Спосіб застосування аконітинвмісного агента як антиангіогенного протипухлинного засобу

Спосіб застосування аконітинвмісного агента як антиангіогенного протипухлинного засобу, що включає аконітинвмісний екстракт рослини Борець, який відрізняється тим, що препарат вводять метрономно перорально в дозах, в 30 разів менших за максимально толерантну дозу. (19) (21) u200908954 (22) 28.08.2009 (24) 25.03.2010 (46) 25.03.2010, Бюл.№ 6, 2010 р. (72) СОЛЯНИК ГАЛИНА ІВАНІВНА, ФЕДОРЧУК ОЛЕКСАНДР ГРИГОРОВИЧ, ПЯСКОВСЬКА ОЛЬГА МИКОЛАЇВНА, ДАСЮКЕВИЧ ОЛЬГА ЙОСИПІВНА, ГОРБИК ГРИГОРІЙ ВАСИЛЬОВИЧ, КОЛЕСНИК ДЕНИС ЛЕОНІДОВИЧ 3 48524 чистого алкалоїду аконітину (Аконітин) чи аконітинвмісного екстракту рослини Борець (рослинний екстракт Борця - РЕБ) в дозах в 30 разів менших за максимально толерантну дозу, що дасть можливість інгібувати пухлинний ангіогенез злоякісних новоутворень з ангіогенез-залежним ростом. Поставлена задача вирішується наступним чином. Ефективність протипухлинної, антиметастатичної та антиангіогенної дії аконітинвмісного агенту досліджується на мишах-самцях лінії С57/В16 з перещепленими внутрішньомазово пухлинними клітинами двох варіантів карциноми легень Льюїс (ангіогенез-незалежним LLC та ангіогенезнезалежним LLC/R9) та на білих безпородних мишах з перещепленою ангіогенез-залежною солідною формою карциноми Ерліха та ангіогенезнезалежною асцитною формою цієї карциноми. Всі тварини віком 2-2.5 міс. з вагою 18-23 г. Дозу розраховують як частку від максимально толерантної дози (МТД), Терапія мишей з експериментальних груп включає щоденне перероральне введення (метрономне введення, що притаманне ПАТ [11]) аконітинвмісного агенту в дозі меншій за МТД/30 в 0.4 мл дистильованої води. Контрольні тварини отримують по відповідній схемі дистильовану воду. Кількість введень - 15. На 5-6 добу після закінчення терапії для кожної тварини визначають об'єм пухлини, кількість легеневих метастазів, об'єм метастатичного ураження та долю метастазів в аваскулярній фазі росту. Протипухлинну дію оцінюють по відсотку гальмування росту первинної пухлини, антиметастатичну - по відсотку гальмуванню процесу метастазування (як по кількості метастазів, так і по об'єм метастатичного ураження), а антиангіогенну дію - по відсотку збільшення долі метастазів в аваскулярній фазі. Антиангіогенну дію Аконітину та РЕБ оцінюють in vitro по їх впливу на функціональну активність ендотеліальних та пухлинних клітин з використанням ендотеліальних клітин лінії МАЕС та пухлинних клітин лінії LLC та LLC/R9. Цитотоксичну/ цитостатичну дію оцінюють після однодобової інкубації клітин з аконітинвмісним агентом. Для цього клітини висаджують в 96лункові планшети в 0.1 мл культурального сере4 довища в кількості 1.5 10 клітин/лунку. Тестагенти додають до клітин в 0.1 мл свіжого середовища в широкому діапазоні концентрацій, які прогресивно зменшуються. У контрольні лунки дода 4 ють свіже середовище у тому ж об'ємі без тестагенту. Кількість живих клітин в лунках по закінченні періоду інкубації визнають за допомогою колориметричного методу. Концентрацію тестагенту, яка викликає 50 % зниження кількості живих клітин (ІС50) за рахунок цитотоксичної або цитостатичної дії - визначають з використання статичного пакету Origin v.7.5. Для дослідження впливу аконітинвмісного агенту на електрокінетичні характеристики ендотеліальних та пухлинних клітин, клітини висаджують в чашки Петрі діаметром 60 мм з початковою щіль5 5 ністю відповідно 5 10 та 3 10 клітин/чашку та інкубують за стандартних умов протягом 16 годин. Після цього клітини промивають фосфатносольовим буфером при pН=7.6, вносять свіже культуральне середовище з аконітинвмісним агентом різної концентрації та інкубують протягом 2-х діб. Лінійну швидкість руху ендотеліальних та пухлинних клітин в постійному електричному полі після їхньої 2-х добової інкубації вимірюють за допомогою прибору, в якому клітини, ресуспендовані в 0.1 М фосфатному буфері при рН=7.0 та температурі 27 °С, рухаються всередині плоскостінного кварцевого капіляру. Проміжок між платиновими електродами прибору дорівнював 5 см при напрузі поля 100 вольт. Фіксують час перебігу клітини між електродами Визначають знак сумарного поверхневого заряду та розраховують його щільність згідно рівнянню Квінке-Гельмгольца. Метрономне введення Аконітину (чи РЕБ) в дозах менших за МТД/30 виявило значну протипухлинну, антиметастатичну та антиангіогенну дію по відношенню до пухлин з ангіогенез-залежним ростом і низьку ефективність по відношенню до пухлин з ангіогенез-незалежним ростом. При застосуванні РЕБ основною активною речовиною, що обумовлює антиангіогенну протипухлинну його дію є Аконітин. Антиангіогенна активність аконітивмісного агенту в низьких не цитотоксичних дозах пов'язана з його впливом на електрокінетичні характеристики ендотеліальних клітин за рахунок його здатності інгібувати натрієві канали, рівень експресії яких в активно проліферуючих ендотеліальних клітинах достатньо високий [12]. Таке інгібування суттєво впливає як на виживаність ендотеліальних клітин, так і на морфогенез судин. Таблиця 1 Вплив Аконітину на поверхневий заряд ендотеліальних клітин (МАЕС) та пухлинних клітин карциноми легень Льюїс (LLC та LLC/R9) Концентрація Аконітину (мкг/мл) 0,0 0.04 (IC50/20) 0.08 (ІС50/10) 2 Знак та щільність поверхневого заряду (Кл/м ) МАЕС LLC LLC/R9 +6.85±0.8 -10,1±0,4 -8,0±0,3 -8.5±0.8 -9,6±0,6 -7,95±0,5 +3.4±0.3 -8,8±0,7 -5,9±0,2 5 48524 В концентраціях менших за IC50/20 аконітинвмісний агент обумовлює інверсію поверхневого заряду ендотеліальних клітин (Табл. 1), що пору 6 шує міжклітинні контакти між ендотеліоцитами та міоцитами та інгібує морфогенез судин. Таблиця 2 Концентрація Аконітину, що забезпечує 50 % інгібування росту пухлинних (LLC, LLC/R9) та ендотеліальних клітин (МАЕС) Лінія клітин МАЕС (активно проліферуючі) МАЕС (не проліферуючі) LLC LLC/R9 При застосуванні аконітинвмісного агенту, різниця між дозою, що обумовлює ефективну антиангіогенну його дію, та токсичною дозою значна, оскільки чутливість активно проліферуючих ендотеліальних клітин до цитотоксичної/цитостатичної дії Аконітину в 9 разів вища за чутливість непроліферуючих ендотеліоцитів (Табл. 2). Прикладами конкретного виконання даного способу можуть бути протоколи 4-х доклінічних досліджень. І. Антиангіогенну протипухлинну дію РЕБ визначали по відношенню до солідного (з ангіогенез ІС50 (мкг/мл) 0.95±0.06 8.7±2.1 23,5±2,1 13,3±0,9 залежним ростом) та асцитного (з ангіогенезнезалежним ростом) варіантів карциноми Ерліха. Терапію РЕБ проводили для двох варіантів карциноми по одній схемі, що включало щоденне пероральне введення на протязі 10 діб РЕБ в дозі (по Аконітину) рівній МТД/30. Контрольні тварини отримували питну воду. Застосування РЕБ в не цитотоксичних дозах по відношенню до солідного варіанту пухлини призвело до значного пригнічення росту пухлини (Табл. 3). Таблиця 3 Протипухлинна дія РЕБ по відношенню до солідної форми карциноми Еріха Доба після перещеплення 18 (кінець терапії) 26 3 Об'єм пухлини (мм ) Контроль РЕБ 2974.7±357.3 2149.0*±139.0 10268.0±1678.0 2332.0*±360.0 Примітка. В цій та подальших таблицях знак * вказує на значущу (р