Спосіб одержання гомологічно рекомбінантної клітини (варіанти), плазміда для використання у способі (варіанти), штам гомологічно рекомбінантних клітин фібросаркоми людини (варіанти), спосіб одержання еритропоет

1 Способ получения гомологически рекомбинантной клетки с измененной экспрессией ге на-мишени, предусматривающий трансформиро вание in vitro исходной первичной вторичной или иммортализойанной клетки, геном которой со держит сайт-мишень, гомологичный направляю щей последовательности экзогенной трансфор мирующей конструкции ДНК, содержащей нап равляющую последовательность, регуляторную последовательность экзон, неспаренный донорный сайт сплайсинга у 3 -конца экэона, и поддер жание трансформированной клетки в условиях, подходящих для гомологической рекомбинации, отличающийся тем, что геном полученной в ре зультате гомологической рекомбинантной клетки содержит экзогенную регуляторную последователь ность экзогенный экзон, экзогенный донорный сайт сплайсинга и эндогенную последовательность генамишени кодирующую терапевтический белок, при чем транскрипция эндогенной последовательности гена происходит под контролем экзогенной регуляторной последовательности для продуцирования предшественника РНК, который, после сплайсирования для образования мРНК, содержит экзоген ный экзон сплайсированный ко второму эндогенно му экзону эндогенного гена 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что геном полученной клетки содержит экзогенную регуля торную последовательность, экзогенный экзон и экзогенный сайт сплайсинга, расположенные против хода инициирующего транскрипцию сайта гена-мишени 3 Способ получения гомологически рекомбинантной клетки с измененной экспрессией гена мишени, предусматривающий трансформирование in vitro исходной первичной, вторичной или иммортализованной клетки геном которой содержит сайт мишень, гомологичный направляющей последовательности экзогенной трансформирующей конструкции ДНК, содержащей направляющую последовательность регуляторную последовательность, экзон, донорный сайт сплайсинга у З'-конца экзонэ, интрон и акцепторный сайт сплайсинга, и поддержание трансформированной клетки в условиях, подходящих для гомологической рекомбинации, отличающийся тем, что геном полученной в результате гомологической рекомбинантной клетки содержит экзогенную регуляторную последовательность экзогенный экзон экзогенный донорный сайт сплайсинга акцепторный сайт сплайсинга и эндогенную последовательность гена-мишени, кодирующую терапевтический белок причем транскрипция эндогенной последовательности гена происходит под контролем экзогенной регуляторной последовательности для продуцирования предшественника РНК, который, после сплайсирования для образования мРНК, содержит экзогенный экзон, сплайсированный к эндогенному экзону эндогенного гена 4 Способ по пп 1 или 2 отличающийся тем, что экзогенный экэон содержит последовательность ДНК отличную от последовательности первого эндогенного экзона гена мишени 5 Способ по л 2. отличающийся тем, что экзо генный экзон соответствует первому эндогенно му экзону гена-мишени р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона (FSHJ5) 6 Способ по п 2, отличающийся тем, что генмишень кодирует копониестимупирующий фак тор гранулоцитов/макрофагов (GM-CSF) 7 Способ по п 2, отличающийся тем, что генмишень кодирует колониестимулируккций фак тор гранулоцитов (G-CSF) 8 Способ по п 2, отличающийся тем, что экзо генный экэон кодирует 50 аминокислот белка предшественника колониестимулирующего фак тора гранулоцитов/макрофагов (GM-CSF) 9 Способ по п 2, отличающийся тем, что экзо генный экзон кодирует 13 аминокислот сигналь ного пептида колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF) мО со О) со зг 34493 10 Способ по любому из пунктов 1, 2, отличаю щийся тем, что экзогенная регуляторная после довательность представляет собой регулятор ную последовательность, выбранную из группы, состоящей из регуляторной последовательности гена регуляторной последовательности гена аде новируса регуляторной последовательности ге на коллагена регуляторной последовательности гена актина, регуляторной последовательности гена редуктазы HMG-CoA, регуляторной после довательности гена EF-1a, регупяторной после довательности ("єна мышиного металлотионеина, регуляторной последовательности гена иммуног лобулина, регуляторной последовательности ге на вируса SV—40, регуляторной последователь ности гена цитоМегаловируса 11 Способ по любому из пунктов 1, 2, отличаю щийся тем, что терапевтический белок выби рают из группы, состоящей из а-интерферон а. колониестимулирующего фактора гранулоцитов/ макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующего фактора гранупоцитоа (G-CSF), р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона (FSHp), эритропоэтина, гормона роста человека 12 Способ по г! 3, отличающийся тем, что экзо генная регуляторная последовательность, экзо генный донорный сайт сплайсинга, экзогенный интрон и экзогенный акцепторный сайт сплайсин га расположены против хода эндогенной регуля торной последовательности гена-мишени 13. Способ по п 3, отличающийся тем, что трансформирующая конструкция дополнительно содержит вторую направляющую последовательность 14 Способ по л 11, отличающийся тем, что вто рая направляющая последовательность гомоло гична последовательности против хода эндоген ной регуляторной последовательности гена-ми шени 15 Способ по п 3, отличающийся тем, что экзо генная регуляторная последовательность допол нительно содержит вторую регуляторную после довательность 16 Способ по п 3, отличающийся тем, что трансформирующая конструкция дополнительно содержит маркерный ген 17 Способ по л 16, отличающийся тем, что маркерный ген является амплифицируемым 18 Способ поп 15 отличающийся тем, что амплифицируемый маркерный ген выбирают из груп пы, содержащей гены дигидрофтолат редуктаэы, аденозин деаминазы, трехфункционального фер мента карбамоилфосфат-синтаз-аспартат-транскарбамилаз-дегидрооротазы (CAD) 19 Способ по п 3, отличающийся тем, что экзон содержит сайт САР 20 Способ по п 19, отличающийся тем, что экзон содержит нуклеотидную последователь ность ATG 21 Способ по п 3, отличающийся тем, что экзо генная регуляторная последовательность предс тавляет собой промотор, энхансер, район при соединения матрикса или сайт связывания фак тора транскрипции 22 Способ по п 3, отличающийся тем, что нап равляющая последовательность гомолопічна последовательности протир хода транскрипции эндогенной регуляторной последовательности эндогенного гена-мишени 23 Способ по п 3, отличающийся тем, что генмишень кодирует а-интерферон 24 Способ по любому из пунктов 1,2,3, отличаю щийся тем, что исходные клетки выбраны из группы состоящей из клеток фибросаркомы НТ1080, клеток HeLa и производных клеток HeLa, клеток рака молочной железы MCF-7, клеток лейкоза К- 562, клеток карциномы KB, клеток рака яичника 2780AD, клеток Raji, клеток Jurkat, клеток Namarwa, клеток HL-60, клеток Daudi, клеток RPM1 8226, клеток U-937, клеток меланомы Боуеса, клеток сублинии 2R4 W1-38VA13 и кле ток MOLT^t 25 Способ по п 1, отличающийся тем, что в ка честве экзогенной трансформирующей конструк ции ДНК используют плазмиду pREPO18. содер жащую единицу транскрипции дигидрофолатредуктазы (dhfr), геномные последовательности против хода кодирующей последовательности человеческого эритропоэтинз, ген устойчивости к ампициллину (amp), экзон 1 гормона роста чело века (hGH), неспаренный донорный сайт сплай синга, промотор CMV, tk промотор гена неомицинтрансферазы (пео) и ген неомицинтрансферазы (пео) 26 Способ по п 1, отличающийся тем. что в ка честве экзогенной трансформирующей конструк ции ДНК используют плазмиду pREPO15, содер жащую ген устойчивости к ампициллину (amp), ген неомицинтрансферазы (пео), промотор CMV, сайт САР, экзон 1 гормона роста человека (hGH), донорный сайт сплайсинга, геномные последова тельности против хода кодирующей последова тельности человеческого эритропоэтина 27 Ппазмида pREPO10 для использования в способе по п 1, содержащая геномную последо вательность человека против хода кодирующей последовательности человеческого эритропоэти на, промотор мышиного металлотионеина, 5' нетранслируемую последовательность гормона рос та человека (hGH), экзон 1 гормона роста чело века (hGH), донорный сайт сплайсинга, и после довательность интрона 1 эритропоэтина челове ка 28 Плазмида pREPO11, для использования в спо собе по п 1, содержащая геномную последователь ность человека от нуклеотида -1 до примерно нуклеотида - 6620 по отношению к кодирующей после довательности человеческого эритропоэтина, про мотор мышиного металлотионеина, 5' нетранслируемую последовательность гормона роста челове ка (hGH), экзон 1 гена гормона роста человека (hGH), и первые 10 нуклеотидов интрона 1 гена че ловеческого эритропоэтина. 29 Ппазмида pREP012 для использования в способе по г» 1, содержащая геномную последо вательность человека от примерно нуклеотида -62- до примерно нуклеотида -6620 относительно кодирующей последовательности человеческого эритропоэтина, ген неомицинтрансферазы (пео), промотор мышиного металлотионеина, 5' нетранслируемую последовательность гормона рос та человека (hGH), экзон 1 гормона роста чело века (hGH), и первые 10 нуклеотидов интрона 1 гена человеческого эритропоэтина. 34493 30 Штамм HTREPO-52 гомологически рекомбинзитных клеток фибросаркомы человека полу ченный путем трансформации клеток НТ1О8О (АТСС CCL 121) плаэмидой pREPO-4, для полу чения эритропоэтина человека 31 Штамм НТ165 18572-10-ЕРО гомологически рекомбинантных клеток фибросаркомы человека, полученный путем трансформации клеток НТ1080 (АТСС CCL 121) плаэмидой pREPO-13, для получения эритропоэтина человека 32 Способ по п 1, отличающийся тем, что тера певтический белок представляет собой эритропоэтин Существующие подходы к лечению заболевания путем введения терапевтических белков включают в себя получение in vitro терапевтических белков для общепринятой фармацевтической доставки {например, посредством внутривенной, подкожной или внутримышечной инъекции) и, более недавно, генной терапии Белки терапевтического значения в общем получают путем введения экзогенной ДНК, кодирующей белок, представляющий интерес для терапии, в подходящие клетки Например, экзогенную ДНК, кодирующую желаемый терапевтический белок, вводят в клетки такие как иммортализованные {"бессмертные") клетки, в векторе, таком как плазмида, из которого экспрессируется кодируемый белок Далее, было сделано предположение, что эндогенные клеточные гены и их экспрессия могут быть модифицированы генным нацеливанием См, например, U S Patent № 5272 071, WO 91/06666, WO 91/06667 и WO 90/11354 Доступные в настоящее время подходы к генной терапии используют инфекционные векторы, такие как ретровирусные векторы, содержащие генетический материал, который должен быть экспрессирован Такие подходы имеют ограничения, такие как возможность генерирования компетентного в отношении репликации вируса во время получения вектора, рекомбинация между геномом терапевтического вируса и эндогенным ретровирусным геномом, потенциально генерирующая инфекционные агенты с новой клеточной специфичностью, диапазонами хозяев или увеличенными вирулентностью и цитотоксичностью, независимая интеграция в большие количества клеток, увеличивающая риск онкогенного инсерционного события, лимитированная клонирующая емкость в ретровирусе (которая ограничивает терапевтическую применимость) и непродолжительная экспрессия in vtvo целевого продукта Ценным был бы лучший подход для обеспечения генных продуктов, в частности, подход, который не имел бы ограничений и риска, связанных с доступными в настоящее время способами Краткое изложение существа изобретения Данное изобретение касается усовершенствованных способов как получения in vitro терапевтических белков, так и получения и дос 33 Способ получения эритропоэтина человека, предусматривающий культивирование гомологи чески рекомбинантных клеток э условиях, подхо дящих для экспрессии эритропоэтина, отличаю щийся тем что в качестве гомологически реком бинантных клеток используют штамм клеток фиб росаркомы по п 30 34 Способ получений эритропоэтина человека, предусматривающий культивирование гомологи чески рекомбинантных клеток в условиях, подхо дящих для экспрессии эритропоэтина отличаю щийся тем, что в качестве гомологически рекомбинамтных клеток используют штамм клеток фиб росаркомы по п 31 тавки терапевтических белков посредством генной терапии В данном способе экспрессию жепаемого гена мишени в клетке (т е желаемого эндогенного клеточного гена) изменяют введением посредством гомологической рекомбинации в заранее выбранный сайт клеточного генома ДНК, которая включает в себя по меньшей мере регуляторную последовательность, экзон и донорный сайт сплайсинга Эти компоненты вводят в хромосомную (геномную) ДНК таким образом, что этом приводит в сущности к получению новой транскрипционной единицы (в которой регуляторная последовательность, экзон и донорный сайт сплайсинга, присутствующие в конструкции ДИК, оперативно соединены с эндогенным геном) В результате введения этих компонентов в хромосомную ДНК изменяется экспрессия желаемого эндогенного гена Измененная экспрессия гена, в применении этого выражения здесь, включает в себя активацию (или индукцию экспрессии) гена, который в норме является молчащим (неэкспрессируемым) в полученной клетке, увеличенную экспрессию гена, который не экспрессируется при физиологически значимых уровнях, в полученной клетке изменение характера регуляции или индукции, который отличается от имеющего место в этой клетке и снижение (в том числе исключение) экспрессии гена экспрессируемого в этой клетке Далее данное изобретение касается конструкций ДНК, применимых в способе изменения экспрессии целевого гена Эти конструкции ДНК содержат(a) направляющую последовательность, (b) регуляторную последовательность, (c) экзон и (d) неспаренный донорный сайт сплайсинга Направляющая последовательность в конструкции ДНК направляет интеграцию эле* ментов (а) - (сі) в ген-мишень в клетке, так что элементы (Ь) и (d) оперативно связываются с последоватепьиостями эндогенного гена-мишени В другом варианте конструкции ДНК включают в себя (a) направляющую последовательность; (b) регуляторную последовательность; (c) экзон, 34493 (d) донорный сайт сплайсинга, (e) интрон и (f) акцепторный сайт сплайсинга, причем направляющая последовательность направляет интеграцию элементов (а) - (0 таким образом, что элементы (b) - (f) оперативно связываются с эндогенным геном Направляющая последова тельность гомологична заранее выбранному сай ту в клеточной хромосомной ДНК, с которым должна иметь место гомологичная рекомбина ция В этой конструкции экзон обычно находится в З'-положении от регуляторной последователь ности, а донорный сайт сплайсинга находится 3'от зкзогена Дальнейшее описание служит для иллюстрации двух вариантов данного изобретения, в которых последовательности, расположенные против хода транскрипции от гена эритропоэтина человека h(EPO), изменяют для возможности экспрессии hEPO в первичных, вторичных или имморталиэованных клетках, которые не экспрессируют ЕРО в детектируемых количествах в их нетрансфицированном состоянии В варианте 1 направляющая конструкция содержит две направляющие последовательности Первая направляющая последовательность гомологична последовательностям 5' второй направляющей последовательности и обе последовательности находятся против хода транскрипции от кодирующего hEPO района Направляющая конструкция также содержит регупяторный район (промотор тМТ-1), экзон (экзон 1 гормона роста человека (hGH) и неспаренный донорный сайт сплайсинга Продукт гомологичной рекомбинации с этой направляющей конструкцией показан на фиг 1 В варианте 2 направляющая конструкция также содержит две направляющие поспедовательности Первая направляющая последовательность гомологична последовательностям внутри регуляторного района эндогенного hEPO, а вторая направляющая последовательность гомологична интрону 1 hEPO Эта направляющая конструкция содержит также регуляторный район (промотор тМТ-1), экэон 1 hGH) и неспаренный донорный сайт сплайсинга Продукт гомологичной рекомбинации с этой направляющей конструкцией показан на фиг 2 В этих двух вариантах продукты событий нацеливания представляют собой химерные транскрипционные единицы, которые генерируют зрелую мРНК, в которой первый экзон гена гормона роста человека (hGH) расположен против хода транскрипции от экзонов 2-5 hEPO Продукт транскрипции, сплайсинга и трансляции является белком, в котором аминокислотные остатки 1-4 сигнального пептида hEPO заменены аминокислотными остатками 1-3 hGH Эти два варианта отличаются как по относительным положениям регуляторных последовательностей направляющей конструкции, которые вводятся, так и по специфическому характеру сплайсинга, который должен иметь место для получения конечного процессированного транскрипта Далее это изобретение касается способа получения белка in vitro или in vivo, посредством введения описанной выше конструкции в хромосомную ДНК клетки хозяина гомологичной реком бинацией для получения гомологично рекомбинэнтной клетки Гомологично рекомбинантная клетка поддерживается затем при условиях, позволяющих транскрипцию, трансляцию и секрецию, что приводит к продуцированию целевого белка Данное изобретение касается трансфицированных клеток, таких как трансфицированные первичные или вторичные клетки (те неиммортализовэнные клетки) и трансфицированные иммортализованные клетки, применимые для получения белков, в частности, терапевтических белков, способов получения таких клеток, способов использования этих клеток для получения белков in vitro и способов генной терапии. Клетки данного изобретения являются клетками происходящими из позвоночных, в частности, из млекопитающих, и, более конкретно, из человека Клетки, полученные по способу данного изобретения, содержат ДНК, кодирующую терапевтический продукт, ДНК, которая сама является терапевтическим продуктом, и/или ДНК, которая заставляет трансфицированные клетки экспрессировать ген на более высоком уровне или с характером регуляции или индукции, который отличается от имеющего место в соответствующей нетрансфицированной клетке Данное изобретение касается также способов, при помощи которых клетки, такие как первичные, вторичные и иммортализованные клетки, трансфицируют для включения экзогенного генетического материала, способов получения клональных клеточных штаммов или гетерогенных клеточных штаммов и способов иммунизации животных или получения антител в иммунизированных животных с использованием трансфицированных первичных, вторичных или иымортализованных клеток Данное изобретение касается, в частности, способа генного нацеливания или гомологической рекомбинации в эукариотических клетках, таких как клетки, происходящие из грибов, растения или животного, например, позвоночного животного, в частности, млекопитающего, и, даже более конкретно, из человека Т е оно касается способа введения ДНК в первичные, вторичные или имморталиэованные клетки, происходящие из позвоночных, посредством гомологичной рекомбинации, так, что эту ДНК вводят в геномную ДНК первичных, вторичных или иммортализованных клеток в заранее выбранном сайте Испопьзуемые направляющие поспедовательности выбирают относительно сайта, в который должна быть вставлена ДНК в направляющей конструкции ДНК. Далее данное изобретение касается гомологично рекомбинантных первичных, вторичных или иммортализованных клеток, называемых гомологично рекомбинантными (HR) первичными, вторичными или иммортализованными клетками, полученных данным способом, и применений этих HR первичных, вторичных или иммортализованных клеток В одном варианте данного изобретения, в котором изменяют экспрессию гена, этот ген активируется То-естъ. ген, присутствующий в первичных, вторичных или иммортализованных клетках, происходящих из позвоночных, который 34493 обычно (в норме) не экспрессируется в этих клетках, активируется и в результате экспрессируется кодируемый им белок В этом варианте гомологичную рекомбинацию используют для вытеснения, выведения из строя или разрушения регуляторного района, обычно ассоциированного с этим геном а клетках, путем введения регуляторной последовательности, которая заставляет ген экспрессироваться при более высоких уровнях, чем уровни в соответствующей нетрансфицированной клетке В одном варианте активированный ген может быть амппифицирован включением эмплифицируемого селективного маркерного гена, который обладает таким свойством что клетки, содержащие змплифицированные копии селектируемого маркерного гена, могут отбираться путем культивирования их в присутствии подходящего селектирующего агента Активированный эндогенный ген амплифицируется в тандеме с амплифицируемым селективным маркерным геном Клетки, содержащие много копий активированного эндогенного гена, применимы для получения белкэ in vrtro и генной терапии Генное, нацеливание и амплификация, описанные в данном изобретении, применимы, в частности, для активации экспрессии генов, которые образуют транскрипционные единицы, которые достаточно велики, так что их трудно выделять и экслрессировать, ипи для активации генов, для которых недоступен ипи не был клонирован полный кодирующий район белка В дальнейшем варианте экспрессия гена, который экспрессируется в клетке как таковой, усиливается или обнаруживает характер регуляции ипи индукции, который отличается от наблюдаемого в соответствующей нетрансфицированной клетке В другом варианте экспрессию гена, который экспрессируется в клетке как таковой, уменьшают (т е ослабляют или исключают) Данное изобретение описывает также способ, при помощи которого гомологичную рекомбинацию используют для превращения гена в кДНКкопию, не содержащую интронов, для переноса в дрожжевые или бактериальные клетки для получения белка in vitro Трансфицированные клетки данного изобретения применимы в ряде приложений в человеке и животных В одном варианте эти клетки можно имплантировать в человека или в животное для доставки белка человеку или животному Например hGH, hEPO, инсулинотропин человека и другие белки могут доставляться системно или локально э больных для терапевтических целей Кроме того, могут быть получены трансфицированные клетки, не происходящие из человека, продуцирующие гормон роста, эритропоэтин, инсулинотропин и другие белки, имеющие иное происхождение (не иэ человека) Для удерживания клеток в фиксированном положении in .vivo или для защиты и изолирования этих клеток от иммунной системы хозяина могут быть использованы барьерные устройства Барьерные устройства, в частности, применимы для имплантации трансфицированных иммортализованных клеток, трансфицированных ксеногенных клеток или трансфицированных аллоген ных клеток ДЛИ лечения патологических состояний человека или животного или для сельскохозяйственных применений (например, применения бычьего гормона роста для производства молочных продуктов) Барьерные устройства позволяют также проводить кратковременную (т е временную) терапию путем обеспечения легкого доступа к клетъам для удаления в случае прекращения режима печений по той или иной причине Кроме того, трансфицированные ксеногенные и аллогенные кпетки можно использовать в отсутствие барьерных устройств для кратковременной генной терапии, так чтобы продукт гена продуцируемый клетками, доставлялся in vivo до отторжения этих клеток иммунной системой хозяина Трансфицированные клетки данного изобретения применимы также для индуцирования антител или для иммунизации людей и животных против патогенных агентов Имплантированные трансфицированные клетки можно использовать для доставки иммунизирующих антигенов, что приводит к стимуляции клеточного и гуморального иммунного ответа хозяина Эти иммунные ответные реакции могут предназначаться для защиты хозяина от инфекционных агентов в будущем (т е для вакцинации) для стимуляции и повышения способности противостояния инфекции в будущем или для продуцирования антител, направленных против антигена продуцируемого in vivo трансфицированными клетками что может быть полезным для терапевтических или диагностических целей Удаляемые барьерные приспособления, содержащие эти клетки, можно использовать для обеспечения простого средства прекращения экспонирования с антигеном Альтернативно, использование клеток, которые будут к конце концов отторгнуты (ксеногенных или аллогенных трансфицированных клеток), можно применять для ограничения контакта с антигеном, поскольку продуцирование антигена будет прекращаться при отторжении этих клеток Способы данного изобретения можно использовать для получения первичных, вторичных или иммортализованных клеток продуцирующих широкое разнообразие терапевтически применимых продуктов, в том числе (но не только) гормонов, цитокинов, антигенов антител, ферментов, свертывающих кровь факторов, транспортных белков рецепторов регуляторных белков, структурных белкое факторов транскрипции рибозимов или антисмысловых РНК Дополнительно, способы данного изобретения можно использовать для получения клеток, которые продуцируют не встречающиеся в природе рибозимы белки или нуклеиновые кислоты, которые применимы для получения tn vitro, терапевтического продукта или для генной терапии Фиг 1 является схематической диаграммой стратегии транскрипционной активации гена hEPO, жирные линии промотор мышиного металлотионеина-1; заштрихованный блок 5'-нетранслируемый район hGH, сплошной блок, экэон 1 hGH, полосатый блок, донорная последовательность 10 п н сплайсинга из интрона 1 hEPO, перекрестно заштрихованный блок, 5'-нетранслируемый район hEPO, многочисленные неэаштри 34493 ховамные (открытые) блоки, кодирующие hEPO последовательности, блок с диагональными полосами, З'-нетранслируемые последовательности hEPO; Н111, сайт Hind 111 Фиг 2 является схемой стратегии транскрипционной активации гена hEPO; жирные линии, промотор мышиного металлотионеина-1; заштрихованный блок, 5"-нетранслируемый район hGH; сплошной блок, экзон 1 hGH, многочисленные незаштрихованные блоки, кодирующие hEPO последовательности; блок с диагональными полосами, З'-нетранслируемые последовательности hEPO; H111, Hind 111 сайт Фиг 3 является схематическим представлением плазмиды pXGH5. которая включает в себя ген hGH под контролем мышиного промотора металпотионеина Фиг 4 является схематическим представлением плазмиды рЕЗпеоЕРО. Указаны положения гена эритропоэтина человека и гена неомицинфосфотрансферазы (пео) и генов устойчивости к ампициллину (amp) Стрелки указывают направления транскрипции различных генов, рт МТ1 обозначает промотор мышиного металлотионеина (регулирующий экспрессию hEPO) и рТК обозначает промотор тимидинканззы вируса простого герпеса (регулирующий экспрессию пео). Покрытие точками районы карты отмечают ' положения последовательностей, происходящих из локуса гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансферазы (HPRT) человека. Указаны относительные положения сайтов узнавания рестриктаз. Фиг,5 является схематическим изображением ппазмиды рс DNEO, которая включает в себя кодирующий пео район (фрагмент ВатН1Bgl11) из плаэмиды pSV2neo, вставпенный в сайт ВатН1 плазмиды pcD; поспедовательносги Amp-R и pBR3220ri из pBR322, и полиА, границы сплайсинга 16S и районы раннего промотора из SV40. Фиг. 6 является схематическим изображением плаэмиды pREPO4. Фиг 7 является графическим изображением экспрессии эритропоэтина в клеточной линии-мишени человека, подвергнутой ступенчатому отбору в 0,02, 0,05, 0,1, 0,2 и 0,4 мкМ метотрексате. Фиг.8 является схематическим изображением плазмиды pREPO15. Фрагменты, полученные из геномных последовательностей hEPO, показаны заштрихованными блоками Район между ВатН1 (3537) и Bgl11 (Hind 111 соответствует последовательности при положениях 1-4008 во вводе HUMERPALU Genbank Район между Bgl11' (Hind 111 (11463) соответствует последовательностям ДНК в положениях 4009-5169 во вводе HUMERPALU Genbank Район между Hind 111' (11463) и Xhol (624) содержит последовательность, соответствующую положениям 7-624 Genbank ввода HUMERPA. Последовательности промотора CMV показаны в виде открытого блока и содержат последовательность из иуклеотидов 546-2105 последовательности HSSMIEP Genbank Ген пео показан в виде открытого блока стрелкой Промотор тимидинкиназы 595 5' GGGGTCCCTCAGCGAC 603 пн (SEQ ID №4) Эти три фрагмента, существенно перекрываются и взаимозаменяемы для поставленных целей Фрагмент 609 л н, простирающийся от 623 до -14 по отношению к сайту инициации трансляции (положения нуклеотидов HUMERPA 2-610) лигируют на обоих концах с линкерами С1а1 Полученный фрагмент с линкерами Clai расщепляют С1а1 и встраивают в сайт Cla4 pBluescnpt 11SK/+ (Stratagene) с такой ориентацией, что положение нуклеотида HUMERPA 610 находится рядом с сайтом Sad в плазмидном полилинкере Эта плазмида, рб'ЕРО, может быть расщеплена, отдельно, при уникальных сайтах Fsp1 или Sfi1 в распопоженном против хода транскрипции фрагменте ЕРО человека (положения нуклеотидов HUMERPA 150 и 405, соответственно) и нитрована с промотором мышиного металлотионеина В типичном случае, этот фрагмент EcoR1-Bgl11 1,8 т п н из гена тМТ-1 (не содержащий кодирующих последовательностей mMT, Hamer, D Н и Walling M J Mo». Appl Gen. 1: 273-288 (1982), этот фрагмент можно также выделить известными способами из мышиной геномной ДНК с применением праймеров ПЦР, сконструированных на основании анализа последовательностей mMT, доступных т Gertbank, т в. 590 п й. MUS-MT1, MUSMT1P, MUSMTIPRM] делают фрагментом с затупленными концами при помощи известных способов и лигируют с расщепленной Sfi1 (также с затупленными концами) или расщепленной Esp1 плаэмидой р5'ЕРО Анализируют ориентацию полученных клонов и те клоны, в которых первый сайт Bgl11 mMT является проксимальным к сайту Sail в плазмидном полилинкере, испопьзуют для нацеливания первичных и вторичных фибробпастов человека Эта ориентация направляет транскрипцию mMT a направлении попожения нуклеотида HUMERPA 610 в конечной конструкции. Попученные ппаэмиды обозначены p5'EPO-mMTF и p5'EPO-mMTS для встраивания mMT а сайты Fsp1 и Sfi1, соответственно. Дополнительные последовательности против хода транскрипции применимы в случаях, когда желательно модифицировать, делетировать и/ипи заменить негативные регуляторные элементы или энхансеры, которые лежат против хода транскрипции от исходной последовательности-мишени В случае ЕРО, может быть делетирован негативный регуляторный элемент, который ингибирует экспрессию ЁРО во внепеченочных и внепочечных тканях [Semenza, V L, et. al, 21 34493 Soil высвобождает направляющий фрагмент 2.4 т.п.н., состоящий из промотора гпМТ 1,8 т.п.н., фланкированного на 5'- и З'-сторонах последовательностями из 405 п.н. и 204 п.н., соответственно, ДНК для направления этой конструкции к регуляторному району гена ЕРО человека. Эту ДНК или направляющий фрагмент 2,4 т.п.н. очищают фенольнои экстракцией и осаждением этанолом и трансфицируют в первичные или вторичные фибробпасты человека при условиях, описанных в примере 1с Трансфицированные клетки высевают на чашки с диаметром 150 мм в питательную среду для фибробластов человека. Через 48 часов эти клетки высевают в 24-луночные чашки при плотности 10000 клеток/см2 [приблизительно 20000 клеток на лунку; если нацеливания происходит при скорости 1 событие нацеливания на 10е клонируемых клеток (пример 1 с), то приблизительно 50 лунок нужно будет проанализировать для выделения одной экспрессирующей колонии). Клетки, в которых трансфицирующая ДНК попала в гомологичный район против хода транскрипции гена ЕРО человека, будут экспрессировать hEPO под контролем промотора тМТ. После 10 дней луночные супернатанты тестируют на экспрессию ЕРО с использованием коммерчески доступного набора для иммунотеста (Amgen). Клоны из лунок, обнаруживающих синтез hEPO, выделяют известными способами, обычно тестированием фракций гетерогенных популяций клеток, распределенных по отдельным лункам; тестированием фракций позитивных лунок с повторением, если это необходимо, и выделением в конце концов колонии со встроенной ДНК путем скрининга 96-луночных микротитрационных планшетов, засеянных при концентрации одна клетка на лунку. ДНК из лиэатов всего планшета может быть также под вертута анализу с применением ПЦР на амплификацию фрагмента и применением тМТ-специфического праймера вместе с праймером, лежащим против хода транскрипции от положения нуклеотида HUMERPA 1. Эта пара праймеров должна амплифицировать фрагмент ДНК с размером, точно предсказанным на основе последовательности ДНК. Позитивные чашки трипсинизируют и пересевают при последовательно более низких разведениях и получение ДНК и стадии ПЦР повторяют для выделения получивших нацеленные конструкции ДНК клеток. Схемы нацеливания, описанные здесь, можно также испопьзовать для активации экспрессии hGH в иммортализованных клетках человека (например, клетках НТ1080 (АТСС CCL 121), клетках HeLa и производных клеток HeLa (АТСС CCL 2,2.1 и 2.2), клетках рака молочной железы MCF-7 (АТСС НВТ 22), клетках лейкоза К-562 (АТСС CCL 232), клетках карциномы (АТСС CCL 17), клетках рака яичника 2780AD (Van Der Blick, A.M., et at., Cancer Res., 48: 5927-5932 (1988), клетках Raji (ATCC CCL 86), клетках Jurkat (ATCC T1B 152), клетках Namalwa (ATCC CRL 1432), клетках HL-60 (ATCC CCL 240), клетках Daudi (ATCC CCL 213), клетках RPM1 8226 (ATCC CCL 155), клетках U-937 (ATCC CRL 1593), клетках меланомы Боуеса (ATCC CRL 9607), подлинии 2R4 клеток W1-38VA13 (ATCC CLL 75.1), клетках Мої. Cell Biol. 10; 930-938 (1990)] Получен ряд делеций во фрагменте 6 т.п.и. Делетированные районы могут быть заменены энхансером с широкой активностью (спектром) клеток-хозяев [например, энхансером из Cytomegalavirus (CMV)]. Ориентация фрагмента 5'ЕРО 609 т.п.н. в векторе pBluescript 11 SK/+ была выбрана, т.к. перед последовательностями HUMERPA на их 5'конце находится сайт BamHI (дистальный) и сайт Hind 111 (проксимальный) Таким образом, фрагментб т.пн. BamH1-Hind 111, обычно лежащий против хода транскрипции от фрагмента 609 п.н. ISemenza Y.L., et а!., Мої. Cell. Biol. 10:930938 (1990)], может быть выделен из геномной ДНК известными способами. Например, бактериофаговую, космидную или дрожжевую искусственную хромосомную библиотеку можно скринировать амплифицированным при помощи ПЦР фрагментом 609 п.н в качестве зонда. Желаемый клон будет иметь фрагмент в т.п.н. ВатН1~ Hind 111 и его идентичность может быть подтверждена сравнением его рестрикционной карты с рестрикционной картой вокруг гена ЕРО человека, определенной известными способами. Альтернативно, конструирование рестрикционной карты генома человека против хода транскрипции от гена ЕРО с использованием фрагмента 609 п.н в качестве зонда может идентифицировать ферменты, которые образуют фрагмент, начинающийся между координатами HUMERPA 2 и 609 и простирающийся за сайт BamHI против хода транскрипции, этот фрагмент можно выделить при помощи гель-электрофореза из подходящего продукта расщепления геномной ДНК человека и лигировать в бактериальный или дрожжевой клонирующий вектор Точный клон будет гибридизоваться с 609 п.н. 5'ЕРО-зондом и содержать фрагмент 6 т.п н BamH1-Hind 111. Выделенный фрагмент 6 т.п н встраивают в правильной ориентации в р5"ЕР0, рб'ЕРО-mMTF или р5"ЕРОmMTS (так чтобы сайт Hind 111 находился рядом с нуклеотидным положением HUMERPA 2). Дополнительные последовательности против хода транскрипции могут быть выделены известными способами, использующими способы прогулки по хромосоме, или выделением дрожжевых искусственных хромосом, гибридизующихся с зондом 609 п.н. 5'ЕРО. Стратегии клонирования, описанные выше, позволяют модифицировать in vitro последовательности против хода транскрипции ЕРО для последующей направленной трансфекции первичных, вторичных или иммортализованных фибробластов человека Эти стратегии описывают простые встраивания промотора гпМТ, а также делецию негативного регуляторного района и делецию негативного регуляторного района и замену его энхансером с широкой активностью клеток-хозяев. д, Активация гена£РО человека и выделение получивших нацеленные конструкции ДНК первичных, вторичных и имморталиэованных фибробластов человека при помощи скрининга. Для нацеливания плазмиды разрезают рестриктазами для освобождения вставки (инсерции) от плаэмидного каркаса. В случае плазмиды p5'EPO-mMTS, расщепление Hind 111 и 22 34493 MOLT-4 (ATCC CRL 1582) и разнообразных гетерогибридомных клетках) для целей получения hGH для общепринятой фармацевтической доставки. п. Активация гена ЕРО человека и выделение получивших нацеленные конструкции ДНК первичных, вторичных и им мортализов энных фибробластов человека при помощи системы позитивного или комбинированного позитивного/негативного отбора. Стратегия конструирования плазмид p5'EPO-mMTF, p5'EPO-mMTS и их производных с дополнительным фрагментом BamHi-Hind 111 6 т.п.н. против хода транскрипции может иметь дополнительную стадию встраивания гена пео рядом с промотором тМТ. Кроме того, негативный селектируемый маркер, например, gpl [из pMSG (Pharmaaa) или другого подходящего источника] может быть встроен рядом с HUMERPA последовательностями в pBluescripi 11 SK/+no ли линкере. В первом случае 6418'-колонии выделяют и скрйнируют с применением ПЦР-амплификации или рестрикционного и гибридизационного анализа по Саузерну ДНК, полученной из пулов колоний, для идентификации получивших нацеленные конструкции колоний, В последнем случае G418'колонии помещают в среду, содержащую 6-тиоксантин, для отбора против интеграции гена gpt (негативный отбор) (Besnard, С, et ai.. Мої. Cell Bfol. 7:4139-4141 (1989)}. Кроме того, ген HSV-TK может быть помещен на противоположной стороне этой инсерции в виде gpt, что позволяет проводить отбор на пео и против как gpt, так и ТК растущими клетками в среде для фибробластов человека, содержащей 400 мкг/мл G418, 100 мкМ 6-тиоксантин и 25 мкг/мл ганцикловира. Двойной негативный отбор обеспечивает Почти абсолютный отбор на истинные события нацеливания, а блоттинг по Саузерну обеспечивает окончательное подтверждение. Описанные здесь схемы нацеливания для гомологичной рекомбинации могут быть также использованы для активации экспрессии hEPO в имморталиэованных клетках человека (например, клетках НТ1080 (АТСС CCL 121), клетках Hela и производных клеток Не(а ;АТСС CCL 2, 2,1 и 2,2), клетках рака молочной железы MCF-7 (АТСС НВТ 22), клетках лейкоза К-562 (АТСС CCL 232), клетках карциномы KB (АТСС CCL 17), клетках рака яичника 2780-AD (Van der Bfick, A.M. etal.. Cancer Res. 48: 5927-5932 (1988), клетках Raji (ATCC CCL 86), клетках Jurkat (АТСС Т1В 152), клетках Namatwa (ATCC CRL 1432), клетках HL-60 (ATCC CCL 240), клетках Daudi (ATCC CCL 213), клетках RPM1 8226 (ATCC CCL 155). клетках U-937 (ATCC CRL 1593), клетках меланомы Bowes (ATCC CRL 9607), подлинии 2R4 W138VA13 (ATCC CLL 75.1). клетхах MOLT-4 (ATCC CLL 1582) и разнообразных гетерогибридомных клетках для целей получения hEPO для общепринятой фармацевтической доставки. І Конструирование направляющих (нацеливающих) плазмид для помещения гена гормона роста человека под контроль мышиного промотора металлотионеина в первичных, вторичных или иммортализованных фибробпастах человека. Следующий пример служит для иллюстрации одного варианта данного изобретения, в котором обычные регуляторные последовательности против хода транскрипции от гена гормона роста человека в первичных, вторичных или иммортализованных фибробластах человека Направляющие молекулы, похожие на опи санные в примере 1f, для нацеливания на регуляторный район гена ЕРО получают с примене нием клонированных фрагментов ДНК, получен ных из 5"-конца гена N гормона роста человека. Фрагмент с длиной приблизительно 1.8 т.п.н., ох ватывающий положения нуклеотидое HUMGHCSA (Genbank Entry) 3787-5432 (положе ния двух сайтов EcoRI, которые образуют фраг мент удобного размера для клонирования или диагностического расщепления включающих в себя этот фрагмент субклонов), амплифицируют при помощи праймеров ПЦР, сконструированных согласно анализу последовательности HUMGHCSA в этом районе Этот район прости рается от середины интрона 1 гена NhGH до по ложения против хода транскрипции приблизи тельно 1,4 т п н. 5' по отношению к сайту старта трансляции pUC12 расщепляют EcoRI иВатН1, обрабатывают с фрагментом Кленова для обра зования тупых концов и повторно замыкают в кольцо при разбавленных условиях, получая плазмиды, которые потеряли сайты EcoRI и ВатН1. Такая плазмида названа p(JCi2XEB. Hind 111-линкеры лигируют на амплифицированный фрагмент hGH и полученный фрагмент рас щепляют Hind 111 и, лигируют с расщепленной Hind 111 плэзмидой pUC12XEB. Полученную плаэмиду, pUC12XEB-5'hGH, расщепляют EcoRI и ВатН1 для удаления фрагмента 0,5 т п н., ле жащего непосредственно против хода транскрип ции от инициирующего сайта транскрипции hGH. Расщепленную ДНК лигируют с фрагментом EcoR1-Bgl11, 1,8 т.п.н. из гена тМТ-1 [не содер жащего кодирующих тМТ последовательностей; Hamer, D.H., and Walling. M., J. Мої. Appl. Gen. 1:273-288 (1982); ЭТОТ фрагмент можно также вы делить известными способами из мышиной ге номной ДНК с применением ПЦР-праймеров, сконструированных на основании анализа после довательностей тМТ. доступных из Genbank т.е. MUSMTI, MUSMTIP, MUSMTIPRM]. Эта плазмида р5' hGH-mMT имеет промотор тМТ, фланкиро ванный на обеих сторонах расположенными про тив хода транскрипции последовательностями hGH. Описанные здесь стратегии клонирования позволяют модифицировать in vitro последовательности против хода транскрипции от hGH для последующей направленной трансфекции первичных, вторичных или иммортализованных фибробластов человека. Эта стратегия описала простое встраивание промотора тМТ. Могут быть рассмотрены другие стратегии, например, в которых энхансер с широкой специфичностью клеток-хозяев встраивают против хода транскрипции от встроенной последовательности гпМТ. j-Активация гена hGH человека и выделение получивших нацеленные конструкции ДНК первичных, вторичных и иммортализованных фибробластов человека при помощи скрининга. 34493 Для нацеливания, плазмиды разрезают рестриктазами, которые освобождают инсерцию от плазмидного каркаса. В случав плазмиды р5' hGH-mMT расщепление Hind 111 высвобождает нацеливающий фрагмент 2,9 т п.н., состоящий из промотора тМТ 1,8 т.п.н , фланкированного на 5'- и З'-сторонах ДНК, предназначенной для направления этой конструкции к регуляторному району гена hGH. Эту ДНК или только нацеливающий фрагмент 2,9 т п.н. очищают фенольной экстракцией и осаждением этанолом и трансфицируют в первичные или вторичные фибробласты человека при условиях, описанных в примере 1. Трансфицированные клетки высевают на чашки с диаметром 150 мм в питательную среду для фибробластов человека. Через 48 часов клетки высевают в 24-луночные чашки при плотности 10000 клеток/см2 [приблизительно 20000 клеток на лунку; если нацеливание происходит при скорости 1 событие на 10е клонируемых клеток (пример 1 с), то нужно анализировать приблизительно 50 лунок для выделения одной экспрессирующей колонии]. Клетки, в которых трансфицирующая ДНК направлялась к гомологичному району против хода транскрипции от hGH, будут экспрессировать hGH под контролем промотора тМТ. После 20 дней все луночные супернатанты аналиэировали на экспрессию hGH с использованием коммерчески доступного набора для иммунотеста (Nichols). Клоны из лунок, обнаруживающих синтез hGH, выделяют известными способами, обычно тестированием фракций гетерогенных попупяций клеток, распределенных в отдельные лунки или планшеты, анализом этих позитивных лунок и повторением этого, если необходимо, и в конце концов выделяют колонии, получившие нацеленные конструкции ДНК, посредством скрининга 96-пуночных микротитрационных планшетов, засеянных по одной клетке на лунку. ДНК из полных лиэатов планшетов можно также анализировать при помощи ПЦР для амплификации фрагмента с использованием тМТ-специфического праймера вместе с праймером, лежащим по ходу транскрипции от положения 5432 HUMGHCSA. Эта пара праймеров должна амплифицировать фрагмент ДНК с размером, точно предсказанным на основе последовательности ДНК. Позитивные чашки трипсиниэировали и повторно засевали при последовательно снижающихся разведениях, и получение ДНК и стадии ПЦР повторяпи, если необходимо, для выделения получивших нацеленную конструкцию ДНК клеток. Схемы нацеливаний, описанные здесь, можно также использовать для активации экспрессии hGH в иммортализованных клетках человека (например, клетках НТ1080 (АТСС CCL 121), клетках Hela и производных клеток HeLa {АТСС CCL 2, 2.1 и 2.2), клетках рака молочной железы MCF-7 (АТСС НВТ 22), клетках лейкоза К-562 (АТСС CCL 232), клетках карциномы KB (АТСС CCL 17), клетках рака яичника 2780AD (Van der Btick, A.M. et.al., Cancer Res. 48: 5927-5932 (1988), клетках Raji (ATCC CCL 86), клетках Jurkat (АТСС Т1В 152), клетках Namalwa (ATCC CRL 1432), клетках HL-60 (ATCC CCL 240), клетках Daudi (ATCC CCL 213), клетках RPM1 8226 (ATCC CCL 155), клетках U-937 (ATCC CRL 1593), клетках меланомы Bowes (ATCC CLL 9607), подлинии 2R4 клеток W1-38VA13 (ATCC CRL 75.2), клетках MOLT-4 (ATCC CRL 1582) и разнообразных гетеротбридомных клетках) для целей получения hGH для общепринятой фармацевтической доставки. к. Активация гена hGH человека и выделение получивших нацеленные конструкции ДНК первичных, вторичных и иммортализованных фибробластов человека при помощи системы позитивного или комбинированного позитивного/негативного отбора. Стратегия конструирования плазмиды p5'hGH-mMT может иметь дополнительную стадию встраивания гена пео рядом с промотором тМТ. Кроме того, маркер негативного отбора, например, дрЦиэ pMSG (Pharmacia) или другого подходящего источника], может быть встроен рядом с HUMGHCSA последовательностями в pUC12 полил'инкер. В первом случае G418f-Konoнии выделяют и скринируют при помощи ПЦРамплификации или рестрикционного и гибридизационного анализа по Саузерну ДНК, полученной из пулов колоний для идентификации получивших нацеленные конструкции колоний. В последнем случае С418'-колонии помещают в среду, содержащую тиоксантин, для отбора против интеграции гена gpt (негативный отбор) [Besnard, С, et а!., Мої. Cell ВіоІ. 7:4139-4141 (1989)]. Кроме того, ген HSV-TK может быть помещен на противоположной стороне инсерции в виде gpt, что позволяет проводить отбор на пео и против как gpt, так и ТК растущими клетками в питательной среде для фибробластов человека, содержащей 400 мкг/мл G418, 100 мкМ 6-тиоксантин и 25 мкг/мл ганцикловира. Двойнойнегативный отбор должен обеспечивать почти абсолютный отбор на правильные события нацеливания. Гибридизационный анализ по Саузерну является подтверждающим. Описанные здесь схемы нацеливания могут быть использованы также для активации экспрессии hGH в иммортализованных клетках человека (например, клетках НТ1080 (АТСС CCL 121), клетках HeLa и производных клеток HeLa (АТСС CCL 2, 2.1 и 2.2), клетка рака молочной железы MCF-7 (АТСС НВТ 22), клетках лейкоза К-562 (АТСС CCL 232), клетках карциномы KB (АТСС CCL 17), клетках рака яичника 2780AD (Van der Blick, A.M. et.al., Cancer Res. 48: 59275932 (1988). клетках Raji (ATCC CCL 86), клетках Jurkat (ATCC T1B 152), клетках Namalwa (ATCC CRL 1432), клетках HL-60 (ATCC CCL 240), клетках Daudi (ATCC CCL 213), клетках RPM1 8226 (ATCC CCL 155), клетках U-937 (ATCC CRL 1593), клетках меланомы Bowes (ATCC CRL 9607), клетках сублинии 2R4 W1-38VA13 (ATCC CLL 75.1), клетках MOLT-4 (ATCC CRL 1582) и разнообразных гетерогибридомных клетках) для целей получения hSH для общепринятой фармацевтической доставки. Направляющие конструкции, описанные в примерах 1f и 1i и использованные в примерах 1g, 1h, 1i и 1j, могут быть модифицированы для включения в них амплифицируемого селектируемого маркера (например, ada, dhfr или CAD), ко 24 34493 торый применим для отбора клеток, в которых амп инфицируются активированный эндогенный ген и амлпифицируемый селектируемый маркер Такие клетки, экспрессирующие или способные экспрессировать эндогенный ген, кодирующий терапевтический продукт можно использовать для получения белков (например, hGH и пЕРО) для общепринятой фармацевтической доставки или для генной терапии ( Трансфекция первичных и вторичных фибробластов экзогенной ДНК и селектируемым маркерным геном посредством электропорации Экспоненциально растущие фибробласты или фибробласты ранней стационарной фазы трипсинизируют и споласкивают (смывают) с пластиковой поверхности питательной средой. Аликеоту этой клеточной суспензии берут для счета, а остальные клетки подвергают центрифугированию Супернатант отсасывают и осадок ресуспендируют в 5 мл буфера для электропорации (20 мМ HEPES рН 7,3, 137 мМ NaCI, 5 мМ KCf, 0,7 мМ Na2HPO4, 6 мМ декстроза) Эти клетки повторно центрифугируют, супернатант отсасывают и клетки ресуспендируют в буфере для электропорации, содержащем 1 мг/мл ацетилированного бычьего сывороточного альбумина Конечная клеточная суспензия содержит приблизительно 3 х Юн6 клеток/мл. Электропорация должна проводиться сразу после ресуспендирования. Суперспирэлизованную плээмидную ДНК добавляют в стерильную кювету с интервалом между электродами 0,4 см (Bio-Rad) Конечная концентрация ДНК обычно по меньшей мере 120 мкг/мл Затем в кювету добавляют 0,5 мл клеточной суспензии (содержащей приблизительно 1,5 х 106 клеток) и клеточную суспензию и растворы ДНК осторожно перемешивают. Электропорацию проводят в устройстве Gene-Pulser (Bio-Rad). Емкость и напряжение устанавливают на 960 мкф и 250-300 В, соответственно. По мере увеличения Напряжения выживание клеток уменьшается, но процент выживших клеток, которые стабильно включают введенную ДНК в их геном, сильно увеличивается. С учетом этих параметров, должен наблюдаться период : мпульсов 1420 мСек. Подвергнутые электропорации клетки поддерживают при комнатной температуре в течение приблизительно 5 минут и затем содержимое кюветы осторожно удаляют стерильной пипеткой Клетки добавляют непосредственно к 10 мл предварительно нагретой питательной среды (с 15% телячьей сывороткой, как указано выше) в чашку с диаметром 10 см и инкубируют, как описано выше На следующий день среду отсасывают и заменяют 10 мл свежей среды и инкубируют еще 16-24 часа. Субкультивирование клеток для определения эффективности клонирования и для отбора устойчивых с G418 колоний выполняют на следующий день Клетки трипсинизируют, считывают и высеивают; обычно фибробласты высевают при 103 клеток/10 см-чашку для определения эффективноети клонирования и при 1-2 х 104 клеток на 10 смчашку для G418-OT6opa. Фибробласты человека отбирают на устойчивость к G418 в среде, состоящей из 300-400 мкг/мл G418 (Geneficin, соль дисульфат, приблизительно 50% раствор, Gibco) в питательной среде для фибробластов (с 15% телячьей сывороткой). Эффективность клонирования определяют в отсутствие G418 Посеянные клетки инкубируют в течение 12-14 дней, затем колонии фиксируют формалином, окрашивают кристаллическим фиопетовым красителем и считывают (для посеянной эффективности клонирования) или выделяют при помощи клонирующих цилиндров (для чашек с G418). Электропорацию и отбор фибробластов кролика выполняют в основном, как описано для фибробластов человека, за исключением того, что используют другие условия отбора. Кроличьи фибробласты отбирают на устойчивость к G418 в среде, содержащей 1 г/мп G418. Фибробласты выделяют иэ свежесрезанной крайней плоти человека Культуры засевают при 50000 клеток/см в среде DMEM + 10% теляч* ья сыворотка Когда культуры становятся конфлюэнтными, фибробласты собирают трипсинизацией и трансфицируют посредством электропорации Условия электропорации оценивали с использованием трансфекции ллазмидой pcDNEO (Рис. 5). Характерный эксперимент по электропорации с использованием приблизительно оптимальных условий (60 мкг плаэмиды рс DNEO при напряжении электропорации 250 В и емкости, установленной на 960 мкф) приводил к одной О418'-колонии на 588 обработанных клеток (0,17% от всех обработанных клеток) или 1 G418r-KonoHHH на 71 клонируемую клетку (1,4%) При проведении 9 отдельных электропорации при близких к оптимальным условиям (60 мкг плазмиды pcDNEO при напряжении при электропорации 300 В и установке емкости при 960 мкф) наблюдали в среднем одну С418'-коломию на 1899 обработанных клеток (0,05%) с диапазоном 1/882 - 1/7500 обработанных клеток. Это соответствует в среднем одной G418'-KonoHmi на 38 клонируемых клеток (2,6%). Первичные фибробласты человека с низким числом пассажей превращали в зкспрессирующие hGH клетки котрансфекцией с плаэмидами pcDNEO и pXGH5 В типичном случае 60 мкг эквимопярной смеси двух плазмид трансфицировали при близких к оптимальным условиях (электропорация при напряжении 300 В и емкости 960 мкФ). Результаты такого эксперимента дали одну G418колонию на 14705 обработанных клеток. Данные по экспрессии hSH для этих и других клеток, выделенных при идентичных условиях трзнсфекции, суммированы ниже. В конечном счете, 98% всех G418-KonoHnrt можно было размножать для образования массовой культуры. Число анализи рованных 6418'-клонов 154 Число 6418г/экспрессирующих hSH клонов 65 Средний уровень экспрессии hGH 2,3 мкг hGH/10B клеток/24ч Максимальный уровень экспрессии hGH 23,0 мкг hGH/iOe клеток/24 ч 25 34493 в отношении обоих относительных положений чужеродных регуляторных последовательностей, которые встроены, и в отношении специфического характера сплайсинга, который должен иметь место для полунения конечного процессированного транскриптз Плазмида рХЕРО-10 сконструирована для замены экзона 1 hEPO экзоном 1 hGH посредством генного нацеливания на эндогенный ген hEPO на хромосоме 7 человека. Плазмиду рХЕРО-10 конструируют следующим образом. Сначала конструируют промежуточную плазмиду рТ163 встраиванием фрагмента 6 т п н Hindi 11BamH1 {см Пример 10, лежащего против хода транскрипции от кодирующего района hEPO, в расщепленную Hindi 1l-BamH1 плазмиду pBfuescnpt11SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) Продукт этого пигирования расщепляют XhO1 и Hmd111 и пигируют с фрагментом 1,1 т.п.н. Hmd111-Xho1 из pMCIneo PolyA (Thomas К R. and Capeccht, M R Cell 51:503-512 (1987)), доступной из Stratagene, La Jolla, CA], для создания pT163 Олигонуклеотиды 13 1-13 4 используют в полимераэных цепных реакциях для образования слитого фрагмента, в котором последовательности мышиного промотора металлотионеина 1 (тМТ-1) - экзона 1 hGH дополнительно слиты с последовательностями интрона 1 hEPO Сначала олигонуклеотиды 13 1 и 13 3 используют для амппификации фрагмента промотор приблизитепьно 0,73 т п н тМТ - экэон 1 hGH из pXGH5 (Рис 5) Затем олигонуклеотиды 13 2 и 13 4 используют для амплификации фрагмента приблизительно 0,57 т п н , содержащего преимущественно интрон 1пЕРО из геномной ДНК человека. Наконец, эти два амплифицированных фрагмента смешивают и амплифицируют далее с опигонуклеотидами 13 1 и 13 4 для образования конечного слитого фрагмента (слитого фрагмента 3), фланкированного сайтом Sail на 5'-стороне тМТ-1 -части и сайта-Xhoi на З'-стороне последовательности интрона 1 hEPO Слитый фрагмент 3 расщепляют Xho1 и Sail лигируют с расщепленной Xho1 плазмидой рТ163 Смесь для лигирования трансформируют в Е coli и клон, содержащий одну инсерцию слитого фрагмента 3, в' котором сайт Xho1 регенерирован на З'-стороне последовательностей интрона 1 hEPO, идентифицируют и обозначают как рХЕРО-10. Стабильные трансферты можно было получить также электропорацией первичных или вторичных фибробпастов человека с pXGH301, конструкцией ДНК, в которой гены пео и hGH присутствуют на одной и той же плаэмидной молекуле Плазмиду pXGH301 конструировали двухступенчатой процедурой Фрагмент Sal1С1а1 из pBR322 (положения 23-651 в pBR322) выделяли и встраивали в расщепленную Sail— С1а1 плазмиду pcDNEO, вводя сайт ВатН1 против хода транскрипции от района раннего промотора SV40 pcDNEO Эту плазмиду pBNEO расщепляли ВатН1 и фрагмент 2,1 т л н , содержащий ген пео под контролем раннего промотора SV40, выделяли и встраивали в расщепленную BamH1 pXGH5 Выделяли ппазмиду с одной вставкой фрагмента 2,1 т п н , BamH1t в которой пео и hGH транскрибируются в одном и том же направлении по отношению друг к другу Эта плазмида была названа pXGH301 Например, 1,5 х 10 клеток подвергали электропорации с 60 мкг pXGH301 при 300 В и 960 мкФ С418'-колонии выделяли из трансфицированных вторичных фибробластов при частоте 652 С418г-колоний на 1,5 х 106 обработанных клеток (1 на 2299 обработанных клеток) Приблизительно 59% этих колоний экспрессиругат hGH Пример 2. Конструирование нацеливающих плазмид, приводящих к образованию химерных транскрипционных единиц, в которых слиты последовательности ДНК гормона роста человека и эритропоэтина Дальнейшее описание служит для иллюстрации двух следующих вариантов данного изобретения, в которых обычные регуляторные последовательности против хода транскрипции от гена ЕРО человека изменяют для* обеспечения экспрессии hEPO в первичных или вторичных ш штаммах фибробластов, которые обычно не экспрессируют hEPO в детектируемых количествах в их нетрансфицированном состоянии В этих вариантах продукты событий нацеливания представляют собой химерные транскрипционные единицы, в которых первый экзон гена гормона роста человека расположен против хода транскрипции экзонов 2-5 hEPO Продукт транскрипции, сплайсинга и трансляции является белком, в котором аминокислоты 1-4 сигнального пептида hEPO заменены аминокислотными остатками 1-3 hGH Эти два варианта отличаются 13.1 13.2 13.3 13.4 5TnTGTCGAC GGTACCTT ТТТТААААС С Sail Крп1 (SEQ Ю №5) 5'CCTAGCGGCA ATGGCTACAG GTGAGTACTC C3CGGGCTGGG CG (SEQ ID № 6) 5'CGCCCAGCCC GCGAGTACTC ACCTGTAGCC ATTGCCGCTA GG (SEQ ID №7) 5' TTTTCTCGAG CTAGAACAGA TAGCCAGGCT Q Xho1 (SEQ ID № B) He выделенный жирными буквами район олигонуклеотида 13 1 идентичен промотору тМТ-1, с природным сайтом Крп1 в виде его 5'границы Жирные буквы обозначают конец сайта SaM для превращения 5'-границы в сайт SaM. Жирный район олигонуклеотидов 13 2 и 13.3 обозі :ачает последовательности hSH, тогда как нежирные районы представляют собой последовательности интрона 1 из гена hEPO Нежирный район нуклеотида 13 4 идентичен последним 25 26 34493 основаниям интрона 1 hEPO Жирный район включает в себя конец сайта XhO1 для превращения З'-границы вмплифицированного фрагмента в сайт Хпо1 Плазмиде рХЕРО11 сконструирована для помещения, генным нацеливанием, промотора тМТ-1 и экзона 1 hGH против хода транскрипции от структурного гена hEPO и промоторного района при эндогенном локусе hEPO на хромосоме 7 человека Плаэмиду рХЕРО-11 конструируют следующим образом Олигонуклеотиды 13 1 и 13.5 - 13 7 используют в полимераэных цепных реакциях для образования слитого фрагмента в котором последовательности промотора мышиного металлотионеина 1 (тМТ-1) - экзона 1 hGH дополнительно спиты с последовательностями hEPO от -1 до -630 по отношению к кодирующему району hEPO Сначала олигонуклеотиды 13 1 и 13 6 используют для амплификации фрагмента промотор тМТ-1 приблизительно 0,75 т п н экзон 1 hGH из pXGH5 (Рис 5) Затем олигонуклеотиды 13 5 и 13 7 используют для амплифика ции, из геномной ДНК человека, фрагмента приблизительно 0,65 т п н , состоящего преимущественно из последовательностей hEPO от -1 до 630 по отношению к кодирующему району hEPO Оба олигонуклеотида 13 5 и 13 б содержат линкерную последовательность 10 п н , расположенную при районе интрон 1 hGH - промотор hEPO, который соответствует донорному сайту сплайсинга Наконец, эти два амплифицированных фрагмента смешивают и амплифицируют далее с олигонуклеотидами 13 1 и 13 7 для образования конечного слитого фрагмента (слитого фрагмента 6), фланкированного сайтом Sail при 5'-стороне гпМТ-1-части и сайтом Хпо1 при З'-стороне района промотора hEPO Слитый фрагмент 6 расщепляют Xho1 и SaM и пигируют с расщеп ленной Xho1 плазмидой рТ163 Смесь для лигирования трансформируют в Е colt и клом, содержащий одну инсерцию слитого г рагмента 6 в которой сайт Xho1 регенерирован при З'-стороне последовательностей промотора hEPO, идентифицируют и обозначают как рХЕРО-11 51 GACAGCTCAC CTAGCGGCAA TGGCTACAGG TGAGTACTC AAGCTTCTGG GCTTCCAGAC CCAG (SEQ ID NO 9) Hind 111 13 6 5' CTGGGTCTGG AAGCCCAGAA QCTTGAGTAC TCACCTGTAG Hind 111 CCATTGCCGC TAGGTGAGCT GTC {SEQ ID NO 10) 13.7 5' TTTTCTCGAG CTCCGCGCCT GGCCGGGGTC CCTC Xho1 (SEQ ID NO 11) 13.6 Районы с жирными буквами олигонуклеотидов 13 5 и 13,6 обозначают последовательности hGH Районы с буквами курсивом соответствуют первым 10 п н интрона 1 hEPO Остальная часть этих олигонуклеотидов соответствует последовательностям hEPO от -620 до -597 по отношению к кодирующему району hEPO Нежирный район олигонуклеотида 13 7 идентичен основаниям -1 -24 по отношению к кодирующему району hEPO Район с жирными буквами включает в себя конец сайта Xfrai для превращения З'-границы амплифицированного фрагмента в сайт Xho1 Плазмиду рХЕРО-10 можно использовать для генного нацеливания расщеплением Ват1 и Xho1 для высвобождения фрагмента 7.3 т п н , содержащего слитый фрагмент mMT-1/hGH, фланкированный на обеих сторонах последовательностями hEPO Этот фрагмент (нацеливающий фрагмент 1) не содержит кодирующих последовательностей hEPO, имея только последовательности, лежащие между -620 и приблизительно -6620 против хода транскрипции от кодирующего района hEPO, и последовательности интрона 1 hEPO для регуляции нацеливания на локусе ЕРО человека Нацеливающий фрагмент 1 трансфицируют в первичные или вторичные фибробласты кожи человека при условиях, сходных с описанными в Примере 1с Устойчивые к G418 колонии выскребают в отдельные пунки 96луночных микротитрационных планшетов и скринируют на экспрессию ЕРО при помощи твердофазного* иммуноферментного анализа (EL1SA) (R&D Systems, Minneapolis MN) Клетки, в которых трансфицированная ДНК интегрируется произвольно в геном человека, не могут продуцировать ЕРО Клетки в которых трансфицированная ДНК подверглась гомологичной рекомбинации с интроном 1 эндогенного hEPO и последовательностями hEPO против хода транскрипции содержат химерный ген, в котором последовательности промотора тМТ-1 и нетранскрибируемые последовательности и 5'-нетранслируемые последовательности hGH и экзон 1 hGH заменяют обычный промотор hEPO и экзон 1 hEPO (см фиг 1) Последовательности, не относящиеся к hEPO, в нацеливающем фрагменте 1 соединены с последовательностями hEPO no ходу транскрипции интрона 1 hEPO Замена нормального регуляторного района hEPO промотором тМТ-1 будет активировать ген ЕРО в фибробпастах которые обычно не экспрессируют hEPO Замена экзона 1hEPO экзоном 1 hGH приводит к образованию белка, в котором первые 4 аминокислоты сигнального пептида hEPO заменены аминокислотами 1-3 hGH что создает функциональный химерный сигнальный пептид, который удаляется посттрансляционным процессингом из зрелого белка и секретируется из экспрессирующих клеток Плазмиду рХЕРО-11 можно использовать для генного нацеливания расщеплением 0атН1 и Xho1 для высвобождения фрагмента 7,4 т п н , содержащего слияние mMT-1/hGH, фланкированное на обеих сторонах последовательностями hEPO Этот фрагмент (нацеливающий фрагмент 2) не содержит кодирующих последовательностей hEPO, имея только последовательности, лежащие между -1 и приблизительно -6620 про 34493 тив хода транскрипции от кодирующего района hEPO, для управления нацеливанием на локус ЕРО человека Нацеливающий фрагмент 2 трамсфицируют в первичные или вторичные фибробласты кожи человека при условиях, сходных с описанными в Примере 1д. Устойчивые к G418 колонии помещают в отдельные лунки 96луночных планшетов и скринируют на экспрессию ЕРО при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) {R&D Systems, Minneapolis, MN). Клетки, а которых трансфицирующая ДНК интегрируется в геном человека произвольно, не могут продуцировать ЕРО Клетки, в которых трансфицирующая ДНК подверглась гомологичной рекомбинации с эндогенным промотором hEPO и последовательности против хода транскрипции, содержат химерный ген, в котором промотор тМТ-1 и нетранскрибируемые последовательности, 5'-нетранслируемые последовательности hGH и экэон 1 hGH и линкер из 10 л.н , состоящий из первых 10 оснований интрона 1пЕР0, встроены при сайте Hindi 11, лежащем при положении -620 по отношению к кодирующему району hEPO (см фиг. 2). Локализация промотора тМТ-1 против хода транскрипции от обычно молчащего промотора hEPO будет управлять синтезом, в первичных или вторичных фибробластах кожи человека, мРНК, считывая (5' -» 3') нетранслируемые последовательности металлотионеина и hGH, экэон 1 hGH, 10 оснований ДНК, идентичных первым 10 основаниям интрона 1 hEPO, и обычный промотор hEPO и зхзон 1 hEPO (-620 - +13 по отношению к кодирующей последовательности hEPO). Линкерная последоватепьность из 10 п.н. из интрона 1 hEPO действует как донорный сайт сплайсинга для слияния экзона 1 hGH со следующим по xdfcy транскрипции акцепторным сайтом сплайсинга, который лежит непосредственно против хода транскрипции от экзона 2 hEPO. Процессинг образующегося транскрипта будет, следовательно, сллайсировать промотор hEPO, экзон 1 и последовательности интронв 1. Замена экзона 1пЕРО зкзоном 1 hGH приводит к образованию белка, в котором первые 4 аминокислоты сигнального пептида hEPO заменены аминокислотами 1-3 hGH, что создает функциональный, химерный сигнальный пептид, который удаляется пост-трансляционным процессингом из зрелого белка и секрвтируется из экспрессирующих клеток. мер, фрагмент Hind 111 - BamH1 6 тп.н. (см. Пример 1f) против хода транскрипции гена hEPO имеет многочисленные последовательности узнавания рестриктаз. которые могут использоваться как сайты встраивания гена лес- и слитого фрагмента промотор mMT-1/hGH. Один такой сайт, Bgl11, лежащий приблизительно 1,3 тп.н. по ходу транскрипции от сайта Hind 111, является единственным в этом районе и может быть использован для встраивания одного или более селектируемых маркеров и регуляторного района, происходящего из другого гена, который будет служить для активации экспрессии hEPO в первичных, вторичных или иммортализованных клетках человека. Сначала конструируют промежуточную плазмиду рТ164 встраиванием фрагмента Hindi 11-ВагпН1 6 тп.н. (Пример 1f), лежащего против хода транскрипции от кодирующего района hEPO, в расщепленную Hindi 11-BamH1 плазмиду pBluescripH 1SK+ (Stratagene, La Jolla, CA). Ппаэмиду pMCIneo PolyA {Thomas K.R. and Capecchi, M.R. Celt 51:503-512 (1987)), доступную из Stratagene, La Jolla, CA) расщепляют BamH1 и Xhoi, затупляют концы при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli и полученный фрагмент 1,1 тп.н. очищают рТ164 расщепляют Bgl11 и затупляют концы с фрагментом Кленова ДНК-полимеразы Е coli. Эти два фрагмента с тупыми концами лигируют вместе и трансформируют в компетентную Е.соІІ. Клоны с единственной инсерцией фрагмента пео 1,1 т.п.н. выделяют и анализируют рестрикционным анализом для идентификации тех клонов, в которых сайт ВдМ1, воссозданный слиянием тупых сайтов Xho1 и Bgl11, покапизован на расстояние 1,3 т.п.н. от единственного сайта Hind 111, присутствующего в плазмиде рТ164. Полученную плазмиду, рТ165, можно теперь расщеплять при единственном сайте Bgl11, фланкирующем 5'-сторону транскрипционной единицы пео. Опигонуклеотиды 13 8 и 13.9 мспопьзуют в полимеразных цепных реакциях для образования фрагмента, в котором последовательности мышиный промотор металлотионеина 1 (тМТ-1) экэон 1hGH дополнительно слиты с фрагментом 10 п.н., содержащим донорный сайт сплайсинга. Выбранный донорный сайт сплайсинга соответствует донорному сайту сплайсинга природного интрона 1hEP0, хотя можно использовать большее число донорных сайтов сплайсинга или консенсусные донорные сайты сплайсинга. Олигонуклеотиды (13.8 и 13 9) используют для амплификации фрагмента из pXGH5 (Рис. 5) промотор тМТ-1 приблизительно 0,73 т п н. - экэон 1 hGH. Амплифицированный фрагмент (фрагмент 7) расщепляют ВдШ и лигируют с расщепленной ВдМ1 ппазмидой рТ165. Смесь для лигирования трансформируют в E.coli и клон, содержащий одну инсерцию фрагмента 7, в котором сайт Крп 1 в промоторе тМТ-1 находится рядом с 5'-концом гена пео и промотор тМТ-1 ориентирован таким образом, что транскрипция направляется по направлению к уникальному сайту Hind 111, идентифицируют и обозначают как рХЕРО-12. Ряд конструкций, относящихся к рХЕРО-10 и рХЕРО-11, можно сконструировать при помощи известных способов. В этих конструкциях относительные положения промотора тМТ-1 и последовательностей hGH, а также попожение, при котором последовательности mMT-1/hGH встраивают в последовательности против хода транскрипции hEPO, вариируют для создания других химерных транскрипционных единиц, которые облегчают генное нацеливание, приводят к более эффективной экспрессии слитых транскриптов или имеют другие желаемые свойства. Такие конструкции будут давать сходные результаты, так что слитый ген hGH-EPO помещают под контроль экзогенного промотора генным нацеливанием на нормальный локус hEPO. Напри 28 34493 13.8 5' AAAAAGATCT GGTACCTT ТТПТААААС CAGCCTGGA BgMI Kpni (SEQ ID № 12) Район с нежирными буквами олигонуклеотида 13 8 идентичен промотору тМТ-1, с природным сайтом Крп1 в качестве его 5'-гра13.9 ницы Жирные буквы обозначают конец сайта ВдИ1 для превращения 5'-границы в сайт Bglii 51 TTTTAGATCT GAGTACTCAC CTGTAGCCAT TGCCGCTAGG Bgl11 (SEQ ID №13) Жирный район олигонуклеотида 13 9 обозначает последовательности hGH Курсив соответствует первым 10 пн интрона 1hEP0 Подчеркнутый сайт Bg)11 добавлен для мелей конструирования плазмиды Ппазмиду рХЕРО-12 можно использовать для генного нацеливания расщеплением ВэтН1 и Hindi 11 для высвобождения фрагмента 7,9 т п н , содержащего ген пео, и слияния тМТ1/hGH фланкированное на обеих сторонах последовательностями hEPO Этот фрагмент (нацеливающии фрагмент 3) не содержит кодирующих hEPO последовательностей имей только последовательности, лежащие между приблизительно -620 и приблизительно -6620 против хода транскрипции от кодирующего района hEPO для регуляции нацеливания против хода транскрипции локуса ЕРО человека Нацеливающий фрагмент З трансфицируют в первичные вторичные или иммортализованные фибробла,сты кожи человека при условиях сходных с описанными в Примерах 1Ьи 1с Устойчивые к G418 колонии выскребают и помещают в отдельные лунки 96-луночных планшетов и скринируют на экспрессию ЕРО твердофазным иммуноферментным анализом ELI SA (R&D Systems, Minneapolis MN) Клетки, в которых трансфицирующая ДНК интегрируется произвольно в геном человека, не могут продуцировать hEPO Клетки, в которых трансфицирующая ДНК подвергалась гомологичной рекомбинации с эндогенным промотором hEPO и последовательностями против хода транскрипции, содержат химерный ген, в котором промотор тМТ-1 и нетранскрибируемые последовательности, 5'нетранслируемые последовательности hSH и экзон 1hSH и линкер 10 пн , состоящий из первых 10 пн интрона 1пЕРО, встроены при сайте Bgl11, лежащем в положении приблизительно 1920 по отношению к кодирующему району hEPO Локализация промотора тМТ-1 против хода транскрипции обычно молчащего промотора hEPO будет направлять в первичных, вторичных или иммортализованных фибробластах человека синтез транскрипта, считывая (51 -♦ 3') последовательности нетранслируемото металлотионеина и hGH, экзон 1hSH, 10 пн, идентичных первым 10 п н интрона 1пЕРО, и район против хода транскрипции hEPO и экэон 1hEP0 (от приблизительно -1920 до +13 по отношению к кодирующей ЕРО последовательности) Линкерная последовательность 10 п н из интрона 1 hEPO действует как донорный сайт сплайсинга для слияния экзона 1 hGH с расположенным по ходу транскрипции акцепторным сайтом сплайсинга, который лежит непосредственно слева (против хода транскрипции) от экзона 2hEPO Процессинг полученного транскрипта, таким образом, будет сплайсировать последовательности против хода транскрипции hEPO, промоторный район, экзон 1 и последовательности интрона 1 При использовании рХЕРО-10, -11 и -12 пост-транскрипционный процессинг транскрипта может быть улучшен посредством мутагенеза \п vitro для исключения акцепторных сайтов сплайсинга, лежащих в последовательностях против хода транскрипции hEPO между промотором тМТ-1 и экэоном 1пЕРО, которые снижают уровень продуктивных событий сппайсинга, необходимых для образования желаемого транскрипта Замена экзона 1 hEPO экзоном 11 hGH приводит к образованию белка, в котором первые 4 аминокислоты сигнального пептида hEPO заменены аминокислотами 1-3 hGH. что приводит к образованию функционального химерного сигнального пептида, который выделяется пост-трансляционным процесСИНГОМ ИЗ ЗреЛОГО беЛКа И СеКретИрувТСЯ ИЗ ЭКСП' рессирующих клеток Пример 3. Направленная модификация последовательностей против хода транскрипции и амплификация получившего нацеленную конструкцию ДНК гена Клетки человека, в которых ген hEPO был активирован описанными выше способами, может быть индуцирован для амплификации транскрипционной единицы пео/тМТ-1/ЕРО, если нацеливающая плазмида содержит маркерный ген, который придает устойчивость к высокому уровню цитотоксичного агента, посредством феномена амплификации генов Было документировано, что среди других генов селектируемые маркерные гены, такие хак ген дигидрофолатредуктазы (dhfr, селектирующий агент - метотрексат), мультифункциональный ген CAD (кодирующий карбамилфосфатсинтазу, аспартаттранскарбамилазу, дигидрооротазу, селектирующий агент -Ы-(фосфоноацетип)-|_>аспартат (PALA)], ген глутаминсинтзэы (селектирующий агент - метионинсульфоксимин (MSX)) и ген аденозиндезаминазы (ada, селектирующий агент - адениннуклеозид), являются амплифицируемыми в иммортализованных клеточных линиях человека (Wnght, J.A.etal Proc Nail Acad Sci USA 87.1791-1795 (t990}; Cockett, Ml etal, ВІо/Technology Є 662667 (1990)) В этих исследованиях было документировано, что амплификация генов происходит в большом числе иммортализованных клеточных линиях человека НТ1080, HeLa, клетки рака молочной железы MCF-7, клетки лейкоза К-562, клетки карциномы KB или клетки рака яичника 29 34493 2780AD среди других клеток, обнаруживают амплификацию при подходящих условиях отбора Плазмиды рХЕРО-10 и рХЕРО-11 могут быть модифицированы встраиванием нормального или мутантного гена dhfr в уникальные сайты Htnd 111 этих плззмид После трансфекции клеток НТ1080 подходящей ДНК, отбора на устойчивость к G418 (сообщаемую геном пео) и идентификации клеток, в которых ген hEPO был активирован генным нацеливанием последовательностей пео, dhfr и гпМТ-1 эти клетки могут быть подвергнуты ступенчатому отбору в метотрексате (МТХ) для отбора на амплификацию dhfr и ко-амплификацию связанных последовательностей пео. тМТ-1 и последовательностей hEPO (Kaufman, R J , Technique 2 221-236 (1990)) Используют схему ступенчатого отбора, в котором клетки сначала выдерживают с низкими уровнями МТХ (0 01-0,08 мкМ) с последующим последовательным выдерживанием при возрастающих концентрациях МТХ до 250 мкМ или выше Линейные возрастающие стадии 0,04-0,08 мкМ МТХ и последующие 2-кратные увеличения в концентрации МТХ будут эффективны в отборе на амплифицированные трансфицированные клеточные линии, хотя различные относительно неглубокие приращения будут также эффективными Амплификацию наблюдают по увеличению в числе копий гена и подтверждают измерением экспрессии hEPO in vitro Этой стратегией может быть достигнута значительная сверхэкспрессия hEPO посредством направленной модификации последовательностей, лежащих полностью вне кодирующего района hEPO Конструкции, похожие на описанные конструкции (Примеры 1f, 1h, 1i, 1k, 2 и 7), для активации экспрессии hGH в клетках человека также могут быть модифицированы далее для включения гена dhfr с целью получения клеток, которые сверхэкспрессируют ген hGH, посредством генного нацеливания на некодирующие последовательности и последующей амплификации Пример 4. Нацеливание и активация локуса ЕРО человека в имморталиэованной пинии фибробластов человека Была изготовлена нацеливающая (направляющая) конструкция рХЕРО-13 для проверки гипотезы, что эндогенный ген hEPO мог бы быть активирован в фибробластной клетке человека. Сначала конструировали плазмиду рТ22 1, содержащую геномную последовательность hEPO 63 п н против хода транскрипции первого кодона гена hEPO, слитого с мышиным промотором металлотионеина (тМТ-1) Олигонуклеотиды 22 122 4 использовали в ПЦР для слияния последовательностей тМТ-1 и hEPO Свойства этих праймеров следующие 22 1 представляет собой олигонуклеотид из 21 оснований, гомологичный сегменту промотора тМТ-1, начинающемуся 28 п н против хода транскрипции от сайта Крп 1 тМТ-1, 22 2 и 22 3 являются комплементарными праймерами из 58 иуклеотидов, которые определяют слияние последовательностей hEPO и тМТ-1 таким образом что это слияние содержит 28 п н последовательностей hEPO. начинающихся 35 оснований против хода транскрипции от первого кодона гена hEPO, и последовательнос ти тМТ-1, начинающиеся при основании 29 олигонуклеотида 22 2. содержащие природный сайт Bgl11 тМТ-1 и простирающиеся на 30 оснований в последовательность тМТ-1, 22 4 представляет собой 21 нуклеотидов в длину и является гомологичным последовательностям hEPO, начинающимся при 725 п н по ходу транскрипции от первого кодона гена hEPO Эти праймеры используют для амплификации фрагмента ДНК 1,4 т п н , содержащего слияние последовательностей тМТ-1 и hEPO, описанное выше Полученный фрагмент расцепляют Крп 1 (фрагмент ПЦР, содержащий два сайта КрШ один природный сайт Крп1 в районе промотора тМТ-1 и один природный сайт Крп1 в последовательности hEPO) и очищают Плазмиду рХЕРО1 также расщепляли Kpni, высвобождая фрагмент 1,4 тп н и фрагмент 6,4 т п н Фрагмент 6 4 т п н очищали и лигировали со спитым фрагментом 1,4 т п.н Кр1 ПЦР Полученная конструкция была названа рТ221 Вторую промежуточную плазмиду, рТ22 2, конструировали лигированием фрагмента Hindi 11-BamH1 6 тп н , лежащего против хода транскрипции структурного гена hEPO (см Пример 1f) с расщепленной BamHI и Hind 111 плазмидой pBS11SK + (Stralagene La Jolla, CA) Третью промежуточную плазмиду, рТ22 3, конструировали вырезанием сначала фрагмента Xho1/BamH1 1,1 т п н из pMCINEPpolyA (Stratagene, La Jotta, CA), содержащего ген неомицинфосфотрансфераэы. Затем концы этого фрагмента затупляли при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 (New England Biolabs) После этого этот фрагмент лигировали с сайтом Нтс 111 pBs11 SK+ (также затупленный ДНК-полимеразой 1) с образованием рТ22 3 Четвертую промежуточную плазмиду, рТ22 4, получали очисткой фрагмента Xho1/Hmd 111 1,1 т л и , содержащего ген пео из рТ22 3, и лигированием этого фрагмента с расщепленной Xho1 и Hind 111 рТ22 2 Таким образом, рТ22 4 содержит ген пео рядом со стороной Htnd 111 фрагмента BamH1-Hind111 фрагмента против хода транскрипции hEPO Наконец, рХЕРО-13 получали вырезанием сначала фрагмента EcoR1-Acc1 2,0 т п н из плазмиды рТ22 1 Сайт EcoR1 этого фрагмента определяет 5'-границу промотора тМТ—1, тогда как сайт Асс1 этого фрагмента лежит внутри экзона 5 hEPO Таким образом, фрагмент Acc1/EcpR1 содержит почти полную экспрессионную единицу hEPO. не имея только части экзона 5 и природного сайта полиаденилирования Этот фрагмент EcoR1/Acc1 2,0 тп н очищали, концы затупляли обработкой фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 и лигировали с расщепленной Xho1, имеющей затупленные концы рТ22 4 Клетки НТ1080 трансфицировали расщепленной PVU1-BamH1 плазмидой рХЕРО-13, рХЕРО-13, расщепленная таким образом, образует три фрагмента, векторный фрагмент 1 т п н , включающий в себя ген amp, векторный фрагмент 1,7 т п н из оставшихся векторных последовательностей и фрагмент приблизительно 9 т п н . содержащий последовательности hEPO, пео и тМТ-1 Этот фрагмент BamH1/Pvu1 из 9 30