Плазмідний експресуючий вектор ррр-150, маючий послідовність днк, відповідаючу за експресію в бактеріях е. coli злитного білка цитомегаловірусу

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної Інженерії і може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка цитомегаловірусу І в медицині, для конструювання тест-систем, придатних для виявлення антитіл до цитомегаловіруса в сироватках крові пацієнів. Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресійних векторів типу рЕХ.1-3 (Keith К Stanley and Paul Luslo., Construction of a new family of high efflclenty bacterial expression vectors: Identification of cDNA clones for human liver proteins. //EMBO Journel, vol 3, N 6, p. 1429-1434). ЦІ вектори походять від crolacZ злитних плазмид, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Рг промотору фагу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить мікробіологічний синтез в Е. coll элитного білка. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез элитного білка цитомегаловіруса. Для цього була створена рекомбінантна плазмида рРР150, яка містить наступні інсерційні фрагменти ДНК: фрагмент гену Сrо, розміром 51 п.о., фрагмент Lad, розміром 114 п.о., фрагмент LacZ, розміром 1050 п.р. і фрагмент ДНК, відповідаючий послідовностям білка цитомегаловіруса розміром 3978 п.о. Одержаною модифікованою плазмідою трансформували клітини Е. coll., штам Рор-2136. Рекомбінантні клони Е. соli нарощували I тестували методом Імуиоблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримували антитіла до структурних білку цитомегаловірусу. Плазмида рРР-150 кодує гібридний білок молекулярною масою 148,6 кД (1326 амінокислот). Штам - продуцент гібридного білка (ITG-6150) одержували трансформацією клітин Е. coll Pop 2136 плазмидою рРР-150 (див. креслення). Клітини-продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32-42°С. При рості на м'ясопептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють Інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійній І нітратній формах. Клітини ростуть.при рН 6,0-8,0. Синтез гібридного білка відбувається при вирощуванні культури Е. Coll ITG-6150 при температурі 32-42°С. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібридний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення І по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмидою рРР-150.