Аналізатор якості сперми

Аналізатор якості сперми із застосуванням лазерно-доплерівської спектроскопії способом оптичного гомодинування розсіяного та опорного лазерних випромінювань з наступним кореляційним аналізом, що включає в себе джерело лазерного випромінювання, схему формування випромінювання, вимірювальну камеру, що виконана з прозорого матеріалу і має термостатичний кожух, з'єднаний з термонагрівачем і каналом вводу зразка сперми, фотоприймач з діафрагмою Обскура, вихід якого з'єднаний зі входом попереднього підсилювача, вихід якого з'єднаний зі входом амплітудно-цифрового перетворювача, вихід якого з'єднано зі входом процесора, що має зв'язок з блоком вводу-виводу, який відрізняється тим, що схема формування випромінювання має діафрагму, що встановлена перед двоплечою призмою для одержання двох лазерних променів, що під заданим кутом перетинаються у центрі вимірювальної камери, канал вводу зразка сперми з'єднаний з дозатором, а процесор виконано з реалізацією алго Винахід стосується до біологи, медицини і сільського господарства, (тваринництва), а саме до пристроїв для вимірювання внутрішніх енерговитрат рухомих мікробіологічних об'єктів на їх рух у в'язкому середовищі і може бути використаний при ОЦІНЦІ якості сперми в практичних задачах контролю стану заморожуваного і деконсервованого генетичного матеріалу, а також скринінгу модифікаторів і криопротекторів біологічних середовищ ритма використання автокореляцшного аналізу флуктуацій фотоструму змішаних оптичних променів від сперматозоїдів, що рухаються, і опорного лазерного променя таким чином, що вимірювана величина власних енерговитрат на рух сперматозоїдів в середовищі і в реальному масштабі часу обчислюється у вигляді Де Е - власні енерговитрати на переміщення сперматозоїдів у в'язкому середовищі, Дж , І - середній струм фотодетектора, що вимірюється в режимі оптичного гомодинування реєстрації розсіяного спермою лазерного променя світла, що усереднений за часом не більш як 10 мс, At - інтервал часу усереднення квадрата похідної середнього фотоструму за термін набору поточної інформації в межах від ЗО мс до 10 с, - символ усереднення, В(Я,,р,6,со) - нормуючий коефіцієнт розмірності, що залежить від довжини хвилі лазерного світла (я,), розмірів сперматозоїдів (р), кута детектування розсіяного ними лазерного променя (Є) і потужності лазерного випромінювання, що опромінює сперматозоїди (ю) , що усі визначаються і встановлюються в попередніх дослідах і задаються постійними величинами у вигляді імперативів Відома лазерно-допплерівська віброметрична система [1], що складається з лазерного джерела світла, блока віброметра, оптичної лави, блока розщеплення лазерного променя світла, приймача світла, аналізатора сигналів і блока виводу інформації Діапазон вимірювань швидкості руху об'єкту від 10 6м/с до 3м/с Недоліком такої системи є те, що за її допомогою неможливо контролювати число нерухомих О ю 45471 товується гелій-неоновий лазер потужністю 5мВт клітин, а також вимірювати величину внутрішніх із когерентною довжиною променя не менше 20см енерговитрат на рух клітин в популяції і низьким фактором шуму Точність виміру 1% Відомий аналізатор руху сперматозоїдів [2], в повного відхилення використаного диапазону виякому світло від джерел опромінювання подають мірів Діапазони допплерівської частоти %о вимірювальну камеру, а флуктуації розсіяного 2,25 15кГц, 8 50кГц, 22,5 150кГц, 8 500кГц, світла реєструють за допомогою фотоприймача з 0,225 1,5мГц,0,8 5мГц , 2,25 15мГц наступним аналізом сигналів і обчисленням частоти флуктуацій, по якій судять про рух і якість сперДо хиб даного пристрою варто віднести високі ми Подача світла здійснюється зо допомогою вимоги до метрологічних характеристик лазерної волоконної оптики, а вивід розсіяного світла з виголівки, зокрема, до когерентності, стабільності, мірювальних камер також здійснюється світловоінтенсивності і шумам генерації випромінювання, дами складність юстировки оптичного тракту, так для гетеродинування сигналу потрібно висока точність Недоліком цього аналізатора є те, що за доі спеціальна стабільність опорного променя лазерпомогою його неможливо здійснити кількісну оцінного світла, ку параметрів швидкості , рухомості і енерговитрат на рух клітин в популяції неможливість одержання інформації про всі параметри руху клітин (швидкості числа клітин , У Франції розроблена вимірювальна система що рухаються, енерговитрат на їх рух), тому що в на лазерно-допплерівському ефекті для аналізу даному випадку вимірюється тільки середня швидруху клітин сперми [3] (лабораторія гістологи і емкість руху часток, неможливість виміру мікрооб'єкбріологи, Паризький університет), в якій промінь тів , що повільно рухаються від лазера подають на вимірювальну камеру, розсіяне світло реєструють фотоприймачем, а флукВідзначаємо, що рухливі рослинні клітини, туації фотоструму аналізуються на спектроаналінайпростіші , спермії тварин і людини мають харазаторі, з одержанням інформації про швидкість ктерні швидкості прямування в діапазоні руху клітин Оскільки нерухомі клітини не дають 10 10 10мкм/с 3 огляду на вимоги до точності допплерівського зсуву частоти, то для їх реєстрації виміру швидкостей і рухливості таких об'єктів, що у в такій системі застосовано метод примусового біологічних дослідженнях складають порядку заохочування їх до руху, для цього використано ±1мкм/с , то очевидно, що використання лазерного засіб обертання вимірювальної камери При цьому анемометра типу 55L у цьому випадку неможливе всі клітини суспензії набувають додаткової швидНайбільше близьким до запропонованого анакості, що дорівнює швидкості переміщення камери лізатору якості сперми, що заявляється, є пристрій В результаті цього в спектрі сигналу з'являється для вимірювання в реальному масштабі параметпік, що відповідає швидкості примусового зміщенрів руху рухомих кліток [5], яке містить в собі такі ня нерухомих клітин, а показник рухомості обчисосновні вузли і блоки люють з відношення площин ПІКІВ, що відповідають Промінь лазерного світла від джерела, як з'єдрухомим і нерухомим клітинам Для контролю за нано з блоком живлення, формується оптичною рівнем інтенсивності світлового променя передбасхемою (діафрагмою і лінзою) і фокусується у чено другий сигнал фотоструму від світла, що центрі вимірювальної камери з суспензією кліток, проходить що досліджуються Джерело світла, вимірювальна камера і фотоприймач встановлені на оптичній Недоліком такого пристрою є те, що в ньому лаві За джерело світла може бути використано використана дуже складна оптична схема, яка чугелій-неоновий або інший лазер, потужність витлива до найменших вібрацій і потребує складної промінювання якого не повинна викликати зміни процедури юстировки Окрім того, при електростану біологічного об'єкту, що досліджується, за аналізі вимагається велика вибірка сигналів , що термін виміру Розсіяне світло і опорний промінь значно збільшує тривалість проведення ДОСЛІДІВ, а детектуються фотоприймачем якого встановлено це, в свою чергу, збільшує помилку вимірювань під кутом до осі променя лазерного світла Фотопри ОЦІНЦІ параметрів руху клітин за рахунок диприймач має джерело живлення, а вихід його з'єднамічних ефектів суто біологічної природи В принано зі входом попереднього підсилювача, який ладі не передбачена можливість одержання велиз'єднано з одним входом корелятора, другий вхід чини внутрішніх енерговитрат на рух клітин в якого з'єднано з таймером Вихід корелятора з'єдпопуляції в реальному масштабі часу нано з мікро-ЕОМ При цьому керування роботою Відомий лазерне-допплерівський анемометр корелятора здійснюється комп'ютером по специа[4], в якому використовується така оптика лазерна льному каналу Одержані результати виводяться головка, оптична лавка, розподільник променя, на друк лінзи, фільтр, фотодетектор При цьому два промені, один із яких використовується як опорний, спрямовані в місце з об'єктами, що рухаються Місце перетинання променів формує обсяг зони розсіювання (виміри) Швидкість потоку або часток визначається по розрахунковій формулі Сигнал від ФЭУ посилюється за допомогою підсилювача і формується у вигляді числового коду й опрацьовується в процесорі допплерівського сигналу, вихід якого сполучений із цифровим вольтметром Діапазон що вимірюється швидкості потоку Змм/с 300м/с У якості лазерної голівки викорис Когерентний опорний промінь на лазерній частоті створюється незміщеним світлом бліків від передньої стінки вимірювальної камери Блики формуються рисками, що їх нанесено на передню стінку камери Режим оптичного гетеродинування реалізований шляхом змішування на фотокатоді фотоприймача розсіяного від об'єкту, що рухається, світла і опорного променя Це дозволяє отримати кореляційну функцію з аналізу флуктуацій фотоструму числовим методом Цифрові дані/ про форму кореляційної функції 45471 надходять в мікро-ЕОМ і обробляються за методом наименьших квадратів з одержанням даних про середню швидкість руху клітин в популяції і про відносну КІЛЬКІСТЬ рухомих клітин Обчислення величини питомих енерговитрат популяції на рух клітин здійснюють за формулою _2 E = v -p-G(O) Вимірювальна камера має термостатичний кожух При цьому, в кожусі є вікна для введення променя лазерного світла і виводу розсіяного світла і світла від бліків, а також вікно для оптичної пастки Термостатичний кожух має зв'язок з термостатом Штрихи на передній СТІНЦІ вимірювальної камери наносять у вигляді сітки, а перед фотоприймачем встановлена діафрагма, що представляє собою камеру Обскура Кут установки фотоприймача вибирають у межах від 0 до 45 у залежності від розмірів досліджуваних рухливих клітин Конкретна технічна реалізація пристрою Пристрій лазерно-допплерівський на базі стандартних приладів може бути здійсненний в такий спосіб За джерело монохроматичного когерентного випромінювання узятий гелій-неоновий лазер ЛГН-105 із довжиною хвилі 632,8нм і потужністю 2,0мВт Пучок лазерного світла формується оптичною схемою, що складається з лінз із фокусною відстанню 100мм і діафрагми з діаметром, d = 0,5мм, що об'єднані в одному корпусі Діаметр світлового променя, сфокусованого в центрі вимірювальної камери складає біля 120мкм Камера являє собою кювету з оптичною довжиною 1мм і МІСТКІСТЮ 0,8мл Така конфігурація кювети обрана для можливості роботи з достатньо великими (до 10млн кл/мл ) концентраціями клітин у суспензії при відсутності ефекту перерозсіювання Малий обсяг камери дозволяє проводити дослідження з мінімальною КІЛЬКІСТЮ клітинної суспензії (200 ЗООмкл) Кювета зі зразком має термостатичний кожух , що виготовлений з почорненої МІДІ і має вікно для оптичної пастки Для підтримки заданої температури використаний рідинний ультратермостат, в якому тепловим носієм є водногліцеринова суміш Останнє обумовлено більшою в порівнянні з дистильованою водою в'язкістю, ЩО дозволяє уникнути вібрації зразка під час проведення виміру Температуру в кюветній камері можна підтримувати в діапазоні від 0 до 60°С із точністю не нижче ±0,1 °С Розсіяне на клітинах, що рухаються, світло реєструється за допомогою фотоелектронного примножувача ФЭУ-79 Область спектральної чутливості ФЭУ 300 830нм Рівномірний дільник напруги і ФЭУ розміщені у світлонепроникному кожусі, за який використана фотометрична насадка до люмінесцентного мікроскопа ФМЭЛ-А зі знятою лінзою, що розсіює У кожусі є барабан револьверного типу з вмонтованими діафрагмами 0 1, 0 5, 1 5мм, що служать для побудови зображення на фотокатоді Напруга живлення на ФЭУ подається від високовольтного, стабілізованого випрямляча типу ТВ2 Нестабільність вихідної напруги в діапазоні 50 1500В не нижче 0 2% На ФЭУ подається на пруга негативної полярності, анод заземлений Опорний промінь одержують від відблиску, формованого штрихами на передній СТІНЦІ камери Відстань між штрихами не більша діаметра променя світла, що подається на камеру, зокрема дорівнює 200мкм, при цьому сітку завдають вертикально по осі симетрії камери Для формування зображення використаний принцип камери Обскури за допомогою діафрагми У цьому випадку забезпечується максимальна глибина різкості при мінімальних вимогах до точності постановки оптичної частини спектрометра, положенню кювети зі зразком і катода ФЭУ Детекторна частина допплерівського кореляційного спектрометра встановлена на поворотному плечі гоніометра Г-5, а термостатичний кожух з кюветою для зразка - у центрі нерухомого столика гоніометра На іншому плечі гоніометра зібрана формуюча промінь світла частина і джерело світла Монтаж здійснений на мікрометричних столиках, що мають горизонтальну і вертикальну ступені свободи Точність установки кута розсіювання ±0,5 Обмеження на світлозахист від зовнішнього засвічування, ЗОВНІШНІХ ВПЛИВІВ типу "хитавиця" мінімальні, що забезпечує широке використання даного пристрою в польових умовах Електронна частина пристрою У якості попереднього підсилювача використовується низькочастотний вимірювальний підсилювач У4-28 із смугою пропускання частот від 2 до 100000Гц Коефіцієнт підсилення установлюється від 10 до ЮОдб східчасте через Юдб Вхідний опір приладу - 1мОм, вхідна ємність на частоті 200кГц не більш 40пф Посилений сигнал надходить на вхід 100-канального цифрового корелятора Х6-4, що працює в реальному масштабі часу при термінах затримки від ЮОмкс до 1с, що дозволяє досліджувати кореляційні характеристики сигналів у діапазоні частот 0,5 25000Гц 3 огляду на те, що частотний діапазон допплерівського зсуву на рухливих клітинах достатньо перекриває діапазон одержуваних у дослідах частот, дана вимірювальна схема дозволяє в широкому діапазоні вимірювати швидкості від 0 до 500мкс/с Час виміру для побудови кореляційної функції вибирається ВІДПОВІДНО до умови конкретного експерименту і може змінюватися від 27 до 217 г , де г - термін затримки корелятора Цифрова інформація про форму кореляційної функції з тактовою частотою ЮкГц подається через порт мікро-ЕОМ, за якої використано "Електроніку МСО401", в оперативну пам'ять На інформаційному виході корелятора є три види сигналів "строб" початок функції , сигнал типу "меандр", що супроводжує видачу інформації і 8-розрядний цифровий сигнал про значення кореляційної функції в конкретному каналі Тому для зчитування інформації з корелятора задіяно два вхідних порти Реально ЕОМ здійснює також і керування роботою корелятора, для чого на роз'їм "дистанційне керування" через вхідний порт подаються сигнали "скидання", "обнуління ЛІЧИЛЬНИКІВ" І "пуск", що запускає набір кореляційної функції До хиб даного пристрій - прототипа можливо віднести не достатня компактність і деяка складність 45471 обслуговування вимірювального комплексу утруднює реалізацію переносного, а тим більше портативного, варіантів аналізаторів якості сперми, для пристрою характерні більші динамічні погрішності виміру внутрішніх енерговитрат сперматозоїдів на їхній рух, що зв'язане з тривалістю проведення аналізів і оцінювання якості сперми (від 4-Х до 15 хвилин), алгоритм обробки сигналів базується на побудові кореляційної функції фотоструму і підгонки експериментальних даних під теоретичну функцію, що притягає за собою відповідну систематичну помилку кінцевого результату зі збільшенням її принаймні в 3 5 разів У основу винаходу поставлена задача - удосконалити пристрій аналізатор якості сперми, із забезпеченням підвищення точності виміру внутрішніх енерговитрат сперматозоїдів (за рахунок зниження динамічної помилки і скорочення часу виміру при зберіганні статистичної вибірки) Крім того, розглянутий аналізатор якості сперми можливо реалізувати з використанням як аналогового, так і цифрового принципу обробки електричних сигналів, тобто, для нього характерні простота, технологічність і гнучкість побудови Алгоритм роботи процесора побудований на простих операторах, що забезпечує можливість створення портативних аналізаторів сперми високими метрологічними характеристиками Технічний результат, що може бути отриманий при здійсненні винаходу, полягає в тому, що з'являється можливість здійснити єкспрес-контроль якості сперми шляхом вимірювання внутрішніх енерговитрат сперматозоїдів на їх рух в реальному масштабі часу Поставлена задача вирішується за рахунок того, що у аналізатори якості сперми з застосуванням лазерне - допплерівської спектроскопії засобом оптичного гетеродинування розсіяного і опорного лазерного випромінювання, з наступним кореляційним аналізом, що включає в себе джерело лазерного випромінювання, схему формування випромінювання, вимірювальну камеру, що виконується з прозорого матеріалу і що має термостатичний кожух, що з'єднаний з термонагрівачем і каналом вводу зразка сперми, фотоприймач з діафрагмою Обскура, вихід з якого з'єднано зі входом попереднього підсилювача, вихід якого з'єднаний зі входом амплітудно - цифрового перетворювача, вихід якого з'єднано зі входом процесора, що має зв'язок з блоком вводу - виводу, в якому згідно з винаходом, схема формування випромінювання має діафрагму, що встановлена перед двоплечевою призмою для одержання двох лазерних променів, що під заданим кутом перетинаються у центрі вимірювальної камери, канал вводу зразка сперми з'єднаний з дозатором, а процесор виконано з реалізацією алгоритма використання автокореляційного аналізу флуктуацій фотоструму змішаних оптичних сигналів від сперматозоїдів, що рухаються, і опорного лазерного променя таким чином, що вимірювана величина власних енерговитрат на рух сперматозоїдів в середовищі і в реальному масштабі часу обчислюється у вигляді Е = ВAt О E - власні енерговитрати на переміщення сперматозоїдів у в'язкому середовищі, Дж , І - середній струм фотодетектора, що вимірюється в режимі оптичного гомодирування реєстрації розсіяного спермами лазерного променю світла, що усереднений за часом не більш як Юмс , At - інтервал часу усереднення квадрату похідної середнього фотоструму за термін набору текучої інформації в межах від ЗОмс до 10с , - символ усереднення, В(л,р9го) . нормуючий коефіцієнт розмірності, що залежить від довжини хвилі лазерного світла (^), розмірів сперматозоїдів (Р), кута детектування розсіяного сперміями лазерного світла (6) і потужності лазерного випромінювання, що опромінює сперматозоїди ( г о ) , що усі визначаються і встановлюються в попередніх дослідах і задаються постійними величинами у вигляді імперативів Те, що в запропонованому винаході використані вищевказані ознаки, дозволяє досягти вирішення поставлених задач - підвищення точності вимірювання внутрішніх енерговитрат сперматозоїдів (за рахунок зниження динамічної помилки і скорочення терміну вимірювання при збереженні статистичної вибірки), тому що аналізатор якості сперми має оригінальну схему побудови оптичної частини пристрою, а процесор реалізований для виконання запропонованого унікального алгоритму обробки сигналу фотоприймача Алгоритм роботи процесора побудований на простих операторах, що забезпечує можливість створення портативних аналізаторів сперми Крім того, розглянутий аналізатор якості сперми можливо реалізувати з використанням як аналогового, так і цифрового принципу обробки електричних сигналів, тобто, для нього характерні простота, технологічність і гнучкість побудови З огляду на неочевидність зазначених стверджень розглянемо більш докладно методологічні аспекти й у цьому зв'язку сутність винаходу Суть запропонованого винаходу і методологічний аспект Величиною, що безпосередньо вимірюється в кореляційному експерименті є не сам спектр розсіяного досліджуваною системою світла а спектр (або кореляційна функція) флуктуацій фотоструму на виході прибору, що фотореєструє Цей спектр являє собою результат биття гармонік електромагнітних полів один з одним і зосереджений у низькочастотній області , тобто там, де можливо проводити аналіз сучасними радіотехнічними засобами Вже на цьому рівні, як то на рівні класифікації гармонік електромагнітних полів, що реєструються фотодетектором, виникають два варіанти вимірів а) на фотодетектор потрапляє лише світло, що розсіяне досліджуваною системою У цьому 45471 варіанті реалізується гомогенний метод виміру, б) разом із розсіяним на фотодетеїсгор потрапляє і частина нерозсіяного (опорного) випромінювання Цей варіант одержав назву гетеродинування На основі аналізу відомих літературних даних можна зробити загальні висновки з цього питання 1 Ідеальне в теоретичному плані гетеродинування дозволяє за інших рівних умов і однаковому часі аналізу одержати в два рази більшу статистичну точність, ніж ідеальне гомодинування 2 Математична обробка результатів вимірів при гетеродинування простіше, оскільки вона звичайно полягає в розкладанні спектра або кореляційної функції на адитивні внески різноманітного походження Ця процедура полегшається, якщо вимірюється сама кореляційна функція, а не й квадрат Те ж можна сказати і для спектрального аналізу, коли вимірюється сам спектр, а не його автозвертка 3 Технічна реалізація гомодинування істотно простіше відпадає необхідність ретельної юстировки і віброзахисту оптичної частини установки 4 У гомогенному режимі легше використовувати техніку рахування фотонів із усіма перевагами, що випливають із цілком цифрової обробки сигналу Отже, гетеродинування в два рази точніше, проте гомодинування набагато простіше в експерименті Розглянемо програмне забезпечення обробки електричного сигналу фотоприймача в лазернодопплерівському спектрометрі, ВІДПОВІДНО до прототипу [5] Алгоритм підпрограми "Керування" для одержання Інформації про рух клітин по флуктуаціям розсіяного світла представляється в такій ПОСЛІДОВНОСТІ операцій Одинична кореляційна функція займає в пам'яті Мікро-ЕОМ 100 байт Обмін інформацією між корелятором і комп'ютером організований на тактовій частоті ЮкГц Обсяг оперативного пристрою, що запам'ятовує, дозволяє записати 16 Кбайт інформації, що відповідає 160 послідовним вимірам, що може бути перенесена на гнучкі магнітні носи Термін побудови одиничної кореляційної функції визначається часом затримки між двома послідовними вибірками і КІЛЬКІСТЮ цих вибірок При статистиці 2 1 3 сигналів і т , рівнім ЮОмкс, побудова кореляційної функції розсіяного світла відбувається протягом 0 82с Вибір величини статистики вибірок, які опрацьовуються, при побудові кореляційній функції визначається характеристиками досліджуваного процесу, при цьому мінімальна КІЛЬКІСТЬ вибірок обмежується власними шумами біологічних систем Термін між двома послідовними вимірами задається КІЛЬКІСТЮ "порожніх" циклів у програмі "Керування" плюс час, що витрачається на передачу даних по каналах обміну Шпаруватість сканування може змінюватися в межах від Юмс до часу, що обумовлюється лише параметрами досліджуваного процесу Слід зазначити, що час обміну хоча й обмежує шпаруватість між вимірами, але не впливає на точність проведеного аналізу Завдяки за 10 стосуванню цифрового корелятора досягається 100% ефективність використання фотоструму під час побудови кореляційної функції Після набору масиву кореляційної функції провадять відновлення інформації про параметри руху клітин у популяції Для суспензії, що складає з рухливих і нерухомих клітин, кореляційна функція складається з швидке і компонентів, що повільно спадають, [6], типовий вид якої, отриманий у наших експериментах, поданий на фіг 1 У загальному вигляді кореляційну функцію для такої системі можна уявити як G 1 (x)=pG m 0 |(x)+(i-p)G i m (x) i 3 Де ^molW . швидкоспадаюча компонента від рухливих клітин, Р - частина рухливих клітин (активність), ^\т\У) . спадаюча повільно складова від нерухомих клітин У принципі клітини з нульовою швидкістю не дають допплерівського зсуву частоти і не можуть бути детектовані, але в умовах реального експерименту вони завжди підпадають під вплив рухливих сусідів і тому мають деяку швидкість, що і дає внесок у сумарну кореляційну функцію При термінах затримки ЮОмкс повільноспадаюча компонента від малорухомих клітин добре описується константою, оскільки чисельні оцінки, приведені у вищевказаній роботі, дають ВІДМІННІСТЬ ВІД константи менше 1% Частина , що повільно спадає, має вигляд Лоренцевої кривої, напівширина котрої обернено пропорційна векторові розсіювання і середній швидкості руху клітин GmolW= 1 1+ gvx Де g - модуль вектора розсіювання, v - середня швидкість руху клітин, т - експериментальний термін затримки Отримані експериментальні результати підгоняються під теоретичну форму автокореляційної функції розсіяного світла за методом найменших квадратів шляхом варіювання v і Р У результаті цього відокремлюється інформація про середню швидкість руху клітин і відносної КІЛЬКОСТІ рухливих клітин у сучасному моменті часу Розмір внутрішніх енерговитрат на рух клітин у популяції обчисляють за формулою -2 Е= vp-G(0)-p-G(0) 5 Таким чином, в розглянутому пристрої - прототипу реалізована автоматизація знімання й опрацювання інформації про швидкість, рухливості й енерговитратах на прямування клітин у популяції з виключенням суб'єктивізму оцінки Реальний час знімання й опрацювання інформації складається в межах 0,5 1 хвилин При дослідженні руху сперматозоїдів у зада 11 45471 12 С х С чах оцінки якості сперми важливою характеристиненорм ( ) = норм кою процесу є показник відносних внутрішніх енерДе говитрат клітини (а також усієї популяції) на переміщення в в'язкому середовищі Як було показано G(0) \ / при цьому \ / - пропорційно, як нами раніше, цей показник пропорційний квадрату показано в наших експериментах, КІЛЬКОСТІ сперсередньої миттєвої швидкості, помноженому на матозоїдів або рухливих мікроорганізмів у зоні коефіцієнт, що пов'язаний із властивостями серерозсіювання лазерного випромінювання довища і формою клітини Для одержання значень середньої швидкості руху сперматозоїдів звичайно G х а Е Таким чином, ()т->«> = ~ " Q застосовуються кінематографічний або фотограде Е - потужність внутрішніх енерговитрат фічний методи, а останнім часом - метод лазерної 2 спектроскопії Засіб виміру швидкості руху шляхом сперматозоїдів, що пропорційна E ~ v •N ] | відбипобудови спектра розсіяного лазерного випроміває енерговитрати мікроорганізмів на подолання нювання має високу точність і об'єктивність, але сил в'язкого тертя середовища Зв'яжемо тепер достатньо працезатратний у плані опрацювання G T " ( ) із фотострумом детектора розсіяного лазерекспериментальної інформації Проте, як буде ного випромінювання показано нижче, існують можливості безпосереднього виділення інформації про внутрішні енерго9 + т 9 витрати клітини і популяції в цілому на рух з фото+ x)dt G(x)= hm струму детектора розсіяного лазерного TT випромінювання, що має допплерівський зсув по де *(*) - інтенсивність фотоструму У цьому частоті При цьому відпадає необхідність побудови випадку маємо автокореляційної функції і и подальшого цифрово9 + т го опрацювання методом підгонки експеримента9 I"(t + x)dt льних даних до теоретичної функції, що істотно G"(x)= hm тТ впливає на систематичну помилку вимірів Інтегруючи цей вираз вроздріб, одержимо Запишемо вираз для кореляційної функції фотоструму (кореляційної функції амплітуди розсіяСненоРм(х)= l i m | l ( t ) - I ' ( t + x) + - | + J l ' ( t ) - I ' ( t + x)dt ного лазерного світла, що у випадку гетеродинної Т^к, І _т І _т схеми виміру збігається з кореляційною функцією , 12 фотоструму) [6] у вигляді З огляду на те, що перший додаток тут прямує до нуля, одержуємо вираз smgvx p(v)dv G(x)= J 2 gvx 6 'ненорм Де g 4л модуль вектору розсіювання © _ g= sin — ,© ^ 2 . К ут розсіювання лазерного світла сперматазосперматозоідами , ^ - довжина хвилі падаючого лазерного випромінювання), т -термін затримки при побудові кореляційної функції, Р ^ - розподіл клітин сперматозоїдів по швидкостях їхнього руху Можна показати, що при G(x)= J при smgvx p(v)dv =1 gvx smgvx тому що gvx Ось чому для визначення квадрата швидкості потрібно взяти другу похідну- від за часом у 2 точці х- 0 Дійсно, G'fxl, = - ^ T v ° 2 ,тому Таким чином, - 7' , 13 Сненорм огляду на формулу (7) „Ч(П 2 маємо /(Г) 2 \~Е , 14 Отже, середнє значення, що пов'язано з природою реєстрації фотоприймачем лазерного випромінювання, квадрата похідною фотострума детектора розсіяного лазерного випромінювання пропорційно внутрішнім енерговитратам мікроорганізмів, зокрема сперматозоїдів, на прямування у в'язкому середовищі Коефіцієнт пропорційності у формулі (14) визначити не важко З огляду на, що для кореляційної функції неточечних об'єктів, що рухаються , відомий вираз [7] X ~ 1 + (2,75gvx-27i)2 Одержуємо q ( 1 5 g"(x)t^=-2-(2,75q-27i) 2 -v 2 _ 1 6 або 7 тобто, друга похідна кореляційної функції пропорційна квадрату миттєвої швидкості руху сперматозоїдів Якщо ж використовувати ненормуєму кореляційну функцію, що дорівнює [6] Тому що під енерговитратами ми розуміємо = v 2 -N тобто = 2-(2,75q-27i)2-E 18 Звідси остаточно отримуємо 13 E= 45471 1 2-(2,75q-27i)' u J і At ! 1 9 Вираз енерговитрат у вигляді (19) уже збігається з тим виразом, що досліджувався нами раніше Праісгичну реалізацію розглянутого алгоритму виміру енерговитрат на рух мікроорганізмів у в'язкому середовищі з використанням лазернодопплерівського спектрометра можна здійснити на персональному комп'ютері будь-якого класу Для цього сигнал фотодетектора розсіяного на мікрооб'єкті, що рухається, лазерного випромінювання через аналогово-цифровий перетворювач із частотою знімання, наприклад 5кГц, заносять , в ОЗУ комп'ютера Для реалізації описаного вище алгоритму достатньо було б проводити виміри фотоструму з частотою 1 кГц, щоб одержати інформацію в дискретному виді Але завдяки підвищеній частоті вдасться одержати середнє арифметичне високочастотних шумів фото детектора Для цього застосовується засіб цифрової фільтрації за методом ковзного середнього, тобто у обчислювальному 14 алгоритмі використовується сигнал, автоматично усереднений по п'ятьох точках У цьому випадку заключна формула одержання похідною фотоструму має вигляд fj=k+5 r= І 2 j=k-1 ij 2 ^ О 5-10"° ,20 Таким чином, вимірювальний комплекс (аналізатор якості сперми), з аналізованим алгоритмом опрацювання сигналів детектора фотоприймача методом гетеродинування, має достатньо високу точність виміру (що природно) параметрів внутрішніх енерговитрат на рух сперматозоїдів, швидкодію, експлуатаційну гнучкість, простоту технічного виконання (аналоговий або цифровий варі анти), тому що в оптичній схемі використаний принцип одержання биття електромагнітного випромінювання в оптичному діапазоні, що припускає вимір флуктуації фотоструму, а процесор практично і технічно реалізований винятково простими операторами послідовної дії, якто Таблиця 1 Структура процесора № оператора Функція оператора 1 Фільтрація сигналу 2 Усереднення в мікротерміновому діапазоні 3 Диференціювання середнього сигналу фотоструму 4 Зведення в квадрат 5 Інтегрування за час проведення експерименту Приклад реалізації запропонованого винаходу На фіг 2 представлена структурна схема аналізатора якості сперми, що вміщує в себе джерело лазерного випромінювання 1, схему формування випромінювання 2 вимірювальну камеру 3, що виконується з прозорого материалу і що має термостатичний кожух 4, що з'єднаний з термонагрівачем 5 і каналом вводу 6 зразком сперми Фотоприймач 7 з діафрагмою Обскура 8, вихід якого з'єднано зі входом попереднього підсилювача 9, вихід якого з'єднаний зі входом амплітудно - цифрового перетворювача 10, вихід якого з'єднано зі входом процесора 11, що має зв'язок з блоком 12 вводу - виводу В аналізаторі, який розглядується, згідно з винаходом, схема формування випромінювання 2 має диафрагму 13, що встановлена перед двоплечевою призмою 14 для одержання двох лазерних променів, що під заданим кутом перетинаються у центрі вимірювальної камери 3 Канал вводу 6 примірника сперми з'єднано з дозатором 15, а процесора 11 виконано з реалізацією алгоритма використання автокореляційного аналізу флуктуацій фотоструму змішаних оптичних сигналів від сперматозоїдів, що рухаються, і опорного лазерного променю таким чином, що вимірювана величина власних енерговитрат на рух сперматозоїдів в середовищі і в реальному масштабі часу обчислю Технічна реалізація Широкополосний фільтр RC - ланцюг Диференціальний підсилювач Квадратичний підсилювач Суматор або ж RC - лагцюг ді 91 Е - власні енерговитрати на переміщення сперматозоїдів у в'язкому середовищі, Дж , І - середній струм фотодетектора, що вимірюється в режимі оптичного гомодирування реєстрації розсіяного сперміями лазерного променю світла, що усереднений за часом не більш як Юмс, At - інтервал часу усереднення квадрату похідної середнього фотоструму за термін набору текучої інформації в межах від ЗОмс до 10с, \ і - символ усереднення, В(А, р, Є, го) нормуючий коефіцієнт розмірності, що залежить від довжини хвилі лазерного світла ( ^ ) , розмірів сперматозоїдів (Р), кута детектування розсіяного сперміями лазерного світла (6) і потужності лазерного випромінювання, що опромінює сперматозоїди ( г о ) , що усі визначаються і встановлюються в попередніх дослідах і задають 15 16 45471 ся постійними величинами у вигляді імперативів З огляду на те, що в розглянутому аналізаторі якості сперми вимірюється (без проміжних вимірів швидкості і рухливості організмів) тільки величина внутрішніх енерговитрат сперміїв на їхнє рух в в'язкому середовищі, необхідно розглянути експериментальне обґрунтування цієї ознаки Приклад 1 По обґрунтуванню параметра контролю енергетичної характеристики руху клітин у популяції БІОЛОГІЧНИЙ об'єкт рухливих клітин поміщали у вимірювальну камеру при заданій температурі Т = 20°С, що підтримували на протязі експерименту з точністю 0,1 °С Освітлювали лазерним світом із реєстрацією розсіяного світла і виміром флуктуацій фотоструму, по яким будували кореляційну функцію v Одержували величину швидкості ( ) , _2 квадрата швидкості ( v ) і енерговитрат на рух _2 клітин у популяції (E = v riG(O)) Потім експерименти повторювали, але при температурі Т = ЗО ± 0 1°С По цих результатах обчисляли А ± а, де А показник, що вимірюється У таблиці 2 наведені значення для всіх досліджуваних параметрів біологічних об'єктів (сперма биків і людини, клітин водорослей Pedmomonas, Dunahella Salma і найпростіших - інфузорій Tetrahymena pymbnnis) Таблиця 2 Оцінка величини К(ДТ = 10°С) = А(30°С) для різноманітних параметрів руху клітин А(20°С) Швидкість № 1 2 Сперма людини Сперма биків 3 Водорості Pedmomonas Dunahella Salma Інфузорії Tetrahymena pynformis 4 Параметри руху Рухливість 1 33 ± 0 02 1 38 ± 0 01 1 78 ± 0 11 1 90 ± 0 07 Енерговитрати 1 93 ± 0 16 2 06 ± 0 09 1 36 ± 0 07 1 45 ± 0 10 1 85 ± 0 18 2 09 ± 0 14 216 ± 011 2 48 ± 0 22 1 33 ± 0 15 1 77 ± 0 22 2 65 ± 0 47 БІОЛОГІЧНИЙ об'єкт Кінетичний показник ферментативних реакцій, ДО 2 00 (див Наприклад, [Маршелл, 1981, Хочачка Сомеро, 1977]) (див наприклад [Гофман, 19711) Результати, які подані в таблиці 2 дозволяють зробити наступні висновки З літературних джерел відомо, що при зростанні температури інкубації на 10°С швидкість ХІМІЧНИХ реакцій зростає в 2 рази (тут маємо на увазі ферментативні процеси синтезу і гідролізу АТФ), а на долю рухових АТФаз припадає 70 - 85% від спільної АТФазної активності сперматозоїдів У цім плані швидкість поступального руху статевих клітин досліджуваних видів явно не відбиває хімічну джуваних організмів 3 цього випливає, що саме показник Е пропорційний відносним енерговитратам клітин на рух і відбиває температурну кінетику ферментативних процесів, пов'язаних із циклом синтезу АТФ Приклад 2 Аналіз приладових і статистичних погрішностей виміру параметрів руху клітин За біологічний об'єкт дослідження розглянемо клітину сперміїв бика Точність визначення долі рухливих клітин можна оцінити, диференцюючи кінетику енерговитрат, тому що К(АТ = 10°С) = 1,3 1,4 Крім того, швидкість поступального руху не має розмірності енергії, а тому безпосередньо _2 вираз для кореляційної функції G(t) по Р дані, тобто ( v ) і (E = v л^С-О) співставляти неправомічно От чому нами пропонується використовувати показник внутрішніх енерговитрат у вигляді Е , для якого К(ДТ=10°С) (у випадку сперміїв) дорівнює 1,9 2,1, що цілком узгоджується з загальними уявами про внутрішні енерговитрати на рух клітин Деяка розбіжність К(АТ=10°С) для інших біологічних об'єктів, очевидно, пов'язана з резервними механізмами енергообміну в цих клітинах дослі Виходячи з того, що точність визначення амплітуди G(T) складає 0 01, можна знайти межу можливості розв'язання Р при фіксованій швидкості v руху клітин Результати оцінки наведені в таблиці З Таблиця З 17 № 1 2 3 18 45471 Залежність абсолютної погрішності рухливих клітин від швидкості і частоти вертіння головки сперміїв Характеристика Частота вертіння головки, Гц Швидкість руху, мкм/с Абсолютна погрішність виміру долі рухливих клітин Як очевидно з таблиці 3, у достатньо широкому діапазоні зміни середніх швидкостей руху сперматозоїдів абсолютна погрішність виміру Р має величину біля 0 01 і лише при малих швидкостях вона незначно збільшується Для оцінки погрішності виміру середньої швидкості руху частинок у суспензії, зв'язаної з дискретністю визначення як амплітуди - напівширини кореляційної функції (0 01), так і з тимчасовим квантуванням корелятора (ЮОмкм), виразимо зміну швидкості, що визначається по напівширині кореляційної функції, через зміни значення часу затримки ^ х Враховуючи незалежність цих 10 85 0 010 8 68 0 011 Значення 6 51 0 011 4 34 0 013 2 17 0 021 параметрів одержимо вираз у вигляді