Спосіб отримання ентомопатогенного біопрепарату “комахоцид” для захисту сільскогосподарських і декоративних рослин від шкідників

Реферат: Спосіб одержання ентомопатогенного біопрепарату «Комахоцид» для захисту сільськогосподарських і декоративних рослин від шкідників включає одержання біопродукту використовують активний штам бактерій «Streptomyces avermitili» штамм 51, культивування штаму-продуцента проводять на збалансованому поживному середовищі, що містить сахарозу, екстракт кукурудзи, магній сірчанокислий калій фосфорнокислий однозамінений, пептон сухий ферментативний, дріжджовий автолізат, гліцин, тіамін хлористоводневий, піридоксин хлористоводневий, вітамін РР та воду питну. Одержання цільового продукту здійснюють у такий спосіб: сахарозу розводять дистильованою водою до досягнення 30 % кількості в розчині, і вводять у готовий розчин інгредієнти. Потім стерилізують 100 г поживного середовища протягом 1 години при температурі 130 °С, охолоджують до 25-30 °С. Потім поміщають 10 мл стерилізованого середовища в пробірку, поміщають туди вихідну культуру, вирощують її протягом 48-72 годин при температурі 28-30 °С. Після стерилізують 10 л поживного середовища протягом 2-х годин при температурі 130 °С, охолоджують до 25-32 °С. Потім визначають титр біомаси, поміщають у міні-ферментер на 50 л. Засівають середовище 10 мл біомаси, отриманої в пробірці, вирощують культуру в міні-ферментері протягом 48-72 годин при температурі 28-32 °С. Проводять перевірку матеріалу на стерильність, визначають титр біомаси, проводять визначення рН середовища. При цьому 10 л напрацьованої біомаси поміщають у стерилізоване поживне середовище того ж складу, розміщене у ферментері на 1 тонну. Здійснюють засів ферментера через посівний штуцер у зоні полум'я, біомасу вирощують 72 години при температурі 25-30 °С при подачі повітря тиском до 0,8 атм і одержують біомасу з 10 титром 9▪10 . У період культивування, для контролю процесу розвитку бактерій у біомасі, з апарата відбирають проби: першу - через 2 години після засіву, другу - через 6 годин. UA 91113 U (12) UA 91113 U UA 91113 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до галузі сільськогосподарської мікробіології, а саме до способу одержання ентомопатогенних препаратів для біологічного захисту сільськогосподарських і декоративних рослин від шкідливих комах, і може бути використана в мікробіологічній промисловості, а також у дослідницькій практиці. Відомий засіб для боротьби з такими шкідниками рослин як павутинний кліщ, моль у вигляді газоподібного діоксиду сірки (SО2), що отримують наприклад при спалюванні сірки на повітрі 3 (ГПК=10мг/м ). Цей засіб названо кращим засобом для дезінфекції у довіднику "Сад, огород і ферма на даче". - Сімферополь: вид. Таврида, 1994. - С. 268. Недоліком цього засобу є нетехнологічність його використання для обробки рослин на відкритому ґрунті. Ефективність сірчистого газу різко знижується при обробці високих дерев, особливо у вітряну погоду. При цьому підживлення рослин не відбувається. Сірчистий газ не затримується на листах рослин, а швидко відноситься навіть слабким рухом повітря. Відомий спосіб боротьби з такими шкідниками сільськогосподарських культур як павутинний кліщ, попелиця, моль, совки та ін. (див. наприклад, спосіб для боротьби зі шкідниками і захворюваннями сільськогосподарських культур, заявлений Одеським національним університетом ім. І.І. Мечникова (патент України № 9081, пр. 17.12.2004р.). Даний спосіб реалізується шляхом сорбції діоксиду сірки водяним розчином карбаміду, що забезпечує більш тривалий за часом вплив SO2 на шкідників рослин з одночасним позакореневим підживленням при розпилюванні на рослини водного розчину КА з діоксидом сірки. Склад запропонованого способу наступний (% мас.): карбамід 5-20, діоксид сірки 3,0-12, вода решта. Недоліком цього засобу є те, що після розпилювання його на рослини відбувається дуже швидка десорбція сірчистого газу з водного розчину карбаміду (5-10хв.), при цьому вплив на шкідників і мікроорганізми виявляється також короткочасним (5-10 хв.), що знижує ефективність застосування способу. Ще одним недоліком цього засобу є те, що при розпилюванні розведеного засобу водою краплі розчину скочуються з листя рослин на землю, внаслідок чого засіб, що пропонується, використовується недостатньо ефективно через великі втрати. Крім цього в окремих випадках препарат може бути причиною захворювання теплокровних. Відома "синергічна інсекцидна композиція", що включає активний інгредієнт - циперметрин (за патентом України №26654, опублікованому у бюлетені "Промислова власність" № 7 за 1999р. Μ кл.6 А09 № 53/08). Недоліком цієї композиції, що використовується як інсектицид для обробки плодових і овочевих культур, є висока отруйність циперметрину для людей і його висока вартість. Розчинність циперметрину у воді дуже низька-10 мг/л. Відомий розчин для боротьби з філоксерою винограду (за авторським свідоцтвом СРСР № 570355 Μ Кл. А01N 11/02, опубл. у Бюл. № 32, 1977р.) Розчин містить, (% мас): сірковуглець 3060, емульгатор-0,3-1,8, карбамід (КА) 11,5-35, воду-решта. Діючим компонентом проти шкідників є дуже сильна отрута - сірковуглець (CS2). КA виконує роль сорбенту CS2 і функцію добрива при позакореневому підживленні. Недоліками відомого розчину є складність використання внаслідок високої токсичності сірковуглецю (гранично 3 припустима концентрація ГПК=0,01мг/м -1-й клас токсичності), велика вартість, погана розчинність у воді. Відомий спосіб культивування ентомопатогенних бактерій, де середовище, на якому здійснюють висів бактерій, містить, вага, %: дріжджі кормові 2,0-4,0 борошно кукурудзяне 1,2-2,4 гідрол 0,5-2,4 гідролізат бавовняного шроту 3,0-14,0 вода решта. Засів середовища здійснюють суспензією спор бактерій Bacillus thuringiensis var. galleriae 10 шт. 69/6 у кількості 30 мл з концентрацією спор 10 спор/мл. Культивування проводять у лабораторному ферментері об'ємом 10 л з інтенсивністю аерації - 1 об/об.мін. протягом 22 годин росту, потім знижують інтенсивність аерації до 0,3 об/об.мін. і продовжують культивування ще 10 годин; культуральну рідину витримують протягом 5 годин на холоді (див. наприклад, спосіб культивування ентомопатогенних бактерій по а.с. 911765 пр. 13.05.80 p.-найближчий аналог). Недоліком даного способу є низький вихід спорової біомаси ентомопатогенних бактерій, відносна тривалість циклу одержання біопродукту, викликана недостатньою збалансованістю 1 UA 91113 U 5 10 15 20 25 30 35 40 поживного середовища, що знижує продуктивність культури, а також виникнення проблем із заощадженням спорової маси в умовах негативної температури. Задачею корисної моделі є одержання у виробничому варіанті необхідної кількості інтемацидного біопродукту, який забезпечує ефективний захист сільськогосподарських культур, у тому числі зернобобових, овочевих, аґрусу, смородини, плодових (яблуні, груші), декоративних рослин від комах-шкідників, що не є фітотоксичними і не токсичним для людини, теплокровних тварин, риб. В основу корисної моделі поставлена задача створення способу одержання у виробничому варіанті з мінімальними енергетичними витратами необхідної кількості екологічно безпечного комплексного інсектофугінцидного біопродукту встановленого титру, що забезпечує його широке застосування для захисту овочів, злакових, плодових, декоративних сільськогосподарських культур (зокрема винограду томатів, смородини, аґрусу, яблунь, груш) від комах-шкідників. Поставлена задача вирішується тим, що у способі одержання біопрепарату "Комахоцид" для захисту рослин від комах-шкідників, що включає засів клітин бактерій штаму бактерій "Streptomyces avermitili" штамм 51, культивування їх у поживному середовищі, яке містить в собі всі необхідні мікроелементи, мінеральні солі, вітаміни і стимулюючі добавки, вирощування біомаси на поживному середовищі з одержанням у промисловому варіанті цільового продукту у вигляді суспензії встановленого титру, визначення активності препарату при боротьбі з комахами-шкідниками різних сільськогосподарських культур, згідно з корисною моделлю, для одержання біопродукту використовують активний штам бактерій "Streptomyces avermitili" штамм 51, а культивування штаму - продуцента проводять на збалансованому поживному середовищі з наступним співвідношенням компонентів у кількості г/л: сахароза 3,0-5,0 екстракт кукурудзи 1,4-1,5 магній сірчанокислий 0,4-0,5 калій фосфорнокислий 0,1-0,15 однозамінений пептон сухий 0,5-0,55 ферментативний дріжджовий автолізат 0,5-0,55 гліцин 0,03-0,032 0,001тіамін хлористоводневий 0,0012 піридоксин 0,001хлористоводневий 0,0012 вітамін РР (нікотинова 0,005-0,006 кислота) вода питна 1,0, а одержання цільового продукту здійснюється в такий спосіб: сахарозу розводять дистильованою водою до досягнення 30 % кількості в розчині, і вводять у готовий розчин інгредієнти в такій послідовності: - дріжджовий екстракт, попередньо вказаний, для варіння доведений до кипіння й охолоджений до 30 °C, - екстракт кукурудзи - магній сірчанокислий - калій фосфорнокислий однозамінений - пептон сухий ферментативний - дріжджовий автолізат - гліцин - тіамін хлористоводневий - піридоксин хлористоводневий - вітамін РР (нікотинова кислота), стерилізують 100 г поживного середовища протягом 1,0 години при температурі 130 °C, охолоджують до 25-30 °C, поміщають 10 мл стерилізованого середовища в пробірку, поміщають туди вихідну культуру, вирощують 48-72 годин при температурі 28-30 °C, потім стерилізують 10 л поживного середовища протягом 2 годин при температурі 130 °C, охолоджують до 25-32 °C, роблять перевірку на стерильність висівом культури на ΜΠΑ чи МАВ, визначають титр біомаси, поміщають її в міні-ферментер на 50 л, засівають середовище 10 мл біомаси, отриманої в пробірці, вирощують культуру в міні-ферментері протягом 48-72 годин при температурі 28-32 °C 2 UA 91113 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 при постійному перемішуванні і подаванні стерильного повітря, проводять перевірку матеріалу на стерильність, визначають титр біомаси, проводять визначення рН середовища; 10 літрів напрацьованої біомаси поміщають у стерилізоване поживне середовище того ж складу, розміщене у ферментері на 1 тонну, роблять засів ферментера через посівний штуцер у зоні полум'я, біомасу вирощують 40-47 годин при температурі 25-30 °C при постійному перемішуванні і подаванні стерильного повітря тиском до 0,7 атм і одержують біомасу з титром 10 9▪10 , у період культивування для контролю процесу розвитку бактерій у біомасі з апарата відбирають проби: першу - через 2 години після засіву, другу - через 6 годин вирощування культури. 3 3 Визначення рН біопрепарату здійснюють шляхом розведення його 5 см у 40 см дистильованої води, суспензію розмішують на магнітній мішалці і проводять вимір рН по інструкції до приладу. Дослідним шляхом встановлено, що оптимальне нарощування біомаси відбувається при рН 7,4-7,6, в оптимальному інтервалі температур - від 32-36 °C. Техніко-економічна ефективність корисної моделі полягає в підвищенні ефективності технологічності виробництва бактеріального препарату, одержання в виробничому варіанті з мінімальними енергетичними витратами необхідної кількості біопродукту для захисту сільськогосподарських культур від комах-шкідників за рахунок раціонального вибору поживного 10 середовища для вирощування біомаси і підвищення її титру до 9·10 , а також використовування міні-ферментера і ферментера на проміжній і кінцевій стадії одержання біопродукту. Новим у способі є те, що як продуцієнт нового штаму бактерій "Streptomyces avermitili" штамм 51, що дозволяє створювати в біопрепараті комплекс природних авермектинів, що блокують передачу нервового імпульсу в комах, що викликає у свою чергу їх параліч, а також вибором для його реалізації поживного середовища зі збалансованими елементами живлення із уведенням у нього як органічні компоненти - активаторів біохімічних і фізіологічних процесів мікроорганізмів штаму бактерій "Streptomyces avermitili" шт. 51, у препарат уведені амінокислоти (гліцин) вітаміни групи В (тіамін і піридоксин), а також вітамін РР (нікотинова кислота). Дані стимулюючі добавки у сполученні з іншими компонентами поживного середовища у зазначеному співвідношенні значно підвищує обмінний процес на рівні клітин при їхньому вирощуванні, сприяє їхньому розвитку, а головне, їхньому визріванню; це забезпечило 10 найбільший вихід біомаси з підвищенням її титру до 9·10 і дозволило використовувати те саме поживне середовище на всіх стадіях виробництва біомаси; крім того, використання для засіву і вирощування біомаси на проміжній стадії міні-ферментера замість традиційних колб і качалок, дозволило при кращому перемішуванні середовища повітрям і збільшенні часу її вирощування 10 одержати культуру з необхідним титром 9·10 . Порівняльний аналіз способу, що заявляється, з іншими відомими з науково-технічної і патентної літератури дозволяє виявити ознаки, які відрізняють рішення, що заявляється, від прототипу, що дає можливість авторам зробити висновок про відповідність ознак, які заявляються, критерію "істотні відмінності", що визначає новизну запропонованого способу. Базовим показником, по якому йшла оптимізація поживного, середовища був титр препарату при закінченні кожної стадії його одержання. Визначення рН біопрепарату ґрунтується на визначенні за допомогою рН-метру концентрації іонів водню у готовому препараті "Комахоцид"; пробу "Комахоцида" об'ємом від 3 3 100 см до 140 см вимірюють циліндром 1(В)-5-2 і наливають у склянку Н(В)-1(2)-50ТС і поміщають у нього електроди лабораторного рН-метру. Показання знімають, коли стрілка рНметру займає стабільне положення, вимір рН повторюють 2-3 рази. За кінцевий результат контролю визнають середнє арифметичне результатів двох-трьох паралельних значень, припустима погрішність між якими не перевищує 0,1. Дослідним шляхом установлюємо, що оптимальне нарощування біомаси відбувається при рН 7,4 в оптимальному інтервалі температур від30 до 35 С Статистичній обробці піддавалася біомаса після вирощування в пробірці, на виході з мініферментера й у процесі вирощування у ферментері. Визначення титру препарату проводили методом, заснованому на підрахунку колоній, що виросли на поживному агарі, при засіві в чашки Петрі суспензії різних концентрацій препарату у вигляді послідовних десятикратних розведень, приготовлених на середовищі ΜΠΑ. Склад середовища: пептон, г 10 натрій хлористий, г 5 агар мікробіологічний, г 13 3 UA 91113 U 3 5 м'ясний бульйон, см 1000 рН середовища 7,4. Усі компоненти середовища поміщали в колбу, рН середовища доводили до 7,4 і стерилізували протягом 30 хв. при температурі 120 °C. Із середньої проби препарату готували ряд послідовних розведень за загальноприйнятою методикою. Використовували очищену воду. 3 -9 -8 -7 Під час проведення іспитів стерильною піпеткою 1 см суспензії розведень 10 ,10 , 10 був нанесений на поверхню середовища (ΜΠΑ) трьох чашок Петрі. Засіяні чашки витримували в термостаті при температурі 28 °C в протягом 50-70 годин. 3 3 Титр або концентрацію життєздатних колонієутворюючих одиниць в 1 см (КУО)/ см ) препарату "Комахоцид" обчислюють по формулі:  10 15 a  10n , V де 3 Т - титр препарату, до 10/ см а - число колоній (середнє арифметичне підрахунку колонії у трьох чашках Петрі), штук 10 - коефіцієнт розведення n - порядковий номер розведення, з якого сіяли "Комахоцид" 3 V - об'єм суспензії, яку брали для висівання, см За кінцевий результат випробувань приймають середнє арифметичне результатів трьох паралельних значень, допустима розбіжність між якими не повинна перевищувати 30 %. Приклад 1. Результати визначення титру культури після її вирощування представлені в таблиці 1. 20 Таблиця 1 Компоненти поживного середовища, г/л Калій Пептон сухий Вода фосфорно Дріжджовий 3 ферментативпитна, рН Титр, млрд/см кислий екстракт ний л однозамінний 3 1,4 0,3 0,1 0,5 0,5 1 7,4 9·10 2 1,5 0,4 0,15 0,55 0,55 1 9·10 3 1,6 0,5 0,17 0,6 0,6 1 9·10 Компоненти поживного середовища, г/л Тіамін Піридоксін Вітамін 3 Сахароза Гліцин хлористоводне- хлористоводне- РР(нікотинова рн Титр, млрд/ см вий вий кислота 3 3,0 0,03 0,001 0,001 0,005 7,4 9·10 2 3,1 0,031 0,0012 0,0012 0,006 9·10 3 3,2 0,032 0,0014 0,0014 0,004 9·10 Екстракт Магній кукуруд- сірчанокисзи лий 25 У міні-ферментері проводився засів культурою, вирощеної в пробірці зі співвідношенням 10 компонентів, що забезпечили її вихід з максимальним титром 9▪10 . Приклад 2. Результати визначення титру культури після вирощування її в міні-ферментері при різних годинних інтервалах і оптимальній температурі 30 °C представлені в таблиці 2. 4 UA 91113 U Таблиця 2 Поживне середовище Компоненти Экстракт кукурудзи Магній сірчанокислий Калій фосфорнокислий однозамінений Пептон сухий ферментативний Дріжджовий автолізат Вода питна Сахароза Гліцин Тіамін Піридоксин Вітамін РР (нікотинова кислота) Час Температура, °C вирощуванКількість, г/л ня, година 1,4-1,5 26 0,4 10 15 20 25 30 35 40 10 9·10 0,15 0,5 0,5 1л 5,0 0,03 0,001 0,001 0,005 30 10 31 9·10 32 9·10 10 5 Титр, 3 млрд/см 10 У ферментері вироблявся засів культури з міні-ферментера з титром 9·10 . У процесі культивування біомаси у ферментері відбиралися проби: перша - через 2 години після засіву, друга - через 6 годин. Визначення титру препарату проводилося за вищенаведеною методикою. Величина титру продукту з проби, узятої у ферментері через 2 10 години культивації, наприкінці її складала 9·10 . Біопрепарат має наступну характеристику. Зовнішній вигляд, колір і запах препарату "Комахоцид" визначають у момент узяття проб органолептично. "Комахоцид" за зовнішнім виглядом і кольором представляє суспензію світлого кольору з різкими відтінками жовтого з запахом поживного середовища. Культурально-морфологічні особливості біопрепарату. Біопрепарат вирощений при температурі 28 °C протягом 44-48 годин на ΜΠΑ утворює однорідну суміш і слабкий дрібнодисперсний осад. Перегляд на предметному склі суспензії з добової культури, пофарбованої по Граму (перегляд при збільшенні 15 × 40 не менш 10 полів зору по діагоналі) показав, що бактерії "Streptomyces avermitili" штамм 51 добре розвиті грам-негативні, пофарбовані в світлокоричневий колір палички середньої довжини і товщини з округлими полями розміром від 0,4 до 4-9 мк; бактерії добре ростуть на печінково-пептоновому бульйоні й інших середовищах, що мають нейтральну чи злегка лужну реакцію (рН 7,4-7,8) в аеробних умовах при температурі 35 °C. Фізіолого-біохімічні ознаки. Факультативний анаероб, нерухомий, каталізонегативний, не відновлює нітрити і нітрати, не розріджує желатини, слабко гідролізує ескулін, не утворює аміак з аргініну, не виживає після прогрівання при температурі 65 °C, росте при температурі від 24 до 55 °C; оптимальна температура росту 34-36 °C, оптимальне рН 7,3-7,6. Як джерело вуглецю використовують сахарозу, культура добре росте на концентрованих середовищах, що містять до 15 г/л сахарози, культура резистентна до кисню, не втрачає свою активність при збереженні біопрепарату тривалий час. Біопрепарат нетоксичний для людини, теплокровних, у застосовуваній концентрації не має фітотоксичності, не впливає на запах і смак одержуваної продукції. Після вирощування біопрепарату на культуральному середовищі (МБП із відповідними добавками) протягом 2-х тижнів при температурі 34 °C у термостаті одержують фільтрат і досліджують його токсичність у дослідах на білих мишах вагою 18-20 г. Фільтрат уводять перорально через зонд чи внутрішньочеревними ін'єкціями. Спостереження за тваринами проводили щодня протягом двох тижнів після закінчення ін'єкції чи перорального введення. У період спостереження усі тварини були активні, добре поїдали харчові раціони, фізіологічні відправлення в них не порушувалися, поведінкові реакції були звичайними, змін з боку вовняного покрову не відзначалося, прояву інтоксикації і загибелі тварин не спостерігалося. 5 UA 91113 U 5 10 15 Усі піддослідні миші після закінчення терміну спостереження були убиті, розітнуті і їхні органи піддані мікроскопічному вивченню. Результати розтину показали: серце - звичайної форми і величини. Легені в обсязі не збільшені, долі легко відокремлюються одна від одної, поверхня гладка, спайок не відзначається. Шлунок, петлі тонкого і товстого кишечнику зовні представляються звичайними. При розтині малюнок слизуватої не змінений. Печінка темно-червоного кольору, середнього наповнення, не збільшена. Долі відділені одна від одної, поверхня гладка. Нирки звичайних розмірів і форми. Поверхні гладкі, на розрізі чіткий малюнок коркової і мозкової речовини. Селезінка не збільшена, щільної консистенції, на розрізі пульпа помірно повнокровна, темно-червоного кольору. Таким чином, патологія внутрішніх органів відсутня. Результати дослідження токсичності фільтрату культури "Streptomyces avermitili" штамм 51 після росту на середовищі Гауза №2 представлені в таблиці 3. Таблиця 3 Кількість мишей у досліді 10 10 10 20 25 30 35 40 45 50 Доза, мл Шлях уведення 0,4 0,4 0,4 Курс /ведення Занедужало Загинуло Вижило Внутрішньоочеревинне Підшкірно Перорально 1 4 4 0 0 0 0 0 0 10 10 10 Таким чином, уведення мишам фільтрату культури "Streptomyces avermitili" штамм 51 не викликало у тварин патологічного процесу, який реєструвався клінічно або при мікроскопічному вивченні внутрішніх органів тварин. Приведені дані дають підставу вважати, що біопрепарат "Комахоцид" нетоксичний, тобто не є патогенним для теплокровних тварин. Визначення біологічної активності препарату "Комахоцид". Метод заснований на здатності бактерій, що знаходяться в препараті, уражати гусениць яблучної плодожерки. Гусениць інфікують, занурюючи в препарат "Комахоцид" на 3 секунди. Як тест-об'єкт використовують гусениць 5-го віку, вирощених на штучному кормі чи зібраних у природі. При проведенні досліджень готують водяний розчин препарату в концентрації 119/9 і 110/8 мікробних тіл на см/куб, що забезпечує смертність гусениць тест-об'єкту 64-97 %. Кожну концентрацію препарату використовують тричі. Гусениць занурюють на 3 секунди в приготовлені суспензії препарату по 30 шт. (3 рази по 10 гусениць). Після цього їх поміщають по одній в пробірку і закривають ватною пробкою. Одночасно проводять контрольний дослід в трьох паралельних, для чого 30 гусениць занурюють на 3 сек. у питну воду і розкладають у пробірки. Пробірки з гусеницями розміщають у термостаті і витримують при температурі 27 °C. Кількість гусениць, що загинули, підраховують на 3-4 добу. Обробка результатів. Середній відсоток загибелі гусениць (X) для кожної концентрації препарату з поправкою на загибель при контролі вираховують за формулою Аббота: Х = Мо – Мк:100 - Мк100, де Mo - кількість гусениць, що загинули від оцінюваної концентрації препарату (середня з 3-х повторюваних), %; Мк - те ж у контролі. Препарат вважається активним, якщо загибель гусениць складає 90-95 %. "Комахоцид" застосовують шляхом обприскування дерев суспензією препарату. Робочу суспензію готують за 3-5 години до початку роботи. Витрата препарату з титрів 1010/9 кліток/см/куб складає 6-10 л/га. Витрати робочої суспензії 500-600 л/га (у залежності від віку дерев). Суспензію готують на чистій воді, рН повинна бути близької до нейтральної. Обприскування дерев проводять у будь-якій фазі вегетації. Найбільш ефективним є використання "Комахоцида" проти плодожерок при температурі повітря 23-28 °C. Першу обробку проводять у період масового народження гусениць. Термін обробки визначають по кількості виловлених за 5 днів самців яблуневої плодожерки на одну феромонну 6 UA 91113 U 5 пастку (для першого покоління -5 самців, другого - 3 самці). Повторні обробки проводять через 7-12 днів. Як правило, проти першого покоління яблуневої плодожерки проводять два обприскування. Проти другого - 2-3, проти третього, факультативного - одне. Зберігання бактерій Pseudomonas(псевдомонас) на рослинах варіює від 7-12 днів, що обумовлено погодними умовами. Ентомоцидна активність "Комахоцида" щодо гусениць яблуневої плодожерки представлена в таблиці 4 Таблиця 4 Гусениці яблуневої плодожерки (L5) Загальна смертність, % 82** Вихід імаго, % 28 ** дані, вірогідність яких порівняно з контролем доведена на 99 %-ному рівні, як видно з приведених у таблиці даних "Комахоцид" має значні інсектоцидні властивості. 10 Ентомоцидна активність "Комахоцида" щодо ряду шкідників представлена в таблиці 5 Таблиця 5 Вид комах Стадія розвитку L2 L2 L3 L2 L2 L5 L,5 L5 L3 L4 Капустяна білявка Виноградна тля Бруньковий кліщ Бурячна блошка Морквяна муха Трібс Яблунева плодожерка Сливова плодожерка Яблучна совка Сливовий п'ядун СК50* для штаму 51 8,7 11,7 16,7 3,0 1,6 1,3 1,3 1,4 1,3 38,3 *CК50 - кількість кліток у млн/мл, що зумовлює 50 %-ную загибель комах. 15 Використання "Комахоцида" для захисту плодового саду від яблуневої плодожерки представлена в таблиці 6 7 UA 91113 U Таблиця 6 Рік 2009* 2010** 2011* 2012** Варіант Контроль «Комахоцид» Еталон Контроль «Комахоцид Еталон Контроль «Комахоцид» Еталон Контроль «Комахоцид» Еталон Норма витрат л/га 0 2 *** 0 2 0 3 *** 0 3 Кратність обробок 0 6 6 0 6 6 0 6 6 0 6 6 Ураження плодів Біологічна Врожайність, знятого врожаю ефективц/га плодожеркою % ність, % 60 10,2 68 0,82 92,1 68 0,82 95,0 72 15,2 76 1,4 93,0 78 1,4 95,5 83 12,4 88 0,62 93.0 88 0,7 98,9 76 16 80 1,1 91,6 80 1,4 96,2 *одне повне покоління яблуневої плодожерки ** два покоління яблуневої плодожерки 5 10 Таким чином, препарат у нормі витрати 2-3 л/га ефективно знижував враженість плодів яблуневою плодожеркою (92-93 %). В цілому за показниками ефективності щодо плодожерки, врожайності та рентабельності "Комахоцид" не поступався хімічним пестицидам. Протягом останніх років "Комахоцид" зарекомендував себе проти таких шкідників як багато видів листокруток, тлі, попелиць, вогнівок, плодожерок та ін. "Комахоцид" на тільки захищає рослини, гальмує розвиток і поширення захворювань, але і позитивно впливає на саму рослину, "лікує" її. Таким чином "Комахоцид" з успіхом використовується для передпосівної обробки насіння, замочування розсади, обробки виноградних насаджень і плодових дерев від шкідників. Додатковою перевагою пропонованої композиції є те, що вона, на відміну від аналогів, не акумулюється в самих рослинах і не впливає негативно на імунітет людини при вживанні в їжу продуктів харчування із сільськогосподарських культур. 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб одержання ентомопатогенного біопрепарату для захисту сільськогосподарських і декоративних рослин від шкідників, що включає засів клітин ентомопатогенних бактерій, культивування їх у поживному середовищі, яке містить в собі всі необхідні мікроелементи, мінеральні солі, вітаміни і стимулюючі добавки, вирощування біомаси на поживному середовищі з одержанням у промисловому варіанті цільового продукту у вигляді суспензії встановленого титру, визначення активності препарату при боротьбі з комахами-шкідниками різних сільськогосподарських культур, який відрізняється тим, що для одержання біопродукту використовують активний штам бактерій "Streptomyces avermitili" штам 51, культивування штаму-продуцента проводять на збалансованому поживному середовищі з наступним співвідношенням компонентів у кількості г/л: сахароза 3,0-5,0 екстракт кукурудзи 1,4-1,5 магній сірчанокислий 0,4-0,5 калій фосфорнокислий 0,1-0,15 однозамінений пептон сухий ферментативний 0,5-0,55 дріжджовий автолізат 0,5-0,55 гліцин 0,03-0,032 тіамін хлористоводневий 0,001-0,0012 піридоксин хлористоводневий 0,001-0,0012 вітамін РР (нікотинова 0,005-0,006 кислота) 8 UA 91113 U 5 10 15 20 25 вода питна 1,0, а одержання цільового продукту здійснюють у такий спосіб: - сахарозу розводять дистильованою водою до досягнення 30 % кількості в розчині, і вводять у готовий розчин інгредієнти в такій послідовності: - дріжджовий екстракт, попередньо в казані для варіння доведений до кипіння й охолоджений до 30 °С, - екстракт кукурудзи, - магній сірчанокислий, - калій фосфорнокислий одно замінений, - пептон сухий ферментативний, - дріжджовий автолізат, - гліцин, - тіамін хлористоводневий, - піридоксин хлористоводневий, - вітамін РР (нікотинова кислота), стерилізують 100 г поживного середовища протягом 1 години при температурі 130 °С, охолоджують до 25-30 °С, поміщають 10 мл стерилізованого середовища в пробірку, поміщають туди вихідну культуру, вирощують її протягом 48-72 годин при температурі 28-30 °С, потім стерилізують 10 л поживного середовища протягом 2-х годин при температурі 130 °С, охолоджують до 25-32 °С, визначають титр біомаси, поміщають у міні-ферментер на 50 л, засівають середовище 10 мл біомаси, отриманої в пробірці, вирощують культуру в мініферментері протягом 48-72 годин при температурі 28-32 °С при постійному перемішуванні і подаванні стерильного повітря, проводять перевірку матеріалу на стерильність, визначають титр біомаси, проводять визначення рН середовища; 10 л напрацьованої біомаси поміщають у стерилізоване поживне середовище того ж складу, розміщене у ферментері на 1 тонну, здійснюють засів ферментера через посівний штуцер у зоні полум'я, біомасу вирощують 72 години при температурі 25-30 °С при подачі повітря тиском до 0,8 атм і одержують біомасу з 10 титром 9·10 ; у період культивування, для контролю процесу розвитку бактерій у біомасі, з апарата відбирають проби: першу - через 2 години після засіву, другу - через 6 годин. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9