Спосіб одержання ентомопатогенного препарату “трихофіт” для захисту сільськогосподарських та декоративних рослин від шкідників

Спосіб одержання ентомопатогенного біопрепарату для захисту сільськогосподарських і декоративних рослин від шкідників, що включає засів клітин ентомопатогенних бактерій, культивування їх у живильному середовищі, яке містить в собі всі необхідні мікроелементи, мінеральні солі, вітаміни і стимулюючі добавки, вирощування біомаси на живильному середовищі з одержанням у промисловому варіанті цільового продукту у вигляді суспензії встановленого титру, визначення активності препарату при боротьбі з комахами-шкідниками різних сільськогосподарських культур, який відрізняється тим, що для одержання біопродукту використовують активний штам бактерій Pseudomonas aureofaciens штам В-111, культивування штаму-продуцента проводять на збалансованому живильному середовищі з автолізат дріжджів пекарських компонентів 36-42 наступним співвідношенням у сік цукрового сорго 10-16 кількості г/л: кукурудзяний екстракт 10-12 K2HPO4S 0,4-0,5 NH4SO3 0,8-1,0 U 2 (11) 1 ЗАХИСТУ UA ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС (19) МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ 3 31328 4 Склад запропонованого способу наступний (% викликана недостатньою збалансованістю мас): живильного середовища, що знижує карбамід 5-20, продуктивність культури, а також виникнення проблем із заощадженням спорової маси в умовах діоксид сірки 3,0-12, вода решта негативної температури. Недоліком цього засобу є те, що після Метою корисної моделі є одержання у розпилювання його на рослини відбувається дуже виробничому варіанті необхідної кількості швидка десорбція сірчистого газу з водного розчиінтемацидного біопродукту, який забезпечує ну карбаміду (5-10хв.), при цьому вплив на ефективний захист сільськогосподарських культур, шкідників і мікроорганізми виявляється також коу тому числі зернобобових, овочевих, аґрусу, роткочасним (5-10хв.), що знижує ефективність смородини, плодових (яблуні, груші) декоративних застосування способу. Ще одним недоліком цього рослин від комах-шкідників, що не є засобу є те, що при розпилюванні розведеного фітотоксичними і не токсичним для людини, засобу водою краплі розчину скочуються з листя теплокровних тварин, риб. В основу корисної моделі поставлено рослин на землю, внаслідок чого засіб, що завдання створення способу одержання у пропонується, використовується недостатньо виробничому варіанті з мінімальними ефективно через великі втрати. енергетичними витратами необхідної кількості Крім того, в окремих випадках препарат може екологічно безпечного комплексного бути причиною захворювання теплокровних. інсектофугінцидноґо біопродукта встановленого Відома "сінергічна інсекцидна композиція", що титру, що забезпечує його широке застосування включає активний інгредієнт - циперметрин [за для захисту овочів, злакових, плодових, патентом України №26654, опублікованому у декоративних сільськогосподарських культур бюлетені "Промислова власність" №7 за 1999р. М (зокрема, винограду томатів, смородини, аґрусу, кл.6 А09№53/08]. яблунь, груш) відзавдання вирішується тим, що у Поставлене комах-шкідників. Недоліком цієї композиції, що способі одержання біопрепарату "Трихофіт" для використовується як інсектицид для обробки захисту рослин від комах-шкідників, що включає плодових і овочевих культур, є висока отруйність засів клітин бактерій штаму бактерій Pseudomonas циперметрину для людей і його висока вартість. aureofaciens штам В-111, культивування їх у Розчинність циперметрину у воді дуже низька живильному середовищі, яке містить в собі всі 10мг/л. Відомий розчин для боротьби з філоксерою необхідні мікроелементи, мінеральні солі, вітаміни винограду [за авторським свідоцтвом СРСР і стимулюючі добавки, вирощування біомаси на №570355 М Кл. А 01 N11/02, опубл. у Бюл. №32, живильному середовищі з одержанням у 1977р.] Розчин містить, (% мас): сірковуглець - 30промисловому варіанті цільового продукту у 60, емульгатор - 0,3-1,8, карбамід (КА) - 11,5-35, вигляді суспензії встановленого титру, визначення воду - решта. активності препарату при боротьбі з комахамиДіючим компонентом проти шкідників є дуже шкідниками різних сільськогосподарських культур, сильна отрута - сірковуглець (CS2). КА виконує для одержання біопродукту використовують роль сорбенту CS2 і функцію добрива при активний штам бактерій Pseudomonas aureofaciens позакореневому підживленні. Недоліками відомого штам В-111, депонований у Депозитарії Інституту розчину є складність використання внаслідок мікробіології і вірусології НАН України 21 січня високої токсичності сірковуглецю (гранично 2004 року; культивування штаму - продуцента припустима концентрація ГПК=0,01мг/м3 - 1-й клас проводять на збалансованому живильному токсичності), велика вартість, погана розчинність у середовищі з наступним співвідношенням воді. ідомий В спосіб культивування компонентів удріжджів пекарських автолізат кількості г/л.: 36-42 ентомопатогенних бактерій, де середовище, на сік цукрового сорго 10-16 якому здійснюють висів бактерій, містить, вага, %: кукурудзяний екстракт 10-12 дріжджі кормові 2,0-4,0 K2HPO4S 0,4-0,5 борошно кукурудзяне 1,2-2,4 NH4SO3 0,8-1,0 гідрол 0,5-2,4 NaCl 0,7-0,9 гідролізат бавовняного шорта 3,0-14,0 вода дистильована решта вода решта При рН 7,2-7,5 Засів середовища здійснюють суспензією спор а одержання цільового продукту здійснюється бактерій Bacillus thuringiensis var. galleriae шт. 69/6 в такий спосіб: у кількості 30мл з концентрацією спор 106спор/мл. натуральний сік цукрового сорго розводять Культивування проводять у лабораторному дистильованою водою до досягнення 15% ферментері об'ємом 10л з інтенсивністю аерації – кількості в розчині, вводять у готовий розчин 1об/об.мін. протягом 22 годин росту, потім інгредієнти в такій послідовності: знижують інтенсивність аерації до 0,3об/об.мін. і - дріжджовий екстракт, попередньо в казані продовжують культивування ще 10 годин; культудля варіння доведений до кипіння й охолоджений ральну рідину витримують протягом 5 годин на до 30°С, холоді [див. наприклад, спосіб культивування - кукурудзяний екстракт, ентомопатогенних бактерій по а.с 911765пр. - хлористий натрій (кухонна сіль) NaCl, 13.05.80р. – прототип]. - амоній сірчанокислий NH4SO3, Недоліком даного способу є низький вихід - калій фосфат K2HPO4S, спорової біомаси ентомопатогенних бактерій, стерилізують 100г живильного середовища відносна тривалість циклу одержання біопродукту, протягом 1,0 години при температурі 130°С, 5 31328 6 це забезпечило найбільший вихід біомаси з охолоджують до 25-30°С, поміщають 10мл підвищенням її титру до 9×1010 і дозволило стерилізованого середовища в пробірку, використовувати те саме живильне середовище поміщають туди вихідну культуру, вирощують 30на всіх стадіях виробництва біомаси; крім того, 35 годин при температурі 28-30°С, потім використання для засіву і вирощування біомаси на стерилізують 101л живильного середовища проміжній стадії міні-ферментера замість протягом 2 годин при температурі 130°С, традиційних колб і качалок, дозволило при охолоджують до 25-30°С, роблять перевірку на кращому перемішуванні середовища повітрям і стерильність висівом культури на МПА чи МАВ, збільшенні часу її вирощування одержати культуру визначають титр біомаси, поміщають її в мініз необхідним титром 9×1010. ферментер на 50л, засівають середовище 10мл Порівняльний аналіз способу, що заявляється, біомаси, отриманої в пробірці, вирощують з іншими відомими з науково-технічної і патентної культуру в міні-ферментері протягом 30-35 годин літератури дозволяє виявити ознаки, які при температурі 29-32°С при постійному відрізняють рішення, що заявляється, від прототиперемішуванні і подаванні стерильного повітря, пу, що дає можливість авторам зробити висновок проводять перевірку матеріалу на стерильність, про відповідність ознак, які заявляються, критерію визначають титр біомаси, проводять визначення "істотні відмінності", що визначає новизну рН середовища; 10 літрів напрацьованої біомаси запропонованого способу. поміщають у стерилізоване живильне середовище Базовим показником, по якому йшла того ж складу, розміщене у ферментері на 1 тонну, оптимізація живильного, середовища був титр прероблять засів ферментера через посівний штуцер парату при закінченні кожної стадії його одержану зоні полум'я, біомасу вирощують 40-45 годин при ня. Статистичній обробці піддавалася біомаса температурі 26-30°С при постійному після вирощування в пробірці, на виході з мініперемішуванні і подаванні стерильного повітря ферментера й у процесі вирощування у тиском до 0,7атм і одержують біомасу з титром 10 ферментері. Визначення титру препарату 9×10 ; у період культивування для контролю проводили методом, заснованому на підрахунку процесу розвитку бактерій у біомасі з апарата колоній, що виросли на живильному агарі, при відбирають проби: першу - через 2 години після засіві в чашки Петри суспензії різних концентрацій засіву, другу - наприкінці вирощування культури. препарату у вигляді послідовних десятикратних Визначення рН біопрепарату здійснюють 3 3 розведень, приготовлених на середовищі МЛА. шляхом розведення його 5см у 40см Склад середовища: дистильованої води, суспензію розмішують на пептон, г 10 магнітній мішалці і проводять вимір рН по натрій хлористий, г 5 інструкції до приладу. Дослідним шляхом встановлено, що агар мікробіологічний:, г 13 оптимальне нарощування біомаси відбувається м'ясний бульйон, см3 1000 при рН 7,3-7,6, в оптимальному інтервалі рН середовища 7,4 температур - від 31-36°С. Усі компоненти середовища поміщали в колбу, Технічним результатом корисної моделі є рН середовища доводили до 7,4 і стерилізували підвищення ефективності технологічності протягом 30хв. при температурі 120°С. Із виробництва бактеріального препарату, середньої проби препарату готували ряд одержання у виробничому варіанті необхідної послідовних розведень за загальноприйнятою кількості біопрепарату, розробленого на основі методикою. Використовували стерильну штаму бактерій, що забезпечує ефективний захист дистильовану воду. Під час проведення іспитів стерильною сільськогосподарських і декоративних рослин від піпеткою 1см3 суспензії розведень 10-8, 10 -9, 10-10 комах-шкідників. способу Новизна характеризується був нанесений на поверхню середовища (МПА) використанням у якості продуцієнта нового штаму трьох чашок Петри. Засіяні чашки витримували в бактерій Psudomonas aureofacine штам В-111, а термостаті при температурі 28°С в протягом 50-70 також вибором для його реалізації живильного годин. Число життєздатних бактеріальних клітин (Т), середовища зі збалансованими елементами млрд/см3 обчислювали за формулою: харчування з введенням у нього кукурудзяного Т=П/Р, де екстракту і дріжджів хлібопекарських, а також соку П - число колоній (середня кількість з 3 чашок сорго в концентрації 15г/л, а також збільшенням Петри) кількості NH4SO3 до 1,0г/л, що є стимулюючими Р - розведення, узяте для засіву добавками й у сполученні з іншими компонентами Приклад 1. Результати визначення титру живильного середовища у зазначеному культури після її вирощування представлені в співвідношенні значно підвищує обмінний процес таблиці 1. на рівні клітин при їхньому вирощуванні, сприяє їхньому розвитку, а головне, їхньому визріванню; Таблиця 1 Компоненти живильного середовища, г/л Автолізат дріжджів пекарських 36 Кукурудзяний Сік цукрового екстракт сорго 8 5 рН K2HPO4S NH4SO3 0,5 0,8 7,4 9×103 NACl 0,2 Титр, млрд/см3 7 45 50 10 12 31328 0,4 0,5 7 10 У міні-ферментері проводився засів культурою, вирощеної в пробірці зі співвідношенням компонентів, що забезпечили її вихід з максимальним титром 9×10-4. 8 0,9 1,1 9×104 9×103 0,1 1,2 Приклад 2. Результати визначення титру культури після вирощування її в міні-ферментері при різних тимчасових інтервалах і оптимальній температурі 30°С представлені в таблиці 2. Таблиця 2 Живильне середовище Компоненти Автолізат дріжджів пекарських Кукурудзяний екстракт Сік цукрового сорго К2HPO4S NH4SO3 NaСІ Вода дистильована рН Кількість,г/л 47 10 9 0,4 0,8 0,95 решта 7,3 У ферментері вироблявся засів культури з міні-ферментера з титром 9×1010. У процесі культивування біомаси у ферментері відбиралися проби: перша - через 2 години після засіву, друга - наприкінці вирощування культури. Визначення титру препарату проводилося за вищенаведеною методикою. Величина титру продукту з проби, узятої у ферментері через 2 години культивації, наприкінці її складала 9×1010. Біопрепарат має наступну характеристику. Зовнішній вигляд, колір і запах препарату "Трихофіт" визначають у момент узяття проб органолептично. "Трихофіт" за зовнішнім виглядом і кольором представляє рідину з кольором від ясно-сірого до ясно-коричневого з запахом живильного середовища. Культурально-морфологічні особливості біопрепарату. Біопрепарат вирощений при температурі 28°С протягом 24 годин на МЛА утворює однорідну суміш і слабкий дрібнодисперсний осад. Перегляд на предметному склі суспензії з добової культури, пофарбованої по Граму (перегляд при збільшенні 15´40 не менш 10 полів зору по діагоналі) показав, що бактерії Pseudomonas aureofaciens - добре розвиті грамнегативні, пофарбовані в ясно-коричневий колір палички середньої довжини і товщини з округлими полями розміром від 0,4 до 4-9мк; бактерії добре ростуть на печінково-пептоновому бульйоні й інших середовищах, що мають нейтральну чи злегка лужну реакцію (рН 7,4-7,8) в аеробних умовах при температурі 35°С. Фізіолого-біохімічні ознаки. Факультативний анаероб, нерухомий, каталізонегативний, не відновлює нітрити і нітрати, не розріджує желатини, слабко гідролізує ескулін, не утворить аміак з аргініна, не виживає після прогрівання при температурі 65°С, росте при температурі від 25 до 53°С; оптимальна температура росту 33-36°С, оптимальне рН 7,37,6. Температура, Час °С вирощування, годин 27 30 Титр, млрд/см3 9×108 31 9×1010 32 9×109 Як джерело вуглецю використовують сік цукрового сорго, як джерело азоту використовують NH4SO3; культура добре росте на концентрованих середовищах, що містять до 15г/л соку цукрового сорго, культура резистентна до кисню, не втрачає свою активність при збереженні біопрепарату тривалий час. Біопрепарат не токсичний для людини, теплокровних у застосовуваній концентрації не має фітотоксичності, не впливає на запах і смак одержуваної продукції. Після вирощування біопрепарату на культуральному середовищі (МБП із відповідними добавками) протягом 2-х тижнів при температурі 32°С у термостаті одержують фільтрат і досліджують його токсичність у дослідах на білих мишах вагою 17-20г. Фільтрат уводять перорально через зонд чи внутрішньочеревними ін'єкціями. Спостереження за тваринами проводили щодня протягом 15 днів після закінчення ін'єкції чи перорального введення. У період спостереження усі тварини були активні, добре поїдали харчові раціони, фізіологічні відправлення в них не порушувалися, поведінкові реакції були звичайними, змін з боку вовняного покриву не відзначалося, прояву інтоксикації і загибелі тварин не спостерігалося. Усі піддослідні миші після закінчення терміну спостереження були убиті, розітнуті і їхні органи піддані мікроскопічному вивченню. Результати розтину показали: серце звичайної форми і величини. Легені в обсязі не збільшені, частки легко відокремлюються одна від одної, поверхня гладка, спайок не відзначається. Шлунок, петлі тонкого і товстого кишечнику зовні представляються звичайними. При розтині малюнок слизуватої не змінений. Печінка темночервоного кольору, середнього наповнення, не збільшена. Частки відділені одна від одної, поверхня гладка. Нирки звичайних розмірів і форми. Поверхні гладкі, на розрізі чіткий малюнок коркової і мозкової речовини. Селезінка не збільшена, щільної консистенції, на розрізі пульпа помірно повнокровна, темно-червоного кольору. Таким чином, патологія внутрішніх органів відсутня. 9 Результати дослідження фільтрату культури Pseudomonas токсичності aureofaciens 31328 10 штам В-111 після росту на середовищі Гауза №2 представлені в таблиці 3. 11 31328 12 Таблиця 3 Кількість мишей у Доза, мл Шлях уведення досліді 10 0,4 Внутрішньочеревинне 10 0,4 Підшкірно 10 0,4 Перорально Таким чином, уведення мишам фільтрату культури Pseudomonas aureofaciens, штам В-111 не викликало у тварин патологічного процесу, який реєструвався клінічно або при мікроскопічному вивченні внутрішніх органів тварин. Приведені дані дають підставу вважати, що біопрепарат "Трихофіт" нетоксичний, тобто не є патогенним для теплокровних тварин. Визначення біологічної активності препарату "Трихофіт". Метод заснований на здатності бактерій, що знаходяться в препараті, уражати гусениць яблучної плодожірки. Гусениць інфікують, занурюючи в препарат "Трихофіт" на 3 секунди. Як тест - об'єкт використовують гусениць 5-го віку, вирощених на штучному кормі чи зібраних у природі. проведенні досліджень готують водяний При розчин препарату в концентрації 1´19/9 і 1´10/8 мікробних тіл на см/куб, що забезпечує смертність гусениць, тест - об'єкту 93-97%. Кожну концентрацію препарату використовують тричі. Гусениць занурюють на 3 секунди в приготовлені суспензії препарату по 30шт. (3 рази по 10 гусениць). Після цього їх поміщають по одній в пробірку і закривають ватною пробкою. Одночасно проводять контрольний дослід в трьох паралельних, для чого 30 гусениць занурюють на 3сек. у питну воду і розкладають у пробірки. Пробірки з гусеницями розміщають у термостаті і витримують при температурі 26°С . Кількість гусениць, що загинули, підраховують на 3-4 добу. Обробка результатів. Середній відсоток загибелі гусениць (X) для кожної концентрації препарату з поправкою на загибель при контролі вираховують за формулою Аббота: Х=Мо-Мк:100-Мк 100, де Mo-кількість гусениць, що загинули від оцінюваної концентрації препарату (середня з 3-х повторюваних), %; Мк - те ж у контролі. Препарат вважається активним, якщо загибель гусениць складає 96-100%. Курс уведення 1 4 4 Занедужало Загинуло 0 0 0 Вижило 0 0 0 10 10 10і "Трихофіт" застосовують шляхом обприскування дерев суспензією препарату. Робочу суспензію готують за 2-4 години до початку роботи. Витрата препарату з титрів 10´10/9 кліток/см/куб складає 5-10л/га. Витрати робочої суспензії 600-1200л/га (у залежності від віку дерев). Суспензію готують на чистій воді, рН повинна бути близької до нейтральної. Обприскування дерев проводять у будь-якій фазі вегетації. Найбільш ефективним є використання "Трихофіта" проти плодожерок при температурі повітря 22-29°С. Першу обробку проводять у період масового народження гусениць. Термін обробки визначають по кількості виловлених за 5 днів самців яблуневої плодожерки на одну феромонну пастку (для першого покоління - 5 самців, другого - 3 самці). Повторні обробки проводять через 6-12 днів. Як правило, проти першого покоління яблуневої плодожерки проводять два обприскування. Проти другого - 2-3, проти третього, факультативного одне. Зберігання бактерій псевдомонас на рослинах вар'їрує від 6-12 днів, що обумовлено погодними умовами. Ентомоцидна активність «Трихофіта» щодо гусениць яблуневої плодожерки представлена в таблиці 4 Таблиця 4 Гусениці яблуневої плодожерки (L5) Загальна смертність, % 70** Вихід імаго, % 30 ** дані, вірогідність яких порівняно з контролем доведена на 99%-ному рівні. Як видно з приведених у таблиці даних "Трихофіт" має значні антифунгальні властивості. Ентомоцидна активність "Трихофіта" щодо ряду шкідників представлена в таблиці 5 Таблиця 5 Ентомоцидна активність «Трихофіта» Вид комах Свинцево-смугаста листокрутка Сітчаста листокрутка Смородинова криво вуса листокрутка Виноградна листовійка Попелиця персикова Яблунева плодожерка Сливова плодожерка Яблунева совка Стадія розвитку L2 L2 L3 L2 L2 L5 L5 L3 СК50 * для Штаму В-111 8,7 11,7 16,7 3,0 1,6 1,7 1,4 1,3 13 31328 14 Продовження таблиці 5 Вид комах Стадія розвитку L4 Сливовий п'ядун СК50 * для Штаму В-111 38,3 *СК50 - кількість кліток у млн/мл, що зумовлює 50%-ную загибель комах Використання "Трихофіта" для захисту плодового саду від яблуневої плодожерки представлена в таблиці 6 Таблиця 6 Рік 2002* 2003** 2004* 2005** 2006** Варіант Контроль Трихофіт Еталон Контроль Трихофіт Еталон Контроль Трихофіт Еталон Контроль Трихофіт Еталон Контроль Трихофіт Еталон Норма витрат л/га Кратність обробок Врожайність, ц/га 0 2 *** 0 2 *** 0 3 *** 0 3 0 2 2 0 3 3 0 4 4 0 4 4 0 4 4 85,3 122,6 120.0 70,5 96,5 97,8 90,1 105,6 105,4 46,2 140,2 170,1 29,5 105,7 182 0 3 Ураження плодів Біологічна зйомного врожаю ефективність, % плодожеркою % 6.2 0,42 93,1 0,51 95,0 14,3 1,23 93,0 1,06 95,5 8,6 0,64 93,0 0,6 92,9 6,8 0,17 91,6 0,15 96,1 10.1 0,63 91,5 0,51 94,5 *одне повне покоління яблуневої плодожерки ** два покоління яблуневої плодожерки Таким чином, препарат у нормі витрати 2-3л/га ефективно знижував враженість плодів яблуневою плодожеркою (92-93%). В цілому за показниками ефективності щодо плодожерки, врожайності та рентабельності "Трихофіт" не поступався хімічним пестицидам. Протягом останніх років "Трихофіт" зарекомендував себе проти таких шкідників як багато видів листокруток, попелиць, п'язунів, вогнівок, плодожерок та ін. "Трихофіт" на тільки захищає рослини, гальмує розвиток і поширення захворювань, але і позитивно впливає на саму рослину, "лікує"зїї. успіхом використовується для Трихофіт передпосівної обробки насінь, замочування розсади, обробки виноградних насаджень і плодових дерев від шкідників. Економічний ефект від використання препарату "Трихофіт" забезпечується за рахунок того, що замість солодового екстракту - одного з основних компонентів живильного середовища, на Комп’ютерна верстка А. Крижанівський якому культивують багато штамів Streptomices griseovirides для одержання біопрепарату для захисту рослин - у біопрепараті "Трихофіт" використовується сік сорго. Ціна 1кг солодового екстракту - 4грн. 20коп. Ціна 1 кг соку сорго -грн.20 коп. Витрата солодового екстракту на 1т біопрепарату - 10кг. Витрата соку цукрового сорго на 1т біопрепарату - 10кг. Вартість солодового екстракту для виробництва 1 тонни біопрепарату 42грн., а вартість соку цукрового сорго - 32грн. Отже, тільки за рахунок заміни одного з компонентів живильного середовища для виробництва 1 тонни біопрепарату досягається економія 10грн. Таким чином, запропонований спосіб дозволяє в промисловому варіанті одержати без застосування дорогих елементів живильного середовища біопрепарат для захисту ряду сільськогосподарських культур від комах шкідників. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601