Композиція, яка містить поксвірус та спосіб її виготовлення

Даний винахід відноситься до складу, зокрема водного складу, який містить (і) поксвірус одного з родів ортопоксвірус, авіпоксвірус, парапоксвірус, капріпоксвірус та суіпоксвірус, (іі) дисахарид, (ііі) фармацевтично прийнятний полімер або, необов'язково, (iv) буфер. Водний склад є, зокрема, прийнятним для сублімаційної сушки, в результаті якої одержують стійку, ліофільно висушен у композицію, яка містить поксвірус. Винахід також стосується способу виготовлення ліофільно висушеної композиції, яка містить поксвірус та продукту, одержаного таким чином. Poxviridae являє собою велике сімейство сукупності ДНК-вірусів, котрі реплікуються в цитоплазмі клітин хребетних та безхребетних. У людей віспа була найбільш поширеною поксвірусною інфекцією. Збудником хвороби віспи є вірус віспи, який є членом родини Orthopoxvirus. Вірус коров'ячої віспи, котрий також є членом родини Orthopoxvirus сімейства Poxviridae, використовувався як жива вакцина для імунізації проти хвороби віспи. Всесвітня вакцинація вірусом коров'ячої віспи призвела до знищення вірусу віспи [Глобальне знищення хвороби віспи. Заключний звіт всесвітньої комісії по засвідченню знищення віспи; Історія охорони здоров'я, №4, Женева: Всесвітня Організація Здоров'я, 1980]. В той же час більшість запасів інфекційних вірусів віспи було знищено. Однак не можна виключати того факту, що поксвіруси, котрі викликають віспу, або захворювання подібні до віспи можуть знову стати основною проблемою охорони здоров'я. Саме тому необхідно мати можливість для виготовлення стабільних вакцин проти поксвірусних інфекцій, зокрема, проти інфекцій віспи, наприклад вакцин на основі вірусу коров'ячої віспи. У минулому віруси коров'ячої віспи також використовувалися для створення вірусних векторів для експресії рекомбінантних генів та для можливості їх використання як рекомбінантних живих вакцин [Mackett, М., Smith, G.L. and Moss, В. [1982] Р; N. A. S. USA 79, 7415-7419; Smith, G.L., Mackett, М. and Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2,383-407]. Це було пов'язано зокрема з тим, що в геном вірусу коров'ячої віспи за допомогою методу рекомбінації ДНК були введені послідовності ДНК (гени), які кодують чужорідні антигени. Якщо ген інтегровано в ділянку вірусної ДНК, котра не є життєво важливою для життєвого циклу вірусу, може так статися, що новопродуковані рекомбінантні віруси коров'ячої віспи будуть інфекційними, тобто вірус здатен інфікувати інші клітини й таким чином експресувати інтегровану послідовність ДНК [ЕР 83286 та ЕР 110385]. Рекомбінантні віруси коров'ячої віспи одержані таким чином, можуть бути використані з одного боку як живі вакцини для профілактики інфекційних захворювань, а, з іншого, для виготовлення гетерологічних протеїнів в еукаріотичних клітинах. Іншими прикладами рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи є віруси, що містять терапевтичні гени, такі як суїцидні гени, гени рибозиму, антисмислові гени. Модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара (MVA) є відомим як виключно безпечний. MVA був одержаний довготривалими послідовними пасажами штаму Анкара вірусу коров'ячої віспи (CVA) на курячих ембріофібробластах [для огляду ди в. Ma yr, A., Hochstein-Mintzel, V. та Stickl, Н. [1975] Infection 3,6-14; Swiss Patent No. 568,392]. Зразками штамів вірусу MVA, які депоновано у відповідності із вимогами Будапештської угоди є штами MVA 572, депонований в Європейській Колекції Тваринних Клітинних Культур (ЕС АСС), Салісбері (UK) під депозитним номером ЕСАСС V94012707, MVA 575, депонований під ЕСАСС V00120707 та MVA-BN, з депозитарним номером ЕСАСС V00083008. MVA є відомим своїми значною ослабленістю, що визначається його низькою вірулентністю або інфективністю при збереженні гарної імуногенності. Вірус MVA був досліджений для визначення змін в геномі порівняно із штамом CVA природного типу. Було визначено шість основних делецій в геномній ДНК (делеції І, II, III, IV, V, та VI), які разом мають 31000 пар основ [Меуег, Н., Sutter, G. and Mayr A. [1991] J. Gen.Virol. 72,1031-1038]. Одержаний вірус MVA стає жорстко обмеженим клітиною-хазяїном до клітин птахів. Також MVA характеризується своєю надзвичайною ослабленістю. При тестуванні на різноманітних тваринних моделях було доведено його вірулентність лише у тварин з пригніченим імунітетом. Більш важливим є те, що відмінні якості штаму MVA було показано при широких клінічних випробуваннях [Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg.l, Abt. Оrg. В 167,375-390 [1987], Stickl et al„ Dtsch. med. Wschr. 99,2386-2392 [1974]]. Під час цих досліджень на більш ніж 120тис. людей, включаючи пацієнтів високого ризику, не було виявлено жодних побічних ефектів пов'язаних із використанням вакцини MVA. Вже створений та використовується в клінічних дослідженнях рекомбінантний MVA придатний для використання як вакцина [дивись, наприклад, W097/02355]. У [WO 98/13500] описується рекомбінантний MVA, який містить й здатний експресувати послідовності ДНК, що кодують антигени вірусу тропічної лихоманки. Чужорідні послідовності ДНК були рекомбіновані у вірусн у ДНК у сайт делеції, що природно зустрічається в геномі MVA. Штам MVA, депонований в Європейській Колекції Культур Тваринних Клітинних (ЕСАСС), Салісбері, UK під депозитним номером V00083008 демонструє навіть більшу ослабленість та поліпшені характеристики безпеки. Крім того, вірус коров'ячої віспи та інші поксвіруси використовувалися як вектори для доставки генетичної інформації у клітини ссавців. У цьому контексті робляться посилання на авіпоксвіруси, такі як поксвіруси птахів. Поксвіруси птахів, що містять у своєму геномі гени HIV описано у [US 5,736,368 та US 6,051,410]. Способи виготовлення композицій, які містять поксвіруси і придатні для використання у якості вакцин добре відомі спеціалістам у даній галузі техніки [дивись, наприклад, Joklik W.К., Virology (1962), 18, 9-18; Richter, К.Н., Abhandlungen aus dem Bundesgesundheitsamt (1970), 9, 53-57]. Відомо результати очистки у водних, поксвірусвмісних розчинах або поксвірусвмісних осадах. Поксвіруси у цих розчинах та осадах нестабільні, тобто інфекційність цих вірусів швидко зменшується. Однак важливим є той факт, що вакцина може бути збережена та переведена у стабілізовану форму, особливо у ти х випадках, коли вакцини необхідно транспортувати у тропічні регіони з обмеженою інфраструктурою. Ліофільно висушений продукт може зберігатися при температурах в межах від 4°С до 25°. Це очевидна перевага у порівнянні зі стандартними умовами зберігання рідких складів, які необхідно зберігати при нижчих температурах [Cryopreservation and freeze-drying protocols Day J, McLellan M; Methods in Molecular Biology, 38,1995, Humana Press]. Відомими та придатними для цієї мети є способи ліофільної сушки поксвірусів, зокрема вірусу коров'ячої віспи та вірусовмісних композицій та розчинів [Burke et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems (1999), 16, 1-83]. У загальних рисах ліофільна сушка вакцини включає заморожування водного розчину, котрий містить вакцину та придатний для ліофільної сушки, наступне видалення води сублімацією за умов пониженого тиску та низьких температур, та подальше видалення води десорбцією за умов зниженого тиску та підвищеної температури. Відомі поксвірусвмісні композиції для ліофільного висушування мають важливі недоліки. Багато з відомих композицій для ліофільної сушки, які містять вірус коров'ячої віспи, містять пептон або гемасел, котрі є, як правило, речовинами тваринного походження. Однак, викликає занепокоєння той факт, що захворювання тварин, такі як BSE можуть передаватися від тварин до людей через продукти тваринного походження, такі як пептон, желатин або гемасел. Більше того, поксвіруси у відомих вірусовмісних композиціях для ліофільної сушки знаходяться у неочищеному вигляді. Таким чином, відомі з рівня техніки композиції для ліофільної сушки, які містять поксвіруси містять, між іншим велику кількість протеїнів із клітин з клітинних або тканинних культуральних систем та з бичачої сироватки, яка використовується для культивації клітин, відповідно. Спеціалістам у даній галузі також відомі ліофільно висушені композиції, котрі не містять додаткових компонентів тваринного походження (наприклад, пептон або гемасел). В цьому випадку композиції містять окремо або в певних співвідношеннях: глутамат натрію, сорбітом, лактозу, солі, амінокислоти та гліцерин. Однак, продукт, отриманий після ліофільної сушки частіш за все виявляється нестабільним, тобто, загальні втрати вірусу при зберіганні виявляються невиправдано великими. Більше того, було показано, що поксвірус тяжіє до утворення агрегатів в деяких із цих композицій та те, що інші складники преципітуються перед або під час заморожування. В [патенті US 3,577,526] розкривається вакцина віспи, яка відрізняється тим, що вона виготовлена з подрібненого вірусного матеріалу вакцини, диспергованої в сахарозі. Кількість сахарози була в межах 20-40%. Склад також може містити 5% декстрану. Вираз „подрібнений вірус" відноситься до вірусу, одержаного із пульп або пустул. По суті, лімфу подрібнювали для розбиття грудок та відділення рідини від мертвих волосся та шкіри. Таким чином, вміст протеїну у вакцині є дуже високим і вимагає стабілізації вірусу. Об'єктом даного винаходу є створення композиції, що містить поксвірус, зокрема водна композиція, що містить поксвірус для ліофільного сушіння, котре призводить до стабільного ліофіліьно висушеного продукту, коли поксвірус бажано є очищеним або частково очищеним вірусом. Наступним об'єктом винаходу є створена водна композиція, яка містить поксвірус, в котрій поксвіруси, не схильні до агрегації та в котрих інгредієнти не утворюють осаду перед або під час заморожування. Наступним об'єктом винаходу є створена композиція, що містить поксвірус, зокрема водна композиція, що містить поксвірус, яка включає невеликі кількості непоксвірусних асоційованих протеїнів. Наступним об'єктом винаходу є створена стабільна, ліофільно висушена, композиція, що містить поксвірус та спосіб одержання вказаної композиції. Даний винахід представляє композицію, що містить поксвірус, зокрема водну композицію, що містить поксвірус. Композиція, зокрема, водна композиція, може бути придатна для ліофільного сушіння вказаного поксвірусу. Також, винаходом пропонується ліофільно висушений, продукт, що містить поксвірус. Композиція, згідно даного винаходу, зокрема водна композиція, яка містить поксвірус, диса харид, фармацевтично прийнятний полімер, та необов'язково буфер. Оскільки ліофільно висушена композиція, згідно даного винаходу не містить стабілізуючих добавок тваринного походження, таких як, пептон, желатин, гемасел, також не містить великих кількостей протеїнів, які походять із систем, які використовуються для ампліфікації вірусу (таких як, систем культивування клітин), вірусна композиція виявляється неочікувано стабільною, тобто, поксвірус в ліофільно висушеній композиції залишається інфекційним на протязі тривалого періоду часу, а також при високих температурах таких як кімнатна температура або 37°С. Якщо не зазначено інакше термін „кімнатна температура" в даному описі винаходу відноситься до температури від 20 до 25°С. Поксвірус, що буде ліофільно висушено є будь-яким поксвірусом вибраним з групи Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus та Suipoxvirus. Ці віруси можуть бути застосовані як вакцини для людей або тварин [Virology, 3rd edition, 1995, ed.-in- chief: Fields, B.N.]. Зокрема, переважними поксвірусами є віруси родів Orthopoxvirus або Avipoxvirus. Переважними прикладами поксвірусів, що належать до роду Avipoxvirus є поксвіруси канарейковий та свійських птахів. Переважними прикладами, що належать до сімейства Orthopoxvirus є коров'ячий поксвірус та вірус коров'ячої віспи. Поксвірус, що міститься в композиції, згідно даного винаходу може бути поксвірусом, що зустрічається в природі, ослабленим поксвірусом або рекомбінантним поксвірусом. Для вакцинації людей проти віспи поксвірус в композиції є переважно штамом вірусу коров'ячої віспи. Прикладами штамів коров'ячої віспи придатними для цих цілей є штами Temple of Heaven, Copenhagen, Paris, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, New York City Board of Health, Elstree, Ikeda та WR. Найбільш придатним штамом вірусу коров'ячої віспи є штам модифікованого вірусу коров'ячої віспи Ankara (MVA) та його похідні, зокрема, штам, який депоновано в ЕСАСС із депозитним номером V00083008 та штам Elstree. Поксвірус в композиції, згідно даного винаходу, є переважно поксвірус, котрий є по суті апатогеном у тварин або суб'єкта вакцинації. Для цих цілей є бажаним або використовувати ослаблені вірусні штами або використовувати поксвіруси, які в природі реплікуються в носіях видів відмінних від видів, котрі будуть вакцинуватися та які не є патогенними в гетерологічному хазяїні. „Ослаблений вірус" є вір усом, який походить від патогенного вірусу але такий, що при інфікуванні організму хазяїна призводить до нижчої смертності та/або захворюваності порівняно з неослабленим батьківським вірусом. Приклади ослаблених поксвірусів є відомими особам досвідченим в цій галузі. Найбільш переважним є модифікований вірус коров'ячої віспи Ankara (MVA). Штамами MVA є штами MVA 575 та MVA 572 котрі депоновано в Європейській Колекції Тваринних Клітинних Культур із депозитними номерами ЕСАСС V00120707 та ЕСАСС V 94012707, відповідно. Найбільш переважним є MVA-BN або його похідний, який описаний в [W002/42480 (РСТ/ЕР01/13628)]. Зміст цієї заявки включено до даної заявки через посилання. MVA-BN депоновано в Європейській Колекції Тваринних Клітинних Культур із депозитними номером ЕСАСС V00083008. Прикладами поксвірусів для яких людина є гетерологічним носієм та які не є патогенними для людини є поксвіруси свійської птиці та канарейковий. Термін „рекомбінантний вірус" відноситься до будь-якого вірусу, який має вставлений у вірусний геном гетерологічний ген, котрий в природі не є частиною вірусного геному. Гетерологічний ген може бути терапевтичним геном, геном, що кодує принаймні один пептид, який включає принаймні один епітоп для викликання імунної відповіді, антисмислову експресійну касету або рибозимний ген. Способи конструювання рекомбінантних вірусів є відомими особам досвідченим в даній галузі. Найбільш переважним поксвірусним вектором є MVA, зокрема MVA 575 та MVA-BN (дивись вище). Особам досвідченим в даній галузі відомо, як поксвіруси можна ампліфікувати та одержувати із культур інфікованих клітин. В загальних рисах, на першому етапі еукаріотична клітина інфікується поксвірусом, котрий має стати частиною композиції згідно даного винаходу. Еукаріотичні клітини є клітинами які є сприйнятливими до інфекції відповідним поксвірусом й допускають реплікацію та вироблення інфекційного вірусу. Такі клітини є відомі особам досвідченим в даній галузі для всіх поксвірусів. Для MVA прикладом цього типу клітин є курячі ембріофібробласти (CEF) [Drexlerl. et al., J. Gen. Virol. (1998), 79,347-352]. CEF-клітини можуть бути культивовані за умов відомих особам досвідченим в даній галузі. Переважно CEF-клітини культивують на безсироватковому середовищі. Час інкубування переважно становить від 48 до 96 годин при 37°С±2°С. Для інфікування поксвіруси беруть в кількостях інфікування (МОI) від 0,05 до 1 TCID 50 (TCID = доза, що викликає інфекцію культури тканин) та інкубують 48-72 години при тій самій температурі. Інфекційний процес може бути виявлено шляхом спостереження цитопатичних ефектів (СРЕ), типово, значне округлення інфікованих клітин. Поксвіруси відомі як такі, що існують у двох різних формах: поксвіруси, прикріплені до клітинних мембран в цитоплазмі інфікованих клітин (внутрішньоклітинні зрілі віріони (IMV)) та сформовані віруси (позаклітинні упаковані віріони (EEV)) [Vanderplasschen A. et al., J. Gen. Virol. (1998), 79,877-887]. Обидві вірусні форми можуть бути використані у складах, згідно з представленим винаходом. EEV можуть бути легко одержані з супернатанту шляхом центрифугування та можуть бути безпосередньо суспендовані у водну композицію, яка включає дисахарид та фармацевтично прийнятний полімер. Однак, вірусовмісні фракції можуть містити клітинний детрит та інші забруднювачі. Особливо для вакцинації людей є надзвичайно бажаним, щоб вірус перед введенням у композицію згідно з представленим винаходом було додатково очищено. Способи очистки поксвірусів відомі спеціалістам у даній галузі. Стадія очищення може являти собою, наприклад, пакетне центрифугування (напр., з використанням сахарозної підкладки) або безперервно-проточне ультрацентрифугування (сахарозні градієнти), ультрафільтрацію (наприклад, поперечно-проточну фільтрацію з використанням мембрани із порами розміром більше 500кДа, але рівними чи меншими 0,1mм), колонкову хроматографію (наприклад, іонообмінна, гідрофобної взаємодії, розмірна ексклюзія або комбінація) або комбінації деяких, або усіх з приведених вище методів [Masuda N. et al., J Bacteriol (1981) 147,1095-1104]. У відповідності з одержанням IMV клітини накопичували на першому етапі і руйнували на др угому е тапі. Якщо інфіковані клітини є клітинами, які можна культивувати у суспензійній культурі, інфіковані клітини можуть бути легко зібрані шляхом центрифугування. Якщо інфіковані клітини є більш чи менш інтактними адгезивними клітинами, можна зібрати клітини, тобто видалити їх з культуральної посудини, перед тим, як піддати їх руйн уванню. Методи збору є відомими особам досвідченим в даній галузі. Придатними для цього є механічні методи (наприклад, з використанням гумового клітинного скребку), фізичні методи (наприклад, охолодження нижче -15°С і відтавання культуральних посудин до близько +15°С) або біохімічні методи (обробка ферментами, наприклад, трипсином, для відділення клітин від культуральних посудин). Якщо для цих потреб використовуються ферменти, слід контролювати час інкубації, оскільки ці ферменти можуть після довготривалого часу інкубації пошкодити також вірус. Методи р уйнування клітин також відомі спеціалістам у даній галузі техніки. Вже описаний вище метод заморожування-відтавання в результаті дає часткове руйнування клітин. Інша відома техніка руйнування клітин включає використання ультразвуку. В результаті обробки клітин ультразвуком одержують вірусовмісний гомогенат. Поксвірусвмісний гомогенат може бути використаний у композиції згідно з представленим винаходом для вакцинації тварин. Однак знову ж таки бажано використовува ти поксвіруси, які були хоч би частково очищені. Як підкреслювалося вище, такі методи очищення відомі спеціалістам уданій галузі. Поксвіруси містяться у композиції, зокрема у водній композиції, у концентрації у межах від 10 4 до 109 TCID50/ml, переважно у концентрації у межах від, наприклад, 105 до 5´108 TCID50/ml, більш переважно у концентрації у межах від, наприклад, 106 до 5´108 TCID50/ml. Дійсна концентрація залежить від кількості введеного у людину або тварину вірусу, котра у свою чергу залежить від типу вірусу, котрий вводять. Для штаму Etstree вірусу коров'ячої віспи типова доза вакцинації для людини включає 2,5´105 TCID50. Для штаму MVA-BN вірусу коров'ячої віспи типова доза вакцинації для людини включає 1´108 TCID50. Як вже відмічалось вище, поксвірус у композиції згідно з представленим винаходом переважно є очищеним або хоча б частково очищеним вірусом. Термін „очищений або хоча б частково очищений" відноситься до факту, що вір ус, який використовується у композиції згідно з представленим винаходом має чистоту, ви щу, від чисто ти неочищеного вірусу („подрібненого вірусу"), котрий використовували у вакцинах, що застосовувались до знищення хвороби віспи (як це розкрито, наприклад у US 3,577,526). Така вища очистка може бути одержана, наприклад, одним або більше наступними методами: пакетним центрифугуванням (напр., з використанням сахарозної підкладки) або безперервно-проточним ультрацентрифугуванням (сахарозні градієнти), ультрафільтрацією (наприклад, поперечно-проточною фільтрацією з використанням мембрани із порами розміром більше 500кДа, але рівними чи меншими 0,1mм), колонковою хроматографією (наприклад, іонообмінною, гідрофобної взаємодії, розмірною ексклюзією або комбінаціями). Особливо бажаною є ультрафільтрація та/або пакетне центрифугування з використанням сахарозної підкладки. У більш загальних термінах, термін „очищений або хоча б частково очищений" стосується вірусних препаратів (наприклад таких, що містять MVA або Elstree), які мають титр щонайменше 106, переважно щонайменше 107, більш бажано щонайменше 5´108 TCID50 на мг загального протеїну. Для штаму Elstree типовий препарат має титр 8´108 TCID50 на мг загального протеїну. Спосіб для визначення титру поксвірусовмісного препарату відомий спеціалісту у даній галузі; один з таких методів наведено у розділі прикладів. Вміст загального протеїну переважно визначається згідно з методом Kjeldahl [Lynch, J.M. and Barbano, D.M., Kjeldahl nitrogen analysis as a reference method for protein determination in dairy products. J AOACInt. 1999 Nov-Dec; 82 (6): 1389-98. Review]. Необхідно відмітити, що загальний вміст протеїну є сумою вірусного та клітинного протеїнів. Несподіваним виявився той факт, що композиція, яка містить очищений або частково очищений вірус, дисахарид та фармацевтично активний полімер є стабільною, з огляду на те, що існувала думка, що велика кількість не вірусних протеїнів у неочищених вір усних препаратах сприяє стабільності композицій рівня техніки. Композиція згідно з представленим винаходом, зокрема водна композиція, містять дисахарид. На відміну від моносахаридів, таких як глюкоза, котра дає хороший біозахист під час сублімаційної сушки, але має низьку температуру колапсу та часто сублімаційна сушка з колапсом, дисахариди показали себе як ефективні проективні агенти, які мають більш високі температури колапсу ніж моносахариди. Дисахариди, що містяться у композиції згідно з представленим винаходом є фармацевтично прийнятними дисахаридами, які мають температур у колапсу (Тс) у межах від близько -25°С до -35°С. Характерна температура колапсу для сахарози -31°С, для трегалози –28,5°С, для лактози –30,5°С. Характерною температурою колапсу для цільової композиції, згідно з представленим винаходом, є, переважно, температура в межах від -50°С до 20°С. Бажанішими діапазонами є, наприклад, -37°С до -30°С, -36°С до -31°С або -35,7°С до –31,2°С. Переважно дисахариди вибирають із групи, яка складається з трегалози, лактози та сахарози. Бажанішою є цукроза. Дисахарид, бажано цукроза, міститься у композиції згідно з представленим винаходом, зокрема, у водній композиції, переважно у концентрації в межах 10-100г/л, більш бажано у межах 20-80г/л, найбільш бажано у межах 25-60г/л. Для цукрози типовою є концентрація 45г/л. Композиція згідно з представленим винаходом, зокрема водна композиція, також містить фармацевтично прийнятний полімер. Полімер переважно вибирають з групи, яка складається з декстрану та полівінілпіролідону (PVP). Полімер, що використовується повинен бути розчинним у композиції згідно з представленим винаходом. Якщо використовується декстран, його молекулярна маса повинна бути переважно у межах від 30,000 до 70,000, більш бажано у межах від 30,000 до 70,000, найбільш бажано у межах від 36,000 до 44,000. Найбільш бажаний декстран має середню молекулярну масу 40,000. Концентрація декстрану є в межах від 1 до 50г/л, переважно в межах від 2 до 40г/л або від 3 до 30г/л. Зокрема хороші результати спостерігалися у межах від 5 до 50г/л, від 5 до 40г/л або від 5 до 30г/л. Навіть більш бажаним є діапазон від 8 до 30г/л. Найбільш бажаним діапазоном є 1027г/л. Прикладом кращої концентрації є 18,9г/л. Кращі концентрації та концентрації меж декстрану як показано вище, зокрема діапазон від 5 до 50г/л та відповідні піддіапазони мають особливу перевагу у тому, що температура колапсу композиції є відносно високою, що дає можливість здійснювати процес у промислових масштабах. Якщо використовується PVP, його молекулярна маса є переважно у межах від 50,000 до 400,000, краще у межах від 70,000 до 360,000, концентрація PVP є в межах від 5 до 200г/л, краще від 5 до 100г/л, найкраще в межах від 10 до 40г/л. Композиція згідно з представленим винаходом, зокрема водна композиція, також може містити буфер. Як відмічалося вище, одним з об'єктів представленого винаходу, що забезпечує одержання водних поксвірусвмісних композицій, в яких поксвірус не агрегує і в яких не відбувається преципітація при висушуванні. Несподівано було показано, що такі несприятливі ефекти корелюють з присутністю фосфатного буфера у водній композиції. Прикладами фосфатного буферу є PBS (фосфатно-сольовий буфер) та фосфатний буфер. Отже, окрема задача винаходу вирішена водною композицією для ліофільного висушування, котра не містить фосфа тний буфер. Таким чином буфер, який міститься у композиції згідно з представленим винаходом є переважно вибраним з групи, яка містить TRIS, TBS, MOPS, HEPES та (бі-)карбонатний буфери. Найкращими буферами є TRIS та TBS. Буфер використовується у концентраціях, достатніх для створення необхідних буферних властивостей. Для TRIS буферу бажаною є концентрація у межах 1-50mM; найкращою є концентрація 10mM, pH переважно встановлюється на рівні, котрий з одного боку є фармацевтично прийнятним для введення людині або тварині, а з іншого - не спричиняє згубного впливу на вірус. Таким чином, рН повинно бути в межах від 6,0 до 9,0, бажаніше, у межах від 7,2 до 7,8, найкращим є рН7,4. Несподівано було одержано хороші результати з використанням вільного від фосфату буферу, незалежно від того, чи був вірус у композиції очищеним, чи неочищеним, чи частково очищеним. Бажаними є очищені або частково очищені віруси. Композиція згідно з представленим винаходом, зокрема водна композиція, може містити солі такі як NaCI. Типовою для NaCI є концентрація у межах від 10 до 200mM. Прикладом переважної концентрації NaCI є концентрація 140mМ. Композиція згідно з представленим винаходом, зокрема водна композиція, може містити сіль L-глютамінової кислоти. Сіль є переважно монокалієвою або мононатрієвою сіллю. Бажаною концентрацією солі L-глютамінової кислоти є концентрація у межах 0,05-0,5г/л, краще, у межах 0,1-0,15г/л. Деякі окремі переважні водні розчини, згідно з представленою заявкою, наведені у наступній таблиці 1. У всіх композиціях, представлених у таблиці 1 буфером є 10mM TRIS, рН7,4, 140mМ NaCI. Таблиця 1 Модифіков аний в ірус коров 'ячої в іспи Анкара (MVA) Перша добав ка [г/л] [TCID50/ml] 25 (цукроза) 5´108 34,5 (цукроза) 5´108 Друга добав ка [г/л] Третя добав ка [г/л] Див ись таблицю 6 10,5 (декстран) 14,5 (декстран) 0,06 (1-глютамінов а кислота) 0,083 (L-глютамінов а кислота) GT8 GT8 5´108 5´108 1´108 1´108 45 (цукроза) 60(цукроза) 45 (цукроза) 45 (цукроза) 18,9 (декстран) 25,5 (декстран) 18,9 (декстран) 3,78 (декстран) 0,108 (L-глютамінов а кислота) 0,144 (L-глютамінов а кислота) 0,108 (L-глютамінов а кислота) 0,108 (L-глютамінов а кислота) GT9 GT9 Водна композиція згідно з представленим винаходом придатна для заморожування-висушування. Для використання ліофільно висушений продукт повинен бути відновлений за допомогою придатного розчинника. Згідно з одним варіантом здійснення для того, щоб перевести компоненти у розчин, до ліофільно висушеного продукту додають стерильну воду. Переважно кількість доданої води у більшій чи меншій мірі відповідає кількості води, що була видалена у процесі заморожування-висушування. Таким чином, згідно з цим варіантом здійснення, композиція відновленого продукту більш-менш ідентична з вихідною водною композицією. Тому у межах представленого винаходу водна композиція згідно з представленим винаходом використовується як вакцина. Згідно з альтернативним варіантом здійснення, ліофільно висушений продукт може також бути відновленим у будь-якому іншому фармацевтично прийнятному розчиннику, котрий може бути використано у підходящій кількості. У якості прикладу розчинником може бути вода, яка містить один або більше наступних компонентів, вибраних з фенолу, гліцерину та буфер. Концентрація фенолу у відновленому продукті є, наприклад, 0.5%, як відзначалося вище, буфер переважно є не фосфатним. На закінчення, цей аспект винаходу стосується, між іншим, наступних особливо бажаних варіантів здійснення: (І) композиції, зокрема водної композиції, що містить або навіть складається з очищеного або частково очищеного поксвірусу, вибраного з групи, яка складається з Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus та Suipoxvirus, дисахариду, фармацевтично прийнятного полімеру та необов'язково, буфер у. Полімером переважно є декстран, бажано у кількості, як визначено вище (II) композиції, зокрема водної композиції, що містить або навіть складається з поксвірусу, вибраного з групи, яка складається з Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus та Suipoxvirus, дисахариду, фармацевтично прийнятного полімеру та буферу, де буфер є не фосфатним, та де поксвірус є переважно очищеним або частково очищеним. Полімером переважно є декстран, бажано у кількості, як визначено вище, (III) композиції, зокрема водної композиції, що містить або навіть складається з поксвірусу, вибраного з групи, яка складається з Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus та Suipoxvirus, дисахариду, фармацевтично прийнятного полімеру та не обов'язково буферу, де полімером переважно є декстран, у кількості, як визначено вище, у якості прикладу переважно в межах від 5 до 40г/л. Бажано, щоб буфер був не фосфатним. Поксвірус є переважно очищеним або частково очищеним. Термін „складається з" як його використано у контексті вказаних вище варіантів (I), (II) та (III), стосується композицій, що складаються тільки з вказаних ви ще компонентів, та композицій, що додатково містять одну або більше солей. Прикладами солей, які можуть додаватися до композицій (І), (II) та (III), що складаються з визначених вище компонентів є КСІ, NaCI, глутамат натрію. Таким чином термін „складається з" у визначенні вказаних вище композицій (I), (II) та (III) не виключає можливості додавання однієї або більше солей. У якості прикладу окреме втілення представленого винаходу включає водн у композицію, яка містить очищений або частково очищений поксвірус, вибраний з групи, яка складається з Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus та Suipoxvirus, дисахарид, фармацевтично прийнятний полімер та буфер, де дисахарид є цукрозою у визначених вище кількостях, полімер - декстрином у визначених вище кількостях, і де буфер є не фосфа тним буфером. У якості прикладу інше окреме втілення представленого винаходу включає водну композицію, яка містить поксвірус, вибраний з групи, яка складається з Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus та Suipoxvirus, дисахарид, фармацевтично прийнятний полімер та необов'язково буфер. Поксвірус переважно є очищеним або частково очищеним. Бажані кількості та приклади дисахариду, полімеру та буферу були визначені вище. Питання щодо того, як багато композицій, зокрема водних композицій, що містять поксвірус може бути введено та яку кількість вірусу використовувати при вакцинації лежать у межах компетенції практикуючого спеціаліста. Як вказувалося вище, вакцини можуть бути використані для індукування імунної відповіді проти їх поксвірусів, зокрема, якщо використовуються атенуйовані або непатогенні, не рекомбінантні поксвіруси. Якщо використовується рекомбінантний поксвірус, додатково підвищується імунна відповідь проти рекомбінантного протеїну/пептиду, що експресується поксвірусним вектором. Термін „композиція" як його використано вище звичайно стосується рідких композицій, переважно водних композицій, якщо не вказано інакше. Якщо концентрації або межі концентрацій позначені "mМ", "г/л" і так далі, це показує, що відповідна композиція є рідкою або навіть водною композицією. Термін „водна композиція" стосується тих композицій, в котрих розчинником є вода. Однак, межі представленого винаходу також охоплюють ті сухі композиції, котрі можуть бути одержані з рідких або навіть водних композицій згідно з представленим винаходом шляхом видалення рідини, незалежно від методу, що використовується для вказаного видалення. Таким чином, винахід також охоплює ті сухі композиції, котрі одержані способами, іншими, ніж заморожуванням-висушуванням. Зокрема, представлений винахід також стосується способу виготовлення стабільної, поксвірусвмісної композиції, який характеризується тим, що композицію згідно з представленим винаходом, зокрема водну композицію ліофілізують. У представленій заявці терміни „стійка, поксвірусвмісна композиція" та „ліофілізована поксвірусвмісна композиція" використовуються замінюючи один одного, якщо не зазначено інакше. Термін „стійка, поксвірусвмісна композиція" використовується у представленій заявці для позначення поксвірусвмісної композиції, у котрій загальна втрата вірусного титру при температурі інкубування 37°С протягом 28 днів менша ніж 0.5log, переважно, менше ніж 0.4log. Детальний протокол визначення вірусного титру та таким чином загальної втрати титру вірусу наведено у розділі прикладів. Однак, також може бути використаний будь-який інший протокол визначення титру вірусу. Метод заморожування-висушування є в цілому відомим для фахівця, обізнаного у даній галузі [Day, J. and McLellan, M., Methods in Molecular Biology, Humana Press, (1995) vol.38]. Процес заморожування-висушування зазвичай полягає у наступних стадіях, котрі більш детально пояснені нижче: 1. виготовлення вакцини; 2. заморожування зразку; 3. первинне висушування (сублімація); 4. вторинне висушування (десорбція); 5. закупорювання продукту та вивантаження; 6. зберігання вакцини; 7. відновлення вмісту вологи. Виготовлення й ампліфікація поксвірусів, що мають використовува тися буде детально пояснено далі. Поксвіруси необов'язково очищували. Склад, згідно даного винаходу було одержано додаванням раніше зазначених дисахаридів, полімерів та, необов'язково, буферу, L-глютамінової кислоти та, необов'язково, також добавок до поксвірусного складу. Заморожування зразка для іммобілізації компонентів в розчині, і таким чином попереджувало пінення продукту під час зниження тиску. Заморожування є двоетапним процесом під час якого вода спочатку утворює нуклеати, з подальшим ростом кристалів льоду, що призводило в результаті до суміші льоду та концентрованого розчину. Енуклеація льоду стимулювалася зниженням температур та збовтуванням охолодженої суспензії. Порівняно із нуклеацією, ріст льоду стимулювався підвищенням температури, й таким чином зниження в'язкості розчину. Незважаючи на вивірений характер заморожування, проліферація кристалів льоду в розчині призводила до зростання концентрації розчину. Біополімери в розчині або суспензії ушкоджувалися або інактивувалися впливом на них підвищеними концентраціями розчину, швидке охолодження мінімізувало вплив біопродукту на концентрат. Вище критичної температури (температури осклування) масова в'язкість може знижуватися достатньо для того щоб скло пом'якшувалося й деформувалося. Це висушувалося до утворення клейкого залишку в ампулі. Температура викривлення називається температурою колапсу. Більш детально, температура колапсу, визначається як температура при якій рухомість води в проміжному регіоні матриксу стає значною. Для запобігання викривленню температура має бути нижчою за температур у колапсу водного складу. Температура колапсу може бути визначена згідно методів, відомих особі досвідченій в даній галузі, наприклад, шляхом диференціального термального аналізу [Jennings, Т.A., "L yophilization, Introduction and Basic Principles", Interpharm Press, Denver, CO, US, 1999, ISBN 1-57491-081-7, pages 132-134]. Якщо температура занадто низька, дифузія води з вірусу може бути загальмована, й може мати місце ушкодження внутрішньоклітинним льодом. От чому, особа досвідчена в даній галузі може емпірично визначити декілька температур замерзання, котрі всі є нижчими за температуру колапсу водного складу й він може визначити котра температура призводить до ліофільно висушеного продукту, котрий має найвищий титр поксвірусів. Первинне сушіння (сублімація): Первинне сушіння є тією частиною процесу ліофільного сушіння, котрий призводить до сублімації сольвенту (льоду) з замороженого матриксу. Процес первинного сушіння починається після того як ліофільна сушила досягає бажаної конденсорної температури та тиску в камері. Тиск в камері зазвичай є нижчим за 1мБар, бажано нижче за 0,2мБар. Типово тиск в знаходиться в межах до 0,04 до 0,12мБар. В усьому цьому описі ці умови іноді будуть зазначені як „низький тиск". Температура полички була збільшена так, щоб відбувалася сублімація льоду в матриксі продукту і температура продукту була значно нижчою за температур у колапсу складу для забезпечення повної замороженості матриксу на протязі всього процесу первинного заморожування й забезпечення ліофільного сушіння без колапсу. Температура може лишатися постійною на протязі всього процесу первинного сушіння. В іншому випадку температура полички може постійно зростати під час первинного сушіння. Однак, температура продукту має бути нижчою від температури колапсу протягом усього процесу первинного сушіння. Наприкінці первинного сушіння продукт все ще може містити більш ніж 5% вологи (за масою). Для одержання продукту із вмістом вологи, який не буде підтримувати біологічний ріст або хімічні реакції необхідно провести повторне сушіння. Під час вторинного сушіння водяна пара десорбується з поверхні брикету, який утворився під час первинного сушіння. Це виконується збільшенням температури тоді як тиск в камері залишається низьким так, що вода десорбується з поверхні брикету. Температура полички для вторинного сушіння була визначена за стабільністю продукту і може бути в межах від 0°С до +30°С. Звичайно температура продукту знаходиться в межах від -5°С до +30°С. Більш бажано, щоб температура була в межах від 5°С до +20°С. Повторне сушіння може біти виконане в дві стадії. На першій стадії температура продукту має бути в межах від -5°С до +15°C, краще в межах 0°С до +10°С, ще краще в межах від +2°С до +7°C. Друга стадія виконується при вищій температурі ніж на першій стадії повторного сушіння. Температура може бути в межах від 0°С до +30°C, краще в межах від +5°С до +20°С. Вміст залишкової вологості також може залежати від вимог продукту. Деякі вироби потребують більшої вологості, а деякі меншої для одержання найкращої стабільності виробу. Оптимальний вміст залишкової вологи, а також час необхідний для досягнення цього має бути визначено емпірично. Процес вторинного сушіння триває до досягнення бажаної вологості. Спосіб визначення рівня вологості продукту є відомим особі досвідченій в даній галузі. Зокрема, може бути застосоване кулонометричне титрування за Карл-Фішером [Jennings, T.A., "Lyophilization, Introduction and Basic Principles", Interpharm Press, Denver, CO, US, 1999, ISBN 1-57491-081-7, pages 415-418]. Вміст залишкової вологості бажано має бути меншим за 5%, більш бажано в межах від 0,5 до 4%, ще більш бажано в межах від 1 до 3%. Усі флакони, що містять продукт, закриваються способом відомим особі, досвідченій в даній галузі. Флакони можуть закорковуватися при дуже низькому тиску (наприклад, 0,04-2,56мБар) безпосередньо в ліофільній сушилці. Також флакони можна закривати при тиску дещо більшому або меншому за атмосферний, з використанням хімічно інертного газу, такого як азот або гелій. Звичайно, флакони можна закривати в атмосфері азоту при тиску 900мБар. Флакони закорковують, переважно за допомогою бутилкаучукових пробок. Після коркування продукту система може бути приведена до атмосферного тиску й поличка може бути розвантажено. Після цього флакони можуть бути закриті алюмінієвими кришками для довготривалого зберігання. Ліофільно висушений продукт може зберігатися при кімнатній температурі (25°С) й лишатися стабільним на протязі принаймні 18 тижнів, бажано принаймні 20 тижнів, більш бажано на протязі 22 тижнів при цій температурі. „Стабільний при певній температурі на протязі певного проміжку часу" означає, що втрата вірусного титру при цій температурі становить 0,5logs за цей проміжок часу. Однак якщо можливе охолодження, бажано щоб ліофільно висушений продукт зберігався при знижених температурах таких як 4°С. Бажано зберігати продукт в темряві. Якщо це не можливо, бажано використовувати кольорове скло або будь-які інші флакони які запобігають небажаному впливу світла. Для розведення ліофільно-висушеного продукту відповідну кількість розчиннику додають у ліофільно висушений продукт для одержання фармацевтично придатної композиції яку можна використовувати для людей або тварин. Розчинником є переважно вода. Зазвичай розчинник додається до композиції в кількості яка є досить подібною до кількості втраченого розчинника під час ліофільного сушіння. Винахід також відноситься до ліофілізованого продукту одержаного способом згідно даного винаходу. Отже, ліофілізований продукт, згідно даного винаходу включає: (і) поксвірус, переважно з родів ортопоксвірус або авіпоксвірус, (іі) дисахарид, (ііі) фармацевтично прийнятний полімер та необов'язково, (iv) та буфер, де поксвірус, диса харид, полімер та буфер такі як означено вище. Типові композиції ліофільно висушеного продукту показані в наступній таблиці 2. В усіх складах приведених в таблиці 2 кількість вірусу становить 5´108TCID50/ml. Таблиця 2 Кількість DSG [%] у водному складі перед ліофільною сушкою (DSG:63г/л декстран у із MW 36000-44000, 150г/л сахарози, 36г/л моногідрату моно калієвої солі L-глютамінової кислоти Сахароза [%] в ліофільно висушеному продукті Декстран [%] в ліофільно висушеному продукті моногідрату моно калієвої солі L-глютамінової кислоти [%] в ліо фільно висушеному продукті Середнє значення ліофільно висушеного брикету [mg] 20 54.7 (36mg) 23 (15.12 mg) 30 40 58.7 (54 mg) 58.4 (72 mg) 24.7 (22.68 mg) 24.6 (30.24 mg) 0.13 (0.0864 mg) 0.14 (0.1296 mg) 0.14 (0.1728 mg) 65.8 92 123.1 Ліофільно висушений продукт, згідно даного винаходу, використовується для виготовлення вакцини. Для цього ліофільно висушений продукт розчиняють/відновлюють, як описано вище й застосовують до людей або тварин способами відомими особі досвідченій в цій галузі. Фігура 1 показує стабільність ліофільно висушеної композиції, яка містить MVA, при температурі 31°С. Досліджувана композиція GT23 (дивіться розділ прикладів та таблицю 6). Вірусний титр водного розчину, згідно даного винаходу, визначали до ліофільного сушіння. Ліофільне сушіння GT23 було проведено як описано (дивіться приклади та таблицю 6). Після ліофільного сушіння композиція зберігалася при 31°С. У вказаних точках часу ліо фільно висушену композицію було відновлено й повторно визначено вірусний титр. На Фігурах 2 та 3 показано результати таких самих експериментів, як описано в підписах до Фігури 1 за виключенням того, що відбувалося інкубування при температурі 37°С на Фігурі 2 та 45°С Фігурі 3. Приклади Наступні приклади додатково проілюструють даний винахід. Особі досвідченій в даній галузі, має бути добре зрозуміло що наведені приклад(и) ні в якому разі не можуть інтерпретуватися як обмеження застосування технології передбаченої даним винаходом для цього приклад(ів). Приклад 1: Ліофільно висушені композиції, які містять Модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара (MVA) В цьому прикладі композиції згідно даного винаходу, які містять MVA були висушені заморожуванням за різних умов. Стабільність MVA в композиції була проаналізована визначенням титру MVA після розведення продукту висушеного заморожуванням та порівняння результату із титром MVA до висушування заморожуванням. Було визначено вплив різних термінів зберігання на вірусний титр. Методика визначення титру композиції, що містить MVA наведено в прикладі 2. 1. Опис експерименту Приготування вакцини/композиції Для тестування процесу сушки заморожуванням згідно даного винаходу було використано декілька композицій MVA. Для експериментів сушки заморожуванням (строки GT 1-4,6-10 та 13-15 в таблиці 6) було використано Модифікований вірус коров'ячої віспи штаму Анкара (MVA). Вірус було очищено центрифугуванням в 36% та 40% сахарозних градієнтах і наступним ресуспендуванням в 1mM Tris-буфері із рН9. В експериментах GT 1-4 (табл.6) не використовували жодних домішок. Було застосовано буферну систему 10mM Tris з 140mM NaCI із рН7.4. Для сушки заморожуванням починаючи з номеру GT6 (табл.6) використовувалися різні домішки без зміни буферної системи. Було вибрано дві різні композиції із різними домішками. Домішки було додано до розчинів, що містили вірус, додаванням буфер у розведення. Склад використаних буферів розведення приведено в наступних таблицях 3 та 4. Дані додавання буферу розведення 1 (DSG) у водний розчин, згідно даного винаходу. Дані додавання буферу розведення 2 (DGG) у розчин для проведення порівняльного аналізу. Таблиця 3 Буфер розведення 1 (DSG) декстран MW 36000-44000 Концентрація в розчині г/л 63 сахарози моногідрату моно калієвої солі L-глютамінової кислоти 150 0,36 Таблиця 4 Буфер розведення 2 (DGG) декстран MW 36000-44000 глюкоза моногідрату моно калієвої солі L-глютамінової кислоти Концентрація в розчині г/л 63 150 0,36 Ці буфери розведення використовувалися в різних концентраціях у кінцевого складах. Буфер розведення 1 (DSG) застосовувався як 16.7%, 23%, 30% та 40% (об/об), буфер розведення 2 (DGG) 20% (об/об). TCID50/ml кінцевого складу доводився до 5´108TCID50/ml із фізіологічним Tris-буфером (10mM Tris- буфер; 140mМ NaCI; pH7.4). Зразки було заморожено в заморожувальному сушнику (заморожувальний сушник Christ, Тип Alpha 2-4). Для складу із сахарозою (DSG) порівняння різних температур заморожування (від -30°С до -45°С) показало, що суспензія має заморожуватися до -40°С, яка є нижчою за температуру колапсу складу, для одержання відмінної структури брикету. Коли температура всередині заморожувального сушника, температура -40°С досягається через 3,5-4,5год (початкова 20°С). Для складу із сахарозою (DSG) температура колапсу становить від -30 до -37°С, як було припущено на значенні температури колапсу сахарози (-31°С). От чому температура продукту підтримувалася в межах від -37 до 41°С, для підтримання повністю замороженої матриці. Тиск застосовувався від 0,04 до 0,12мБар (-50°С та -40°С на фазовій діаграмі води). Рушійною силою сублімації під час первинного висушування є різниця тисків між продуктом та конденсором заморожувального сушника створена температурним диференціалом. Закон природи говорить про те, що якщо температура води знижується, то і тиск над водою також знижується. Певна температура води завжди пов'язана із певним тиском. Конденсор було встановлено на температуру в межах від -83 до -89°С. Тиск у камеру й температура полички регулює температуру полички. Це вказує на те, що тривалість первинної сушки не може бути просто скорочена, оскільки температура конденсора є фіксованою. Тс складу є лімітуючим фактором для збільшення температури продукту. Температури вторинного сушіння були визначені за стабільністю продукту. Також вміст остаточної вологи складу залежав від вимог продукту. Деякі потребували більший вміст вологи, деякі менший, для досягнення найкращої стабільності продукту. Оптимальний вміст остаточної вологи так само як і час для його досягнення мав бути визначений дослідним шляхом. Після того як почалася вторинна сушка і температура продукту стала вище 0°С, вторинна сушка проводилася в два етапи. На першому температура полички регулювалася на протязі декількох годин (в межах від 4 до 7 годин) таким чином, що температура продукту була вищою за 0°С, (в межах від 4 до 6°С). Таким чином весь залишковий лід, який лишився після первинного сушіння було розтоплено. Застосування таких м'яких умов для початку вторинного сушіння дозволило мінімізувати ушкодження продукту. Потім, другий етап було розпочато збільшенням температури продукту до значень в межах від 18 до 20°С на протязі 20-30 годин. Час другого етапу чітко залежав від потрібного рівня залишкової вологи у ліофільно висушеного продукту. Для одержання різних рівнів залишкової вологи застосовували різні проміжки часу. Як метод визначення вмісту залишкової вологи в ліофільно висушеному матеріалі було кулонометричне титрування за Карлом-Фішером [Jennings, Т.A., "L yophilization, Introduction and Basic Principles", Interpharm Press, Denver, CO, US, 1999, ISBN 1-57491-081-7, pages 415-418]. Усі продукти одержані під час розробки даного способу коркували при дуже низькому тиску (0,04-2,56мБар) безпосередньо в ліофільній сушилці. Флакони закорковували, переважно за допомогою бутилкаучукових пробок. Після того як продукт було закорковано, система була приведена до атмосферного тиску й стелаж може бути розвантажено. Після цього флакони були закриті алюмінієвими кришками для довготривалого зберігання. Важливим аспектом застосування даного винаходу є одержання вакцини, яка є стабільною при зберіганні. Факторами, які впливають на стабільність включають остаточний вміст вологи, склад атмосфери при коркуванні, та умови зберігання, включаючи температуру, вологість та сві тло. Різні пакети одержані при розробленні даного способу зберігали при 4°С та при кімнатній температурі. Також, декілька пакетів зберігали при 31°С, 37°С та 45°С. Всі зразки зберігали в темноті. Ліофільно висушені зразки розводили автоклавованою водою Milli-Q. Більш докладно, вода (1,2мл) вносилася до зразка за допомогою шприца. Суспензію розмішували легким збовтуванням. Розведення тривало лише декілька секунд. Вірусний титр розведеного продукту було визначено порівняно з вірусним титром до ліофільного сушіння. Стабільність складу GT23 (див. таблицю 6) оцінювали при 31°С, 37°С та 45°С. Вірусний титр спостерігали постійно. Результати приведено на фігурах з 1 по 3. 2. Результати й заключення: MVA було ліофільно висушено без застосування різних домішок. Склади без домішок виявилися нестабільними (див. таблицю 6). В цьому контексті зразки було визнано стабільними де титр не падав більш ніж на 0,5log. Таким чином, термін „стабільний при певній температурі для певного проміжку часу" означає, що втрата вірусного титру при цій температурі менша за 0,5log на протязі цього ча су. Склад „невдалий", якщо втрата вірусного титру на протязі вказаного часу при вказаній температурі становить 0,5log або більше. Склади, які містили декстран та глюкозу, показали дуже низьку стабільність при кімнатній температурі. Склади, згідно даного винаходу, які мали різні концентрації сахарози та декстрану визнано стабільними. Стабільність MVA в складах, згідно даного винаходу, є принаймні 25 тижнів при 4°С та кімнатній температурі. Детальну інформацію стосовно окремих експериментів подано в таблиці 6: В таблиці 6 показано, що стабільність складів без добавок (таблиця 6, GT 1-4) дуже низька. Після декількох тижнів вони втрачали 0,5log їхнього початкового титру, що не є прийнятним. Склади із 20% (об/об) DGG були не прийнятні із-за колапсу матеріалу під час процесу ліофільного сушіння (дані не приведено). Цей колапс пояснює низьку Тс глюкози, яка значно не збільшувалася застосуванням декстрану, котрий має високу Тс (-11°С). Для первинного сушіння було застосовано найнижчу можливу температуру обладнання для ліофільного сушіння (-45°С). От чому неможливо було знизити температури нижче за Тс глюкози. Склади із 30% (об/об) DGG не зазнали колапсу. Цей феномен може бути пояснений більшим вмістом декстрану, котрий підвищив Тс до значення вищого за температур у первинного сушіння. Хоча матеріал не зазнав колапсу, стабільність, особливо при кімнатній температурі, була незадовільною, що могло бути спричинено низькою солідністю Тс глюкози (таблиця 6, GT 10). Буфер розведення 1 (DSG) використовувався в більшості експериментів. Стабілізація із цим компонентом є дуже доброю. Завдяки високій Тс (-31°С) колапс сахарози не був проблемою в цьому складі. Стабільність ліофільно висушеного складу (таблиця 6). Не було великої різниці між застосуванням 16.7%, 20%, 23%, 28.6%, 30% та 40% (об/об) DSG у складах. Стабільність при 4°С та кімнатній температурі було визнано для 6 складів. Ліофільно висушені продукти із 30% та 40% DSG мали дещо кращу стабільність. Одну з композицій (процес GT 23, дивись таблицю 6) було детально проаналізовано на прискорений тест стабільності. Результати показано на фігурах 1-3 та підсумовано у наступній таблиці 5. Таблиця 5 Втрата титр у Втрата 0,5log Температура [°С] (експеримента- після [днів] льні дані) (розраховано) 0,245logs через 31 59 29 днів 0,321logs через 37 54 35 днів 0,332logs через 45 44 29 днів При 31°С вакцина зберігалася протягом близько 1 місяця та все ще відповідала технічним вимогам (втрата вірусного титр у є меншою, ніж половина log). Однак навіть при вищих температурах є можливим зберігання вакцини протягом більш ніж одного місяця, що може викликати зацікавленість особливо у тропічних регіонах. Для старої вакцини проти віспи WHO рекомендував метод оцінки стабільності. Якщо вакцина втратила менше, ніж 1log за 4 тижні при 37°С, то допускалося, що вона є стабільною щонайменше протягом 1 року, якщо зберігалася при 4°С (прийнятним критерієм для використання старих вакцин була втрата менше ніж 1log). Як показано, композиція GT 23 згідно з представленим винаходом задовольняє цьому критерію. Приклад 2: Титрування модифікованого вірусу коров'ячої віспи Ankara (MVA) Титрування модифікованого вірусу коров'ячої віспи Ankara (MVA) проводилося методом заснованим на TCID50 з використанням 10-разового розведення в 96-лункових планшетах. Кінцева точка тесту, ін фіковані клітини візуалізовані з використанням антитіл до вірусу коров'ячої віспи та відповідним забарвлюючим розчином. 2-3-денні первинні клітини CEF (курячі ембріобласти) були розведені до 1´105 клітин/мл в 7% RPMI. 10-кратні розведення виконані із 8-ма реплікатами на кожне розведення. Після розведення 100mІ поміщали в кожну лунку 96-лункової планшети. Клітини інкубували на протязі ночі при 37°С та 5% СО2. Розведення розчинів, що містили вірус були виконані в 10 стадій (10-1 до 10-12 як призначено) з використанням RPMI без телячої сироватки. Потім, 100mІ кожного вірусного зразка додавали в лунки із клітинами. 96-лункові планшети інкубували при 37°С та 5% СO2 на протязі 5 днів для того щоб забезпечити інфікування та вірусну реплікацію. Через 5 днів після інфікування клітини обробляти антитілами специфічними до вірусу коров'ячої віспи. Для визначення специфічних антитіл використовували пероксидазу хрону (HRP) зв'язану із вторинними антитілами. Антитіла специфічні до MVA є антитілами специфічними до вірусу коров'ячої віспи, кролячими поліклональними антитілами, фракція IgG [Quartett, Berlin, Germany #9503-2057]. Вторинні антитіла є антитіла до кролячого IgG, поліклональні козячі зв'язані із HRP антитіла [Рrоmеgа, Mannheim, Germany, #W4011]. Кольорові реакції виконуються згідно відомих методик. Кожна лунка із клітинами, котра є позитивною при кольоровій реакції, маркувалася як позитивна для обрахування TCID50. Титр обраховува вся з використанням формули Spearman [1] та Kaerber [2]. Оскільки всі параметри методу залишалися незмінними, то використовувалася спрощена формула: xa xb xc ù é ê a+ 1. 5+ 8 + 8 + 8 ú ë û Вірусний титр [TCID50 / ml] = 10 а = коефіцієнт розведення останньої колонки, в котрій всі вісім лунок були позитивними ха = кількість позитивних лунок в колонці а+1 хb = кількість позитивних лунок в колонці а+2 хс = кількість позитивних лунок в колонці а+3 Таблиця 6 Показники стабільності поксвірусів у різних ліофільно висушених композиціях GT1 Добавки GT2 QT3 GT4 GT6 30%DSG GT7 23%DSG Процес GT8 GT9 ЗамороПервинне сушіння Вторинне сушіння жування до - 30°С Тиск: 0,37мБар Темпера- Тиск: 0,37мБар Темпетура полички: ратура полички: 2°С (протягом 20год) 5°C (протягом 2,5год) 8°С (протягом 1год) 10°С (протягом 2год) до -40°С Тиск: 0,12мБар Темпера- Тиск: 2,56мБар Темпетура продукту: ратура продукту: -13°С (протягом 24год) -4°С (протягом 3,5год) 12°С (протягом 4год) до -39°С Тиск: 0,07мБар Темпера- Тиск: 0,07мБар Темпетура продукту: ратура продукту: -16°С (протягом 24год) -1°С (протягом 2,75год) 7°C (протягом 3,5год) до -45°С Тиск: 0,04мБар Темпера- Тиск: 0,04мБар Темпетура продукту: ратура продукту: -37°С (протягом 25,5год) -3°С (протягом 6год) 14°С (протягом 26,5год) до -44°С Тиск: 0,04мБар Темпера- Тиск: 0,04мБар Темпетура продукту: ратура продукту: 5°C -42°С (протягом 23год) (протягом 6год) 16°С (протягом 25год) до -44°С Тиск: 0,04мБар Темпера- Тиск: 0,04мБар Темпетура продукту: -37°С ратура продукту: (протягом 22,5год) 0°С (протягом 6год) 13°С (протягом 24год) 16,7% та до -42°С Тиск: 0,04мБар Темпера- Тиск: 0,04мБар Темпе23% DSG тура продукту: ратура продукту: -38°С (протягом 24год) 4°C (протягом 8год) 17°С (протягом 21год) 30% та до -44°С Тиск: 0,04мБар Темпера- Тиск: 0,04мБар Темпе40% DSG тура продукту: ратура продукту: -37°С (протягом 25,5год) 4°C (протягом 6,5год) 17°С (протягом 24год) GT10 30% DGG до -35°С Тиск: 0,04мБар Темпера- Тиск: 0,04мБар Темпетура продукту: -37°С ратура продукту: (протягом 23год) 6°С (протягом 6,5год) 19°С (протягом 24год) GT11 20% DGG до -45°С Тиск: 0,04мБар Темпера- Тиск: 0,04мБар Темпетура продукту: ратура продукту: 5°C -41°С (протягом 23год) (протягом 4год) 19°С (протягом 25,5год) 30% DSG до -40°С Тиск: 0,04мБар Темпера- Тиск: 0,04мБар Темпетура продукту: ратура продукту: -37°С (протягом 24год) 4°C (протягом 6год) 17°С (протягом 24год) GT12 Стабільність Втрачає активність після 1 тижня зберігання при кімнатній температурі та 37°С Втрачає активність після 11 днів зберігання при кімнатній температурі та 37°С Втрачає активність після 23 днів зберігання при кімнатній температурі Втрачає активність після 2 тижнів зберігання при 4°С та кімнатній температурі Композиція стабільна при 4°С протягом щонайменше 34тижнів при кімнатній температурі протягом щонайменше 20 тижнів Композиція стабільна протягом щонайменше 46 тижнів при 4°С та при кімнатній температурі при 4°С та кімнатній температурі стабільна протягом щонайменше 45 тижнів Композиція 3 30% DSG: При 4°С протягом щонайменше 57тижнів при кімнатній температурі протягом щонайменше 43 тижнів. Композиція 3 40% DSG: Стабільна при 4°С та кімнатній температурі протягом щонайменше 43 тижнів Композиція стабільна при 4°С протягом 42 тижнів. Композиція втрачає активність після 10 тижнів при кімнатній температурі (КТ) Композиція втрачає активність при 4°C після 56 тижнів; при КТ - після 14 тижнів Композиція стабільна протягом щонайменше 54 тижнів при 4°С При 25°С стабільна протягом GT13 GT14 GT15 GT23 30% DSG до -40°С Тиск: 0,04мБар Температура продукту: -38°С (протягом 19год) -15°С (протягом 9год) 30% DSG до -40°С Тиск: 0,04мБар Температура продукту: -38°СОТ (протягом 21,5год) -13°СОТ (протягом 17,5год) 30% DSG до -41°С Тиск: 0,04мБар Температура продукту: -37°СОТ (протягом 20год) Тиск: 0,04мБар Температура продукту: 4°C (протягом 15,5год) 17°С( протягом26,5год) Тиск: 0,04мБар Температура продукту: 15°С (протягом 6,5год) 18°С (протягом26,5год) щонайменше 40 тижнів Композиція стабільна протягом щонайменше 36 тижнів при 4°С Композиція стабільна протягом щонайменше 50 тижнів при 4°С При 25°С стабільна протягом щонайменше 19 тижнів Тиск: 0,04мБар Темпе- Композиція втрачає акратура продукту: тивність після 49 тижнів при 4°С; При 25°С стабі5°C (протягом 3год) 17°С (протягом 24,5год) льна протягом щонайменше 18 тижнів 30% DSG до -40°С Тиск: 0,12мБар Темпера- Тиск: 0,04мБар Темпе- Дивись дані прискорений тура продукту: -34°СОТ ратура продукту: 7°COT тест на стабільність на (протягом 21год) (протягом 18год) 17°С Фіг.1-3 (протягом 28год)