Спосіб ідентифікації або селекції еукаріотичних клітин та трансформовані клітини

1 Способ идентификации или селекции растительных клеток, обладающих метаболическим преимуществом, являющимся результатом их трансформации, из популяции растительных клеток в/на среде, содержащей, по меньшей мере, одно селективное соединение, отличающийся тем, что клетки трансформируют нуклеотидной последовательностью или совместно вводимой нуклеотидной последовательностью, содержащей область, которая кодирует белок, участвующий в метаболизме указанного соединения, и/или регулирует активность гена, кодирующего указанный белок 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что селективное соединение используют в достаточно высокой концентрации для оказания токсического или иным образом ингибирующего эффекта на рост клеток, результатом которого является комбинирование позитивной или негативной селекции 3 Способ по п 2, отличающийся тем, что в среду добавляют реагент, который понижает токсичность указанного соединения для клеток 4 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанное соединение является маннозой, а нуклеотидная или совместно вводимая нуклеотидная последовательность кодирует маннозо-6-фосфатизомеразу 5 Способ по п 4, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одна из указанных нуклеотидных последовательностей содержит ДНК, которая модифицирована таким образом, что использованы кодоны, предпочтительные для организма, в который вводят последовательности, при этом экспрессия модифицированной таким образом ДНК в указанном организме приводит к образованию белка, аналогичного в целом белку, продуцируемому при экспрессии немодифицированной ДНК в организме, для которого компоненты последовательности, кодирующие белок, являются эндогенными 6 Способ по любому из пп 1-5, отличающийся тем, что указанное соединение является неактивным в нетрансформированных клетках или менее активно в нетрансформированных клетках, чем в трансформированных клетках, либо менее токсично для трансформированных клеток, чем для нетрансформированных клеток, а экспрессия или транскрипция указанной нуклеотидной последовательности увеличивает доступность указанного соединения для клеток или приводит к увеличению активности фермента, эндогенно присутствующего в клетках таким образом, что активность указанного фермента в трансформированных клетках больше его активности в нетрансформированных клетках, либо экспрессия или транскрипция указанной нуклеотидной последовательности приводит к блокировке метаболизма указанного соединения или к блокировке в синтезе указанного соединения в трансформированных клетках, посредством чего трансформированные клетки могут быть отделены от нетрансформированных клеток 7 Способ по любому из пп 1-6, отличающийся тем, что используют клетки, трансформированные нуклеотидной последовательностью, кодирующей экзогенный промотор, способный к гомологичной рекомбинации с ДНК последовательностью в/или вблизи структурного гена, который способен находиться под контролем указанного промотора 8 Способ по любому из пп 1-7, отличающийся тем, что указанное соединение является маннозой 9 Способ по любому из п п 1-8, отличающийся тем, что указанное соединение является маннозо6-фосфатом, ксилозой или D-маннозамином 10 Способ по любому из пп 1-9, отличающийся тем, что указанный белок является ферментом 11 Способ по п 10, отличающийся тем, что указанный фермент выбирают из группы, состоящей О (О о> (О ю из фосфосахароизомеразы, фосфосахаромутазы, фосфатазы, сахароэпимеразы, сахаропермеазы и фосфосахаропермеазы 12 Способ по любому из пп 1-7 или 9-11, отличающийся тем, что указанный белок является маннозо-6-фосфат-изомеразой 13 Способ по любому из пп 1-11, отличающийся тем, что указанный белок является ксилозоизомеразой 14 Способ по п 11, отличающийся тем, что указанная фосфосахаромутаза является фосфоманно-мутазой, а фосфатаза является маннозо-6фосфатазой 15 Способ по любому из пп 1-14, отличающийся тем, что указанные клетки трансформируют бактерией, чувствительной к указанному соединению 16 Способ по любому из пп 1-15, отличающийся тем, что трансформированные клетки селектируют с помощью комбинации положительной и отрицательной селекции, а указанную нуклеотидную последовательность в трансформируемые клетки вводят совместно с дополнительной нуклеотидной последовательностью, кодирующей устойчивость, Предметом настоящего изобретения является способ селекции генетически трансформированных клеток, при котором требуемую нуклеотидную последовательность вводят посредством обеспечения трансформированных клеток селективным преимуществом Селективное преимущество, которым обладают трансформированные клетки, может иметь место благодаря их усиленной по сравнению с нетрансформированными клетками способностью использовать вносимое соединение в качестве питательного вещества, фактора роста или источника энергии Известно, что в том случае, когда генетический материал должен быть введен в популяцию клеток посредством трансформации, успешно трансформируется только определенное количество клеток Идентификацию и отделение трансформированных клеток традиционно производят с применением "отрицательной селекции", при которой трансформированные клетки способны выживать и расти, в то время как нетрансформированные клетки подвергаются ростовому ингибированию или, возможно, даже убиваются веществом, к которому трансформированные клетки проявляют устойчивость в силу их трансформации Например, в случае трансформации популяции растительных клеток селекция трансформированных клеток обычно базируется на наличии в трансформированных клетках "селективного гена", который придает им устойчивость к антибиотику или гербициду Селективный ген, который сам по себе может не выполнять никакой полезной функции в трансформированном растении (а может быть даже нежелательным для растения), спаривают или вводят совместно с требуемым геном, который необходимо ввести в растение, так что оба гена вводятся в популяцию клеток или, что 57696 по меньшей мере, к одному компоненту, выбранному из группы, включающей токсины, антибиотики и гербициды, а среда в/на которой культивируют указанные клетки, содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, включающей токсины, антибиотики и гербициды, к которым трансформированные клетки проявляют устойчивость 17 Способ по любому из пп 1-16, отличающийся тем, что требуемую нуклеотидную последовательность вводят с, по меньшей мере, двумя различными селективными генами 18 Способ по любому из пп 2-17, отличающийся тем, что реагент, понижающий токсичность, выбирают из группы, состоящей из метил-3-0-глюкозы и флоридзина 19 Способ по любому из пп 1-16, отличающийся тем, что трансформированными клетками являются клетки растений 20 Трансформированные клетки, отличающиеся тем, что представляют собой трансформированные клетки растений, отобранные с применением способа по любому из пп 1-18 правильнее, в определенные клетки популяции, поскольку трудно, если не невозможно, практически трансформировать все клетки Затем клетки культивируют на/в среде, содержащей антибиотик или гербицид, к которому генетически трансформированные клетки обладают устойчивостью в силу наличия в них селективного гена, что позволяет идентифицировать трансформированные клетки, поскольку нетрансформированные клетки, которые не содержат гена устойчивости к антибиотику или гербициду, подвергаются ростовому ингибированию или погибают Подобные методы отрицательной селекции обладают рядом недостатков Например, нетрансформированные клетки могут погибать из-за присутствия антибиотиков или гербицидов в ростовой среде В результате в том случае, когда популяция клеток представляет собой организованную ткань, существует опасность, что могут погибнуть не только нетрансформированные клетки, но также и трансформированные клетки в силу того, что гибель нетрансформированных клеток может прервать поступление питательных веществ к трансформированным клеткам, либо в силу того, что угнетенные или погибающие нетрансформированные клетки могут выделять токсичные соединения Другим недостатком отрицательной селекции является то, что присутствие несущественного гена, например, гена, кодирующего устойчивость к антибиотику, является нежелательным Среди исследовательских групп и государственных органов существуют определенные сомнения в том, насколько безопасно вводить гены антибиотикоустойчивости в растения и микроорганизмы Это опасение особенно существенно в отношении пищевых растений и микроорганизмов, которые не предназначены для применения в замкнутых сие темах (например, микроорганизмы, предназначенные для применения в сельском хозяйстве), также как и в отношении микроорганизмов, которые предназначены для применения в замкнутых системах, но могут случайно проникнуть за их пределы Другим недостатком отрицательной селекции является то, что растительные ткани или клетки, обработанные токсичными веществами, становятся более чувствительными к бактериальной инфекции Это представляет проблему приприменении в качестве вектора для трансформации Agrobactenum, поскольку обработанные ткани или клетки иногда зарастают бактерией, даже при применении антибиотиков для предотвращения бактериального роста Кроме того, селекция клеток или тканей с применением отрицательной селекции требует строгого подбора времени экспрессии вводимых генов по отношению к селекционному процессу Если трансгенные клетки обработают токсичным соединением перед тем, как произойдет экспрессия гена детоксикации или перед тем, как продуцируется достаточно генных продуктов для того, чтобы ослабить действие токсичного соединения, то как трансгенные, так и нетрансгенные клетки будут убиты Если селекцию проводят слишком поздно, то селекции трансгенных клеток или тканей может помешать, например, формирование побега или каллуса из нетрансформированных клеток или тканей, который создаст барьер для проникновения соединения, применяемого для селекции трансформированных клеток Вышеуказанные недостатки устраняются, по меньшей мере в значительной степени, способом согласно настоящему изобретению (именуемому "положительная селекция" или комбинированная "положительная/отрицательная селекция"), который делает возможной идентификацию и изоляцию генетически трансформированных клеток без опасности гибели нетрансформированных клеток в популяции и без необходимости совместного введения генов устойчивости к антибиотикам или гербицидам В дополнение к тому факту, что устраняется потребность в генах антибиотико- или гербицидоустойчивости, способ положительной селекции согласно настоящему изобретению часто является намного более эффективным, чем традиционная отрицательная селекция, а сочетание положительной и отрицательной селекции обеспечивает частоту селекции трансгенных побегов такую же, если не более высокую, чем частота, наблюдаемая при применении только одной отрицательной селекции Кроме того, применение положительной селекции дает то преимущество, что один ген может быть использован в качестве как репортерного гена, так и селективного гена, что приводит к упрощению векторных конструкций, большей стабильности таких конструкций и 100%ной корреляции между экспрессией репортерного и селективного генов Положительная селекция также может устранить вышеизложенные проблемы в отношении выбора времени, так как селективные соединения могут продуцироваться в следствии действия генных продуктов, образованных в результате экс 57696 прессии введенного гена, на специфические субстраты Поэтому селективное соединение может накапливаться как следствие экспрессии селективного гена, а селективное действие появляется тогда, когда продуцируется достаточное количество селективного соединения Согласно настоящему изобретению предлагается способ идентификации или селекции из популяции эукариотических клеток, культивируемых на/в среде, содержащей по меньшей мере одно соединение, клеток, обладающих метаболическим преимуществом, являющимся результатом их трансформации, при котором а) клетки трансформируют нуклеотидной последовательностью или вводимой совместно нуклеотидной последовательностью, одна из которых содержит область, которая (а) кодирует белок, участвующий в метаболизме указанного соединения, и/или (б) регулирует активность гена, кодирующего указанный белок, и б) соединение является маннозой или ксилозой либо их производным или предшественником, либо субстратом для белка, либо оно может быть метаболизировано трансформированными клетками в такой субстрат, причем указанное соединение не является маннозой в случае, когда белок является маннозо-6-фосфатизомеразой Изобретение включает также способ идентификации или селекции из популяции эукариотических клеток, культивируемых на/в среде, содержащей по меньшей мере одно соединение, клеток, которые обладают метаболитным преимуществом, являющимся результатом их трансформации, при котором а) клетки трансформируют нуклеотидной последовательностью или совместно вводимой нуклеотидной последовательностью, одна из которых содержит область, которая (а) кодирует белок, участвующий в метаболизме указанного соединения, и/или (б) регулирует активность гена, кодирующего указанный белок, и б) в среду добавляют реагент, который понижает токсичность указанного соединения для клеток Предпочтительно, чтобы в том случае, когда реагент, понижающий токсичность, добавляют в культуральную среду, указанное соединение являлось бы маннозой, а нуклеотидная последовательность или совместно вводимая нуклеотидная последовательность кодировала бы маннозо-6фосфат-изомеразу Клетки, которые обладают "метаболитным преимуществом", помимо прочего способны к более быстрому росту по сравнению с клетками, не обладающими таким преимуществом, и/или способны утилизировать субстраты (такие как предшественники питательных веществ и др) которые клетки, не обладающие этим преимуществом, утилизировать не способны, и/или способны детоксифицировать субстраты, которые являются токсичными или ингибирующими иным способом рост клеток, не обладающих указанным преимуществом Белок, который "участвует в метаболизме соединения", является, как правило, но не исключительно, ферментом, который может быть ответственным, прямо или косвенно, за продуцирование 57696 8 являются сахарная свекла и кукуруза Применение настоящего способа положительной селекции in vitro наиболее целесообразно, например, в применении к трансформации, проводимой на целых растениях или частях растений, при которой растения или их части содержат как трансформированные, так и нетрансформированные клетки, поскольку селекцию трансформированных клеток проводят без непосредственного повреждения соседних нетрансформированных клеток Поэтому трансформированные клетки обладают селективным "преимуществом" по сравнению с нетрансформированными клетками (например, способность формировать побеги), но нетрансформированным клеткам не наносится при этом никакого ущерба в том смысле, что они могут быть повреждены или убиты, как в случае отрицательной селекции с применением антибиотиков или гербицидов "Селективное преимущество", которым обладают трансформированные клетки, может, как правило, являться отличием или преимуществом, позволяющим идентифицировать трансформироПод "производным" маннозы или ксилозы пованные клетки простым визуальным способом, то нимают любое соединение, способное утилизироесть без применения специального анализа для ваться, связываться, являться субстратом для или определения присутствия маркерного гена продуктом любого белка, участвующего, прямо или косвенно, в метаболизме маннозы или ксилоПопуляцию клеток можно культивировать в/на зы В случае маннозы к числу подобных произсреде, содержащей по меньшей мере одно соедиводных относятся углеводы, такие как глюкоза или нение, которое может быть неактивным и которое галактоза, которые могут подвергаться действию прямо или косвенно активируется в трансформиэпимераз с образованием маннозы либо ее пророванных клетках, это соединение является неакизводных или предшественников Термин "произтивным в нетрансформированных клетках или водное" включает также остатки маннозы или ксименее активным в нетрансформированных клетлозы, имеющие одну или более гидроксильных ках по сравнению с трансформированными клетгрупп, с которыми остатки связаны ковалентной ками таким образом, чтобы трансформированные или ионной связью К числу подобных связанных клетки обладали селективным преимуществом, остатков относятся сложноэфирные, эфирные позволяющим проводить их селекцию из клеточгруппы, аминогруппы, амидогруппы, фосфатные ной популяции группы, сульфатные группы, карбоксильные групПопуляцию клеток можно также культивиропы, карбокси-алкильные группы и их сочетания вать в/на среде, содержащей соединение, которое Производные маннозы или ксилозы могут вклюстановится доступным для трансформированных чать также предшественников маннозы или ксилоклеток за счет экспрессии или транскрипции нукзы при условии, что модифицирующие группы леотидной последовательности, при этом такое могут быть удалены с образованием маннозы или соединение не является доступным для нетрансксилозы формированных клеток или является менее доступным для нетрансформированных клеток, поТермин "клетка" в контексте изобретения средством чего трансформированные клетки включает протопласты, термин "популяция" вклюприобретают селективное преимущество чает ткань, орган или его часть, популяцию отдельных клеток в/на субстрате либо целый оргаВ том случае, когда полипептид, кодируемый низм, например, растение нуклеотидной последовательностью, прямо активирует неактивное соединение в трансформироНастоящее изобретение включает также ванных клетках, нетрансформированные клетки трансформированные клетки, которые селектирумогут эндогенно содержать или продуцировать ют с применением способа по изобретению, и таопределенное количество указанного полипептикие трансформированные клетки, которые являда, который чаще всего может представлять соются растительными клетками, а также растения, бой фермент В таких случаях нет необходимости потомство, или семена, полученные из таких клев том, чтобы "неактивное соединение" было полток К числу растений, которые могут быть отсеностью неактивным в нетрансформированных лектированы согласно изобретению, относятся клетках, так как может оказаться вполне достаточфрукты, включая томаты, манго, персики, яблоки, ным, чтобы соединение или питательное вещестгруши, землянику, бананы и дыню, полевые кульво было лишь существенно менее активным в туры, такие как канола, подсолнечник, табак, санетрансформированных клетках по сравнению с харная свекла, зерновые с мелким зерном, такие трансформированными клетками Другими словакак пшеница, ячмень и рис, кукуруза и хлопок, ми, качественное отличие трансформированных и овощи, такие как картофель, морковь, салат, канетрансформированных клеток в отношении актипуста и лук вации изначально неактивного соединения может Наиболее предпочтительными растениями или утилизацию указанного соединения либо его производных или предшественников Белок может также участвовать в метаболизме соединения, если он связывается с ним, переносит из одного сайта в другой в пределах клетки либо ткани или организма или, в противном случае, изолирует его, изменяя тем самым его локальную доступность Область нуклеотидной последовательности, "которая регулирует активность гена, кодирующего белок", может изменять уровень экспрессии эндогенного гена в силу того, что она является промотором либо обладает промоторной активностью и локализована вблизи него Под понятием "вблизи" подразумевают участок длиной до 10000т п о С другой стороны, непрямая регуляция может являться результатом изменения связывания РНК-полимеразы с промотором структурного гена, кодирующего белок, или комплиментарного связывания нуклеотидной последовательности с по меньшей мере частью структурного гена, понижая тем самым количество белка в клетке 57696 10 ние двух или более генов, приводящее к совместявляться достаточным критерием для проведения ной экспрессии генов в одной и той же клетке селекции В таких случаях к клеткам могут быть имеет, как можно ожидать, низкую вероятность, а добавлены ингибиторы или субстраты, которые улучшенные частоты селекции, имеющие место конкурируют с нативными ферментами Особенно при реализации способа положительной селекции, подходящими являются ингибиторы, активируекак следует поэтому ожидать, являются особым мые нативными ферментами, приводящими к сапреимуществом в таких системах мокатализируемому продуцированию этого активного ингибитора в количестве, при котором Соединение, применяемое для целей селекуказанный лативный фермент является по сущеции, может, кроме того, оказывать как положиству полностью ингибированным тельное, так и отрицательное действие Например, манноза в достаточно высоких Клетки также могут быть трансформированы концентрациях токсична для большинства растесовместно вводимой нуклеотидной последований, но в клетках, содержащих ферменты, метательностью, которая может кодировать пермеазу болизирующие маннозу, ее отрицательное влияили другой транспортный фактор, который позвоние элимировано, и клетки дополнительно ляет соединению проникать через клеточную получают преимущество, заключающееся в спомембрану и поступать в трансформированные собности использовать маннозу в качестве источклетки либо проникать через другую (органельника углеводов В этом случае одно соединение и ную) мембрану, так что "активация" неактивного один ген совместно обеспечивают комбинировансоединения включает селективное поглощение ную систему положительной и отрицательной сесоединения трансформированными клетками, а лекции, хотя такая система может быть создана и поглощение нетрансформированными клетками с применением двух или более генов, которые невозможно либо происходит в меньшей степени совместно отвечают за ингибирование отрицаВместо того, чтобы облегчать проникновение сотельного воздействия соединения и за проявлеединения в клетку, совместно вводимая нуклеоние положительного воздействия соединения в тидная последовательность может, напротив, натрансформированных клетках правлять свой продукт в область, в которой локализовано неактивное соединение, например В дальнейшей реализации способа, экспресза плазменную мембрану или в вакуоль либо энсия и транскрипция нуклеотидной последовательдоплазматический ретикулум ности приводит к блокировке метаболизма соедиВ том случае, когда две нуклеотидные последовательности совместно вводят в клетки, они могут быть спарены друг с другом либо вводиться совместно таким образом, что присутствие одной нуклеотидной последовательности в клетке указывает на присутствие или на повышенную вероятность присутствия в клетке другой последовательности Эти две нуклеотидные последовательности являются, таким образом типичной, хотя и не необходимой частью одной и той же генетической конструкции и могут быть введены с помощью одного и того же вектора Поскольку необходимо, чтобы вводимые нуклеотидные последовательности экспрессировались в трансформированных клетках, генетическая конструкция, содержащая две нуклеотидные последовательности, обычно имеет регуляторные последовательности, способствующие экспрессии нуклеотидных последовательностей, например, известные промоторы и терминаторы транскрипции Таким образом, совместно вводимая нуклеотидная последовательность обычно ассоциирована с промотором, который может быть констуитивным или регуляторным Описанные здесь способы могут быть также применены в случае, когда две нуклеотидные последовательности вводят независимо Это может быть осуществлено, например, путем использования одной и той же бактерии для введения обоих генов и введения относительно большого количества копий требуемой нуклеотидной последовательности в клетку, в силу чего относительно высока вероятность того, что клетки, которые, как показано, экспрессируют совместно вводимую нуклеотидную последовательность, также будут содержать и экспрессировать требуемую нуклеотидную последовательность Независимое введе нения, вносимого в популяцию клеток, или блокировке синтеза соединения в трансформированных клетках, в силу чего трансформированные клетки могут быть идентифицированы или отселектированы от нетрансформированных клеток В дальнейшей реализации способа, трансформированные клетки могут быть отселектированы путем применения комбинации положительной селекции и отрицательной селекции, нуклеотидную последовательность в трансформированные клетки обычно вводят совместно с дополнительной нуклеотидной последовательностью, кодирующей устойчивость к по меньшей мере одному компоненту, выбранному из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков и гербицидов, а среда в/на которой клетки культивируют, содержит, по меньшей мере, один компонент, выбранный из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков и гербицидов, к которым трансформированные клетки оказываются устойчивыми Предпочтительно, чтобы нуклеотидную последовательность вводили совместно с по меньшей мере двумя различными селективными генами Предпочтительно, чтобы соединение являлось маннозой или ксилозой Как было показано выше, соединение, однако, может представлять собой производное маннозы, например, манно-зо6-фосфат, или производное ксилозы, такое как ксилозофосфат, либо предшественник маннозы или ксилозы Клетки могут быть трансформированы любой нуклеотидной последовательностью, предназначенной для введения в них Такая нуклеотидная последовательность может кодировать гены, придающие вирусную, грибную, бактериальную устойчивость либо устойчивость к нематодам Клетки могут быть трансформированы бакте 12 11 57696 рией, такой как бактерия рода Agrobactenum, чувлученные недоступные 3' концы достраивают с ствительной к указанному соединению, так что помощью полимеразы Кленова Линеаризованную селекция трансформированных клеток с помощью D018 плазмиду с заполненным Hmdlll сайтом (Нтуказанного соединения приобретает преимущестdlll*) (см Ф и г і ) расщепляют рестриктазой Bell, a во, заключающееся в том, что уменьшается опасполученный Bcll-Hindlll* фрагмент длиной ность послетрансформационного заражения 1218т п н , содержащий кодирующую область трансформированных клеток бактерией Следует фосфоманнозоизомеразы, клонируют в плазмиду отметить, что клетки могут быть трансформироваpEn-hanced-Peter-Lmker (усиленный линкер Peter) ны любым из приемлемых известных способов, (pEPL), которую сначала подвергли рестрикции по включая электропорацию, микроинъекцирование, Smal, а затем - по BamHI Полученную плазмиду применение микрозарядной пушки и трансформаименуют р(ЕРІ_-манноза) цию Ri- и Ті-плазмидами Трансформированные pEPL конструируют из pCaMVCN [4, 5], в котоклетки в соответствующих случаях могут быть рой CAT ген удален путем рестрикции по Pstl Нерегенерированы в целые растения, в которых ребольшой линкер (линкер Pstl-BamHI-Ball-Pstl) комбинантная ДНК стабильно введена в геном встраивают в Pstl сайт этой плазмиды, в результате чего получают плазмиду, именуемую pLise (pl_) Предпочтительно, чтобы белок представлял pl_ подвергают рестрикции по Hindi и Bglll, а ресобой фермент, участвующий в метаболизме зультирующий фрагмент, содержащий 35S промоманнозы или ксилозы К числу таких ферментов тор и NOS терминатор, клонируют в другую pl_ относятся ксилозоизомеразы, фосфоманнозоизоплазмиду, подвергнутую рестрикции по EcoRV и меразы, такие как маннозо-6-фосфат-изомераза, Bglll Как EcoRV, так и Hindi являются сайтами с маннозо-1-фосфат-изомераза, фосфоманномутатупыми концами Полученную конструкцию имеза, маннозоэпимеразыа, которые превращают нуют pEnhanced-Lise (pEL) pEL существенно отуглеводы в маннозу или маннозу в такие углеводы личается от CaMVCN тем, что она содержит варикак глюкоза и галактоза, фосфатазы, такие как ант 35S промотора с тандемной дупликацией 250маннозо-6-фосфатаза и маннозо-1-фосфатаза, и ти пар оснований вышележащей последовательпермеазы, которые участвуют в транспорте манности промотора Вариант 35S промотора обланозы, либо ее производного или предшественнидает транскрипционной активностью приблизика, в клетку тельно в десять раз более высокой, чем Реагентом, понижающим токсичность соедиприродный 35S промотор [6] pEL подвергают ренения для клеток, обычно является производное стрикции по Pstl и Bglll, удаляя тем самым NOS глюкозы, такое как метил-3-О-глюкоза или флотерминатор, а вместо него встраивают CaMV терридзин минатор (DW2t) И наконец, в Pstl сайт, располоНастоящее изобретение будет далее раскрыженный между усиленным 3e5S промотором и то на основании рассмотрения следующего текста CaMV терминатором, встраивают линкер (Pstlсовместно с прилагаемыми иллюстрациями, на BamHI-Smal-Sacl-Sa-ll-Sphl) Эту плазмиду имекоторых нуют pEPL (см Фиг 2) На Фиг 1 представлена схема получения Bcll/Hmdlll рестрикционного фрагмента, содержар(рЕРІ_-манноза) подвергают рестрикции по щего кодирующую область фосфоманнозоизомеHmdlll для выделения фрагмента, содержащего разы Е coli, полный усиленный 35S промотор, кодирующую область фосфоманнозоизомеразы Е coli и CaMV На Фиг 2 представлено строение плазмиды терминатор Выделенный фрагмент клонируют в EPL [1], Hmdlll сайт бинарного вектора pBKL4 (Фиг 4) ПоНа Фиг 3 представлено строение бинарной лученную плазмиду именуют р(ВКІІ-манноза) плазмиды pBKL4 [2], Hmdlll сайт в pBKL4 расположен между геном усНа Фиг 4 представлено строение плазмиды тойчивости к канамицину и геном рpBKL4, содержащей man А ген, встроенный между глюкуронидазы (GUS) (см ФигЗ) Химерный манGUS геном и NPTII геном нозный ген, ген устойчивости к канамицину (NPTII) Конструирование бинарной плазмиды p(BKL4и GUS ген имеют каждый собственный промотор и нанноза), содержащей кодирующие последоватерминатор На Фиг 4 представлена p(BKLтельности фосфонаннозоизомераэы Е coli манноза) конструкция, содержащая химерный ген Ген фосфоманнозоизомеразы Е coli (EC фосфоманнозоизомеразы, встроенный между 5 3 2 8) происходит из плазмиды pGS63 [3] (Фиг 1), GUS и NPTII генами плазмиды pBLK4 конструкции, полученной из pBR322, в которой область между уникальными Pstl и Hmdlll сайтами Конструкцию р(ВКІ_-манноза) выделяют из была замещена участком Е coli хромосомы, несуЕ coli и трансформимруют ею Agrobactenum tumeщим структурный ген (man А) фосфоманнозоизоfaciens штамм LBA4404, который содержит обезомеразы и фрагмент соседнего гена фумаразы (fum руженную хелперную плазмиду pAL4404 [7, 8], А) Поэтому в pGS63 утеряна часть гена рметодом замораживания-оттаивания [9] лактамазы и ее селекцию следует вести на тетраПоследовательность структурного гена (man, циклине А), кодирующего фосфоманнозоизомеразу, была опубликована [3] В сайт множественного клонирования pUC18 был лигирован Pstl/BamHI фрагмент (2466т п н), Аксеничные исходные культуры содержащий полный Pstl/Hmdlll хромосомный Культуры побегов Solanum tuberosum 'Saturna', фрагмент и участок pBR322 длиной 357т п н , что 'Bmtje' или 'Dianella' поддерживают, как описано привело к образованию pD018 (см Фиг 1) [10], на LS субстрате (см ниже) с добавлением 2иМ тиосульфата серебра, при температуре 25°С pD018 расщепляют рестриктазой Hmdlll, а по 14 13 57696 и циклической смене освещенности 16ч свет/ 8ч пустимо добавление также канамицин сульфата темнота Исходные культуры пересевали через 20 (50мг/л) и/или маннозы (0 - 20г/л) и/или сахарозы - 40 суток Листья отделяли от побегов и разреза(0 - 20г/л) Этот субстрат далее именуют как "субли их на узловые сегменты (приблизит 0,8см), страт для селекции/регенерации" Сегменты иносодержавшие по одному узлу кулируют на свежий субстрат с интервалами в две недели либо, как описано ниже Через 2 - 4 недеИнокуляция тканей картофеля ли из сегментов развиваются побеги, при этом Чашки для сокультивирования содержат LS образование новых побегов продолжается около 3 субстрат (сахароза ЗОг/л), агар (8г/л), 2,4- 4 месяцев дихлорфеноксиуксусная кислота (2,0мг/л) и трансзеатин (0,5кг/л) Укоренение регенерировавших побегов Регенерировавшие побеги переносят на субПобеги из примерно 40-суточных культур пострат для укоренения, представляющий собой LSбегов (высота приблизит 5 - 6см) разрезают на субстрат с добавлением карбенициллина межузловые сегменты (приблизит 0,8см) Сегмен(500 м г/л) ты помещают в жидкий LS-субстрат (LS-среда), содержащий Agrobactenum tumefaciens, трансПеренос регенерировавших побегов в почву формированную таким образом, что он содержит Заново укорененные регенерировавшие побебинарный вектор, несущий гены, которые преднаги (растения) (высота приблизит 2 - Зсм) пересазначены для введения в клетки картофеля К чисживают из субстрата для укоренения в почву и лу таких генов относятся, например, гены, кодипомещают в растильную камеру при 21 °С с циклирующие р-глюкуронидазу (GUS), NPTII ген, ческим освещением 16 часов свет/ 8 часов темкодирующий устойчивость к антибиотику канаминота, и 200 - 400иЕ/м2/сек После того, как растецину и/или гены, кодирующие белки, участвующие ния достаточно хорошо приживутся, их переносят в метаболизме маннозы, например, маннозо-6в теплицу, где их выращивают до тех пор, пока не фосфат-изомераза, маннозоэпимеразы, фосфоразовьются клубни, а надземная часть не увянет манномутазы и т д (см ниже) Контроль генетической подлинности трансформантов Agrobactenum культивируют в течение ночи в УМВ-субстрате (дикалий гидрофосфат (тригидрат) Трансгенные генотипы регенерировавшего (0,66г/л), сульфат магния (гептагидрат) (0,20г/л), побега контролируют хлорид натрия (0,10г/л), маннитол (10,0г/л) и (а) посредством проведения NPTII анализов, дрожжевой экстракт (0,40г/л)), содержащем необкак описано [11], ходимые соответствующие антибиотики (соответили ствующие гену устойчивости штамма Agrobacte(б) посредством проведения GUS анализа на num), до тех пор, пока оптическая плотность при ферменте, экспрессируемом совместно вводимым 660 нм (ОП-660) не достигнет значения приблизит геном р-глюкуронидазы, согласно [12], или 0,8 Затем суспензию центрифугируют, а клетки (в) посредством анализа экспрессии мРНК ресуспендируют в LS-среде так, чтобы значение введенного гена, кодирующего фермент, наприОП составило 0,5 мер, фосфоманнозоизомеразу, участвующего в метаболизме маннозы, либо посредством измереВышеуказанные межузловые сегменты затем ния активности фермента инкубируют в суспензии ресуспендированной Agrobactenum в течение 30 минут, а затем избыток ПРИМЕР 1 бактерии удаляют из сегментов путем промокания Регенерировавшие растения получают, как их стерильной фильтровальной бумагой описано выше, с тем отличием, что сегменты побегов не сокультивируют с бактерией, а послеСокультивирование сегментов побегов и дующую процедуру промывки не проводят КолиAgrobactenum чество регенерировавших побегов определяют на Сегменты побегов сокультивируют с бактери40-е сутки от начала эксперимента В Таблице 1 ей в течение 72 часов на фильтровальной бумаге представлены результаты ингибирования маннона LS-субстрате (как описано выше) в чашках зой регенерации побегов из сегментов ствола карПетри, покрытых белой бумажной тканью Этот тофеля, которые не были трансформированы субстрат будет именоваться далее как "субстрат Agrobactenum Из Таблицы 1 видно, что манноза для сокультивирования" Субстрат и сегменты эффективно ингибирует регенерацию таких побепокрывают стерильной фильтровальной бумагой, гов, а сахароза стимулирует такую регенерацию а чашки Петри выдерживают при 25°С и цикличеВообще говоря, маннозу нельзя применять в каческой смене освещения 16ч свет/ 8ч темнота стве источника углеводов для большинства видов Процедура промывки растений При добавлении к растениям маннозы Через 48 часов сокультивирования сегменты она метаболизируется и накапливается маннозопобегов переносят на LS-среду, содержащую 6-фосфат Маннозо-6-фосфат может быть пре800мг/л карбенициллина Эти пересаженные сегвращен во фруктозо-6-фосфат с помощью манноменты затем аккуратно покачивают для того, чтозо-6-фосфат-изомеразы, причем количество пребы смыть и разрушить прилипшие клетки Agrobacвращенного вещества зависит от активности tenum изомеразы Такой фруктозо-6-фосфат может быть Селекция трансформированной ткани утилизирован растениями, но в целом высокие Промытые таким образом сегменты переносят уровни маннозы (независимо оттого, имеется или затем на LS-субстрат (каки ранее), с тем отличинет другой источник углеводов) токсичны для расем, что концентрация транс-зеатина составляла тений Таким образом, как видно из Таблицы 1, 1мг/л, а в субстрат добавляют гиббереллиновую образование побегов полностью ингибируется, кислоту (0,1мг/л) и карбенициллин (800мг/л), до 16 15 57696 когда концентрация маннозы составляет 5 - Юг/л, Повторяют Пример 3, с тем отличием, что Agrobactenum трансформируют плазмидой p(BKLнезависимо от доступности сахарозы, даже если манноза), a GUS+ трансформанты отбирают на она присутствует в высоких концентрациях основании их способности расти на канамицине (50мг/мл) В этом случае меньшая, чем в Примере Таблица 1 3, часть отобранных побегов является GUS+ Ингибирование маннозой регенерации побегов из ПРИМЕР 5 нетрансформированных сегментов стебля карВыполняют стандартную методику листовых тофеля дисков для табака, как описано в Примере 13 [13], с тем отличием, что исключают инокуляцию Agrobactenum и стадию сокультивации В качестве Конц (г/л) Конц (г/л) Регенерировавшие цитокинина применяют бензиладенин (1 мг/л), а сахарозы маннозы побеги/эксплантат(*) содержание углеводов соответствует представ0 0 0 ленному ниже Количество регенерировавших из 0 5 0 каждого листового диска побегов регистрируют 0 10 0 спустя 21 сутки 0 20 0 Таблица 2 показывает, что D-ксилоза не инги10 0 50 бирует регенерацию побегов в присутствии саха10 5 3 розы и, кроме того, D-ксилоза не утилизируется в 10 10 0 качестве источника углеводов D-ксилулоза явля10 20 0 ется хорошим источником углеводов в ходе реге20 о 53 нерации побегов 20 5 0 20 10 0 Таблица 2 20 20 о ПРИМЕР 2 Регенерированные растения получают, как описано выше Aqrobactenum, с которой соинкубируют сегменты побегов, была трансформирована конструкцией р(ВКІ_-манноза), полученной, как описано выше, таким образом, что бактерия несет вектор, содержащий гены, кодирующие GUS и маннозо-6-фосфат-изомеразу Трансгенные побеги (GUS+) селектируют на основании их способности метаболизировать маннозу в присутствии реагента (метил-3-Оглюкоза), который понижает токсичность маннозы для побегов Побеги, являющиеся GUS+, селектируют на основании их способности расти в присутствии маннозы в концентрации около 5г/л Проводили также контрольные эксперименты, в которых Agro-bacterium, применявшаяся для трансформации сегментов побегов, несла вектор, сходный с р(ВКІ_-манноза) с тем отличием, что у него отсутствует ген, кодирующий маннозо-6фосфат-изомеразу В случае, когда регенерировавшие трансформированные побеги росли в присутствии 5г/л маннозы и 20г/л сахарозы, GUS+ трансформанты не были получены ПРИМЕРЗ Проводят следующий эксперимент, в котором Agrobactenum, которую применяют для трансформации сегментов побегов, несет вектор, сходный с р(ВКІ_-манноза) с тем отличием, что у него отсутствует ген, кодирующий маннозо-6-фосфатизомеразу Такой вектор содержит ген, кодирующий NPTII, который способен придавать трансформированным клеткам устойчивость к канамицину Соответственно этому, GUS+ трансформанты селектируют на основании их устойчивости к канамицину, присутствующему в концентрации 50мг/л В этой последней селекции GUS+ генотип имела меньшая по сравнению с Примером 2 часть отобранных клеток ПРИМЕР 4 Тест на способность D-ксилозы и D-ксилулозы выступать в качестве источников углеводов в ходе регенерации побегов из листовых дисков табака Количество побеКсилоза Сахароза Ксилулоза гов, регенерировавших из каждого г/л г/л г/л листового диска 0 0 0 0 10 0 0 0 10 10 0 43 0 10 о 23 0 0 10 41 0 10 10 11 7 Ксилоза может быть превращена в ксилулозу с помощью ксилозоизомеразы В соответствии с этим функциональный ген ксилозоизомеразы, а также структурный ген, находящиеся под контролем подходящих промоторов и терминаторов, внедряют в растения, или их части, или их клетки, и трансформированные растения (или их части, или их клетки) селектируют по их способности использовать ксилозу в качестве источника углевода ПРИМЕР 6 Эксплантаты получают и обрабатывают, как описано выше в пункте "Селекция трансформированной ткани", с тем отличием, что в субстрат для селекции/регенерации не был добавлен канамицин или карбенициллин, а растительная ткань не является трансформированной Таким образом, единственной стадией субкультивирования является перенос эксплантатов с субстрата для сокультивирования на субстрат для селекции/регенерации, обогащенный ксилозой в концентрациях, указанных ниже Количество регенерировавших побегов регистрируют спустя 12 недель 17 57696 Таблица 3 Способность D-ксилозы выступать в качестве источника углеводов в ходе регенерации побегов из сегментов картофельных стеблей Ксилоза г/л Сахароза г/л 0 5 10 20 0 5 10 20 0 0 0 0 10 10 10 10 Количество побегов, регенерировавших из каждого стеблевого сегмента 0 0 0 0 6 3 0 0 Из результатов, представленных в Таблице 3, видно, что D-ксилоза (по сравнению с D-маннозой) является слабым ингибитором регенерации побегов в присутствии сахарозы и, кроме того, Dксилоза не является источником углеводов в растениях, которые являются нетрансгенными по ферменту или белку, метаболизирующему ксилозу Более того, D-ксилоза (5г/л), добавленная в субстраты при отсутствии в них сахарозы, вызывала регенерацию 2,2 побегов на эксплантат через 9 недель ПРИМЕР 7 Повторяют Пример 5, с тем отличием, что субстрат для селекции/регенерации обогащен метил-3-О-глюкозой (МОГ) в концентрациях, приведенных в Таблице 4 Процент живых эксплантатов регистрировали через 8 недель Из результатов, представленных в Таблице 4, видно, что совместная обработка с МОГ ингибирует токсическое действие маннозы на чувствительные растительные ткани Так как манноза токсична в концентрациях, являющихся оптимальными для соединений, служащих источниками углеводов, то добавление МОГ создает возможность для обогащения субстрата углеводами в форме маннозы в оптимальных концентрациях Это делает возможным применение маннозы в качестве агента положительной селекции при отсутствии других источников углеводов 18 ПРИМЕР 8 Повторяют Пример 7, с тем отличием, что субстрат для регенерации/селекции содержит маннозу (15г/л), метил-3-О-глюкозу в концентрациях, приведенных в Таблице 5, и не содержит сахарозы Трансформированный растительный материал является трансгенным по гену маннозо6-фосфат-изомеразы Спустя 21 сутки отселектированные побеги собирают Все собранные побеги анализируют на предмет экспресии совместно введенного гена р-глюкуронидазы, а затем вычисляют общее количество (по двум сборам) трансгенных побегов, экспрессирующих рглюкуронидазу (GUS+), на эксплантаты, как долю побегов, экспрессирующих р-глюкуронидазу (GUS+) от общего количества отселектированных побегов (Таблица 5) Из результатов, представленных в Таблице 5, видно, что при совместном добавлении маннозы и метил-3-О-глюкозы селекция трансгенных побегов возможна даже при высоких концентрациях маннозы и отсутствии других источников углеводов Таблица 5 Влияние метил-3-О-глюкозы на селекцию трансгенных побегов на бессахарозных субстратах, содержащих маннозу Манноза (г/л) 15 МОГ (г/л) 0 GUS+ побе0 ги/эксплантат GUS+ побеги/отобр 0 побеги (%) 15 25 15 50 15 10 15 15 02 1 0 05 06 57 81 53 89 ПРИМЕР 9 Повторяют Пример 8, с тем отличием, что МОГ заменяют флоридзином Из Таблицы 6 видно, что при совместном добавлении маннозы и флоридзина возможна селекция 100% трансгенных побегов при высоких концентрациях маннозы и отсутствии других источников углеводов Это является примером того, как симбиотический рост на минимальной среде и продуцирование эксудатов может быть сведено к минимуму посредством добавления ингибитора углеводного транспорта Таблица 6 Таблица 4 Ингибирование токсичности маннозы посредством совместной обработки с метил-3-О-глюкозой (МОГ) Манноза (г/л) Сахароза (г/л) МОГ (г/л) 0 5 10 20 0 5 10 0 5 10 0 0 0 10 10 10 71 13 47 50 4 54 82 98 0 0 9 88 100 100 1100 100 1 100 100 100 4 5 141 1100 0 5г/л Флоридзин г/л Манноза 50 75 100 125 150 GUS+Побеги/Отсел Побеги +Сахароза 99 0% 88 0% 100 0% 100% 100% ПРИМЕРЮ GUS+Побеги/Экспл хСахаро- +Сахароз хСахароза а за 100 0% 78 5% 95% 12 05 05 0 03 0 03 0 08 05 05 00 00 20 19 57696 Из Таблицы 7 видно, что соединения, не явв субстрат для селекции/регенерации добавляют ляющиеся маннозой, могут быть применены в каманнозу и сахарозу, как указано в Таблице 9 Кочестве селектирующих агентов для трансгенной личество регенерировавших побегов регистрирурастительной ткани, которая несет, среди прочего ют через 11 недель В Таблице 9 представлено ген маннозо-6-фосфат-изомеразы из Е coh количество регенерировавших побегов на субстратах, содержащих метил-3-О-глюкозу, как процент от количества побегов, регенерировавших на Таблица 7 субстратах без маннозы и метил-3-О-глюкозы Количество регенерировавших побегов на эксплантат, отселектированных соединениями в Таблица 9 дополнение к маннозе Метил-3-О-глюкоза (г/л) Количество регенерировавших побегов на эксплантат Ман-6-ФДикий тип Манноза Сахароза Генотип изомераза г/л г/л Соединение М-6-ФДикий тип 25 50 25 50 изомераза 0 0 0 0 0 0 D-манноза 0 11 5 0 0 0 7 0 D-маннозамин 0 08 10 0 0 0 64 28 D-маннозо-б-фосфат 0 07 20 0 0 0 107 128 0 10 53 17 0 0 ПРИМЕР 11 Сахарную свеклу трансформируют так назы5 10 6 41 64 64 ваемым cot-pet (сем-гер) способом [14], при кото10 10 10 0 86 36 ром в качестве эксплантов используют семядоли, 20 10 0 0 200 86 включая черешки Проростки отделяют от семян, пророщенных и выращивавшихся в течение 4 - 7 Регенерация побегов на субстрате, содержанедель при 12°С в световом режиме 16ч день/8ч щем сахарозу (Юг/л) и не содержащем ни манноночь Семядоли отрезают на 2 - Змм ниже узла, зу, ни метил-3-О-глюкозу отделяют и культивируют либо в темноте, либо на Трансгенная ткань 1,4 побега/эксплантат свету в присутствии или отсутствии ксилозы Из Ткань дикого типа 1,7 побега/эксплантат Таблицы 8 видно, что ксилоза утилизируется саСледует иметь ввиду, что настоящее изобрехарной свеклой в качестве источника углеводов в тение не ограничивается приведенными выше присутствии света, но не в темноте, что свидеПримерами Например, тканеспецифическая экстельствует о том, что основанную на ксилозе попрессия гена, кодирующего фермент, участвуюложительную селекцию сахарной свеклы, трансщий в метаболизме маннозы или ксилозы, либо в генной, среди прочего, по гену ксилозо-изомеразы, метаболизме производного маннозы или ксилозы следует проводить в темноте или предшественника маннозы или ксилозы, может быть применена для контроля ростовой регуляции таких тканей при их культивировании на Таблица 8 субстрате, являющемся модулятором указанного фермента Более того, манноза или ксилоза Оценка действия D-ксилозы на сахарную свеклу в (включая их производные или предшественники) сочетании с сахарозой свете и без него могут быть использованы в качестве селективного гербицида для культур, обладающих селективным Результаты через 3 недели (свет) преимуществом, которые были трансформироваD% экспл вес Сахароза ны путем введения генов, кодирующих белки, учаксилоза с побе- (сухой) зеленые(%) (г/л) ствующие в метаболизме ксилозы или маннозы (г/л) гами (г) либо их предшественников или производных 0 10 98 7 41 100 0 10 13 0 64 60 Следует также иметь ввиду, что применение способа согласно изобретению может охватывать 10 0 90 1 53 90 а) эукариотические организмы, обладающие в 10 10 97 5 47 100 целом или в отдельных типах тканей/клеток пониРезультаты спустя 2 недели в темноте и 1 неделю женными уровнями фруктозо-6-фосфата либо его на свету производных, благодаря введению гена, кодиD% экспл вес зеленые рующего, например, фосфоманнозо-изомеразу, ксилоза Саха роза (г/л) с побе- (сухой) (%) б) эукариотические организмы, обладающие в (г/л) гами (г) целом или в отдельных типах тканей/клеток по0 10 50 1 38 97 вышенными уровнями маннозо-6-фосфата либо 0 01 0 0 36 47 его производных, благодаря введению гена, коди10 0 13 0 37 77 рующего, например, фосфоманнозо-изомеразу, 10 10 80 0 891 97 в) эукариотические организмы, обладающие во всех или в некоторых типах клеток повышенной ПРИМЕР 12 фосфоманнозо-изомеразной активностью благоПолучают эксплантаты, трансгенные, среди даря введению гена, кодирующего фосфоманнопрочего, по гену маннозо-6-фосфат-изомеразы, а 57696 22 21 зоизомеразу, в эти клетки (1983) ЛИТЕРАТУРА 8 Ooms et al , Plasmid 7, pp 15 - 29 (1982) 1 Pietrzak, М et al , Nucleic Acids Res 14, рр 9 Holsters etal , Мої Gen Genet 163, pp 181 5857-5868(1986) 187(1978) 2 Nielsen, К К et al , Мої Plant Microbe Inter10 Linsmaier et al , Phisiol Plant 18, pp 100act 6, pp 495-506(1993) 127(1965) 3 Miles, H et al , Gene 32, pp 41 - 48 (1984) 11 Radke et al , Theor Appl Genet 75, pp 685 4 Fromm et al , Proc Natl Acad Sci USA 82, p -694(1988) 5824(1985) 12 Hodal et al , Plant Sci 87, pp 1 1 5 - 1 2 2 5 Fromm et al , Nature 319, p 791 (1986) (1992) 6 Kay et al , cience 236, pp 1299 -1302 (1987) 13 PCT/92/00252 7 Hoekema et al , Nature 303, pp 1 7 9 - 1 8 0 14 Заявка PCT/DK 92/00108 f'O EcoBI •Пяазмида EPL DW2t: Pst-КрпГ фрагмент с CaMV терминатором, выделенный на ppW2 плазииды. Bdi/gsmHlTjepeB a p Bdl \ —•—.—. Mnrfii! П.1Ї bp Правая г р а н и ц а 0,30 Є 27 \ Левая г р а н и ц а 6,62 ю a- / р B/Bc Bel I легированный в Bam HI H sac I S Se Hind lit H II pst I Sa Ban HI/Bol I Sp Hinc II X ri/Зя! Mind iil'/sia I Sal I Spe X Sptl I Xbe I достроенный в h n d III сайте пым концом лигипованмвм с s Направление не ГЇ 3 23 Комп'ютерна верстка М Клюкш 57696 24 Підписано до друку 05 08 2003 Тираж 39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна