Спосіб виділення шуканого аналіту з складу речовини і пристрій для визначення афінності партнерів по скріпленню

1 Спосіб виділення шуканого аналіту з складу речовини, що містить етапи, на яких (і) приводять речовину в контакт з іммобілізованим на поверхні партнером по скріпленню з аналітом і (м) надають поверхні коливального руху із зростаючою амплітудою для видалення аналіту або іншого компонента складу речовини з поверхні і (їм) реєструють явище дисоціації 2 Спосіб за п 1, в якому аналіт або інший компонент вибірково видаляють і розділяють 3 Спосіб за п 1, в якому видалення аналіту або іншого компонента реєструють 4 Спосіб за п 3, при якому визначають афінність партнерів по скріпленню по відношенню один до одного або властивість одного з партнерів по скріпленню, що залежить від афінності 5 Спосіб за п 3, при якому визначають інтенсивність скріплення між партнерами по скріпленню 6 Спосіб за п 3, при якому визначають наявність іншого партнера по скріпленню 7 Спосіб за 3, в якому інший партнер по скріпленню є частинкою або іммобілізований на частинці 8 Спосіб за п 7, в якому визначають розмір або наявність частинки 9 Спосіб за будь-яким з пп 3-8, в якому явище дисоціації реєструють по акустичному випромінюванню 10 Спосіб за п 9, в якому здіснюють коливання поверхні з частотою, яка відповідає одній основній частоті, і акустичне випромінювання реєструють поблизу іншої резонансної частоти 11 Спосіб за п 10, в якому поверхня є частиною мікроваг на кристалі кварцу (МКК), які збуджують засобом збудження коливань на їх основній резонансній частоті, причому МКК реєструє акустичне випромінювання поблизу частоти, яка визначається як 3 основних резонансних частоти 12 Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому ліганд або будь-який з партнерів по скріпленню являє собою білок, антитіло, антиген, фермент, інгібітор ферменту або полінуклеотид 13 Спосіб за будь-яким з пп 1-11, в якому ліганд або партнер по скріпленню являє собою клітину, бактерію, вірус, прюн або фаг 14 Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому різні партнери по скріпленню іммобілізовані в різних місцях поверхні 15 Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому поверхня є частиною п'єзоелектричного перетворювача або акустичного перетворювача 16 Спосіб за п 13, в якому перетворювач являє собою мікроваги на кристалі кварцу або пристрій поверхневої акустичної хвилі 17 Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який здійснюють в рідкому середовищі 18 Спосіб за будь-яким з пп 1-16, який здійснюють у повітряному середовищі 19 Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому поверхня коливається в площині поверхні 20 Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому для видалення аналіту або іншого компонента складу з поверхні здійснюють коливання поверхні з амплітудою, що постійно збільшується 21 Пристрій для визначення афінності партнерів по скріпленню по відношенню один до одного, що МІСТИТЬ поверхню, на якій іммобілізований один з партнерів по скріпленню, засіб збудження коливального руху поверхні із зростаючою амплітудою в площині поверхні і засіб реєстрації явища дисоціації 22 Пристрій за п 21, в якому засіб реєстрації виконаний з можливістю реєстрації акустичного випромінювання 23 Пристрій за п 21 або 22, в якому іммобілізований партнер по скріпленню являє со О (О 00 ю бою білок, антитіло, антиген, фермент, інгібітор ферменту або полінуклеотид 24 Пристрій за п 21 або 22, в якому іммобілізований партнер по скріпленню являє собою клітину, бактерію, вірус, прюн або фаг 25 Пристрій за будь-яким з пп 21-24, в якому різні партнери по скріпленню іммобілізовані в різних Винахід відноситься до способів вимірювання міжмолекулярних взаємодій І розділення, сортування і калібрування часток Зокрема, винахід відноситься до вимірювання афінності різних партнерів по скріпленню по відношенню один до одного, наприклад, при взаємодії антитіло-антиген ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Специфічне розпізнавання молекул це фундаментальний процес, що лежить в основі взаємодій фермент-ліганд, взаємодій антитіл о-анти ген і скріплення молекул з рецепторами Розпізнавання молекул здійснюється за допомогою нековалентних взаємодій, наприклад, електростатичної взаємодії (водневі зв'язки) і гідрофобних взаємодій Результати термодинамічних вимірювань констант зв'язку і зміни вільної енергії, ентальпії і ентропії проливають світло на молекулярну основу розпізнавання, особливо в поєднанні з інформацією, отриманою методом дифракції рентгенівських променів і, по можливості, сайт-специфічного мутагенезу Прямі вимірювання інтенсивності взаємодії виробляли методами мікроскопи міжатомних взаємодій (МАВ), а також за допомогою пристрою поверхневих сил Оскільки метод МАВ заснований на вимірюванні сили розриву зв'язку, недолік цього методу полягає в тому, що вимірювання можна проводити однократно Досі МАВ використовували для вивчення взаємодій авидин-бютин (Florin et al , Science, 1995, 264 415), гібридизації ДНК (Boland et al , PNAS, 1995, 92 5291), взаємодій антитіл о-анти ген (Dammer et al , Biophys J , 1996, 70 2437) і адгезійних глікопротешів (Dammer et al Science, 1995, 267 1173) Розділення біологічних молекул на основі їх відносної афінності до лігандів є загальновідомим методом Наприклад, в афінній хроматографії, компоненти, що підлягають розділенню, пропускають по колоні, що містить специфічний ліганд Потрібний компонент виборче і сильно зв'язується з колоною і утримується на колоні при видаленні інших компонентів На подальшому етапі, пов'язаний матеріал можна видалити з колони Технології відділення є важливою частиною багатьох експериментальних досліджень Бажано підвищити чутливість або вибірковість цих методів У роботі Kolomenskii et al , J Appl , Phys , 1998, 84(4) 2404-10 розкриті дослідження очищення і адгезії поверхні, проведених з використанням поверхневих акустичних Імпульсів, що генеруються лазером У цих дослідженнях застосовували імпульси постійної енергії з низькою частотою повторення (20Гц) Оскільки процедура здійснюється у вакуумі, вона непридатна для комерційного засто 57876 місцях поверхні 26 Пристрій за будь-яким з пп 21 -25, в якому засіб збудження коливань містить п'єзоелектричний або акустичний перетворювач 27 Пристрій за п 26, в якому перетворювач являє собою мікроваги на кристалі кварцу або пристрій поверхневої акустичної хвилі сування Для реєстрації видалення часток використовували оптичний мікроскоп, який не дозволяє розрізнювати частки різних розмірів У патентній заявці WO-A-98/45692 розкрите використання датчика на основі п'єзоелектричного кристала для визначення утворення/дисоціації клатратних гідратів У роботі Kurosawa et al , Chem Pharm Bull , 1990, 38(5) 1117-20 повідомляється про використання такого датчика для реєстрації аглютинації латексного носія антитіл У патентній заявці WO-A-98/40739 також розкритий подібний датчик, що містить пластину, на якій імобілізовані специфічні об'єкти, що зв'язуються, які використовуються для вказування наявності клітин в середовищі Ці датчики використовують, вимірюючи зміну резонансної частоти при ПОСТІЙНІЙ напрузі У цей час, по можливості, більшість вірусів виявляють за допомогою культури зразка в клітинах, оскільки цей спосіб забезпечує чутливість, хоч і вимагає великих витрат часу Пряме виявлення вірусної ДНК або РНК в КЛІНІЧНИХ зразках можна здійснювати з використанням PCR і специфічних праймерів, пристосованих для потрібного вірусу Оскільки PCR передбачає етап посилення, виникає серйозна проблема перехресного забруднення, що ускладнює застосування надійних способів КІЛЬКІСНОГО аналізу Існують і ІНШІ прямі способи, в тому числі електронна мікроскопія, імунна електронна мікроскопія і способи, засновані на виявленні антигенів за допомогою імобілізованого на антитілі ферменту Ці способи нерідко виявляються недостатньо чутливими і, тому, для їх здійснення потрібна відносно велика КІЛЬКІСТЬ вірусних часток РОЗКРИТТЯ ВИНАХОДУ В основі даного винаходу лежить той факт, що зв'язки між шуканою молекулою або шуканою молекулою, приєднаною до часток, і поверхнею можна руйнувати, збільшуючи амплітуду механічних коливань поверхні, що приводить до відриву шуканої молекули або частки від поверхні Необхідне для цього прискорення, а, отже, сила, визначається різними чинниками, в тому числі масою молекули або частки, характером зв'язку з поверхнею і геометричною формою або розміром шуканої молекули або частки Таким чином, даний винахід можна використати для відділення або калібрування різних шуканих молекул або для реєстрації їх наявності Згідно З першим аспектом даного винаходу, спосіб виділення шуканого аналіту з складу містить етапи, на яких (і) приводять склад в контакт з імобілізованим на поверхні партнером по скріпленню з аналітом і 57876 (м) надають поверхні коливальне рушення із відділення не вимагає великих витрат і легко позростаючою амплітудою для виборчого видалення дається мультиплексуванню і автоматизації Він, аналіту або інших компонентів складу з поверхні наприклад, дає можливість осаджувати різні шукаКрім того, даний винахід можна використати ні об'єкти в різних позиціях на одні і ті ж мікроваги і при здійсненні способу визначення наявності або скрикувати бібліотеку лігандів по відношенню відрозміру часток або афінності партнерів по скріпразу до декількох шуканих об'єктів Ще однією обленню по відношенню один до одного Згідно З ластю застосування є виявлення і аналіз вірусних другим аспектом винаходу, цей спосіб містить етачасток фіксованого розміру Істотно також, що дапи, на яких ний винахід передбачає новий спосіб дослідження сил, що беруть участь в молекулярному розпізна(і) приводять в контакт партнери по скріпленванні, що забезпечує чутливість і можливість КІЛЬню, один з яких імобілізований на поверхні, КІСНИХ вимірювань (м) повідомляють поверхні коливальне рушення із зростаючою амплітудою і ПЕРЕВАЖНИЙ ВАРІАНТ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ (їм) реєструють явище дисоціації Згідно З ЦИМ другим аспектом, винахід можна Даний винахід передбачає використання призастосовувати до різних фізичних і ХІМІЧНИХ ЗВ'ЯЗстрою датчика, якому можна надавати коливальне КІВ, починаючи з відносно слабих взаємодій, нарушення Датчику можна надавати коливальне приклад, водневих зв'язків, І закінчуючи ковалентрушення різними способами, наприклад, за допоними зв'язками могою пристроїв поверхневих акустичних хвиль, резонансних пристроїв на кристалі кварцу, приПристрій, придатний для використання згідно з строїв на основі моди акустичної пластини і гнучкої даним винаходом, містить поверхню, на якій імобіпластини у вигляді тонкої мембрани лізований один партнер по скріпленню, засіб збудження коливання поверхні із зростаючою ампліКомерційне доступні датчики багатьох різних тудою і засіб реєстрації явища дисоціації типів, придатних для використання у винаході Опис датчиків, які можна використати в даному Зокрема, пристрій може містити акустичний винаході, міститься в роботі Acoustic Wave перетворювальний пристрій (АПП), наприклад, Sensors, Ballantme et al , (1997) Academic Press мікроваги на кристалі кварцу (МКК) або пристрій Датчик, переважно, являє собою пристрій поверхповерхневої акустичної хвилі або будь-який п'єзоневої акустичної хвилі або, що більш переважно, електричний матеріал, який можна приводити в мікроваги на кристалі кварцу (МКК) коливання, наприклад, прикладаючи змінне напруження або магнітне поле Ці пристрої дешеві в МКК звичайно являє собою диск з кристалічнопорівнянні з МАВ, і їх можна мультиплексувати го кварцу із золотими електродами на верхній і Інша перевага використання такого пристрою понижній поверхнях При подачі на електроди змінлягає в тому, що відбувається одночасне руйнуної напруги він відчуває коливання зсуву, внаслівання великої КІЛЬКОСТІ зв'язків, ЩО приводить до док п'єзоелектричного ефекту Зростання напруги збудження звукових хвиль, що реєструються і госприводить до збільшення амплітуди коливань трих шумових ПІКІВ при певних значеннях прискоМКК рення (напруження, що подається на АПП) Ще Кристал кварцу також є чутливим мікрофоном, одна перевага полягає в тому, що АПП можна виі його можна використати для реєстрації акустичкористати як чутливий мікрофон для реєстрації ного випромінювання, виникаючого внаслідок акустичного випромінювання, коли відбувається явища відриву Технічно простіше збуджувати коявище дисоціації ливання на частоті, ВІДПОВІДНІЙ ОДНІЙ ОСНОВНІЙ резонансній частоті і реєструвати акустичне випроВІДПОВІДНО ДО рівня техніки, в більшості експемінювання поблизу іншої моди Наприклад, МКК риментів з використанням АПП, зміни резонансної збуджують на їх резонансній частоті і реєструють частоти або фази вимірювали при ПОСТІЙНІЙ напруакустичне випромінювання на м третій гармоніці зі на АПП Даний винахід, навпаки, передбачає збільшення збудливої напруги, а отже, амплітуди З метою ілюстрації, термін «аналіт» можна виколивань АПП користати для опису зв'язуючого партнера або компонента, який входить в контакт зі зв'язуючим Даний винахід має широку область застосупартнером, імобілізованим на поверхні Після вання в процесах відділення, сортування і калібвстановлення контакту, аналіт зв'язується з датчирування Приведені нижче Приклади свідчать про ком за допомогою міжмолекулярної взаємодії і те, що в повітряному середовищі, сфери, маркірозазнає прискорення, а отже, впливу сили, приклавані стрептавідином, можна ВІДДІЛЯТИ ВІД нормаденої до аналіту По мірі зростання амплітуди кольних латексних сфер, подаючи на МКК з бютиниливань, при досягненні силою певного порогу, відльованою поверхнею збудливу напругу понад бувається розрив зв'язку Раніше пов'язана частка 0 1В, але нижче за 6В Нормальні латексні сфери аналіту отримує можливість перекочуватися по відриваються від поверхні, тоді як сфери, маркіроповерхні вані стрептавідином, залишаються приєднаними до поверхні (за допомогою більш сильного зв'язку Аналіт може являти собою мікроскопічний об'стрептавідин-бютин) Це відкриває нові можливосєкт, здатний утримуватися на датчику за допомоті для використання технології відділення, засногою міжмолекулярної взаємодії Аналіт може являваної на прикладенні змінної сили протягом певноти собою протеїн, антитіло, антиген, фермент, го інтервалу часу, яку можна застосовувати, інгібітор ферменту або полінуклеотид Аналіт монаприклад, для калібрування і сортування часток, же також являти собою більш велику частку, накалібрування клітин, пенінгу фага, а також для приклад, бактерію, клітину, вірус, прюн або фаг конструювання нових бюдатчиків Такий спосіб Інші приклади часток, які особливо придатні для 57876 8 використання в даному винаході, включають в можна, за допомогою чутливого підсилювача, ресебе мікросфери з будь-якого матеріалу, наприєструвати характерний шум і спостерігати рушенклад, кварцу, золота або латексу або великі макня часток, наприклад, за допомогою оптичного ромолекули, наприклад, плазміди Зв'язуючий мікроскопа Величина сигналу залежить від КІЛЬКОпартнер, імобілізований на поверхні, може відноСТІ часток, пов'язаних з поверхнею датчика Звиситися до того ж типу, і його можна вибирати ВІДчайно, коли МКК використовують ВІДПОВІДНО до ПОВІДНО І в залежності від ВІДПОВІДНОГО фізичного описаного нижче Прикладу 1, спільно з фізично або ХІМІЧНОГО зв'язку абсорбованими мікросферами, шум реєструють при напрузі 0 1-1 0В, в залежності від розміру мікДисоціацію більш дрібних аналітів переважно росфер, при цьому можна спостерігати під мікрореєструють по акустичному випромінюванню скопом, як мікросфери ковзають по поверхні і відБільш великі частки можна також реєструвати оприваються від неї Можна побудувати графік тичними засобами, наприклад, за допомогою мікзалежності рівня шуму, що генерується від ампліроскопи туди (або прикладеної напруги), який буде являти Згідно З першим аспектом винаходу, відділенсобою спектр сили відриву За допомогою графіка ня здійснюють шляхом імобілізацм шуканої молеможна визначити момент розриву зв'язку, оскільки кули на поверхні датчика за рахунок взаємодії з він відповідає піку шуму Таким чином, можна випартнером по скріпленню Потім поверхню можна значити критичну напругу, при якій відбувається привести в коливальне рушення, щоб відривати розрив зв'язку Належні калібрувальні експеримемолекули від поверхні датчика При цьому постійнти з використанням часток з відомими ЩІЛЬНІСТЮ І но збільшують амплітуду коливань, а отже, присилою зв'язку, дозволяють використати цей спосіб скорення, щоб, або видалити з поверхні шукану для КІЛЬКІСНИХ вимірювань Крім того, висота піка молекулу, або видалити з поверхні ІНШІ компоненакустичного випромінювання є мірою КІЛЬКОСТІ поти суміші, залишивши шукану молекулу пов'язав'язаних часток ною з поверхнею Згідно З переважним варіантом здійснення, для надання поверхні датчика коливаДаний винахід можна використати для вильного рушення використовують п'єзоелектричний вчення міжмолекулярної взаємодії, і, особливо, пристрій акустичної хвилі, наприклад, МКК Той для вивчення взаємодій фермент/ліганд, взаємосамий п'єзоелектричний пристрій можна викорисдій антитіло-антиген і взаємодій рецептор/ліганд тати як мікрофон для реєстрації акустичного шуму, або взаємодії між макромолекулою і її природним породжений явищем відриву партнером по скріпленню Даний спосіб також можна застосовувати для вивчення явищ гібридизації Метод відділення можна застосовувати для між полінуклеотидами Таким чином, згідно з первиділення молекул, які сильно взаємодіють конкшим аспектом винаходу, як ліганд може виступати, ретним партнером по скріпленню Наприклад, цей наприклад, білок, антитіло або антиген, фермент, метод можна застосовувати для виділення клітин інгібітор ферменту, полінуклеотид або велика макконкретними рецепторними молекулами, експреромолекула, наприклад, велика плазміда або вісованими на поверхні клітини, або для виділення рус Згідно З другим аспектом винаходу, з поверхантитіл з сильної афінністю до конкретного ліганнею або часткою може бути пов'язаний будь-який ДУ матеріал РІЗНІ ліганди можна розмістити в різних місцях Нижче приведені Приклади, що ілюструють поверхні за допомогою, наприклад, контактного винахід друку або з використанням масок або фотолітогЗгідно З ЦИМИ Прикладами, для вимірювання рафії Це дає можливість скрикувати суміш відноссил злипання між поверхнею і малою часткою вино відразу декількох сильно зв'язуючих партнерів з користовують спектроскопію сили відриву Для допомогою декількох різних лігандів Зокрема, вицього поверхні з тими, що знаходяться на ній мікнахід можна використати у застосуванні до пласрочастками надають коливальне рушення з монотинок, на яких імобілізовані різні матеріали, напритонно зростаючою амплітудою і, отже, зростаючим клад, рецептори У більш загальному випадку, прискоренням Для цього, поверхню приводять в пластинки можуть демонструвати матеріали, що рушення за допомогою п'єзоелектричного придозволяють тестувати різні інфекції, патогени, прістрою акустичної хвилі, в цьому випадку, мікроваг они, харчові алергени, віруси, бактерії і т д при на кристалі кварцу (МКК) По мірі зростання ампліздійсненні КЛІНІЧНОГО тестування людини або тватуди, зростає прискорення, а значить, і сила, пририни і при гігієнічному моніторингу їжі і води Крім кладена до частки Розрив всіх зв'язків, що з'єднутого, винахід можна використовувати для скринують частку з поверхнею, породжує акустичний вання бібліотеки, фагового відображення і т д шум, і той самий п'єзоелектричний пристрій викоДругий аспект даного винаходу передбачає ристовують як чутливий мікрофон для реєстрації спосіб визначення наявності або розміру часток цього шуму, породжений явищем розриву На фіг 1 або рівнів афінності молекул по відношенню одна показана схема пристрою, що використовується в до одної Переважно, одну молекулу імобілізують Прикладах 1-5, на фіг 8 схема переважного прина поверхні датчика, а іншу молекулу імобілізують строю показана в більш загальному вигляді на частці, наприклад, мікросфері Потім частку приєднують до датчика за допомогою міжмолекуЗокрема, схема, показана на фіг 1, містить лярної взаємодії, що вивчається Функцюналізовап'єзоелектричний перетворювач 10, генератор 11 ні частки приводять в коливальне рушення, подачисто-синусоїдального сигналу частоти f, генераючи на датчик напругу По мірі зростання тор 12 частоти 3f+Af, фільтр 13 частоти 3f+Af, блок амплітуди, сила досягає критичного значення, при 14 синхронного підсилювача і аналоговоякому відбувається розрив зв'язків У цей момент цифрового перетворювача і комп'ютер 15, введен 57876 10 лінії 36 і для прийому сигналів, що генеруються на ня даних в який і виведення керуючого сигналу з одному або декількох входах 38, а також для обякого позначені стрілками Згідно з Прикладами 1робки сигналу даних, наприклад, методом кореля5, f=14 2МГц і Д^82кГц Частки 16 знаходяться на ційного аналізу поверхні підкладки Робота датчика на основі ПАВ полягає в тому, На фіг 8 показані п'єзоелектричний перетвощо генератор 31 генерує напругу РЧ, яка придатна рювач 21 (наприклад, пристрій МКК, ПАВ і т п) і для забезпечення частоти ефективного перетвопідсилювач 22 із змінним коефіцієнтом підсилення, рення на виході 32, і вона поступає на генеруючи забезпечений входом 23 і виходом 24, здатний електроди 33 перетворювача, розташовані на п'євидавати вихідний сигнал з плавно зростаючою зо-підкладці 34 (пунктирна ЛІНІЯ) Амплітуда напруамплітудою під управлінням сигналу 25 Схема ги РЧ росте згодом під управлінням контролера також містить смуговий приймач 26 (наприклад, 35, здійснюваного по лінії 36 управління Приймааналогічний радіоприймачу ОБП) і аналоговольні електроди 37 перетворюють акустичне вицифровий перетворювач 27 або декілька таких промінювання, що виходить з активної зони, в елеперетворювачів, звідки дані поступають в ЛІНІЮ 28 ктричний сигнал, який поступає на вхід(входи) 38 Крім того, схема містить пристрій 29 управління, приймача/контролера 35 Дані, отримані після запису і обробки сигналу даних (наприклад, команалогово-цифрового перетворення, піддають п'ютер або спеціалізований процесор ЦСП) Консигнальній обробці, витягуючи корисні сигнали такт, вказаний пунктирною ЛІНІЄЮ ЗО, можна заміЗрештою, результати записують і/або представнити більш оптимізованим засобом фільтрації і ляють оператору підключення, як останнє може виступати, наприклад, пасивний LCR-контур Деякі результати, отримані в Прикладах, показані на фіг 2-7 і 10 Фіг2А, 2В, ЗА, ЗВ, 4А, 4В, 4С, У схемі, показаній на фіг 8, підсилювач 22 спі4D, 6В, 7 і 10 являють собою графіки залежності льно з перетворювачем 21, а також необов'язкошумового сигналу (S, ДОВІЛЬНІ ОДИНИЦІ) ВІД амплівим засобом ЗО фільтрації/підключення забезпетуди (А, вольти) Фіг 5А, 5В, 6Д І 6С ЯВЛЯЮТЬ собою чують простий коливальний контур, в якому графіки залежності шумового сигналу (S, ДОВІЛЬНІ коливання відбувається, переважно, на частоті ОДИНИЦІ) ВІД КІЛЬКОСТІ часток (N) ефективної роботи перетворювача, для МКК це може бути основна частота послідовного резонанВикористовуються наступні абревіатури су Ця частота коливань (F) рівна, наприклад, БСА бичачий сироватковий альбумін 14МГц Амплітуда напруги збудження на виході 24 БЛ бульйон луріа плавно зростає під управлінням контролера 29, ХДИ хлорид диметиламшоїзопропілу здійснюваним по лінії управління 25 Вихідний сигДМАП диметиламінопіридин нал акустичного випромінювання в точці ЗО можна ЕДК 1,3-диметиламшопропіл-Зочищати за допомогою необов'язкового фільтетилкарбодммід ра/з'єднувача, після чого подавати на вхід смугоN-ГС N-пдроксисукцинімід вого приймача 26 На основі критерію максимальСБФ сіль, буферизована фосфатом ного відношення сигнал-шум, як робочу смугу ПРИКЛАД 1 частот приймача можна вибирати, наприклад, реЛатексні сфери діаметром 5мкм приєднали до зонансну моду, що знаходиться поблизу третьої поверхні датчика МКК за допомогою множинних гармоніки (3*F+AF), наприклад, 42 082МГц зв'язків, ЩО досліджуються Сфери, що використовуються покривали 1% площі поверхні МКК ПоОдиничні або квадратурні ВИХІДНІ сигнали пегрішність діаметра сфер становила лише 1% ретворюються аналого-цифровим перетворюваДатчик МКК містив поліровані кварцові пласчем 27 або декількома перетворювачами з висотини, обрізані по фронту акустичної хвилі під кутом ким динамічним діапазоном Потім дані піддають 35°, діаметром 8 25мм На пластини були осаджені подальшій цифровій обробці на блоці 29, шари хрому (товщиною 20-30нм), а потім золота витягуючи корисний сигнал, який записують і/або (товщиною 100-120нм) представляють спостерігачеві Підсилювач 22 можна додатково обладнати пасивним вихідним і/або Провели експериментальне дослідження в повхідним фільтром(ами), щоб підвищити відношенвітряному середовищі трьох різних зв'язків фізичня сигнал-шум, а також, щоб гарантувати, що коного зв'язку (латекс-золото), зв'язок стрептовідинливальний контур працює на правильній частоті і з бютин і ковалентний зв'язок (амідний зв'язок) Для правильним зсувом фази струму відносно напруги створення фізичного зв'язку, латексні сфери вмісна перетворювачі тили безпосередньо на поверхню датчика і висушили азотом Для створення зв'язку стрептовідинНа фіг 9 показаний переважний варіант датчибютин, на поверхню наклали бютинільований БСА ка на основі ПАВ, що використовується у винаході і висушили азотом Для створення ХІМІЧНОГО зв'язВін МІСТИТЬ засіб 31 генерації напруги РЧ на виході ку, сформували моношар тіолу, використовуючи 32 з амплітудою, що підвищується, яка поступає тіол з кислотним кінцем (12-меркаптододеканойну на електроди 33 перетворювача Структура електкислоту), розчинений в етанолі, потім її активували родів 33 оптимізована для генерації на п'єзоз використанням ЕДК-N-TC і додали сфери з кінпідкладці 34 ПАВ з високою амплітудою Структуцевою аміногрупою для формування амідного ра електродів 37 оптимізована для найбільш ефезв'язку ктивного перетворення акустичного випромінювання в електричний сигнал Це може бути Експерименти проводили в камері, забезпеческладний шаблон, що містить одну або декілька ній двома оптичними вікнами, одне з них забезпепар електродів Пристрій додатково містить блок чувало освітлення зразка, а інше дозволяло споуправління 35 для управління генератором 31 по стерігати розсіяне лазерне світло за допомогою 12 11 57876 оптичного мікроскопа МКК знаходилися в камері ження Q, а отже, до зниження амплітуди коливань Для збудження МКК використали генератор сигнапри заданій напрузі в порівнянні з тими ж величилу моделі DS345 (Стенфордські ДОСЛІДНИЦЬКІ сиснами в повітрі Шар води, що оточує мікросферу, теми) Рушення і відділення часток спостерігали за обумовлює наявність сили в'язкості, діючої на мікдопомогою оптичного мікроскопа Olympus BH-2, росферу, і збільшення її ефективної маси, що приобладнаного відеокамерою на приладах із заряводить до зростання сили, діючої на сферу довим зв'язком Panasonic WL-SL300 Як основний На фіг 3 показані спектри сили відриву для лавимірювальний пристрій виступав синхронний підтексних сфер діаметром 5мкм, приєднаних до посилювач SR844 (Стенфордські ДОСЛІДНИЦЬКІ сисверхні за допомогою стрептавідин-бютинового теми) Опорний сигнал подавали на синхронний (фіг ЗА) і ХІМІЧНОГО (фігЗВ) зв'язку Розрив відбупідсилювач з використанням другого генератора, вається ВІДПОВІДНО при 1В і 10В синхронізованого з першим Всі пристрої були Зниження критичної напруги для зв'язку стрепприєднані до комп'ютера для контролю експеритавідин-бютин з коефіцієнтом б, тобто з 6В до 1В, менту і збору даних при переході з повітря у воду, як і руйнування ХІМІЧНОГО зв'язку у воді, свідчить про переважання На фіг2А показані спектри сили відриву для останнього ефекту Таким чином, цей Приклад стрептавідин-бютинового (1) і ХІМІЧНОГО (2) зв'язку, виразно демонструє, що руйнування зв'язків, а на фіг 2В показаний спектр для фізичного зв'язку отже, розділення і робота бюдатчиків можуть мати Реєструючи спектри сили відриву, можна ексмісце у водному або іншому рідкому середовищі периментальне визначити величину сили або напруги, необхідну для руйнування зв'язків ОтримаВважаючи, що фізичний, стрептавідинну інформацію можна використати для розділення бютиновий і ХІМІЧНИЙ зв'язки характеризуються суміші ВІДПОВІДНО ДО графіка, зображеного фіг2А, однаковою ЩІЛЬНІСТЮ зв'язку, і враховуючи, що в подаючи на МКК, на поверхні яких, обробленій цих експериментах використовували мікросфери біотином, є суміш сфер діаметром 5мкм, деякі з однакового розміру, можна отримати відносну яких містять на своїй поверхні стрептавідин, тоді шкалу сили відриву Для фізичного стрептавідиняк ІНШІ не містять його на своїй поверхні, напругу бютинового ХІМІЧНОГО зв'язку вона має вигляд понад 01В, але не більше за 6В, скажімо, 1В, мо1 60 600 Таке маштабування виглядає розумним і жна розділити дві множини сфер, залишивши на демонструє динамічний діапазон способу Провоповерхнях тільки сфери, маркіровані стрептавідидячи належні калібрувальні експерименти при віном Ці методи можна також використати для видомих значеннях ЩІЛЬНОСТІ зв'язку, можна забезявлення сфер, маркірованих стрептавідином, оскіпечити КІЛЬКІСНІ вимірювання льки з поверхнею, що коливається при напрузі 1В, ПРИКЛАД З будуть пов'язані тільки ці сфери Приклад демонструє виявлення вірусів і, зокрема, генетичне модифікованого бактеріофага, що Для забезпечення КІЛЬКІСНИХ вимірювань, на відображає білок, зв'язуючий мальтозу, приєднаоснові експериментальних даних, обчислювали ний до білка оболонки фага pill, оскільки і фаг, і амплітуду коливань МКК при різних напругах, що взаємодія, зв'язуюча мальтозу, добре вивчені і дозволило оцінити силу, прикладену до мікросфелегко доступні Фаг являє собою довгий, тонкий, ри Це оцінювання здійснювали шляхом вимірюниткоподібний вірус, що складається з гнучкого вання споживання потужності на МКК і їх добротстрижня довжиною 1мкм і діаметром бнм Генетиності Q (величина, зворотна ВІДНОСНІЙ ширині чно модифікований фаг додатково відображає на резонансного піка, Q=f/AfPe3OHaHc) Амплітуда А заодному КІНЦІ вірусу до 5 білків, зв'язуючих мальтодана вираженням зу, приєднаних до білка оболонки фага pill, див А=[ОР/2ті¥м] Уг McCafferty et al , Nature, 1990, 348 552 Цей фаг де Q - добротність, Р - електрична потужність, можна специфічно очистити на амілозній смолі споживана МКК, f - резонансна частота кристала Приєднання білка, зв'язуючого мальтозу, до кварцу, а М - ефективна маса приведеної в рукінцевої аміногрупи індол-гліцерофосфатсинтази шення кварцової пластини МКК Значення Q при було відображено на поверхні fd-фага як приєд6В визначили рівним с 15000, що дало можливість нання до кінцевої аміногрупи білка оболонки, заоцінити амплітуду коливань МКК рівною бОнм Такодованого геном III 3 цією метою побудували ким чином, сила, прикладена до сфери, становила вектор pJB113 fd-фага, в ньому закодоване гене9мкН Якщо порівняти це значення з величиною тичне злиття між MalE (E coh), trpC (Е соїі) і геном сили, необхідної для розриву одиничного зв'язку III Цей фаговий вектор ніс маркер СТІЙКОСТІ ДО тестрептавідин-бютин, яка рівна 160пН2, виходить, трацикліну Як немодифікований конкуруючий фат що одночасно відбувається руйнування приблизно виступав фаг-помічник VCS M13K07 (Стратаген), 60000 зв'язків Оцінка вказує, що це відповідає 50 несучий маркер СТІЙКОСТІ ДО канаміцину або більш процентам від первинної КІЛЬКОСТІ стрептавідин-бютинових зв'язків між сферою і поверхІнфікувавши Змл mid log фази LB культури нею Це означає, що більшість зв'язків, що приєдEschenchia coh штаму TG1 штамом фага в об'ємі нують сфери до поверхні, розриваються Юмкл, отримали концентрації бактеріофага 1x1012 одночасно Звідси - різкі піки, що спостерігаються в к о є/мл Після 2 годин збовтування (250об/хв ) спектрі сили розриву і шум, що реєструється при при 37°С, 1мл культури інокулювали в ЮОмл LB і руйнуванні зв'язків збовтували з частотою 350об/хв при 37°С протягом 1 години, У культуру pJB113 або VCS, вироПРИКЛАД 2 щену за ніч при 30°С і 250об/хв , додали, ВІДПОВІДЗ цього Прикладу випливає, що способи, які НО, тетрациклін (10мг/мл) або канаміцин (50мг/мл) відповідають винаходу, можна також здійснювати Бактерії були осаджені (15хв 4 1тис об/хв), і фаг в розчині Завантаження рідини приводить до зни 14 13 57876 був виділений з супернатанту додаванням NaCI і вання зв'язків відбувається при граничній напрузі, PEG6000 до кінцевих концентрацій 0 5моль і 4% це приводить до виникнення акустичного шуму (об/об), ВІДПОВІДНО Після витримування протягом протягом короткого проміжку часу і, отже, робить 1 години на льоду, фаг виділили центрифугуванспосіб вельми чутливим Крім того, сигнал, зумовням (ЗОхв , 4 1тис об/хв ), і осаджений фаг повтолений специфічно зв'язуючим фагом, можна легко рно зважили в 1мл Ь^О і зберігали при 4°С відрізнити від сигналу, зумовленого неспецифічно зв'язуючим фагом і виникає при більш високій амРозчинний крохмаль (500 мг, 0 01 ммоль, плітуді, а це означає, що неспецифічне поглинан1екв) розчинили в ДМФ (N.N-диметилформамід) ня не впливає негативним чином на вимірювання (Юмл) і перемішували протягом 5хв (частково специфічного поглинання Для подолання специрозчинили) До 11-меркаптододеканойній кислоти фічної взаємодії між білками, зв'язуючими мальто(11 5мґ, 0 05ммоль, 5екв) в ДМФ (0 5мл) додали зу, відображеними на фагу, і поверхнею, покритою DIC (7 8мкл, 6 Змг, 0 05ммоль, 5екв,) і DMAP (кат), крохмалем, потрібна набагато більша сила, ніж і цей розчин додали в розчин крохмалю Реакційну для подолання неспецифічних взаємодій між несуміш залишили перемішуватися при кімнатній модифікованим фагом і поверхнею температурі на ніч Потім реакційну суміш очистили з використанням осередку з мішалкою з мемНа фіг4С показаний результат контрольного бранною ВІДСІЧКОЮ 10000MW шляхом промивки експерименту, проведеного в повітрі з фагом, зв'ярозчину milliQ води (6х50мл) і концентрування з зуючим мальтозу, коли його сайт скріплення блоподальшою люфілізацією протягом ночі кований мальтозою, з подальшим осадженням фага на МКК в центрі (верхній графік) або по всій Поверхню підготували з використанням модиповерхні (нижній графік), він поводиться аналогічфікованого крохмалю, що містить тюльну групу, но немодифікованому фагу, підтверджуючи, що завдяки якій його можна було ХІМІЧНО приєднати до різниця зумовлена цими специфічними взаємодіяповерхні МКК (підготовлені аналогічно Прикладу ми На фіг 4В показаний спектр сили відриву у воді 1) вмістили в розчин крохмалю в метанолі (1мкг на при наявності на поверхні тільки 1000 примірників мл) на 12 годин Потім зразки промили і висушили фага, звідки слідує, що явище відриву все ще реструменем азоту Для проведення експериментів в єструється Невеликий зсув положення піка зумоповітрі, віруси осадили на поверхню з розчину і влений тим, що внаслідок зміни завантаження довисушили при кімнатній температурі Розбавляюбротність Q КММ змінюється в меншій мірі чи, отримали різні концентрації вірусу Для здійснення експериментів, в яких мальтоза блокує біРезультати вимірювань також кажуть про те, лок, зв'язуючий мальтозу, в розчин фага додали що для відділення неспецифічно пов'язаного фага ЮОнмоль мальтози від фага, зв'язуючого мальтозу, можна подавати на МКК збудливу напругу, яка вище граничної наТаким чином, поверхня МКК виявилася покрипруги руйнування зв'язків З неспецифічне пов'язатою шаром розчинного картопляного крохмалю ним фагом, але нижче граничної напруги руйну(який містить розгалужені полімери мальтози), вання зв'язків З фагом, зв'язуючим мальтозу Це ХІМІЧНО приєднаного до поверхні золота за допозабезпечує альтернативний спосіб скрикування могою зв'язку сірка-золото Експерименти провобібліотек фапв для скріплення, згідно з яким зв'ядили в повітрі і у воді зуючою афінністю фага, що залишається на повеНа фіг 4А показаний спектр сили відриву, рхні, управляють, регулюючи величину прикладеотриманий у воді для суміші в рівних кількостях ної напруги і час, протягом якого вона подається, фага, зв'язуючого мальтозу (-) і немодифікованого при умові, що фаг залишається життєздатним фага ( ), сканування було отримане протягом 500 секунд На поверхні золотого електрода знаходиЩоб визначити чутливість способу, фаг, зв'ялося приблизно 500 МІЛЬЙОНІВ примірників фага зуючий мальтозу, що знаходиться у водному секожного типу Для немодифікованого і, отже, не редовищі, піддали експерименту по розбавленню специфічно пов'язаного фага, був зареєстрований На фіг 5А показано (для найбільш інтенсивних пік відриву при 1 2В ВІДПОВІДНІ ПІКИ відриву для шумових ПІКІВ поблизу 9В), що потужність сигналу фага, зв'язуючого мальтозу, мали місце при наЛІНІЙНО залежить від КІЛЬКОСТІ примірників фага в прузі біля 9В і були більш інтенсивними, ніж у немежах, щонайменше, п'яти порядків величини, і специфічно пов'язаного фага, оскільки при розриві що наявність на МКК приблизно 200 примірників зв'язку вивільняється більша КІЛЬКІСТЬ енергії У фага можна виявити з імовірністю 99% На фіг5В повітрі, ніяких ПІКІВ, зумовлених специфічно пов'япоказана аналогічна крива для неспецифічно зв'язаним фагом, зв'язуючим мальтозу, не було зарезуючого фага в повітрі, що вказує на чутливість єстровано аж до 10В, на фіг4В показані дані, виявлення 100 примірників фага з імовірністю отримані в повітрі виключно для неспецифічно 99% КІЛЬКІСТЬ примірників фага, зв'язуючого пов'язаного фага Пік має місце при 7 5В, і його мальтозу, на поверхні при низькому розбавленні висота приблизно в 6 раз перевищує висоту піка, було підтверджено безпосередньою візуалізацією зареєстрованого у воді Друге сканування ( ) не за допомогою МАВ виявило практично ніяких ПІКІВ, свідчачи про те, що Цей Приклад показує, що КІЛЬКІСТЬ примірників фаг був видалений з поверхні Це підтверджує, що фага на поверхні МКК можна виявити Навпаки, з у воді, завдяки наявності додаткових сил в'язкого допомогою PCR виявляють КІЛЬКІСТЬ ПІКІВ вірусного тертя і збільшенню ефективної маси частки, руйДНК в розчині При умові, що всі частки вірусу в нування зв'язків МІЖ частками фага і поверхнею зразку розчину пов'язані з поверхнею, яка виконувідбувається легше, ніж в повітрі ється або при наявності сильної взаємодії вірусповерхня, або при можливості випаровування розГострота ПІКІВ в спектрі сили відриву очевидчину, внаслідок чого вірус залишається на поверхним образом пов'язана з тим фактом, що руйну 16 15 57876 ні, можна безпосередньо порівнювати чутливість дою і занурили на Юхв в 1 моль розчину етаноЧутливість PCR складає біля 100 ПІКІВ вірусного ламіну при рН8 5 Після цього їх ретельно промиДНК на мл, що порівняно з чутливістю виявлення ли водою і зберігали при 4°С в 1 мл СБФ фага ВІДПОВІДНО до даного Прикладу (без оптиміКІЛЬКІСТЬ вірусних часток/мл в розчині штаму зацм) Електроніку можна удосконалити, і таке вірусу, очищеного фіколом, визначали з викорисудосконалення дозволяє підвищити чутливість, танням електронної мікроскопи по внутрішньому + щонайменше, на порядок величини Наприклад, в стандарту латексних сфер Розчин штаму HSV gD 10 цих експериментах застосовували однорідне осаз концентрацією 5х10 вірусних часток/мл піддали дження фага на поверхню МКК Однак, амплітуда і послідовним десятиразовим розбавленням в СБФ чутливість МКК має просторову залежність, а це (Юммоль Na2HPO4/NaH2PO4, 2 7 ммоль КСІ, 120 значить, що сигнал приходить, в основному, з ммоль NaCI, рН 7 4), утримуючої БСА (0 1мг/мл) і центра МКК (як показано на фіг4С) Це означає, зберігали при 4°С Пластинки МКК встановили за що, якщо осаджувати фаг тільки в центрі МКК, то допомогою безпайкових контактів в приладі, і або зареєстрованих ПІКІВ буде менше, а значить, їх 1мкл, або 40мкл кожного з цих розбавлених розінтенсивність буде більшою, що обумовлює підчинів вмістили на поверхню пластинки, покриту вищення чутливості антитілом IgG проти gD Після 40хв , поверхню ретельно промили водою, а потім покрили 40мкл Цей спосіб можна безпосередньо розповсюдиСБФ і проскакували МКК від 0 до 10В ти на виявлення людських вірусів із застосуванням специфічних антитіл до вірусу, приєднаного до Результати подані на фіг 6 ФігбА являє соповерхні МКК Ці антитіла вступають в специфічні бою графік залежності сигналу (шумовий пік повзаємодії з вірусом, приєднаним до поверхні МКК близу 7 5В) від КІЛЬКОСТІ часток симплексного віруЦі антитіла обумовлюють специфічні взаємодії між су герпеса gD + для 1мкл (о) і 40 мкл (•) зразків, вірусом і поверхнею, які можна подолати при певточки даних добре лягають на лінії Фіг 6 являє ному прискоренні поверхні Неспецифічна абсорбсобою графік залежності шуму від амплітуди для ція аналогічних по розміру або більш великих часвірусу gD+ і gD Вірус gD , який не має специфічної ток, присутніх в зразку, обумовлює наявність ПІКІВ взаємодії з антитілом на поверхні, не демонструє при низькій напрузі, як було показано, але це не ПІКІВ, навпаки, вірус gD + демонструє різкий пік поможе впливати негативним чином на аналіз, хоч близу 7 5В абсорбція макромолекул на поверхні може привоПРИКЛАД 5 дити до зменшення КІЛЬКОСТІ антитіл, здатних Для цього аналізу бактерійного скріплення, утворювати зв'язок з вірусом Ефективна маса пластинки МКК підготували, як в Прикладі 4 Е соїі найбільш поширених вірусів більше, ніж у фата, і S Aureus (лабораторні штами) були вирощені в що використовується в цьому Прикладі, хоч КІЛЬбульйоні екстракту мозок серце/0 5% дріжджі і інКІСТЬ і сила специфічних взаємодій з поверхнею кубовані на ніч при 37°С 1мл зразка кожної кульбуде іншою Це означає, що необхідна напруга тури довели до концентрації 101 Ок о є /мл, яку повинна бути близькою до отриманої по даному визначають по оптичній ЩІЛЬНОСТІ, І центрифугуПрикладу або менше неї вали з прискоренням 12000д протягом 2хв , осадок повторно зважили в стерильній СБФ Юмкл бактеЦей Приклад показує, що спектроскопія сили рійної ВЗВІСІ вмістили на пластинку МКК, покриту відриву не вимагає наявності етапу посилення, антитілом IgG проти Е соїі подібно тому, як описадає можливість виробляти КІЛЬКІСНІ вимірювання, но в Прикладі 4 для антитіла проти HSV Після безпосередні вимірювання і не вимагає великих 40хв , поверхню ретельно промили водою, а потім витрат 3 и допомогою можна здійснювати швидку покрили 40мкл СБФ і проскакували МКК від 0 до діагностику вірусної інфекції в багатьох випадках, 10В в тому числі, при обстеженні пацієнтів в КЛІНІЧНИХ умовах або рослин і тварин в сільському госпоРезультати приведені на фіг 7 Графік дарстві шум/амплітуда демонструє різкий пік при напрузі ПРИКЛАД 4 біля 6 В для Е соїі і ніякого піка для S aureus Цей Приклад ілюструє пробу, зв'язуючу вірус ПРИКЛАД 6 Для цієї проби, пластинки мікроваг на кристалі У цьому Прикладі використали пристрій ПАВ, кварцу виготовили з полірованих кварцових пласпоказаний на фіг 9 У цьому випадку використали тин, обрізаних по фронту акустичної хвилі під куєдиний прилад (НР8512а, Hewlett Packard), який том 35° (HyQ, Cambridge, UK), і покрили в камері об'єднує підсилювач 1 і блок 5 приймача і управпарового осадження Едвардса адгезійним шаром ління в єдиному приладі Прилад настроїли на хрому товщиною ЗОнм, потім шаром золота товрежим гармонічної хвилі, що не затухає і розгортай щиною 200нм, яка визначається каліброваною по живленню Пристрій ПАВ представляв комерелектричною провідністю Потім ЦІ пластинки заційне доступний прилад RF1171 від RF Monohtics, нурили в розчин Іммоль меркаптододеканойної Іпс На поверхню ПАВ нанесли біля 100000 латеккислоти в етанолі спектроскопічного класу на сних сфер діаметром 1мкм Отриманий спектр 18год , ретельно промили етанолом, а потім воподаний на фіг 10 Він містить декілька ПІКІВ, відсудою, після чого висушили струменем азоту Потім тніх на чистій поверхні Це свідчить про те, що ЦІ пластинки занурили на 20хв в суміш N-TC пристрій ПАВ можна використати для реєстрації (ЮОммоль) і ЕДК (400ммоль) Після цього їх ретеявища руйнування РІЗНІ ПІКИ, МОЖЛИВО, відповідально промили водою, а потім занурили на 1год в ють скупченням сфер на поверхні, що мають різні розчин 50мкг/мл мишачого моноклонального антирозміри, і тому піки спостерігаються в різних полотіла IgG, продукованого проти глікопротешу D HSV женнях І в Юммоль СБФ при рН7 0 Потім їх промили во Фіг 1 Фіг ЗВ 1 4 x 1 0 ' 1 2 x 1 0 " * I S 80x10! 40x1092 0x10 э '1 00 L 1 1 Л А, їм,- і, и imиAiJtMUIi'IfYii№ш 00 02 04 06 08 10 12 14 Фн 4А Фіг 2А ЗОхЮ5 5 0x10"6 4 0x10"6к • 2 0x105 1 ОхЮ5 l 3 0x10"6 I 00 0 1 2 3 А -"' 1 2 \ ) 4 20x10^ 1 0x10 в 00 А, , , . І ї г . 1 г і Фіг 2В 2 01 ' • x0 1 0 1 ОхЮв Фіг ЗА 1 2x10"6 Г • 1 0x1068 0X10 7 8 0x10 7 4 0X10 7 2 0x10 7 8 ОхЮ1 • 40Х10-5 00 4 А 6 і Iі 10 2 ОхЮ"8 00 1 0 20 57876 19 Фіг. 6В 500 г 8 1 5ХІСГ 400 1.2x1 (Г8 300 9.0x10"6 20010009 10 ' 0 1 2 3 4 A 5 6 7 ФІГ. 7 г. 5А ю 10*' 10 -а 10 -i 1 0 о 10 1 10 2 1О з 10 4 10 5 1О в 10 7 1О в ю310101011 •2000 N А Фіг. S Фіг. 5В 2523 ЗО 21 А—. 29 27 і £ 3 4 s 6 7 10 10 1O 10 10 10 10 N Фіг. 6А Фіг.9 22 і * \ \ і 36 10° 101 102 103 N 104 10s 1G6 1C; Г || || 33 35 22 57876 21 Фіг 10 0.0006 0.0002 0.0 Комп'ютерна верстка О Воробей 0.5 1.0 1.5 Л 2.0 2,5 ЗО 3.5 Підписано до друку 05 08 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна