Застосування хелатуючого агента разом з антимікробним агентом

Реферат: Винахід стосується застосування хелатуючого агента разом з антимікробним агентом, ефективним проти патогенного для рослин мікроорганізму для пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму на рослині, де антимікробний агент містить поліпептид, який включає послідовність Blad. UA 113150 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід відноситься до галузі антимікробних агентів, які впливають на патогени рослин. Вступ Боротьба з патогенами рослин і захист сільськогосподарських культур є серйозними загальносвітовими проблемами, які викликають усе більшу стурбованість у міру росту світової чисельності населення й пов'язаної з цим недостачі продовольства. Крім того, сучасні методи ведення сільського господарства в частині збору й зберігання врожаю, як правило, забезпечують гарні умови для росту патогенів. Використання хімічних пестицидів є стандартним підходом у боротьбі зі шкідниками сільського господарства. Однак численні використовувані в даний час пестициди мають деякі істотні недоліки. Наприклад, багато які з них негативно впливають на навколишнє середовище, та багато які мають низьку або знижувану ефективність. Особливу стурбованість викликають низька активність та/або вузький спектр дії деяких хімічних сполук, одночасно з розвитком стійкості у патогенів. Одна із цілей даного винаходу полягає в спробі вирішення цих проблем і, зокрема, наприклад, у розробці засобів поліпшення активності антимікробних агентів, які є ефективними проти патогенних для рослин мікроорганізмів. Суть винаходу Авторами даного винаходу неочікувано було виявлено, що хелатуючий агент може синергетично посилювати ефективність антимікробних агентів, які є ефективними проти патогенних для рослин мікроорганізмів. Таким чином, авторами даного винаходу запропоновано: (і) застосування хелатуючого агента та антимікробного агента, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму, для пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму на рослині; і (іі) застосування хелатуючого агента для підвищення активності антимікробного препарату, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму. У кращих варіантах здійснення винаходу зазначений хелатуючий агент і зазначений антимікробний препарат наносять на рослину, якій це необхідно, при цьому переважно зазначений антимікробний агент і зазначений хелатуючий агент наносять на зазначену рослину: a) у складі однієї композиції; або b) окремо, або послідовно або одночасно. У кращих варіантах здійснення винаходу антимікробний агент є ефективним проти патогенних для рослин бактерії або гриба. У кращих варіантах здійснення винаходу антимікробний агент містить у собі поліпептид, при цьому переважно зазначений поліпептид включає Blad або його активний варіант. У кращих варіантах здійснення винаходу хелатуючий агент являє собою поліамінокарбоксилат, переважно ЕДТА. Авторами даного винаходу також запропоновані: - спосіб пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму, що включає нанесення на рослину, якій це необхідно, хелатуючого агента та антимікробного агента, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму; і - спосіб підвищення активності антимікробного препарату, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму, що включає застосування зазначеного антимікробного препарату з хелатуючим агентом. Крім того, авторами даного винаходу запропонована композиція, що містить хелатуючий агент і антимікробний агент, ефективний проти патогенного для рослин мікроорганізму. Переважно антимікробний агент є ефективним проти патогенних для рослин бактерії або гриба, переважно гриба. У кращих варіантах здійснення винаходу антимікробний агент містить у собі поліпептид, при цьому переважно зазначений поліпептид включає Blad або його активний варіант. У кращих варіантах здійснення винаходу хелатуючий агент є поліамінокарбоксилатом, переважно ЕДТА. Авторами даного винаходу додатково запропоновані застосування композиції даного винаходу для пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму на рослині й спосіб пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму, що включає нанесення на рослину, якій це необхідно, композиції даного винаходу. Авторами даного винаходу неочікувано було виявлено, що поліпептид Blad з Lupinus має потужну антимікробну дію у відношенні великого числа різноманітних бактеріальних організмів, які є патогенними для рослин. 1 UA 113150 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Таким чином, авторами даного винаходу запропоноване застосування композиції, що містить антимікробний поліпептид, який включає Blad або його активний варіант, для знищення або пригнічення росту патогенної для рослини бактерії на рослині. Переважно, зазначена композиція додатково містить хелатуючий агент. У кращих варіантах здійснення винаходу зазначена бактерія є патогенним видом одного з наступних родів: Pseudomonas, Erwinia і Streptomyces. У кращих варіантах здійснення винаходу композиція наноситься на рослину, якій це необхідно. Авторами даного винаходу також запропонований спосіб знищення або пригнічення росту патогенної для рослини бактерії на рослині, де зазначений спосіб включає нанесення на зазначену рослину композиції, яка містить ефективну кількість антимікробного поліпептиду, що включає Blad або його активний варіант. Короткий опис фігур На Фіг. 1 показана кодуюча послідовність попередника β-конглютину Lupinus albus (SEQIDNO: 1); і на Фіг. 2 показаний внутрішній фрагмент кодуючої послідовності попередника β-конглютину, що відповідає Blad (SEQ ID NO: 3). Детальний опис винаходу Авторами даного винаходу було виявлено, що при використанні комбінації хелатуючого агента й антимікробного агента, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму, зазначена комбінація особлива ефективна для пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму. Таким чином, в одному аспекті авторами даного винаходу запропонована композиція, що містить або в основному складається з хелатуючого агента й антимікробного агента, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму. Композиція, що містить хелатуючий агент і антимікробний агент, ефективний проти патогенного для рослин мікроорганізму, може також являти собою препарат, що містить іншу хімічну сполуку(и), додану в цю композицію фахівцем у даній галузі техніки. Антимікробні агенти Антимікробним агентом є будь-який агент, який зменшує ріст або знищує мікроорганізм, який є патогенним для рослини. Зазначений мікроорганізм переважно є бактерією (грампозитивною або грамнегативною) або грибом, переважно грибом (який може бути дріжджовим або цвілевим грибом). Переважно антимікробний агент містить (або в основному складається з) поліпептид, такий як антигрибковий білок. Підходящі приклади антигрибкових білків включають хітинази, хітинзв'язуючі білки, хітозанази, β-1,3-глюканази та ацетил-е-глюкозамінідази. Конкретні приклади мікроорганізмів, на які може впливати антимікробний агент, наведені нижче. Поліпептид Blad У кращих варіантах здійснення винаходу, у яких антимікробний агент містить (або в основному складається з) поліпептид, зазначений поліпептид включає (або в основному складається з) Blad або його активний варіант. Blad ("banda de Lupinus albus doce" - смуга з солодкого L. albus) - це назва, дана стабільному проміжному продукту розпаду β-конглютину, основного запасного білка, що міститься в насінні рослин роду Lupinus. Він являє собою поліпептид з масою 20 кДа, що складається з 173 амінокислотних залишків, який кодується внутрішнім фрагментом (519 нуклеотидів, зареєстрований в GenBank під номером доступу ABB 13526) гена, що кодує попередник βконглютину з Lupinus (1791 нуклеотидів, зареєстрований в GenBank під номером доступу AAS97865). Коли праймери, що кодують кінцеві послідовності Blad, були використані для ампліфікації послідовності з геномної ДНК Lupinus, був отриманий продукт розміром ~620 п.н., що вказує на наявність інтрону у фрагменті, що кодує Blad. Існуючий у природі Blad є основним компонентом глікоолігомеру масою 210 кДа, який накопичується (після інтенсивного обмеженого протеолізу β-конглютину) винятково в сім'ядолях видів рослин з роду Lupinus між 4 і 12 днями після початку проростання. У той час як зазначений олігомер є глікозильованим, існуючий в природі Blad є неглікозильованим. Глікоолігомер, що містить Blad, складається з декількох поліпептидів, основні з яких мають молекулярну масу 14, 17, 20, 32, 36, 48 і 50 кДа. Поліпептид масою 20 кДа Blad безсумнівно є найпоширенішим поліпептидом цього олігомеру, і скоріше за все тільки він один має лектинову активність. Присутній у природі Blad складає приблизно 80 % від усіх сім'ядольних білків в 8-денних проростках. Кодуюча послідовність попередника β-конглютину L. albus (SEQ ID NO: 1) наведена на Фіг. 1. Кодуюча послідовність вихідної субодиниці β-конглютину відповідає залишкам з 70 по 1668. Кодовані нею 533 амінокислотних залишків вихідної субодиниці β-конглютину (SEQ ID NO: 2) являють собою: 2 UA 113150 C2 Внутрішній фрагмент кодуючої послідовності попередника β-конглютину, що відповідає Blad (SEQ ID NO: 3), наведений на Фіг. 2. Поліпептид Blad (SEQ ID NO: 4) являє собою: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Таким чином, коли антимікробний агент містить (або в основному складається з) поліпептид, що включає в себе (або в основному складається з) Blad або його активний варіант, зазначений агент містить (або в основному складається з) поліпептидну послідовність, що включає в себе (або в основному складається з) послідовність SEQ ID NO: 4 або її активний варіант. Активним варіантом Blad є варіант Blad, який зберігає здатність діяти як антимікробний агент (тобто має антимікробну активність - опис рівня такої активності та способу її вимірювання наведені нижче). Термін "активний варіант Blad" включає в свій обсяг фрагмент послідовності SEQ ID NO: 4. У кращих варіантах здійснення винаходу фрагмент послідовності SEQ ID NO: 4 вибраний таким чином, що він становить, щонайменше, 10 % довжини SEQ ID NO: 4, переважно, щонайменше, 20 %, переважно, щонайменше, 30 %, переважно, щонайменше, 40 %, переважно, щонайменше, 50 %, переважно, щонайменше, 60 %, переважно, щонайменше, 70 %, переважно, щонайменше, 80 %, переважно, щонайменше, 90 % і, найбільше переважно, щонайменше, 95 % довжини SEQ ID NO: 4. Таким чином, Blad або його варіант, як правило, має довжину, щонайменше, 10 амінокислотних залишків, наприклад, щонайменше, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160 або 173 амінокислотних залишків. Термін "активний варіант Blad" також включає у свій обсяг поліпептидну послідовність, яка має гомологію з SEQ ID NO: 4, наприклад, щонайменше, 40 % ідентичності, переважно, щонайменше, 60 %, переважно, щонайменше, 70 %, переважно, щонайменше, 80 %, переважно, щонайменше, 85 %, переважно, щонайменше, 90 %, переважно, щонайменше, 95 %, переважно, щонайменше, 97 % і, найбільш переважно, щонайменше, 99 % ідентичності, наприклад, за всією послідовністю або на ділянці з, щонайменше, 20, переважно, щонайменше, 30, переважно, щонайменше, 40, переважно, щонайменше, 50, переважно, щонайменше, 60, переважно, щонайменше, 80, переважно, щонайменше, 100, переважно, щонайменше, 120, переважно, щонайменше, 140 і, найбільш переважно, щонайменше, 160 або більше сусідніх амінокислотних залишків. Способи вимірювання гомології білків добре відомі з рівня техніки, і фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що в даному контексті гомологія розраховується на основі ідентичності амінокислот (іноді позначається як "точна гомологія"). Гомологічний активний варіант Blad, як правило, відрізняється від поліпептидної послідовності SEQ ID NO: 4 замінами, інсерціями або делеціями, наприклад, має від 1, 2, З, 4, 5 до 8 або більше замін, інсерцій або делецій. Заміни є переважно "консервативними", тобто, інакше кажучи, амінокислота може бути замінена аналогічною амінокислотою, де аналогічні амінокислоти мають однаковою із замінною амінокислотою одну з наступних груп: ароматичні залишки (F/H/W/Y), неполярні аліфатичні залишки (G/A/P/I/L/V), полярні незаряджені аліфатичні залишки (C/S/T/M/N/Q) і полярні заряджені аліфатичні залишки (D/E/K/R). Кращі підгрупи включають в себе: G/A/P; I/L/V; C/S/T/M; N/Q; D/E; і K/R. Поліпептид, що включає в себе Blad або його активний варіант (як описано вище), може складатися з Blad або його активного варіанта з будь-якою кількістю амінокислотних залишків, доданих до N-кінця та/або С-кінця, за умови, що поліпептид зберігає антимікробну активність (опис рівня такої активності й способу її вимірювання знову дивіться нижче). Переважно, щоб до одного або обох кінців Blad або його активного варіанта було додано не більше 300 3 UA 113150 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 амінокислотних залишків, більш переважно, не більше 200 амінокислотних залишків, переважно, не більше 150 амінокислотних залишків, переважно, не більше 100 амінокислотних залишків, переважно, не більше 80, 60 або 40 амінокислотних залишків, найбільш переважно, не більше 20 амінокислотних залишків. Поліпептид, що включає в себе (або в основному складається з) Blad або його активний варіант (як описано вище), може бути використаний у даному винаході в очищеному вигляді (наприклад, виділений з рослинного, тваринного або мікробного джерела) та/або у вигляді рекомбінантного білку. Одержання рекомбінантної форми дозволяє одержувати активні варіанти Blad. Способи очищення присутнього в природі Blad вже описані в літературі (наприклад, Ramos et al. (1997) Planta 203(1): 26-34 і Monteiro et al. (2010) PLoS ONE 5(1): e8542). Придатним джерелом присутнього в природі Blad є рослина роду Lupinus, така як Lupinus albus, переважно сім'ядолі зазначеної рослини, переважно, зібрані між приблизно 4 і приблизно 14 днем після початку проростання, більш переважно, зібрані з 6 по 12 день після початку проростання (наприклад, на 8 день після початку проростання). У рівні техніки розкриті способи екстрагування спільного білку, що приводять до одержання неочищеного екстракту, який містить Blad, і способи виділення білків з такого екстракту, що приводять до одержання частково очищеного екстракту, наприклад, що включає Blad-вмісний глікоолігомер, який включає в себе Blad. Для того щоб виділити власне Blad, можна потім використовувати ДСН-ПААГ і/або, переважно, обернено-фазну ВЕРХ на колонці С-18. Альтернативним способом одержання частково очищеного екстракту, що містить глікоолігомер, який включає Blad, є залучення хітинз'язуючої активності Blad. Цей глікоолігомер дуже ефективно зв'язується з хітиновою колонкою, у способі очищення за допомогою хітинової афінної хроматографії, та елююється 0,05 Η розчином НС1. Детальний опис прикладу цього способу очищення наводиться нижче: Сім'ядолі восьмиденних рослин люпину збирають і гомогенізують у воді, очищеній за допомогою системи Milli-Q plus (значення рН доведено до 8,0), що містить 10 мМ СаСb і 10 мМ MgCh. Гомогенат фільтрують через марлю і центрифугують при 30000 g впродовж 1 години при температурі 4 °C. Потім осад ресуспендують в 100 мМ Tris-HCl буфері з рН 7,5, що містить 10 % (маса/об'єм) NaCl, 10 мМ ЕДТА та 10 мМ ЕГТА, перемішують впродовж 1 години при температурі 4 °C і центрифугують при 30000 g впродовж 1 години при температурі 4 °C. Спільну глобулінову фракцію, що міститься в надосадовій рідині, осаджують сульфатом амонію (561 г/л), перемішують на холоді впродовж 1 години й центрифугують при 30000 g впродовж 30 хвилин при температурі 4 °C. Отриманий осад розчиняють в 50 мМ Tris-HCl буфері з рН 7,5, знесолюють на колонці PD-10, урівноваженій тим же буфером, і пропускають через колонку для хітинової афінної хроматографії, попередньо врівноважену тим же буфером. Цю колонку промивають 50 мМ Tris-HCl буфером з рН 7,5 і білки, що зв'язалися, елююють 0,05 Η розчином НС1. Елюйовані фракції відразу нейтралізують 2 Μ розчином Tris, і пікові фракції об'єднують, ліофілізують і аналізують за допомогою ДСН-ПААГ. Для виготовлення хітинової колонки, хітинова сировина була отримана від компанії Sigma і оброблена в такий спосіб: зразок хітину добре промивали водою, очищеною за допомогою системи Milli-Q plus, а потім 0,05 Η розчином НС1. Потім її промивали 1 % (маса/об'єм) розчином карбонату натрію, і потім етанолом доти, поки поглинання промивної рідини не ставало менше 0,05. Після цього хітин поміщали в наконечник для піпетки й урівноважували 50 мМ Tris-HCl буфером з рН 7,5. Способи одержання рекомбінантних білків добре відомі з рівня техніки. Такі способи, які застосовуються тут, будуть включати вставку полінуклеотиду, що кодує поліпептид, який включає в себе Blad або його активний варіант, у придатний експресійний вектор, що дозволяє сполучати зазначений полінуклеотид з одним або декількома промоторами (наприклад, з індуцибельним промотором, таким як Т7lас промотор) та з іншими цільовими полінуклеотидами або генами, введення даного експресійного вектора в підходящу клітину або організм (наприклад, Escherichia coli), експресію поліпептиду в трансформованій клітині або організмі й видалення експресованого рекомбінантного поліпептиду з цієї клітини або організму. Для полегшення такого очищення експресійний вектор може бути сконструйований так, щоб полінуклеотид додатково кодував, наприклад, кінцеву мітку, яка може сприяти очищенню: наприклад, мітку з гістидинових залишків для афінного очищення. Після того як рекомбінантний поліпептид був очищений, мітка очищення може бути видалена з поліпептиду, наприклад, шляхом протеолітичного розщеплення. 4 UA 113150 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У композиції даного винаходу, що містить антимікробний м, який включає (або в основному складається з) поліпептид, зазначений поліпептид переважно знаходиться в частково очищеному вигляді, більш переважно, в очищеному вигляді. Зазначений поліпептид є частково очищеним, якщо він знаходиться в середовищі, у якому відсутні один або більше інших поліпептидів, з якими він зв'язаний у природніх умовах, та/або становить, щонайменше, 10 % від усіх присутніх білків. Зазначений поліпептид є очищеним, якщо він знаходиться в середовищі, у якому відсутні всі або більшість інших поліпептидів, з якими він зв'язаний у природніх умовах. Наприклад, термін "очищений Blad" означає, що Blad становить, щонайменше, 50 %, щонайменше, 60 %, щонайменше, 70 %, щонайменше, 75 %, щонайменше, 80 %, щонайменше, 85 %, щонайменше, 90 %, щонайменше, 95 %, щонайменше, 97 %, щонайменше, 98 % або, щонайменше, 99 % від усіх білків у композиції. У композиції даного винаходу, що містить антимікробний агент, набір білків Lupinus може складатися в основному з Blad-вмісного глікоолігомеру, який включає в себе поліпептид, що включає в себе (або в основному складається з) Blad або його активний варіант. Патогенні для рослин мікроорганізми Патогенним для рослини мікроорганізмом, проти якого ефективний антимікробний агент, являє собою будь-який мікроорганізм, здатний викликати захворювання зовні або всередині рослини. Особливо можна виділити цільові бактеріальні мікроорганізми, які включають в себе патогенні види Pseudomonas, такі як Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae, Pseudomonas tolaasii і Pseudomonas agarici (переважно P. syringae); патогенні види Erwinia, такі як Erwinia persicina, Pectobacterium carotovorum, Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Erwinia psidii і Erwinia tracheiphila; та патогенні види Streptomyces, такі як Streptomyces griseus. Особливо можна виділити цільові мікроорганізми грибів, які включають в себе патогенні види Altemaria, такі як Altemaria alternata, Alternaria arborescens, Alternaria arbusti, Alternaria brassicae, Alternaria brassicicola, Alternaria carotiincultae, Alternaria conjuncta, Alternaria dauci, Alternaria euphorbiicola, Alternaria gaisen, Alternaria infectoria, Alternaria japonica, Alternaria petroselini, Alternaria selini, Alternaria solani та Alternaria smyrnii; патогенні види Fusarium, такі як Fusarium oxysporum та Fusarium graminearum (переважно F. oxysporum); патогенні види Botrytis, такі як Botrytis cinerea; та патогенні види Colletotrichum, такі як Colletotrichum actuatum, Colletotrichum coccodes, Colletotrichum capsici, Colletotrichum crassipes, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum kahawae, Colletotrichum lindemuthianum, Colletotrichum musae, Colletotrichum nigrum, Colletotrichum orbiculare, Colletotrichum pisi та Colletotrichum sublineolum. Хелатуючі агенти Хелатуючий агент (також відомий як хелант, хелатор або комплексоутворювальний агент) являє собою будь-яку хімічну сполуку, яка зв'язує іон металу з утворенням нековалентного комплексу й зменшує активність іону. Придатні хелатуючі агенти включають поліамінокарбоксилати, такі як ЕДТА (етилендиамінтетроцтова кислота) і ЕГТА (етиленглікольбіс(β-аміноетиловий eфip)-N,N,N',N'-тетраоцтова кислота). Переважно, як хелатуючий агент використовується ЕДТА, переважно в концентрації, щонайменше, 10 мкг/мл, щонайменше, 50 мкг/мл або, щонайменше, 100 мкг/мл, і до 500 мкг/мл, до 1 мг/мл, до 5 мг/мл, до 10 мг/мл або до 20 мг/мл. Переважно, ЕДТА використовується в концентрації від 0,1 мг/мл до 20 мг/мл, більш переважно, від 1 мг/мл до 20 мг/мл. Результати Антимікробний агент у комбінації з хелатуючим агентом може застосовуватися для пригнічення росту патогенного для рослини мікроорганізму (означає, що він має мікробостатичну дію) або знищення зазначеного мікроорганізму (означає, що він має мікробоцидну дію). Фахівець у даній області техніки за допомогою стандартних методів буде здатний визначити підходящу дозу та/або концентрацію антимікробного агента при конкретній концентрації хелатуючого агента для досягнення бажаного пригнічення росту або знищення мікроорганізму в кожному конкретному випадку. Переважно, комбінація антимікробного агента й хелатуючого агента є нетоксичною для людей або тварин. Переважно, при використанні комбінації антимікробного агента й хелатуючого агента (наприклад, композиції даного винаходу) як мікробостатичного агента, ця комбінація зменшує швидкість росту на 10 %, більш переважно, на 50 %, більш переважно, на 75 %, більш переважно, на 90 %, більш переважно, на 95 %, більш переважно, на 98 %, більш переважно, на 99 % і, ще більш переважно, на 99,9 % у порівнянні з еквівалентними умовами без використання даного комбінації. Найбільш переважно, дана комбінація запобігає будь-якому росту мікроорганізму. 5 UA 113150 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Переважно, при використанні комбінації антимікробного агента й хелатуючого агента (наприклад, композиції даного винаходу) як мікробоцидного агента, ця комбінація знищує 10 % популяції мікроорганізмів, більш переважно, 50 % зазначеної популяції, більш переважно, 75 % зазначеної популяції, більш переважно, 90 % зазначеної популяції, більш переважно, 95 % зазначеної популяції, більш переважно, 98 % зазначеної популяції, більш переважно, 99 % зазначеної популяції й, ще більш переважно, 99,9 % зазначеної популяції в порівнянні з еквівалентними умовами без використання даного комбінації. Найбільш переважно, дана комбінація знищує всю популяцію мікроорганізму. При застосуванні для запобігання або пригнічення зараження рослини мікроорганізмом зазначена комбінація бажано використовується в ефективній кількості, тобто, інакше кажучи, кількості, яка забезпечує такий рівень пригнічення росту та/або знищення мікроорганізму, за якого досягається обумовлений рівень запобігання або пригнічення зараження (наприклад, досягається обумовлений рівень запобігання або пригнічення ушкодження рослинної тканини), переважно в порівнянні з еквівалентними умовами без використання даного комбінації. Якщо обраний антимікробний препарат містить поліпептид, що включає в себе Blad або його активний варіант, у комбінації з хелатуючим агентом (наприклад, ЕДТА в будь-якій з вищеописаних концентрацій), то підходящі концентрації, у яких використовується зазначений поліпептид, включають, щонайменше, 5 мкг/мл, щонайменше, 10 мкг/мл, щонайменше, 20 мкг/мл, щонайменше, 50 мкг/мл, щонайменше, 100 мкг/мл або, щонайменше, 500 мкг/мл і до 1 мг/мл, до 2,5 мг/мл, до 5 мг/мл або до 10 мг/мл. Переважно, вибрана концентрація зазначеного пептиду становить від 50 мкг/мл до 10 мг/мл, більш переважно, від 500 мкг/мл до 5 мг/мл і, ще краще, від 1 мг/мл до 5 мг/мл (наприклад, близько 2,5 мг/мл). Наприклад, при концентрації ЕДТА 50 мМ (тобто приблизно 15,8 мг/мл) концентрація Blad 1 мг/мл або 2,5 мг/мл може бути використана, наприклад, для пригнічення росту В. сіпегеа або F. oxysporum, відповідно. Це є несподіваним результатом, враховуючи, що сам по собі Blad необхідно застосовувати в концентраціях приблизно 5 мг/мл або 10 мг/мл (відповідно) для пригнічення росту цих патогенів. Відкриття, зроблені авторами даного винаходу, дозволяють а) ефективно використовувати антимікробні агенти (які ефективні проти патогенів рослин) у більш низьких концентраціях, завдяки застосуванню хелатуючого агента, або b) підвищити ефективність антимікробних агентів (які ефективні проти патогенів рослин) при стандартних концентраціях, завдяки застосуванню хелатуючого агента. Це забезпечує більш економічне/ефективне використання таких антимікробних препаратів для запобігання або лікування інфекції рослини (або її частини), що викликається мікроорганізмом. Застосування й способи Авторами даного винаходу запропоновано застосування композиції даного винаходу для пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму на рослині. У зв'язку з цим, авторами також запропонований спосіб пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму, який включає в себе нанесення на рослину, якій це необхідно, композиції даного винаходу (наприклад, ефективної кількості зазначеної композиції). Авторами даного винаходу також запропоновано застосування хелатуючого агента та антимікробного агента, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму, для пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму на рослині. Ними також запропоновано застосування хелатуючого агента для підвищення активності антимікробного препарату, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму. У зв'язку із цим, авторами також запропоновані: a) спосіб пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму, що включає нанесення на рослину, якій це необхідно, хелатуючого агенту та антимікробного агенту, який є ефективним проти патогенного для рослин мікроорганізму (наприклад, ефективної кількості комбінації зазначених агентів); і b) спосіб підвищення активності антимікробного препарату, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму, що включає застосування зазначеного антимікробного препарату з хелатуючим агентом. У цих варіантах здійснення винаходу зазначений хелатуючий агент і зазначений антимікробний препарат можуть бути нанесені на зазначену рослину в складі однієї композиції або окремо. Якщо ці два агенти наносяться окремо, то це нанесення може бути послідовним (де кожний агент може бути нанесений першим) або одночасним. Нанесення на рослину може здійснюватися, наприклад, шляхом накладення (наприклад, розпилення) агентів (або композиції, що містить зазначені агенти) на рослину (або на будь-яку його частину) або шляхом занурення рослини або її частини (наприклад, насіння) у відповідний розчин(и). 6 UA 113150 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Коли хелатуючий агент використовується для підвищення активності антимікробного препарату, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму, зазначений хелатуючий агент (і його концентрація) переважно вибираються таким чином, щоб комбінація зазначеного антимікробного агента й зазначеного хелатуючого агента забезпечувала підвищений рівень пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму (наприклад, такий, при якому досягається підвищений рівень запобігання або пригнічення зараження рослини, наприклад, досягається підвищений рівень запобігання або пригнічення ушкодження рослинної тканини), переважно, у порівнянні з еквівалентними умовами без використання даного хелатуючого агента. У варіантах здійснення даного винаходу, що відносяться до застосування/способу, антимікробний агент і хелатуючий агент є такими, як детально описане вище. Рослиною, що потребує комбінації антимікробного препарату, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму, і хелатуючого агента, може бути будь-яка рослина, для якої існує ймовірність зараження або, яка вже заражена, де зазначене зараження викликане патогенним для рослин мікроорганізмом. Бажано рослина є культурною рослиною (наприклад, будь-якою рослиною, яка вирощується, щоб бути зібраною з метою одержання їжі, корму для худоби, палива, волокон або будь-якого іншого комерційно цінного продукту). Переважно зазначена культурна рослина є продовольчою культурною рослиною, такою як рослина, що є джерелом цукру (наприклад, цукровий буряк, цукрова тростина), фруктом (включаючи горіх), овочем або зерном. Конкретні рослини, що забезпечують зерно, включають в себе злаки (наприклад, кукурудза, пшениця, ячмінь, сорго, просо, рис, овес і жито) і бобові (наприклад, квасоля, горох і сочевиця). Авторами даного винаходу також запропоноване застосування композиції, що містить (або в основному складається з) антимікробний поліпептид, що включає (або в основному складається з) В lad або його активний варіант, для знищення або пригнічення росту патогенної для рослини бактерії на рослині. У зв'язку з цим, авторами також запропонований спосіб знищення або пригнічення росту патогенної для рослини бактерії на рослині, де зазначений спосіб включає в себе нанесення на зазначену рослину композиції, що містить (або в основному складається з) ефективну кількість антимікробного поліпептиду, що включає (або в основному складається з) Blad або його активний варіант. За необхідності антимікробний поліпептид, що включає (або в основному складається з) Blad або його активний варіант, може бути використаний в ізольованому вигляді. У кращих варіантах здійснення винаходу зазначену композицію наносять на рослину, якій це необхідно. Рослиною, яка потребує зазначеної композиції, може бути будь-яка рослина, для якої існує ймовірність зараження або, яка вже заражена, де зазначене зараження викликане патогенною для рослини бактерією. Кращі рослини описані вище. Значення термінів "знищення/пригнічення росту бактерії" і "ефективна кількість" є такими ж, як описано вище для комбінації антимікробного агенту і хелатуючого агенту. Приклади У наступних прикладах BLAD позначає існуючий у природі Blad-вмісний глікоолігомер, що включає в себе поліпептид Blad масою 20 кДа, очищений за методикою, описаною в Ramos et al. (1997) Planta 203(1): 26-34: див. розділи "Рослинний матеріал і умови вирощування" і "Очищення білків" у параграфі "Матеріали і методи" цього документу. Визначення: МІК - мінімальна інгібуюча концентрація: найменша концентрація антимікробного препарату, яка пригнічує видимий ріст мікроорганізму. МФК/МБК - мінімальна фунгіцидна/бактерицидна концентрація (або мінімальна летальна концентрація): найменша концентрація антимікробного агенту, необхідна для знищення 99,9 % первинного інокулуму після 24 годин при стандартизованому наборі умов. Приклад 1 - Бактерицидна дія BLAD і синергічний вплив на нього ЕДТА A. Було встановлено, що для P. aeruginosa бактеріостатична концентрація BLAD становить 100 мкг/мл, а бактерицидна - 250 мкг/мл. BLAD у концентрації 50 мкг/мл або ЕДТА в концентрації 1 мг/мл пригнічують ріст P. aeruginosa (тобто обидві концентрації є бактеріостатичними), але комбінація цих двох речовин у даних концентраціях є бактерицидною. B. Для Erwinia pirsicina МІК BLAD становить 32 мкг/мл, і МІК ЕДТА становить 15 мМ. Однак у присутності субпригнічуючої кількості ЕДТА (0,75 мМ) МІК BLAD знижувалася до 16 мкг/мл. C. У випадку Streptomyces griseus МІК BLAD становить 1024 мкг/мл, і МІК ЕДТА становить 16 мМ. Однак у присутності субпригнічуючої кількості ЕДТА (8 мМ) МІК BLAD знижувалася до 256 мкг/мл. Приклад 2 - Синергічний вплив ЕДТА на фунгіцидну дію BLAD 7 UA 113150 C2 Зона пригнічення BLAD спільно та без ЕДТА у відношенні Botrytis cinerea на 1,2 % (маса/об'єм) картопляно-декстрозному агарі (PDA) (3 доби інкубації при 25 °C): Агент(и) Blad (200 мкг) Віасі(ІООмкг) Blad (50 мкг) Blad (20 мкг) ЕДТА (50 мМ) Blad (200 мкг)+ЕДТА (50 мМ) Blad (100 мкг)+ЕДТА (50 мМ) Blad (50 мкг)+ЕДТА (50 мМ) Blad (20 мкг)+ЕДТА (50 мМ) 5 10 Blad (200 мкг) Blad (100 мкг) Blad (50 мкг) Blad (20 мкг) ЕДТА (50 мМ) Blad (200 мкг)+ЕДТА (50 мМ) Blad (100 мкг)+ЕДТА (50 мМ) Blad (50 мкг)+ЕДТА (50 мМ) Blad (10 мкг)+ЕДТА (50 мМ) 20 25 30 35 Середній діаметр зони пригнічення (мм) 21 16 0 0 0 24 19 14 11 Ріст В. сіпега пригнічувався при кількості BLAD 200 мкг і 100 мкг. Це пригнічення підсилювалося при додаванні 50 мМ (приблизно 15,8 мг/мл) ЕДТА. Відсутність пригнічення росту спостерігалася при використанні тільки BLAD у кількості 20 мкг або 50 мкг або використанні тільки 50 мМ ЕДТА. Однак пригнічення мало місце, коли кожна з цих двох концентрацій BLAD використовувалася в комбінації з 50 мМ ЕДТА. Зона пригнічення BLAD спільно та без ЕДТА у відношенні Fusarium oxysporum на 1,2 % (маса/об'єм) картопляно-декстрозному агарі (PDA) (3 доби інкубації при 25 °C): Агент(и) 15 Діаметр зони пригнічення (міч) 21 21 22 16 16 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 24 25 19 19 18 13 15 14 10 12 12 Діаметр зони пригнічення (мм) 25 22 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 27 30 22 21 26 24 20 15 0 0 0 Середній діаметр зони пригнічення (мм) 23 0 0 0 0 28 23 20 0 Ріст F. oxysporum пригнічувався при кількості BLAD 200 мкг. Це пригнічення підсилювалося при додаванні 50 мМ (приблизно 15,8 мг/мл) ЕДТА. Відсутність пригнічення росту спостерігалася при використанні тільки BLAD у кількості 20 мкг, 50 мкг або 100 мкг або використанні тільки 50 мМ ЕДТА. Однак пригнічення мало місце, коли 50 мкг або 100 мкг BLAD використовувалося в комбінації з 50 мМ ЕДТА. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Застосування хелатуючого агента разом з антимікробним агентом, ефективним проти патогенного для рослин мікроорганізму для пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму на рослині, де антимікробний агент містить поліпептид, який включає послідовність Blad, як показано у SEQ ID NO: 4, або її активний варіант, який має протимікробну активність і включає послідовність, яка має принаймні 70 % ідентичність до SEQ ID NO: 4 або фрагменту SEQ ID NO: 4, що має довжину принаймні 100 амінокислот. 2. Застосування хелатуючого агента для підвищення активності антимікробного агента, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму, де антимікробний агент містить поліпептид, який включає послідовність Blad, як показано у SEQ ID NO: 4, або її активний варіант, який має протимікробну активність і включає послідовність, яка має принаймні 70 % ідентичність до SEQ ID NO: 4 або фрагменту SEQ ID NO: 4, що має довжину принаймні 100 амінокислот. 3. Застосування за п. 1 або п. 2, у якому зазначений хелатуючий агент і зазначений антимікробний агент наносять на рослину, якій це необхідно. 4. Застосування за п. 3, у якому зазначений антимікробний агент і зазначений хелатуючий агент наносять на зазначену рослину: 8 UA 113150 C2 5 10 15 20 a) у складі однієї композиції; або b) окремо або послідовно, або одночасно. 5. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, у якому хелатуючий агент являє собою поліамінокарбоксилат, переважно ЕДТА. 6. Застосування за будь-яким з пп. 1-5, у якому мікроорганізм являє собою патогенну для рослини бактерію. 7. Застосування за п. 6, у якому бактерія є патогенним видом одного з наступних родів: Pseudomonas, Erwinia і Streptomyces. 8. Спосіб пригнічення росту та/або знищення патогенного для рослин мікроорганізму, що включає нанесення на рослину, якій це необхідно, хелатуючого агента й антимікробного агента, де зазначений антимікробний агент містить поліпептид, який включає послідовність Blad, як показано у SEQ ID NO: 4, або її активний варіант, який має протимікробну активність і включає послідовність, яка має принаймні 70 % ідентичність до SEQ ID NO: 4 або фрагменту SEQ ID NO: 4, що має довжину принаймні 100 амінокислот. 9. Спосіб підвищення активності антимікробного агента, ефективного проти патогенного для рослин мікроорганізму, що включає застосування зазначеного антимікробного агента з хелатуючим агентом, де зазначений антимікробний агент містить поліпептид, який включає послідовність Blad, як показано у SEQ ID NO: 4, або її активний варіант, який має протимікробну активність і включає послідовність, яка має принаймні 70 % ідентичність до SEQ ID NO: 4 або фрагменту SEQ ID NO: 4, що має довжину принаймні 100 амінокислот. 10. Спосіб за п. 8 або п. 9, у якому мікроорганізм являє собою патогенну для рослини бактерію. 9 UA 113150 C2 Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 10