Спосіб лікування пацієнтів, які страждають на саркому капоші, спосіб лікування пацієнтів, які страждають на гепатит с, препарат для лікування пацієнтів, які страждають на саркому капоші, препарат для лікування

1 Способ лечения пациентов, страдающих саркомой Капоши, отличающийся тем, что назначают IFN-con, выбранный из IFN-con 1, IFNсоп 2 и IFN-con 3, в терапевтически эффективных количествах 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что IFN-con является продуктом экспрессии экзогенной последовательности ДНК прокариотов 3 Способ по п 1, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество IFN-con назначают перорально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраназально или в место поражения 4 Способ по п 1, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество IFN-con составляет от 2x106 до 30x106 единиц на пациента 5 Способ по п 4, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество IFN-con составляет от 6x106 до 15x106 единиц на пациента 6 Способ по п 1, отличающийся тем, что дополнительно включает назначение терапевтически эффективного количества химиотерапевтического агента 7 Способ по п 1, отличающийся тем, что дополнительно включает назначение терапевтически эффективного количества стимулирующего колонии гранулоцитов фактора 8 Способ лечения пациентов, страдающих гепатитом С, отличающийся тем, что назначают IFN-con, выбранный из IFN-con 1, IFN-con 2 и IFNcon 3, в терапевтически эффективных количествах 9 Способ по п 8, отличающийся тем, что IFN-con является продуктом экспрессии экзогенной последовательности ДНК прокариотов 10 Способ по п 8, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество IFN-con назначают перорально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраназально или в место поражения 11 Способ по п 8, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество IFN-con составляет от 2x106 до 30x106 единиц на пациента 12 Способ по п 11, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество IFN-con составляет от 6x106 до 15x106 единиц на пациента 13 Способ по п 8, отличающийся тем, что дополнительно включает назначение терапевтически эффективного количества химиотерапевтического агента 14 Способ по п 8, отличающийся тем, что дополнительно включает назначение терапевтически эффективного количества стимулирующего колонии гранулоцитов фактора 15 Препарат для лечения пациентов, страдающих саркомой Капоши, отличающийся тем, что содержит IFN-con, выбранный из группы IFN-con 1, IFN-con 2 и IFN-con 3, в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый разбавитель, вспомогательное вещество, носитель, консервант или солюбилизатор 16 Препарат по п 15, отличающийся тем, что IFN-con является продуктом экспрессии экзогенной последовательности ДНК прокариотов 17 Препарат по п 15, отличающийся тем, является пригодным для назначения перорально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраназально или в место поражения 18 Препарат по п 15, отличающийся тем, что О го представляет собой инъекционный раствор 19 Препарат по п 15, отличающийся тем, что включает терапевтически эффективное количество стимулирующего колонии гранулоцитов фактора G-CSF, составляющее от 0,5 до 6 мкг/кг/день 20 Препарат для лечения пациентов, страдающих вирусным гепатитом С, отличающийся тем, что содержит IFN-con, выбранный из группы IFN-con 1, IFN-con 2 и IFN-con 3, в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый разбавитель, вспомогательное вещество, носитель, консервант или солюбилизатор Интерфероны являются подклассом цитокининов, которые проявляют противовирусную и антипролиферативную активность На основе биохимических и иммунологических свойств человеческие интерфероны подразделяются на три класса интерферон альфа (лейкоцитарный), интерферон бета (фибробластный) и интерферон гамма (иммунный) По крайней мере для 14 интерферонов альфа (разделяемых на подтипы от А до Н) известны точные аминокислотные последовательности, установленные путем выделения и секвенирования ДНК, кодирующих эти полипептиды Интерфероны альфа привлекают значительное внимание как потенциальные терапевтические агенты, обусловленное их противовирусной активностью и способностью ингибировать рост опухолей Метод очистки человеческого лейкоцитарного интерферона, выделенного из фракции светлого слоя кровяного сгустка клеток крови, описан в патенте США 4 503 035 Человеческий лейкоцитарный интерферон, приготовленный этим методом, содержит смесь человеческих лейкоцитарных интерферонов с различными аминокислотными последовательностями Очищенный материал имел удельную активность от 0,9 х 108 до 4 х 108ед/мг белка, когда была использована линия, клеток быка MDBK, и от 2 х 106 до 7,6 х 108ед/мг белка, когда была использована линия клеток человека Ад 1732 Метод ингибирования цитопатического эффекта, применяемыйдля определения противовирусной активности, раскрыт в патенте США 4 241174 Измеренная активность интерферона была вычислена по отношению к стандарту сравнения для человеческого лейкоцитарного интерферона, предоставленному Национальным Институтом Здравоохранения Методы конструирования рекомбинантных ДНК плазмид, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие, по крайней мере, часть человеческого лейкоцитарного интерферона, и методы экспрессии в Е coh полипептида, имеющего иммунологическую или биологическую активность человеческого лейкоцитарного интерферона, изложены в 44223 21 Препарат по п 20, отличающийся тем, что IFN-con является продуктом экспрессии экзогенной последовательности ДНК прокариотов 22 Препарат по п 20, отличающийся тем, является пригодным для назначения перорально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраназально или в место поражения 23 Препарат по п 20, отличающийся тем, что представляет собой инъекционный раствор 24 Препарат по п 20, отличающийся тем, что включает терапевтически эффективное количество стимулирующего колонии гранулоцитов фактора G-CSF, составляющее от 0,5 до 6 мкг/кг/день патенте США 4 530 901 Создание гибридных генов интерферона альфа, содержащих комбинации различных подтипов последовательностей (например, А и D, А и В, А и F), описывается в патентах США 4 414 150, 4 456 748 и 4 678 751 Патенты США 4 695 623 и 4 897 471 описывают новые полипептиды человеческого лимфоцитарного интерферона, имеющие аминокислотные последовательности, которые содержат общие или преобладающие аминокислоты по сравнению с найденными в каждом таком положении у полипептидов природных подтипов интерферона альфа, и обозначенные как "согласованные" человеческие лимфоцитарные интерфероны (INF-con) Раскрываемые последовательности аминокислот INF-con обозначаются как INF-con1, INF-con2 и INF-сопЗ Описываются и препараты полученных генов, кодирующих IFN-con, и экспрессия этих генов в Е coh Очистка IFN-con1, продуцируемого Е coh, описана Klein et al (J Chromatog , 1988, 454, 205 215) IFN-con1, очищенный таким образом, описан и имеет удельную активность 3 х 109ед/мг белка, измеренную в опыте ингибирования цитопатического эффекта при использовании линии клеток человека T98G (Fish et al J Interferon Res, 1898, 9, 97 - 114) Очищенный INF-con1 включает три изоформы, что определено изоэлектрическим фокусированием, которые были идентифицированы какметионил-IFN-coni, десмети-онил-IFN-coni и десметионил-IFN-coni, у которого конечная аминогруппа блокирована ацетильной группой (Klein et al Arch Biochem Biophys , 1990, 276, 531 - 537) Интерферон альфа в настоящее время разрешен в США и в других странах для лечения волосистой клеточной лейкемии, венерических бородавок, саркомы Калоши (рак, обычно наблюдающийся у пациентов, страдающих СПИДом) и хронических гепатитов ни А, ни В Два препарата интерферона альфа получили разрешение для терапевтического использования интерферон альфа-2а, продаваемый под торговым названием Роферон А, и интерферон альфа-2Ь, продаваемый под торговым названием 44223 Интрон А Аминокислотные последовательности Роферона А и Интрона А различаются структурно лишь по единственной позиции, но в других отношениях идентичны аминокислотным последовательностям интерферона альфа подтипа 2 (подтипа А) Кроме отмеченных показаний интерфероны альфа используют или испытывают сами по себе или в сочетании с химиотерапевтическими агентами при многих других расстройствах клеточной пролиферации, включая хроническую миелогенную лейкемию, множественные миеломы, пузырчатку, рак кожи (базальная клеточная карцинома и малигнизированная миелома), карциному почек, рак яичников, лимфому с низким уровнем лимфоцитов, лимфому клеток кожи и глиому Интерферон альфа может быть эффективен в комбинации с другими химиотерапевтическими агентами для лечения плотных опухолей, которые возникают в легких, толстой и прямой кишке, и рака груди (см Rosenberg et al "Principles and Applications of Biologie Therapy" in Cancer Principles and Practices of Oncology, 3rd ed , Devita et al , eds, pp 301 - 547, Balmer DICP, Ann Pharmacother, 1990, 24, 761 768) Известно, что интерфероны альфа воздействуют на многие клеточные функции, включая репликацию ДНК и синтез белка и РНК в равной мере в нормальных и ненормальных клетках Таким образом, цитотоксические эффекты интерферона не ограничиваются опухолевыми или инфицированными вирусами клетками, а проявляются и в нормальных, здоровых клетках Как результат, в процессе терапии интерфероном возникают нежелательные побочные эффекты, особенно когда требуются высокие дозы интерферона Назначение интерферона может привести к снижению уровня красных клеток крови, белых клеток крови и тромбоцитов Высокие дозы интерферона обычно приводят к усилению гриппо-подобных эффектов (например, лихорадка, утомляемость, головная боль, озноб), к желудочно-кишечным расстройствам (например, анорексия, тошнота, понос), к головокружению и кашлю Было бы весьма полезным снизить или устранить нежелательные побочные эффекты интерферонотерапии без снижения терапевтической эффективности такой терапии Поэтому, целью настоящего изобретения является лечение состояний, поддающихся лечению интерфероном, но при котором побочные эффекты, обычно обусловленные применением интерферона альфа, значительно снижены, по сравнению с практикуемыми в настоящее время методами лечения, или полностью устранены Другой целью изобретения является достижение повышенного, по сравнению с практикуемыми в настоящее время методами, терапевтического эффекта лечения заболеваний интерфероном при реально не пропорциональном увеличении в частоте или выраженности нежелательных побочных эффектов Сущность изобретения Изобретение охватывает способы лечения различных состоянии, поддающихся лечению интерфероном, и предусматривает назначение млекопитающим, преимущественно человеку, терапевтически эффективного количества "согласованного" человеческого лимфоцитарного интерферона (IFN-con) Изобретение основано на том вновь открытом факте, что I FN-con не вызывает той же степени побочных эффектов у пациентов, которые вызывают интерфероны альфа Состояния, которые могут лечиться в соответствии с настоящим изобретением, обычно, те, которые поддаются лечению интерферонами альфа Иными словами, IFN-con реально полезен для лечения тех состояний, которые могут лечиться интерферонами альфа, такими как Интрон А, Типичные состояния включают, но не ограничиваются, расстройствами клеточной пролиферации и вирусными заболеваниями IFNcon эффективен при лечении расстройств клеточной пролиферации, часто обусловленных раковыми заболеваниями Такие расстройства включают, но не ограничиваются, волосистой клеточной лейкемией и саркомой Капоши IFN-con может быть полезен сам по себе или в комбинации с другими лекарственными препаратами для лечения рака и других расстройств пролиферации В предпочтительном варианте осуществления изобретения IFN-con используют совместно с терапевтически эффективным количеством одного или более агентов, стимулирующих пролиферацию или дифференциацию клеток, таких как стимулирующий колонии гранулоцитов фактор (GCSF), стимулирующий колонии гра н ул о цито в/макрофагов фактор (GM-CSF), интерлейкин-1, интерлейкин-3, интерлейкин-6, эритропоэтин и фактор стволовых, клеток G-CSF является предпочтительным агентом для совместного использования с IFN-con Вирусные заболевания, которые могут лечиться IFN-con, включают гепатит А, гепатит С, другие гепатиты ни А, ни В, гепатит В, вирусный герпес (ЕВ, CML, простой герпес), папилому, проявления, вызванные поксвирусами, пикорнавирусами, аденовирусами, риновирусами, вирусами HTLV I и HTLV II и ротавирусами человека Хотя ранее было показано, что перечисленные выше состояния могли лечиться интерфероном, побочные эффекты, вызываемые таким лечением, серьезно ограничивали широкое использование этого метода лечения В некоторых случаях, в таких как инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барра, побочные эффекты, сопровождающие лечение интерфероном альфа, фактически исключали возможность лечения Таким образом, преимущества настоящего изобретения состоят в том, что состояния, которые можно лечить IFNcon, включают такие состояния, при которых лечение интерфероном альфа показывает такую же эффективность, но которые не могут лечиться известными интерферонами вследствие неблагоприятных побочных эффектов, которые перевешивают достоинства лечения Теперь заявителем обнаружено и показано, что лечение 44223 неприродным интерфероном, выбранным из "согласованных" интерферонов (IFN-con), приводит к существенному снижению или к устранению побочных эффектов, по сравнению с имеющими место при лечении интерфероном альфа Снижение или устранение побочных эффектов может быть продемонстрировано независимо от состояний, которые подвергались лечению Снижение или устранение побочных эффектов, открытое заявителем как свойство IFNcon, не могло быть предсказано на основе предшествующих результатов, известных в данной области знаний В настоящее время клинические результаты, представленные в настоящей заявке, ясно показывают не только то, что IFN-con вызывает сниженные побочные эффекты или не вызывает их вообще при той же дозировке, что и интерферон альфа, но и то, что IFN-con может назначаться в больших в 3 - 5 раз дозах, не вызывая побочных эффектов, ограничивающих дозировку Дополнительно далее показано, что IFN-con имеет одинаковую или более высокую активность, чем Интрон А в описанных выше показателях В частности, IFN-con проявляет более высокую антипролиферативную активность, чем Интрон А Следовательно, лечение расстройств клеточной пролиферации при использовании IFN-con обеспечивает повышенную эффективность и безопасность, по сравнению с другими используемыми в настоящее время методами лечения интерфероном Назначение терапевтических эффективных количеств IFN-con приводит к более быстрому лечению или к расширению круга заболеваний, поддающихся лечению, по сравнению с применяемыми в настоящее время методами, в то время как не наблюдается соответствующего увеличения частоты или выраженности сопутствующих нежелательных побочных эффектов Кроме того, терапевтически эффективные количества IFN-con могут быть меньшими, чем количества интерферона, используемые в настоящее время в принятых схемах лечения Как результат, в некоторых случаях сниженные дозы IFN-con дают те же терапевтические результаты, что и более высокие дозы других интерферонов, но при уменьшенных или устраненных нежелательных побочных эффектах, сопутствующих используемым в настоящее время методам интерферонотерапии IFN-con является неприродным полипептидом, обладающим антипролиферативной активностью Предпочтителен вариант, когда IFN-con является полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность IFN-con1, IFN-con2 или IFNсопЗ Наиболее предпочтительно, когда IFN-con имеет аминокислотную последовательность IFNсоп1 Изобретение также связано с фармацевтическими препаратами, включающими терапевтически эффективные количества IFN-con вместе с подходящими разбавителями, вспомогательными веществами, носителями, консервантами и/или солюбилизаторами 8 Краткое описание изобретения На Фигурах 1 - 7 показана сравнительная антипролиферативная активность IFN-con1 и Интрона А при использовании линии клеток Eskol (линии волосистых лейкозных клеток), когда интерфероны добавлялись к суспензии клеток Eskol в количестве 0,1 - 0,5 - 1 - 5 - 10 - 50 100нг/мл, соответственно На Фигуре 8 показаны начальные и текущие средние величины максимально переносимой дозы (МПД), достигнутые у пациентов с саркомой Капоши, подвергнутых лечению Интроном A, IFNсоп1 или IFN-con1 совместное r-metGCSF Подробное описание изобретения Использованный "согласованный" человеческий лимфоцитарный интерферон (IFNcon) - неприродный полипептид, который преобладающе включает теаминокислотные остатки, которые являются общими для всех последовательностей природных подтипов человеческого лимфоцитарного интерферона, и который включает в одной или более позициях, где нет аминокислот общих для всех подтипов, аминокислоты, которые преобладающе наблюдаются в этих позициях, и, во всяком случае, не включает каких-либо аминокислотных остатков, которые не встречаются в этих позициях, по крайней мере, у одного природного подтипа IFN-con охватывает, но не ограничивается аминокислотными последовательностями, обозначаемыми IFN-con1, IFN-con2 и IFN-сопЗ, которые в общем раскрыты патентами США 4 695 111 и 4 897 471 Последовательности ДНК, кодирующие IFN-con, могут быть синтезированы как описано в ранее указанных патентах или другими стандартными методами Полипептиды IFN-con являются преобладающими продуктами экспрессии созданной последовательности ДНК, трансформированной или трансфицируемой в клетку-хозяин, особенно в Е coli Таким образом, IFN-con является рекомбинантным IFN-con IFNcon, предпочтительно продуцируемый в Е coli, очищают процедурами, известными специалисту в данной области, и в общем описанными Klein et al (см выше, Klein et al, 1988) для IFN-con1 Очищенный IFN-con может включать смесь изоформ, например, очищенный IFN-con1 включает смесь метионил-IFN-coni, десметионилIFN-con1 и десметионил-IFN-coni с блокированной терминальной аминогруппой (Klein et al , 1990) Однако IFN-con может включать и изолированные индивидуальные изоформы Изоформы IFN-con разделяют такими методами, как изоэлектрическое фокусирование и другими, известными специалистам в данной области Предмет изобретения включает способ лечения состояний, излечиваемых интерфероном альфа, при этом снижение или устранение одного или более побочных эффектов, связанных с лечением интерфероном альфа, предусматривает назначение пациенту терапевтически эффективных количеств IFN-con Преимущественный вариант осуществления изобретения - это метод лечения, включающий 44223 назначение терапевтически эффективных количеств IFN-con1, IFN-con2 и IFN-сопЗ Наиболее предпочтительно назначение терапевтически эффективных количеств IFN-con1 Понятие "снижение или устранение одного или более побочных эффектов, сопутствующих назначению интерферона" должно быть ясным и понятным специалисту в данной области Для определения этих показателей можно использовать некоторые из множества методов измерений частоты и степени выраженности побочных эффектов, сопутствующих интерферонотерапии, или сравнивать профили побочных эффектов разных интерферонов Одним из подходящих интерферонов для целей сравнения с "согласованным" интерфероном является Интрон А (интерферон альфа-2Ь), выпускаемый фирмой Schering-Plough Традиционный путь оценки выраженности побочных эффектов - использование стандартной шкалы, такой как принята ВОЗ (Всемирной Организацией Здравоохранения) Шкала, которая в настоящее время широко используется клиницистами, предусматривает следующие степени (уровни) побочных эффектов степень I, слабая, степень II, средняя, степень III, сильная, степень IV, угрожающая жизни Хотя некоторая субъективность присутствует в этой классификации, когда отдельные клиницисты формируют группы, сравнение профилей побочных эффектов, даваемых двумя лекарствами, может быть достоверным и приемлемым для врачей Проводя сравнение, врачи обычно будут видеть, приводит или нет назначение лекарства в данной дозе к достижению дозы, ограничиваемой токсичностью Доза, ограничиваемая токсичностью, наблюдается когда пациент судит о побочном эффекте как о непереносимом Когда этот факт имеет место, врач может или снизить дозировку (обычно Змлн единиц для Интрона А или "согласованного" интерферона) или на время отменить лекарство с последующим возобновлением назначения в той же или в более низкой дозе В некоторых случаях, когда дозировка достигает дозы, ограничиваемой токсичностью, результатом может быть субоптимальный режим лечения с менее, чем оптимальной эффективностью Таким образом, другой путь доказательства снижения побочных эффектов - это факт снижения числа случаев достижения дозы, ограничиваемой токсичностью Сравнение доз, ограничиваемых токсичностью, для Интрона А и "согласованного" интерферона представлено в Примере 3 Хотя могут быть выполнены другие измерения профилей побочных эффектов, результат одинаков по сравнению с другими интерферонами, особенно с интерферонами альфа, такими как Интрон А и Роферон (фирмы Huffman La Roche), использование "согласованного" интерферона приводит к достижению меньшего числа доз, ограничиваемых токсичностью, и в общем пациенты чувствуют себя лучше при всех дозировках лекарств, которые использовались для лечения Подходящие состояния для лечения IFN-con 10 включают многочисленные расстройства клеточной пролиферации, особенно различные формы рака Эти состояния включают, но не ограничиваются, волосистой клеточной лейкемией, саркомой Капоши, хронической миелогенной лейкемией, множественными миеломами, пузырчаткой, раком кожи (базальной клеточной карциномой и малигнизированной миеломой), карциномой почек, раком яичников, лимфомой с низким уровнем лимфоцитов, лимфомой Т клеток кожи и глиомой Другие состояния, подходящие для лечения IFN-con, включают различные вирусные заболевания Эти заболевания включают, но не ограничиваются, гепатитом А, гепатитом В, гепатитом С, гепатитом ни А, ни В (иным, чем гепатит В или С), заболеваниями, вызванными вирусом Эпштейна-Барра, вирусом HIV, вирусом герпеса (ЕВ, CML, простым герпесом), поксвирусами, пикорнавирусами, аденовирусами, риновирусами, вирусом HTLV I, вирусом HTLV II, ротавирусами человека IFN-con может быть использован как таковой или в комбинации с другими лекарствами для лечения указанных заболеваний Например, IFN-con может назначаться совместно с терапевтически эффективными количествами одного или нескольких химиотерапевтических средств, таких как бусульфан, 5-фторурацил, зидовудин (азатимидин, AZT), лейковорин, мельфалан, преднизон, циклофосфамид, дакарбазин, цисплатин и дипиридамол IFN-con может также назначаться совместно с цитокинами, такими как интерлейкин-2 Терапевтически эффективные количества IFN-con могут назначаться в комбинации с терапевтически эффективным количеством одного или нескольких факторов, которые стимулируют дифференциацию миелоидных клеток с тем чтобы преодолеть эффекты миелосупрессии, наблюдающиеся в процессе лечения интерфероном Такие агенты включают, но не ограничиваются, фактором, стимулирующим колонии гранулоцитов (G-CSF), фактором, стимулирующим колонии гра н ул о цито в/макрофагов (GM-CSF), интерлейкином-1, интерлейкином-3, интерлейкином-6, эритропоэтином и фактором стволовых клеток Фактор стволовых клеток стимулирует пролиферацию молодых гем ато поэтических клеток и это было описано в американской Заявке 573 616 Предпочтительным агентом является G-CSF В Примерах 1 - 3, приводимых ниже, показано, что IFN-con1 является эффективным антипролиферативным агентом в отношении волосистой клеточной лейкемии и сопутствующей синдрому приобретенного иммунодефицита человеку саркомы Капоши Антипролиферативная активность IFN-con1 и Интрона А, испытанная на клетках Eskol (линии волосистых лейкемических клеток), показана в Примере 1 Показано, что IFN-con1 имеет более высокую антипролиферативную активность, чем Интрон А, в широком диапазоне концентраций Похожие результаты были получены, когда IFN 11 44223 12 con1 был сравнен с Рофероном А Эти результаты количество IFN-con для лечения расстройств показывают, что IFN-con1 имеет более высокую клеточной пролиферации может составлять от 2 х 6 терапевтическую активность, когда назначается 10 до 60 х 10 единиц на пациента при при тех же концентрациях, что и Интрон А С назначении несколько раз в неделю Более низкие другой стороны, чтобы обеспечить дозы эффективны при лечении волосистой клеточной лейкемии, в то время, как более терапевтическую эффективность, эквивалентную высокие дозы приемлемы для лечения саркомы таковой Интрона А, требуются более низкие Калоши Терапевтически эффективные концентрации IFN-con1 Пример 2 описывает результаты количества IFN-con обеспечивают 20 - 80%-ное сравнительного изучения IFN-con1 и Интрона А уменьшение опухоли, зависящее от типа опухоли, при лечении сопутствующей СПИДу саркомы в течение 6 месяцев В общем, терапевтически Капоши Было показано, что пациенты, эффективное количество IFN-con для лечения получающие IFN-con1, переносят более высокую вирусных заболеваний будет лежать в пределах 6 6 дозу лекарства, чем пациенты, получающие от 3 х 10 до 30 х 10 единиц, предпочтительно от 6 6 Интрон А Кроме того, пациенты, получающие 6 х 10 до 15 х 10 единиц на пациента, одновременно IFN-con1 и G-CSF, переносят более назначаемое несколько раз (например, 2 - 7, высокие дозы IFN-con1, чем пациенты, предпочтительно 3 раза) в неделю получающие только IFN-con1 (см Фиг 8) В этом Предпочтительный путь введения - введение изучении все пациенты получали азатимидин в кровь млекопитающего, когда инъекции могут (AZT) как часть лечения инфекции, вызванной быть внутривенными, внутримышечными, вирусом HIV Азатимидин, назначаемый как подкожными или в место поражения Введение таковой, не эффективен в отношении саркомы может быть также осуществлено перорально или Капоши интраназально Соответствие назначаемого фармацевтического препарата избранному пути IFN-con1 показал большую безопасность, чем его введения определяется специалистом в этой Интрон А, о чем можно было судить по снижению области частоты проявлений токсичности степени 3 при назначении IFN-con1 Лечение IFN-con1 показало Следующие Примеры более полно снижение темпов падения числа нейтрофиллов и иллюстрируют изобретение, но они не должны числа нарушений функции печени, по сравнению с истолковываться как ограничивающие сферу его результатами, достигаемыми при лечении действия Интроном А, вто время, как лечение IFN-con1 и гПример 1 metGCSR полностью устраняет проявления Антипролиферативная активность IFN-con1 и токсичности степени 3 (см Таблицу 2) Интрона А Пример 3 представляет данные, полученные в Антипролиферативная активность IFN-con1 и результате клинических испытаний на пациентах, Интрона А были определены на линии клеток страдающих вирусным гепатитом Eskol - волосистых клетках линии лейкозных клеток, выделенной Dr E Srour из Медицинской Предполагается, что фармацевтические школы Индианского университета Змл культуры препараты включают фармацевтически клеток Eskol инкубировали в среде RPMI (фирма эффективные количества IFN-con совместно с Gibco), содержащей 10 % эмбриональной фармацевтически приемлемыми носителями, сыворотки теленка и 5% углекислого газа при вспомогательными веществами, разбавителями, температуре 37 градусов в течение 12 часов при консервантами и/или солюбилизаторами посевной дозе 1x10 5 клеток/мл IFN-con1 или Фармацевтические композиции IFN-con включают Интрон А (интерферон альфа-2Ь фирмы Sobering как разбавители различные буферные растворы Corp) были добавлены до конечной концентрации (например, ТРИС, ацетатный, фосфатный белка от 0,1 до 100нг/мл в ЮОмкл среды буфера) с определенным значением ph и ионной Концентрация белка IFN-con1 была определена силы, носители (например, человеческий методом Бредфорда (Bradfofd, Anal Biochem, сывороточный альбумин), солюбилизаторы 1976, 72, 248 - 254), в то время, как концентрация (например, твин, полисорбат) и консерванты Интрона А была вычислена, исходя из его (тимерозол, бензиловый спирт) удельной активности (2 х 108межд ед /мг белка) и В общем, компоненты фармацевтических содержание белка корректировалось в процессе препаратов могут быть выбраны из обычно опыта Число живых клеток подсчитывалось через используемых для этих целей с интерферонами и каждые 24 часа при удалении трипанового с другими антиполиферативными или голубого (фирма Sigma) ЮОмкл IFN-con1 или противовирусными агентами, которые известны Интрона А добавлялось до указанной конечной специалистам в этой области Фармацевтические концентрации с 24 часовыми интервалами препараты IFN-con выпускаются в виде Подсчитанное число живых клеток было средним инъекционных растворов или лиофилизированных из 4 независимых экспериментов, причем каждый порошков, которые растворяются перед эксперимент осуществлялся в двух повторностях употреблением Колебания в числе клеток лежали в пределах от Терапевтически эффективное количество IFNприблизительно 5% в 24 - 48-часовых опытах до con может быть определено каждым приблизительно 2% при более длительных специалистом в этой области, принимая во опытах Результаты, показанные на Фиг 1 - 7, внимание такие обстоятельства, как время представляют собою отношения числа живых полужизни препаратов IFN-con, путь введения и клеток в присутствии или в отсутствие диагноз В общем, терапевтически эффективное 13 44223 интерферона в разные временные интервалы и эти отношения выражены в процентах Число живых клеток было подтверждено измерением включения Н-тимидина в клетки Eskol, инкубированные в присутствии IFN-con1 или Интрона А После 120 часов инкубирования было отобрано 200мкл суспензии клеток и она была инкубирована при температуре 37 градусов в течение 3 часов в присутствии 5ткСі/мл Нтимидина (фирмы Amersham) Клетки были собраны, используя сепаратор (фирмы Cambridge Technology), промыты 7 раз дистиллированной водой и 2 раза 95%-ным этанолом и количество включенного меченого тимидина было определено с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика Наблюдаемое потребление меченого тимидина клетками Eskol, инкубированными в течение 120 часов в присутствии IFN-con или Интрона А, было пропорционально числу живых клеток Пример 2 Безопасность, толерантность и эффективность IFN-con1, назначаемого пациентам, страдающим саркомой Капоши Было предпринято изучение степени опасности и переносимости IFN-con1 и Интрона А для определения их максимально переносимой дозы (МПД) И IFN-con1 и Интрон А назначались в комбинации с зидовудином (азатимидином, AZT) пациентам с саркомой Капоши, сопутствующей СПИДу Кроме того, безопасность, переносимость и максимально переносимая доза IFN-con1 определялись при его назначении в комбинации с AZT и с продуцируемым Е coh рекомбинантным фактором, стимулирующим колонии гранулоцитов, который имеет остаток метионина на конце полипептида (r-metGCSF) Изучались три группы пациентов, которые, соответственно, получали 1 Интрон А и AZT 2 IFN-con1 и AZT 3 IFN-con1, AZT и r-metGCSF В каждую лечебную группу включалось, по крайней мере, 12 пациентов А Описание продуктов IFN-con1 продуцировался Е coh при использовании метода, описанного в патентах США 4 695 623 и 4 897 471 IFN-con1 был очищен общим процессом, описанным Klein et al (см выше, Klein et al , 1988) Для подкожного назначения в данном опыте IFN-con1 был приготовлен в виде стерильного белкового раствора в натрий-фосфатном буфере Если требуется, разведение осуществляли стерильным солевым раствором Зидовудин (AZT) был получен от фирмы Burroughs-Wellcome Co и использован как указано на вкладыше в упаковку Интрон А был получен от фирма Schermg Corp в виде стерильной ли-офилизированной формы, которая была суспендирована в разбавителе, как указано на вкладыше в упаковку r-metGCSF был биосинтезирован Е coh, при использовании метода в общем описанного в патенте США 4 810 643 r-metGCSF был приготовлен как стерильный белковый раствор в 10мл раствора ацетата натрия, 5% маннита и 14 0,004% твина 80 с ph 4,0 и с конечной концентрацией 0,Змг/мл Если требуется, проводилось разведение стерильным 5%-ным раствором глюкозы в воде В Дозировка и схема назначения AZT AZT назначался всем пациентам в фиксированной дозе ЮОмн перорально каждые 4 часа и в это время у пациента прерывался сон для получения суммарно пяти доз или 500мг ежедневно r-metGCSF Для лечения группы пациентов, получающих r-metGCSF, дозировка r-metGCSF была 1мкг/кг веса тела в день и назначалась подкожно как единичная инъекция Если было необходимо, эта доза увеличивалась выше 1мкг/кг/день (не превышая 6мкг/кг/день) или уменьшалась до дозы 0,5мкг/кг/день или меньшей для того, чтобы обеспечить абсолютное содержание нейтрофилов в пределах от 5 000 до 15 000 в куб мм Интерферон Пациенты получали или IFNсоп1 или Интрон А в соответствии с увеличивающейся дозировкой по принятой схеме Принятая дозировка предусматривала назначение равного числа единиц активности сравниваемых интерферонов Однако, поскольку удельные активности двух использованных интерферонов различались (2 х 108межд ед /мг у Интрона А и по крайней мере, 1 х 10 9 междед/мг у IFN-con1, что было определено по противовирусной цитотоксической пробе, описанной в патенте США 4 695 623 весовые количества белка (в мг) при принятых дозировках должны были отличаться и Интрона А и IFN-con1 Использованная схема лечения с увеличением дозировок представлена в помещенной далее Таблице 1 Дозировка, выраженная в мг белка, соответствовала уровню дозировки, выраженной в международных единицах, для каждого интерферона, что вытекает из данных Таблицы 1 Таблица 1 Схема увеличения дозировок Интрона А и IFN-con1 Уровень Доза х дозировки 106межд ед 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3 9 12 15 18 21 24 27 30 Дозав мг белка Интрон А 0,015 0,045 0,060 0,075 0,090 0,105 0,120 0,135 0,150 IFNсоп1 0,003 0,009 0,012 0,015 0,018 0,021 0,024 0,027 0,030 Пациентам каждой из трех лечебных групп, названных ранее, назначал и IFN-con1 или Интрон А при начальном первом уровне дозировки ежедневно в течение недели до перехода к следующему, более высокому уровню дозировки Увеличение дозы происходило на 8 - 15 - 22 - 29 - 3 6 - 4 3 - 5 0 - 5 7 дни Увеличение дозировок 15 44223 16 продолжалось до тех пор, пока каждый пациент статус (что характеризуется уровнем CD 4 достигал максимально переносимой дозы или лимфоцитов) и лечение азатимидином менее достигалась максимальная суточная доза в 30 х года 6 10 межд ед интерферона Максимально Среди аргументов в пользу исключения пациентов из опыта - повторный случай переносимая доза для отдельного пациента проявления токсичности степени 3 или более определялась как уровень дозировки ниже, чем высокой в период увеличения дозировок, третий доза, ограничиваемая токсичностью Токсичность случай достижения дозы, ограничиваемой ранжировалось по шкале от 0 (отсутствие токсичностью, после того, как у конкретного токсичности) до 4 (острая токсичность) при пациента определена максимально переносимая использовании критериев, установленных доза и пациент находился на поддерживающем Всемирной Организацией Здравоохранения и лечении, прогрессивное развитие саркомы описанных Miller et al (Cancer, 1981, 47, 210-211) Капоши Доза, ограничиваемая токсичностью, была определена как 3 или 4 степень токсичности, D Определение максимально переносимой которая может быть рассмотрена как, по крайней дозы IFN-con1 и Интрона А мере, возможно связанная с применением Используя схему увеличения дозы, описанную интерферона Лихорадка и озноб, выше, в течение 1 - 9 недель, последующую поддерживающую терапию и снижение дозы, продолжающиеся менее 24 часов, утомляемость, были определены соответствующие первая и головная боль или степень токсичности 2 и текущая средние максимально переносимые дозы меньшая не принимались во внимание для для пациентов всех лечебных групп, которые установления максимально переносимой дозы, представлены на Фиг 8 если они не были оценены как непереносимые для отдельных пациентов Каждая группа состояла из 15 пациентов У После завершения цикла увеличения пациентов группы 1 (Интрон А и AZT) первая дозировок пациентам назначалась максимально переносимая доза достигалась в процессе увеличения дозировок и составляла 9 х поддерживающая терапия, состоящая в 106межд ед , а текущая максимально переносимая ежедневном назначении лекарств пациентам, доза составляла 6 х 10 6 междед, у пациентов достигшим максимально переносимой дозы и 6 группы 2 (IFN-con1 и AZT) первая максимально получавшим максимальную дозу 30 х 10 межд ед , переносимая доза равнялась 15 х 106межд ед , у если она была достигнута Поддерживающая пациентов группы 3 первая и текущая терапия продолжалась до тех пор, пока болезнь максимально переносимые дозы были равны, прогрессировала или пока не возникли какие-либо соответственно, 24 х 106межд ед и 21 х обстоятельства, служащие основанием для 106межд ед исключения пациента из опыта В процессе поддерживающей терапии Е Оценка безопасности лечения Интроном А допускалось дважды снижать дозировку и IFN-con1 интерферона вследствие проявления токсичности Безопасность лечения Интроном А и IFN-con1 После двукратного снижения дозировок в определялась по наличию или отсутствию резко дальнейшем не допускалось изменений в выраженных неблагоприятных эффектов, что дозировках интерферона и пациенты, требовало снижения дозировки интерферона нуждающиеся в дальнейших уменьшениях доз, Результаты суммированы в Таблице 2 выводились из исследования Исключения из этого порядка допускались тогда, когда Таблица 2 проявлением ограничивающей дозу токсичности Токсичность, обусловливающая снижение являлась нейтропения (абсолютное число дозировок в трех лечебных группах нейтрофилов много меньше 1000 в куб мм и падение их числа наблюдалось за 2 дня Ч а с т о т а с л у ч а е в (%) приблизительно в течение недели) В этом случае Итрон A IFN-conl* IFN-conl + r-metGCSF* допускалось оставление пациента в исследовании без дальнейшего снижения дозировки Степень 2 интерферона, но при этом пациентам, не Непереносимость 70 20 получавшим ранее r-metGCSF, начиналась (гришо-нодобные терапия r-metGCSF в дозе 1мкг/кг веса в день, вводимой подкожно Для пациентов, уже синдромы) получавших r-metGCSF, назначаемая доза гmetGCSF была увеличена до следующего, более Степень 3 высокого уровня (увеличение дозы 1мкг/кг/день) Нейтропения С Отбор пациентов В изучение было вовлечено 49 пациентов Отдельные пациенты отбирались для опыта лишь после их согласия и при соответствии критериям отбора Значимые критерии для отбора в опыт это серологически подтвержденная HIV инфекция, ги сто-патологи чески доказанная саркома Капоши с умеренными кожными или стоматическими поражениями, приемлемый иммунологический 40 10 30 10 Степень 3 Функция печени * Сумма процентов D случае лечения IFN-conl и IFN-conl+r-melGCSF не достигает 1 0 0 %,поскольку некоторые пациента достигали максимально переносимой дозы 30x10* межд.ед без проявлений у них неблагоприятных эффектов 17 44223 18 С того момента, когда опыт был начат, инфицированных вирусом гепатита С и пациенты не исключались из опыта по причине проявляющих повышенный (по крайне мере, в 1,5 проявления токсичности, очевидно связанной с раза выше границ нормы) уровень назначением Интрона А или IFN-con1 аланинтрансферазы (аланинтрансфераза фермент печени), при этом превышением границ F Определение эффективности лечения IFNнормы в данном исследовании считалась соп1 и Интроном А величина 35миллиединиц/мл Противоопухолевая реакция Противоопухолевая реакция оценивалась после Кроме того, эффективность IFN-con1 четырех месяцев лечения, используя критерии, оценивалась измерением противовирусной применяемые Исследовательской клинической активности, выполненным PCR анализом, и группой Онкологического комитета по изучения определением содержания аланинтрансферазы в СПИДа (Krown et al J Clm Oncol , 1989, 7, 1201 процессе лечения Затем литературные данные о 1207) клиническом изучении вирусного гепатита при использовании других рекомбинантных Иммунные функции Подсчет CD 4 лимфоцитов осуществляли в процессе опыта интерферонов альфа, особенно интерферона ежемесячно в течение шести месяцев для альфа-2а (Роферона) и интерферона альфа-2Ь иммунного ответа у пациентов на HIV инфекцию (Интрона А) были сравнены с результатами настоящего исследования в отношении Во всех трех лечебных группах у пораженных безопасности и изменений уровня саркомой Капоши противоопухолевая реакция и уровень CD 4 лимфоцитов были эквивалентными аланинтрансферазы Пример 3 Подходящие пациенты были зачислены в одну из групп, получающих разные дозы IFN-con1, Безопасность, переносимость и указанные в Таблице 3 эффективность IFN-con1, назначаемого пациентам, страдающим гепатитом С (HCV) Повышение переносимой дозы Лечение Таблица 3 интерферонами типа 1 вызывает отдельные побочные эффекты, которые могли ограничить Число пациентов Доза IFN-conl Недельная доза* абсолютные дозы, назначаемые для лечения в миллионах специфических заболеваний Эти побочные единиц (млн.ед.) эффекты включают гриппо-подобные симптомы, понос, миелосупрессию, признаки повышенной функции печени и изменения психического 5 3 3 статуса Эти токсические проявления 5 6 3 классифицировались в соответствии со шкалой Всемирной Организации Здравоохранения как 5 9 3 степень I (слабая), степень II (умеренная), степень 12 3 5 III (сильная) и степень IV (угрожающая жизни) 15 5 3 Токсические проявления при лечении интерфероном типа 1 могут ранжироваться от степени I до степени IV Если токсичность * Прием доз разделялся по крайней мере 48 часами интерферона типа 1 в процессе лечения оценивается пациентом или врачом как Дозировки в одной группе менялись после непереносимая, то должна быть снижена изменения дозировок в другой группе с дозировка или изменена схема назначения интервалом в две недели Пять пациентов были Изменения дозировок могут привести к включены в первую группу и их состояние субоптимальному режиму лечения, который оценивалось как безопасное, если в течение двух обеспечивает результаты меньшие, чем недель проявлений токсичности III или более оптимально эффективные "Согласованный" высокой степени, приписываемых IFN-con1, не интерферон позволяет достигнуть оптимальной наблюдалось, пять пациентов были включены в дозировки и сохранять ее в процессе лечения без следующую группу (бмлн ед) Однако, если у проявления какой-либо токсичности, связанной с какого-либо пациента наблюдались проявления принятой дозировкой токсичности III или более высокой степени, Клинические испытания "согласованного" приписываемые IFN-con1, три дополнительных интерферона для лечения хронического пациента включались в первую группу и их инфекционного гепатита С были начаты с состояние оценивалось в течение двух недель изучения эффекта различных доз лекарства Если у дополнительно включенных в Сведения о пациентах, подвергавшихся лечению исследование пациентов не наблюдалось "согласованным" интерфероном были сравнены проявлений токсичности III или более высокой со сведениями о пациентах с тем же степени, приписываемых IFN-con1, пациенты заболеванием и с такими же демографическими затем включались в следующую группу (бмлн ед ), характеристиками, подвергавшихся лечению но если у какого-либо из дополнительно интерфероном альфа-2а (Рофероном) или включенных в исследование пациентов интерфероном альфа-2Ь (Интроном А) одним и наблюдались проявления токсичности III или тем же руководителем исследований более высокой степени, приписываемые IFN-con1 План исследований Изучение было , пациенты не включались в следующую группу, осуществлено по крайней мере на 30 пациентах, 20 19 44223 характеризующуюся назначением более высокой пациенту дозировка была симптомами Этому дозы лекарства (бмлн ед ) Увеличение дозировок снижена до 12млн ед в группах до 9 - 1 2 - 1 5 - 1 8 - 24мл н ед Доза интерферона альфа-2, ограничиваемая происходило в соответствии с правилами, токсичностью для периода в 12 недель лечения описанными выше Кроме того, если два или для каждой группы пациентов, и состояние более пациентов испытывали проявления пациентов были следующими токсичности III или более высокой степени, приписываемые IFN-con1, при каком-либо уровне Таблица 4 дозировки, дополнительные пациенты не включались в эту группу, для пациентов уже Доза IFN-conl % доз,ограшчиБаемых Токсичность находящихся на стадии исследования в этой (млн.ед.) токсячноеіью группе или в группе с более высокой дозировкой лекарства, дозировка снижалась до уровня, ниже такого, при котором у двух или более пациентов п=4 3 0 наблюдались проявления токсичности III или л=5 6 0 более высокой степени Однако, могло быть продолжено введение в эксперимент п=5 9 0 дополнительных пациентов (до общего числа 10 п=5 12 Гриппо-подобная 20 дополнительных пациентов) при уровне дозировки Гршшо-псщобная п=5 15 20 ниже той, при которой два или более проявления п=19 3 шш ед интерфетоксичности III или более высокой степени имели место рона альфа-2 32 Гриппо-подобная Если пациент в какой-либо группе достигал проявлений токсичности III или более высокой степени, приписываемых IFN-con1, в процессе или в течение двух недель после начальной оценки, назначение IFN-con1 отменяется до снижения проявлений токсичности до II или более низкой степени Лечение затем возобновляют при следующем, более низком уровне дозировки лекарства Если пациент получал дозу лекарства в Змлн ед в то время, как возникли проявления токсичности III степени, лечение могло быть продолжено при дозировке 2млн ед Если у какого-либо пациента возникли проявления токсичности IV степени, связанные с IFN-con1, пациент исключался из эксперимента Допускалось три раза снижать у пациентов дозировки в процессе лечения (но при снижении дозировки не ниже 2млн ед) Для некоторых пациентов требуется четыре раза снижать уровень дозировок для того, чтобы проявления токсичности были исключены в процессе исследования Лихорадка и озноб, продолжающиеся менее 34 часов, утомляемость, головная боль или проявления токсичности II или более низкой степени токсичности не считались проявлениями ограничивающей дозу токсичности, если они не признавались непереносимыми для отдельных пациентов Лекарство вводилось в домашних условиях самим пациентом или с посторонней помощью (после успешного завершения обучения) Состояние пациентов оценивалось на третий месяц по тесту, основанному на изменениях уровня аланинтрансферазы Результаты Пациенты включались в опыт и распределялись в описанные ранее группы Доза, ограничиваемая токсичностью, не наблюдалась у каких-либо пациентов в течение первых двух недель при дозах 3 - 6 - 9 - 12млн ед Одна доза, ограничиваемая токсичностью, проявилась у одного пациента, получавшего 15млн ед в течение первых двух недель лечения Наблюдаемая токсичность была II степени непереносимости с гриппо-подобными Как видно из приведенной Таблицы 4, пациенты, получавшие IFN-con1 в дозах от 3 до 15млн ед 3 раза в неделю, достигали дозы, ограничиваемой токсичностью, реже, чем пациенты, получавшие интерферон альфа-2 Поскольку альфа-2 исследовался лишь при уровне дозировки Змлн ед в принятых в данном случае единицах, невозможно провести клиническое сравнение при более высоких уровнях дозировок интерферона альфа-2 Однако, можно полагать, что число доз, ограничиваемых токсичность, будет существенно выше для интерферона альфа-2 при более высоких дозировках Реакция после 12 недель лечения Доза IFN-conl Таблица 5 Норма реакции* (млн.ед.) -, — А 3 25 % п=5 6 60 % п=5 9 80 % п=5 12 60 % 15 75 % п=4 п=19 3 млк.ед. интер^зерона ал:ьфа-2 47 % * Полная и частичная реакции Как видно из приведенной Таблицы 5, у пациентов, получавших IFN-con1 в дозах от 3 до 15млн ед 3 раза в неделю, норма реакции аланинтрансферазы была, по крайней мере, так же благоприятна, как наблюдалось при использовании интерферона альфа-2 Выше было показано, что лечение IFN-con1 22 21 44223 приводит к благоприятным результатам при более высокой переносимости лекарства, по сравнению с лечением интерфероном альфа-2 Поскольку настоящее изобретение было описано в границах предпочтительного варианта воплощения, допускается, что при его использовании специалистами будут иметь место варианты и модификации идеи изобретения Поэтому имеется в виду, что приводимая формула изобретения охватывает все такие равноценные варианты, которые включаются в объем заявленного изобретения 20 40 SO SO 100 - Ин-puir А 1 нг/ш: Фіг З •Сі •» І ^ Ч О Л І 3,1 ІНГ/ІІЛ Китрои ft 0,1 ]іг/ив Фіг 1 ISO 140 23 44223 24 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90