Фармацевтичний препарат для лікування хворих з порушеннями функції коагуляції, спосіб лікування таких хворих, спосіб одержання фармацевтичного препарату

1. Фармацевтический препарат для лечения больных с нарушениями функции коагуляции, содержащий активный компонент, который обладает воздействием на время коагуляции, отличающийся тем, что в качестве активного компонента C2 (54) ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ ПРЕП АРАТ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ХВОРИХ З ПОРУШЕННЯМИ ФУНКЦІЇ КОАГУЛЯЦІЇ, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ТАКИХ ХВОРИХ, СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ФАРМАЦ ЕВТИЧНОГО ПРЕПАРАТУ 35567 внешних п утей ингибируются ЕРI (ингибитор внешних путей), также называемых АСI. ЕРI - это ингибитор протеаз типа Куница, который связывается и ингибирует FXa. Комплекс EPI-FXa ингибирует ФVIIа-ТФ. Важность ЕРI для реакций коагуляции еще не была установлена, за исключением высоких нефизиологических концентраций, действующи х в общепринятых исследованиях коагуляции. Однако активность ЕРI измеряли в сложных исследованиях, где ЕРI позволял связать FXa и ЕРI-Fxa, добавляли к ТФ-ФVII реагентам, что могло активировать ФIХ или ФХ. При нормальном гемостазе факторы коагуляции сбалансированы друг с другом. Однако при некоторых обстоятельствах наблюдается избыточное кровотечение. Примерами являются: гемофилия, вызываемая недостатком ФVIII или ФIХ, идиопатическая тромбоцитопения (ITР), вызываемая сокращением числа пластинок. В хирургии также часто встречаются обильные кровотечения. Примерами агентов, которые могут быть использованы для предотвращения кровотечения, являются: ФIХ, ФVIII, ФVIIа, апротинин и трансксамовая кислота. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является фармацевтический препарат для лечения больных с нарушениями функции коагуляции, содержащий активный компонент, который обладает воздействием на время коагуляции, который описан в статье George, J., Broze, Jr. Et al: "Regulation of Coagulation by a Multi valent Kunitz-Type Inhibitor" Biochemistry, Vol. 29, No. 33, 1990, pp. 7539-7546. Недостатком известного фармацевтического препарата является его недостаточно высокая эффективность, т.к. он не блокирует EPI, играющий важную роль в гемостатическом балансе. В основу настоящего изобретения поставлена задача создания фармацевтического препарата, обладающего повышенной эффективностью в отношении воздействия на время коагуляции за счет блокирования EPI. Поставленная задача достигается тем, что фармацевтический препарат для лечения больных с нарушениями функции коагуляции, содержащий активный компонент, который обладает воздействием на время коагуляции, согласно изобретению, в качестве активного компонента указанный препарат содержит эффективное количество ЕРI-ингибитора. Кроме того, нарушение функции коагуляции связано с гемофилией А или В. Кроме того, нарушение функции коагуляции связано с идиопатической тромбоцитопенией, хирургической операцией или ДВС-синдромом. Объектом изобретения является также способ лечения больных с нарушениями функции коагуляции. Наиболее близким является способ, описанный в статье George, J., Broze, Jr. Et al: "Regulation of Coagulation by a Multivaient Kunitz-Type Inhibitor" Biochemistry, Vol. 29, No. 33, 1990, pp. 7539-7546, который включает введение больному терапевтически эффективной дозы фармацевтического препарата, содержащего активный компонент, который обладает воздействием на время коагуляции. Недостатком известного способа является его недостаточно высокая эффективность ввиду отсутствия блокирования ЕРІ. В основу настоящего изобретения поставлена задача создания эффективного способа лечения больных с нарушениями функции коагуляции за счет блокирования ЕРІ. Поставленная задача достигается тем, что в способе лечения больных с нарушениями функции коагуляции, включающем введение терапевтически эффективной дозы фармацевтического препарата, содержащего активный компонент, который обладает воздействием на время коагуляции, согласно изобретению, в качестве активного компонента вводят ЕРІ-ингибитор. Кроме того, нарушение функции коагуляции связано с гемофилией А или В. Кроме того, нарушение функции коагуляции связано с идиопатической тромбоцитопенией, хирургической операцией или ДВС-синдромом. Объектом изобретения является также способ получения фармацевтического препарата для лечения больных с нарушениями функции коагуляции. Наиболее близким является способ получения фармацевтического препарата, который содержит активный компонент, обладающий воздействием на время коагуляции, описанный в статье George, J., Broze, Jr. Et al: "Regulation of Coagulation by a Multivalent Kunitz-Type Inhibitor" Biochemistry, Vol. 29, No. 33, 1990, pp. 7539-7546. Недостатком известного способа является то, что он не позволяет получить фармацевтический препарат, обладающий эффективным воздействием на время коагуляции. В основу настоящего изобретения поставлена задача создания способа получения фармацевтического препарата, обладающего эффективным воздействием на время коагуляции. Поставленная задача достигается тем, что в способе получения фармацевтического препарата для лечения больных с нарушениями функции коагуляции, который содержит активный компонент, обладающий воздействием на время коагуляции, согласно изобретению, в качестве активного компонента берут эффективное количество ЕРI-ингибитора. Настоящее изобретение показывает, что агенты, которые блокируют активность ЕРI, могут также снижать тенденции к кровотечению. Это неожиданно, так как не было известно, чтобы ЕРl сам по себе участвовал в гемостатическбм балансе. Авторами изобретения проведены следующие наблюдения: 1. В коагулирующи х образцах плазменный ЕРI более активен, чем ЕРI, изготовленный с применением рекомбинантной техники (-ЕРI). 2. Коагуляция, индуцируемая очень разведенным ТФ, зависит от плазменного ЕРI, и таким образом ЕРI влияет на гемостатический баланс. 3. Анти тела, которые блокируют ЕРI-актив-ность (анти-ЕРI), сокращают время коагуляции нормальной плазмы. 4. Анти-ЕРI сокращает время коагуляции плазмы при гемофилии. Эти наблюдения указывают, что блокирование ЕРI уменьшает тенденции к кровотечению. 2 35567 Ранее можно было ускорить процессы коагуляции в нормальной плазме только путем добавления инициаторов коагуляции (тканевой фактор, каолин и т.д.) или активных ферментов (тромбин, ФХа и т.д.). Наши эксперименты представляют доказательства того, что возможно также ускорение процессов коагуляции блокирование плазменного белка (ЕРI). Внутренняя коагуляция обычно измерялась в пробах АРТТ, где коагуляция инициируется каолином, фосфолипидами и Са2+. Высокие концентрации ЕРI необходимы для воздействия на АРТТ пробы. Внешняя коагуляция измеряется в пробах РТ, где коагуляция инициируется тканевым фактором (экстракт мозга) и Са2+. В стандартных пробах используется неразведенный тканевый фактор и добавление ЕРІ имеет только незначительное влияние на наблюдаемое время коагуляции (см. Пример 2). Гораздо более физиологические значения получены, когда раствор тканевого фактора был значительно разведен. Тогда время коагуляции становится зависимым как от внешних, так и от внутренних факторов коагуляции. Фиг. 1 показывает, что добавление ЕРI увеличивает время коагуляции приблизительно на 2 секунды на каждую добавленную единицу ЕРI. Неожиданно было установлено, что добавление антител к ЕРI (устранение одной единицы ЕРI) сокращает время коагуляции на 30 секунд. Были проведены контрольные эксперименты, чтобы убедиться, что эффект действительно связан с ингибированием ЕРІ. Получены следующие результаты: А. Добавление избытка антител не сопровождается сокращением времени коагуляции. Б. Титр антител в пробах по ингибированию активности ЕРІ соответствует титр у, наблюдаемому в пробах с сокращенным временем коагуляции. В. Антитела афинно очищали с использованием чистого RWPI, связанного с сефаразой. Результаты проб IOG, приведенные в мг, указывают на десятикратное увеличение титра к коагуляции, а также к активности ЕРI. Г. Когда антитела добавляли в количестве, достаточном для сокращения времени коагуляции, добавление REPI имело более выраженный эффект на уменьшение времени коагуляции по сравнению с добавлением плазмы без антител (фиг. 2). Д. Плазма без ЕРI была приготовлена из нормальной плазмы путем иммуноабсорбции. Эта плазма имеет время сокращения коагуляции, сравнимое с нормальной плазмой. Добавление антител при анализах коагуляции, однако, не сократило время коагуляции неполной плазмы. Антитела, блокирующие активность ЕРI были описаны в литературе. Однако ингибирование плазменного ЕРI антителами не было описано и не было установлено, что такие антитела могут оказывать существенный прямой эффект на коагуляцию и, соответственно, на гемостатический баланс. Чтобы измерить ЕРI, использовали сложные 3-х стадийные пробы коагуляции. Сначала образцы ЕРI инкубировали с ТФ, ФVIIа, ФХ и Са 2+. Когда добавляли ФХ, через 1 минуту инкубации добавляли плазму без ФХ и цефалин мозга кролика. В этих пробах ЕРІ инкубирует ТФ-активность, при этом было показано, что антитела против ЕРI ингибируют эффект ЕРI. На одном этапе опытов по коагуляции смесь Са2+ и ТФ добавляли прямо в плазму и записывали время коагуляции. В подобных исследованиях Броз и др. показано, что требуется добавить 2,5 мкг ЕРI/мл (50 ед/мл) для получения 50% уменьшения кажущейся активности ТФ. Неожиданно было обнаружено, что добавление анти-ЕРI к плазме (внесение 1 единицы ЕРI) существенно влияет на время коагуляции, когда коагуляция инициировалась непосредственно разведенным ТФ. Эти исследования имитируют физиологическую ситуацию, поскольку это единственный тип опытов по коагуляции, где имеет место зависимость от присутствия как ФVIII, ФVII, так и FIХ, и все х факторов, необходимых для нормального гемостаза. Кроме того, плазменный ЕРI должен быть очищен. Однако не наблюдали существенного влияния на коагуляцию плазменного ЕРI, по крайней мере, не до такой степени, что ингибирование ЕРI будет оказывать влияние на гемостатический баланс. Однако было подчеркнуто, что регистрация физиологической значимости ЕРI остается условной. Наши наблюдения, что ЕРI плазмы существенно влияет на время коагуляции, является доказательством, что ЕРI играет важную роль в гемостатическом балансе. Проведенные авторами изобретения эксперименты свидетельствуют, что блокирование ЕРI позволяет снизить тенденцию к кровотечению. В первом аспекте настоящее изобретение относится к изготовлению фармацевтических препаратов для лечения больных с нарушениями функции коагуляции, при этом фармацевтический препарат в качестве активного компонента содержит ЕРI-ингибитор. Во втором аспекте изобретение касается способа лечения больных с нарушениями функции коагуляции с использованием препарата, содержащего ЕРI-ингибитор. В третьем аспекте изобретение касается использования ЕРI-ингибитора для производства фармацевтического препарата для лечения больных с пролонгированным временем коагуляции. Изготовление антител анти-ЕРI: Рекомбинантные человеческие ЕРI (RWPI) были получены из клеток, инфицированных вирусной РНК, как описано Педерсеном и др. (J. Biol. Chem. 265, p. 67866793. 1990). RWPI было очищено при помощи гепариновой афинной хроматографии, ионообменной хроматографии и хроматографии в обратной фазе (Nordfang et al., Biotech. PIasma Peot, p. 98, 1990). REPI, полученные таким путем, были очищены от SDS-PAGE. Кролики были иммунизированы после 21-дневного интервала на 0, 14, 35 день. Каждая иммунизация проводилась при помощи 0,1 мг REPI в адъюванте. Первая иммунизация проводилась полными Freunds-адъювантами, тогда как последующие проводили неполными адъювантами. Полученная антисыворотка проверялась на ингибиторную активность к ЕРI в опытах по определению активности ЕРI, а ингибирование выражали количественно как и ингибирующие антитела к ФVIII в опытах Бетесды: равные объемы антисыворотки и ЕРI (1 Ед/мл) инкубировали 2 часа при 37°С. Измеряли 3 35567 активность ЕРI, и разведение антисыворотки, которое ингибировало активность нэ 50%, брали как титр. Кроличья антисыворотка имела титр ингибирования между 1000 и 4000 ”Бетесда-подобных” единиц/мл как к REPI, так и к ЕРI человеческой плазмы. Ниже 50-кратного разведения сыворотка из иммунизированных кроликов не влияла на активность ЕРI-образцов (1 Ед/мл). IOG готовили с 8 мг IOG/мл, которые содержали 2000 ингибирующи х ”Бетесда-подобных" единиц на 1 мл к ЕРI человеческой плазмы. Пробы ЕРI-активности: ЕРI измеряли в опытах на хромогенных микропластинках, модифицированных по методу Сандсета и др. (Throm. Res., 47, p. 389, 1989). Пул обработанной нагреванием плазмы использовали в качестве стандарта. Определено, что этот стандарт содержал 1 Ед/мл активности EPI. Стандарты и образцы разводили буфером А (0,05 М ТРИС / 0,1 М NaCl / 0,1 М Naцитрат / 0,02% NaN3 (pH 8,0), содержащим 2 мкг/мл полибрена и 0,2% бычьего сывороточного альбумина. Смесь реагентов ФVIIа/ТФ-ФХ/СаСl2 готовили на буфере А. Она содержала 1,6 нг/ФVIIIа (Ново Нордиск А/С). Тканевый фактор человека, разведенный в 60 раз (Hjort. Scand. J. CIin. Invest., 9, 1957) 50 нг/мл ФХ/Сигма/ и 18 мМ СаСl2. Пробы помещали на ленты микроплашек при 37°С. 50 мкл образца и стандарта пипеткой наносили на ленты и к каждой добавляли 100 мкл смеси реагентов. Через 10 минут инкубации 50 мкл ФХ (3,2 мкг/мл) добавляли в каждую лунку и еще через 10 минут добавляли 25 мкл хромогенного субстрата FXa (S2222) через 10 минут после добавления субстрата. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1,0 М лимонной кислоты с pH 3,0. Микроплашки считывали при 405 нм. Опыты по коагуляции: Активность коагуляции измеряли, используя аппарат АCl-коагуляции. 20 мкл раствора антител или раствора ЕРІ инкубировали с 200 мкл плазмы 15 минут при комнатной температуре. После нагревания до 37°С АСI смешивали с 75 мкл образцов плазмы с 75 мкл раствора ТФ в 20 мл СаСI2, 50 мМ NaCI, 17 мМ имидазола, 33 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина при PH 7,4. Пример 1. Пробы по коагуляции проводили, как описано ранее, с использованием 20,000 кратного разведения клеточного фактора. Табл. 1 показывает эффект добавления анти-ЕРI к 10 индивидуальным донорским образцам, 7 образцам с гемофилией А и 1 образцу с гемофилией В. Наблюдали существенное сокращение времени коагуляции, особенно на образцах с гемофилией. Эти данные отражают предварительно возрастающую важность поверхностных, ФVII-зависимых путей в случае поврежденных внутренних путей коагуляции (гемофилия А ч В). Таблица 1 Влияние анти-ЕРI на время коагуляции индивидуальных образцов плазмы Время коагуляции без АВ, (с) Пределы Время коагуляции с анти-ЕРI, (с) Пределы Снижение, (с) Пределы Доноры n=10 102 91-113 77 71-87 26 11-39 Гемофилия А n=7 131 104-165 92 82-113 39 22-63 Пример 2. Опыты по коагуляции проводили с пулом нормальной плазмы, используя различные разведения ТФ. Табл. 2 показывает, что чем более ТФ разведено, тем более существенный эффект ока Гемофилия В n=1 165 116 49 зывает добавление анти-ЕРI к плазме. Это иллюстрирует, что, чем дольше время коагуляции, тем более эффективно анти-ЕРI сокращает время коагуляции. Таблица 2 Влияние добавления анти-ЕРI или ЕРI, как функция времени коагуляции Разведение ТФ Время коагуляции в секундах Нормальная плазма 60 300 1500 16,6 28,1 49,0 Нормальная плазма с антиЕРI 16,1 24,5 38,9 7500 15000 92,0 121 %от нормальной Нормальная плаз- % от нормальной плазмы ма с добавлением плазмы 16 Ед/мл ЕРI 97 17,6 106 87 31,4 112 79 59,0 120 64,8 80,5 70 67 4 123 >165 134 >136 35567 Пролоджение таблицы 2 Разведение ТФ Время коагуляции в секундах Нормальная плазма 21000 30000 45000 143 >165 >165 Нормальная плазма с антиЕРI 91,3 102 117 %от нормальной Нормальная плаз- % от нормальной плазмы ма с добавлением плазмы 16 Ед/мл ЕРI 64 >165 > 165 > 165 > Пример 3 Цитратная плазма получена от пациента от пациента после кардиопульмонарной бифазной хирургической операции (КПБ). При этой операции свертываемость крови пациента снижали большой дозой гепарина. После операции гепарин был нейтрализован протамин сульфатом. При измерении ингибирования хромогенного FXa анализ плазмы показал отсутствие гепарина в образцах. В пробах ЕРI по Сандесту образцы содержали 2 Ед/мл активности ЕРI. Табл. 3 показывает разведение ТФ и время коагуляции этой плазмы до и после добавления анти-ЕРI. Кажется, что время коагуляции продлевается и анти-ЕРI может сократить время коагуляции. Таким образом, увеличенный уровень ЕРI может быть одной из причин, почему у КПБ-пациенты наблюдается кровотечение во время и после операции. Таблица 3 Влияние анти-ЕРI на время коагуляции плазмы у КПБ-больных Время коагуляции без антитела Пул донорской плазмы 100 Плазма КПБ-пациента >165 Время коагуляции с антителом 70 82 Пример 4 Гепарин-связывающий белок (НВР) WO89/08666 - это белок из нейтрофильных гранул, демонстрирующий высокую гомологию к эластазе. НВР не является ферментом сам по себе, но, повидимому, связывает ингибитор фермента. При исследовании проб с ЕРI титр НВР к ЕРI состав ляет 10 Бетесдо-подобных единиц/мг. НВР также блокирует ингибирование FXa под влиянием ЕРI с соответствующим титром. При добавлении к нормальной плазме в концентрации 150 мкг/мл разведенный ТФ индуцирует сокращение времени коагуляции (табл. 4). Таблица 4 Влияние НВР на время коагуляции нормальной плазмы Время коагуляции, (с) Нормальная плазма Нормальная плазма с анти-ЕРI 98 70 Нормальная плазма с НВР 81 5 35567 Фиг. 1 Фиг. 2 6 35567 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 7