід включав 3 групи тварин по 1015 мишей у кожній: 1 група - миші, яким вводили досліджуваний засіб "Ліварекс" за 24 години (профілактична дія), через 24 години після інфікування тварин вірусом герпесу (лікувальна дія); 2 група - миші, яким вводили Віралекс за 24 години, через 24 години після інфікування тварин вірусом герпесу; 3 група - миші, яким вводили фізіологічний розчин та вірус герпесу (плацебо). 5 38889 Оцінка активності препарату проводилась шляхом порівняння летальності мишей в дослідній та контрольних групах. При цьому враховувалось: відсоток летальності тварин; кратність захисту (КЗ) - кратність зменшення кількості мишей, що загинули в дослідній групі у порівнянні з контрольним; індекс ефективності (IE) - обчислювали за формулою (КЗ - 1) × 100 . IE = КЗ Результати дослідження профілактичної та лікувальної дії наведені у табл. 18-20. Тестування репродукції вірусу здійснювалось імуноферметним методом з залученням моноклональних антитіл. Результати експерименту показали, що лікувальний засіб "Ліварекс" інгібує репродукцію вірусу грипу на 2,0 Іg. ЛД50. Це свідчить про активний процес інгібування репродукції вірусу грипу. Таким чином, проведені дослідження показали, що супозиторії "Ліварекс" при введенні per rectum, мають виражений антигерпетичний ефект при профілактичному та лікувальному застосуванні. Приклад 11. Вивчення впливу лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на ВІЛ. Для оцінки анти-ВІЛ активності використовували модель первинно-інфікованих вірусом імунодефіциту людей суспензійних клітин МТ-4. Штам ВІЛ-1 одержаний з Інституту вірусології РАМН. Інфікування клітин МК-4 штамом ВІЛ-1 проводили додаванням вірусу до клітинної суспенції в концентрації 4х105 кл/мл та множинністю зараження 1,0 Іg IД50. Інгібуючий ефект препаратів оцінювали на 5 добу культивування за кількістю вірусного антигену імуноферментним методом (тест-систем Vironostika, Нідерланди). В дослідженні використовували супозиторії "Ліварекс", що вводились ректально в дозі 55 мг на 1 кг маси тварини. Як референт-препарат використовували ретровір в дозі 100 мкг/мл. Результати дослідження наведені в табл. 21. В результаті досліджень було встановлено, що введення лікувального засобу "Ліварексу" Інгібує репродукцію ВІЛ. Можна вважати, що інгібування репродукції ВІЛ здійснюється за рахунок сполуки диметилуреїдофосфорної кислоти. Таким чином, проведені дослідження показали, що запропонований лікувальний засіб "Ліварекс" виявляє протипухлинну, інтерфероногенну, противірусну та протизапальну та може бути використаний в клінічній практиці органів охорони здоров'я та ветеринарної медицини для лікування онкологічних та суп утніх інфекційних і запальних захворювань. Джерела інформації 1. Pharmindex. Лекарственные препараты. - К.: Морион, 1998. - 1038 с. 2. XI Державна фармакопея СРСР. – Т. 1, 2. 3. Патент України 21453 А від 16.12.1997 p. 4. Шумейко О.В. Екологічна токсикологія на порозі XXI сторіччя. Збірник наукових праць. - К.: ДІПК, 1997. - Вип. 1. - С. 76-79. 5. Шумейко О.В. // Український кардіологічний журнал. - 1999. - Вип. II. - № 2. - С. 81-85. 6. Методичні рекомендації по представленню документації на лікарські засоби у Фармакологічний комітет МОЗ України / За ред. В.І. Кондратюка. - К.: МОЗ України, 1993. - 36 с. Таблиця 1 Токсикометричні показники згідно із ГОСТ 12.1.007-76 Показник ефекту дії Вид тварин Середня летальна доза при введенні у шлунок (ЛД50), мг/кг Білі щури Білі миші Морські свинки Кролі Коти Білі щури Білі миші Кролі Білі щури, (ЛК 50), мг/м 3 Білі миші (ЛК50), мг/м 3 Коти, (ЛК50), мг/м 3 Білі щури Білі миші Білі щури Білі миші Білі щури Білі миші Білі щури Білі миші Морські свинки Середня летальна доза при нашкірній дії, (ЛД50), мг/кг Середня летальна концентрація у повітрі: Статика; Динаміка, LCt50h336 , мг л/хв. Внутрішньом'язево (ЛД50h336), мг/кг Внутрішньочеревинно (ЛД50h336), мг/кг Ректально (ЛД50h336), мг/кг Оцінка небезпеки використання Прогнозоване ГДКр\з, мг/м 3 6 Термін визначення ефекту дії 7 доба 14 доба >5000,0 5200,0±500,0 >5000,0 6500,0±250,0 >5000,0 >5000,0 >5000,0 5100,0±450,0 >5000,0 5250,0±160,0 >2500,0 >2500,0 >2500,0 >2500,0 >2500,0 >2500,0 >50000,0 51000,0110,50 >50000,0 52500,0±16,0 >50000,0 52500,0±9,0 0,320±0,09 0,280±0,07 235,0±7,5 270,0±2,4 165,0±3,36 200,0±8,51 410,0±20,0 500,0±15,5 350,0±34,3 Помірно небезпечні Помірно небезпечні >10,0 38889 Продовження табл. 1 Показник ефекту дії Термін визначення ефекту дії 7 доба 14 доба Щури:миші=0,8275 Морські свинки: щури від 0,85 до 0,96 Від 15 до 42 Середнє 23,6 3 - помірно токсич3 - помірно токсичний ний Вид тварин Коефіцієнт видової чутливості Зона гострої дії Клас небезпеки, ГОСТ 12.1.007.-76 Таблиця 2 Вплив тест-доз різних зразків лікувального засобу "Ліварекс" на білих мишей з масою тіла 20 г при ректальному введенні Зразок лікувального засобу Серія 120595 141196 220499 Розподіл загибелі (%) у різні терміни (год.) 24 48 72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Оцінка стану дослідних тварин Задовільний Задовільний Задовільний Таблиця 3 Вплив лікувального засобу "Ліварекс" на снові диметоксіуреїдофосфорної кислоти на розвиток перещепленої меланоми В16 у мишей Маса пухлини, мг № п/п Контрольна група 660 656 625 680 729 1060 735±180 1 2 3 4 5 6 7 8 Середнє % змін відносно контролю Дослідна група 132 255 355 475 515 520 615 645 439±108* 59,73 Таблиця 4 Динаміка зміни об'єму та маси пухлини карциноми Герена Кількість щурів 20 20 20 Група 1 2 3 Початок 0,8±0,02 0,8±0,04 0,8±0,03 3 доба 6,6±0,8 2,3±0,2* 2,9±0,5* Об'єм пухлини, см 3 5 доба 7 доба 39,2±1,1 50,1±3,6 24,7±1,3* 24,2±2,0* 33,6±1,2* 32,5±0,8* 10 доба 75,3±5,3 30,1±2,7* 38,8±1,3* Маса пухлини (г) 42,5±6,1 20,2±0,1* 29,6±2,0* * - зміни достовірні відносно контролю Таблиця 5 Вплив лікувального засобу "Ліварекс" на ріст пухлини прямої кишки людини (підкапсульний тест) № групи Умови досліду Кількість тварин Маса пухлини, мг 1 Контроль Дослід Контроль Дослід Контроль Дослід Контроль Дослід 6 3 6 3 6 3 6 3 1,05±0,02 0,57±0,01 1,20±0,02 0,45±0,02 1,58±0,03 0,84±0,01 1,60±0,01 0,75±0,02 2 3 4 7 Гальмування росту, % 45,7 62,5 46,8 53,1 38889 Продовження табл. 5 № групи Умови досліду Кількість тварин Маса пухлини, мг 5 Контроль Дослід Контроль Дослід 6 3 1,38±0,03 0,67±0,01 1,362±0,012 0,688±0,011 Середнє значення Гальмування росту, % 51,5 51,02±1,92 Таблиця 6 Вплив лікувального засобу "Ліварекс" на рак шийки матки (підкапсульний тест) Маса трансплантанту, г Середнє значення Маса після лікування, г 2,36 2,11 2,51 3,03 3,14 2,63±0,22 1,63 1,46 1,86 1,82 2,53 1,86±0,23 Зміна відносно контролю, % 30,93 30,80 25,89 40,00 19,42 29,40±2,34 Таблиця 7 Вплив лікувального засобу "Ліварекс" на раку тіла матки (підкапсульний тест) Маса трансплантанту, г Середнє значення Маса після лікування, г 2,85 2,44 3,69 2,87 3,05 2,98±0,12 1,60 1,50 2,85 1,50 2,40 1,90±0,28 Гальмування відносно контролю, % 43,86 38,50 22,80 47,70 33,01 37,17±3,21 Таблиця 8 Вплив лікувального засобу "Ліварекс" на рак яєчника (підкапсульний тест) Маса трансплантанту, г Середнє значення Маса після лікування, г 2,12 2,40 3,10 2,41 3,22 2,65±0,35 1,23 1,67 1,87 1,20 1,65 1,53±0,14 Гальмування відносно контролю, % 42,00 30,41 39,67 50,20 48,75 42,21±3,23 Таблиця 9 Вплив лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на ріст пухлин людини в підкапсульному тесті Маса пухлини, г Гальмування росту, % Контроль "Ліварекс" Контроль "Ліварекс" прямої кишки 1,362±0,012 0,688±0,011 0 51,02±1,92 яєчника 2,65±0,35 1,53±0,14 0 42,21±3,23 тіла матки 2,98±0,12 1,90±0,28 0 37,17±3,21 шийки матки 2,63±0,22 1,86±0,23 0 29,40±2,34 Критеріальне значення наявності ефекту гальмування росту = 25,0% Пухлина Рак Рак Рак Рак 8 38889 Таблиця 10 Вплив лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на карагеніновий та формаліновий набряк Модель набряку Карагеніновий набряк Формаліновий набряк Лікувальний засіб Контроль Вольтарен 0,1 ЛД50 "Ліварекс" 0,1 ЛД50 "Ліварекс" Контроль Вольтарен 0,1 ЛД50 "Ліварекс" 0,1 ЛД50 "Ліварекс" Приріст набряку, мл 1,52±0,3 0,45±0,2 0,74±0,1 0,65±0,2 1,35±0,2 0,53±0,1 0,72±0,1 0,63±0,1 Зниження набряку, % 70,39 51,33 57,24 60,74 46,67 53,33 Таблиця 11 Вплив лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на "вологу" та "суху" гранульому "Волога" гранульома маса, мг пригнічення, % 424,1±0,5 0 205,0±11,4 -51,66 187,6±8,5 -55,76 131,8±21,3 -68,92 Умови досліду Контроль Вольтарен 0,1 ЛД50 "Ліварекс" 0,01 ЛД50 "Ліварекс" "Суха" гранульома маса, мг пригнічення, % 64,8±2,3 0 33,3±2,1 -48,61 30,5±2,5 -52,93 26,3±1,2 -59,41 Таблиця 12 Оцінка антипроліферативної дії лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти Термін реєстрації ефекту альтерації на шкірі гіперемія, хв набряк, хв виразка, год 35-45 40-50 24-32 50-99 50-85 24-49 60-175 90-120 37-75 60-120 90-125 48-100 Умови досліду Контроль Вольтарен 0,1ЛД5о"Ліварекс" 0,01ЛД5о"Ліварекс" Розмір некрозу, мм 30-48 19-29 10-20 8-18 Таблиця 13 Оцінка анальгезуючої дії ліку вального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на моделі "корчів", що викликані оцтовою кислотою Тест-доза "Ліварексу" 0,25 ЛД50 0,1 ЛД50 0,01 ЛД50 Кількість "корчів" у контрольній групі тварин 15,00±2,87 15,00±2,87 15,00±2,87 Кількість "корчів" у дослідній групі тварин 15,41±1,78 14,15±3,25 14,11±2,22 Відсоток інгібування кількості "корчів" стимуляція на +2,73 пригнічення на -5,66 пригнічення на -5,93 Таблиця 14 Результати дослідження анальгезуючої дії ліку вального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на в тесті "гарячої" пластинки Тест-доза "Ліварексу" 0,25 ЛД50 0,1 ЛД50 0,01 ЛД50 Латентний період реакції (вихідне значення) 15,24±0,95 14,96±0,51 15,46±0,50 Відсоток змін до латентного вихідного періоду реакції через: 30 хвилин +30,45 +18,05 +0,78 9 60 хвилин +68,89 +20,99 +13,84 90 хвилин +11,02 +75,93 +22,12 120 хвилин +0,13 +43,05 +28,85 38889 Таблиця 15 Результати оцінки жарознижуючих властивостей лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на моделі пірогеналової лихоманки Тест-доза "Ліварекс" 0,1 ЛД50 0,01 ЛД50 Підвищення температури тіла М±м, st 1,03±0,19 1,00±0,17 Зниження температури М±м, st через: 30 хвилин -0,70±0,27 -0,36±0,48 60 хвилин -1,14±0,52 -0,38±0,13 90 хвилин -0,46±0,33 -0,08±0,15 120 хвилин -0,54±0,25 -0,1±0,15 180 хвилин -0,28±0,34 +0,24±0,23 Таблиця 16 Вплив лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на активність інтерферону Доза у мг 100 100 "Ліварекс" Гама-інтерферон Активність інтерферону у од/ мл. акт 640 640 Таблиця 17 Вплив лікувального засобу "Ліварекс" у різних дозах на індукцію інтерферону у мишей Доза, мг/кг 25 50 75 100 125 Вміст інтерферону у сироватці крові через 6 годин через 18 годин через 48 годин 150 80 20 640 320 160 320 320 160 640 32 320 160 160 80 Кількість тварин 12 12 12 12 12 Таблиця 18 Введення лікувального засобу "Ліварекс" при герпетичному менінгоенцифаліті з профілактичною метою Плацебо "Ліварекс" Віралекс Шлях введення В/очеревинно Ректально В/очеревинно Кількість мишей 14 14 10 Загинуло мишей шт. відсоток 14 100 0 0 7 70 КЗ IE 0 1,4 100 28 Таблиця 19 Введення лікувального засобу "Ліварекс" при герпетичному менінгоенцифаліті з лікувальною метою Шлях введення Контроль – плацебо "Пїварекс" Віралекс Кількість мишей Загинуло мишей шт відсоток В/очеревинно 14 14 Ректально В/очеревинно 12 12 4 7 КЗ IE 100 33,3 58,3 3,0 1,7 66,6 41,1 Таблиця 20 Вплив лікувального засобу "Ліварекс" на репродукцію вірусу Умови досліду Вірус (Гонконг 68) Вірус грипу А (Гонконг 68) + "Ліварекс" Доза, мкг 100 10 Інфекційний титр вірусу Іg. ЛД50 6,0 2,0 38889 Таблиця 21 Вплив лікувального засобу "Ліварекс" на основі диметоксіуреїдофосфорної кислоти на ВІЛ Експресія р24, пг/мл Контроль ВІЛ "Ліварекс" Ретровір Інфекційний титр, Іg ІД 50 800 400 302 3,0 0 1,5 Інгібіція інфекційного титру, Іg ІД50 3,0 3,0 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 11