Спосіб одержання рекомбінантної днк, що вміщує ген, кодуючий амілазу

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК, СОДЕРЖАЩЕЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ АМИЛАЗУ, включающий гидролитическое расщепление ДНК бактерии донора, последующее соединение полученных фрагментов ДНК с вектором» о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, в качестве бактерии донора используют бактерии Bacillus megaterium СІВ № 11568, или Bacillus coagu?aus СІВ № 11571, или Bacillus cereus АТСС № 31102, или Klebsiclta pucuтопіої АТСС № 15050, а в качестве вектора используют фаг % NM 590 или Ъ NM 781 , или "A-NM 989, или плазмиду рВР 322, или плазмиду рАСУС 184, или плазмиду рС 194. СП с I І 2 33805 % Изобретение относится к биотехбульон хлорид натрия: рост при нологии, а именно к производству концентрации хлорида натрия 3,5%; рекомбинантных ДНК, содержащих ген, оптимальная температура роста 30кодирующий амилазу. 37 С, максимальная температура росП р и м е р !. Клонирование гена та 40-50 С, минимальная температура альфа-амилазу. роста 5-20 С; потребность в кислороДля клонирования гена применяют де: аэробный микроорганизм. следующие материалы: ограничивающая Микроорганизм идентифицирован как •эндонуклеаза Hind 111; ДНК лигаза Bacillus megaterium на основе его фага Т4; фаг *К NM 590, ДНК которого 10 микробиологических признаков со ссылполучена экстракцией фенолом из очикой на Bergey's Manna? of Determinaщенных частиц фага; плазмида pBR 322, te Bacterilogy (8 edition), R. E. BuДНК которой получена из клеток Е, соchanau, N, E. Gibbous, co-editors, ti обработанных лизоцимом в градиенPublished by the Williams and Wilіе плотности хлорида цезия ~ бромида 1 5 kius Company, Baltinore, Md. этидия; микроорганизм - хозяин Е. соМикроорганизм сдан на хранение в їі НБ1О1; микроорганизм - донор бакНациональную коллекцию промышленных терии Васіїїиє megaterium со следуюбактерий (NCIB) , Torry Research Staщими морфологическими признаками: tion, РО BOX № 31, 135 Abbey Rol, морфология: палочки (0,5-0,7x2,0- ? 0 Aberdeen AB98DG, Scotland, 12 февраля I 980 г . под номером NCIB № 11568. 5,0 м к м ) , подвижные, споры терминальные и субтерминалъные; Рекомбинация in vitro между ДНК лямбда и Bacillus tnegaterium. жидкая питательная среда: рост Около 7 мкг ДНК BaciHus megaхороший; 25 terium расщепили 10 ед. Hind Ж при твердая питательная среда: рост 37 С в течение 1 ч в объеме 25 мкл хороший, колонии плотные посредине трис -буферного раствора при рН 7,5. и более расплывчатые вокруг; Около 2 мкг лямбда М 590 расщепили молоко: пептонизирует без изменеаналогичным образом тем же ферменния рН; том. Реакции остановлены путем нагжелатин: не разжижает; 30 рева в течение 10 мин при 75 С. восстановление нитратов: отрицаС целью определения эффективности тельная реакция; расщепления проведены два испытания. каталиэная реакция: отрицательОбразец обеих реакционных смесей ная; подвергли электрофорезу в геле агаоксидазная реакция: отрицатель35 розы в течение 20 ч при напряжении ная; 20 В, После окрашивания геля этидяйци'тохромоксидная реакция: отрицабромидом наблюдали ожидаемую схему тельная; полос: две полосы ДНК лямбда, полупродуцирование индола: отрицательченные в результате расщепления отная; 40 дельного участка Hind Ш, на ДНК образование сероводорода: отрицапямбда, и очень большое количество тельная; почти перекрывающихся полос бактерипотребление углеводов: потребляет альной ДНК, расщепленной на большое арабинозу, ксилозу, галактозу, глюколичество участков. козу , левулезу, мальтозу, рафинозу, 45 Трансфекция ДНК фага показала, сахарозу, крахмал и кислоты, получто расщепление эффективно более чем ченные из них. Рамнозу, маниозу, на 99% и уничтожило таким образом мелибиозу, инулин и салицин не потпочти всю биологическую активность ребляет; ДНК фага. потребпение многоатомных спиртов: 50 Расщепленные ДНК были смешаны к потребляет сорбитол и маннитол, не инкубированы в течение 5 ч при 10*С потребляет аденитол, дульцитол и ино0,15 единиц ДНК лигазы Т4, чтобы зитол; мопли происходить произвольная повдекарбоксилазная реакция на литорная ренатурация и ковалентное зин: отрицательная; 55 связывание фрагментов ДИК. уреолиз: слабый; По окончании инкубации ДНК смесопротивляемость действию тяжелых шали с препаратом, инкапсидированметаллов: растет непосредственно на ным in vitro, состоящим из смеси 500 м.д. С 7 ; 2 3 1805 * размножилось в чистоте (продуцируя двух комплементарно дефективных амилазу) и обозначено "лямбда NM 590 лизатов фага (лямбда Dam и лямбда Amy Г'. Фаг лямбда NM 590 Amy 1 сдан Earn) , индуцированных из не подавляна хранение в Национальную коплекцию ющих штампов. В -этой смеси любая 5 промышленных бактерий 12 февраля молекула ДНК, имеющая края cos ДНК 1980 г., как NCIB № 11569. лямбда и соответствующие размеры, может быть введена в протеин фага, Повторное клонирование гена амилатаким образом воссоздавая in vitro зы в плаэмиду pBR 322. биологически активную частицу фага, Это было сделано с целью штамма способную инфицировать Е. co?i и 10 сверхпродуцента, а также с целью попродуцировать центр инфекции (пятлучения большого количества ДНК с гено) . ном амилазы. Чтобы оценить эффективность этого 1 мкг ДНК из лямбда NM 590 Amy 1 способа, были выполнены два контроль и 0,3 мкг плазмиды pBR 322 расщепиных опыта. 15 ли, смешали и обработали лигазой, Образец смеси был посеян на как описано выше. Этот препарат приЕ. соїі, было найдено 3x1 0 ^ пятен на менили для трансформации (по обычной 1 мкг введенной ДНК лямбда. Это прибметодике) штамма НВ 101. Отбор пролизительно в 100 раз больше, чем найизводили пЬ сопротивляемости ампицилдено в расщепленном препарате, и 20 лину (ар) - свойству, которое сообуказывает на большую эффективность щается клеткам в присутствии этой обработки лигазой. плазмиды. Обычно эта плазмида сообщает также сопротивляемость к тетраПолученные таким образом пятна быциклину (Тс). Однако введение постоли исследованы визуально. Из них 70% 25 ронней ДНК в эту плаэмиду расщеплябыли прозрачные, а не мутные, что ется tet ген, таким образом содеруказывает на присутствие фрагмента жание чувствительных к тетрациклину ДНК Bacillus megaterium, который трансформированных клонов отражает стыкует и, следовательно, инактивисодержание содержащих плаэмиды клонирует лямбда ген СР, отвечающий за зо рованных ДНК. В данном случае 16% помутнение пятна. клонов содержали новую плазмиду, коТаким образом, можно оценить, что торая придавала амилазе активность препарат содержал случайно выбранный к Е. со 1 і (в соответствии с совреобразец всех возможных фрагментов менной международной номенклатурой Bacillus megaterium Hind Ш ДНК, совплазмид новые плазмиды, описываемые местимых с введением в фаг лямбда 35 в изобретении, называются (рСР), а NM 590. конкретная плазмида согласно настояОтделение деривата фага лямбда, щему примеру обозначена (рСР 1 ) . несущего амилазу Bacillus megaterium. Это показывает, что повторное кло^ нирование гена тем же самым ферменОстаток инкапсидированнои смеси 40 том (в данном случае Hind ПГ) являетбыл применен для заражения Е. coFi ся очень эффективным способом (16% на большом количестве крахмалсодервместо 1:10 ) . жащих посевов приблизительно 10 жизнеспособных частиц на посев. ПосШтамм, содержащий плазмиду, обозле роста зараженных Е. co?i и образоначен Е. coEi CL 7001 (рСР 1) и сдан вания пятен посевы были отсортирована хранение в Национальную коллекны на присутствие пятен разложения цию промышленных бактерий (NCIB) крахмала. Это было сделано путем 12 февраля 1980 г. как NC1B № 11570. • Амплификация и продуцирование феркратковременного действия на посевы мента . парами иода; предполагали, что пят50 но, образованное таким фагом, будет Продуцирование фермента в содерокружено прозрачной зоной, образуюжащих плазмиду (рСР 1) клетках улучщейся в результате диффузии и дейшено двумя способами. ствия амилазы из лизованных клеток. Насыщенные культуры. Одно такое пятно было найдено и Культуры инкубированы в течение фаг, содержащий это пятно, немедлен- 55 ночи при 37°С на вращающемся вибрано был отобран для субкультивироваторе в пятилитровых колбах Эрленмейния (длительное действие паров иода ера, содержащих 1 л культуральной убило бы ф а і ) . Потомство этого пятна 1233805 гррды (LB; дрожжевой экстракт для сравнения) в минуту в течение триптон), 10 мин инкубационного времени. СубХлорамфеникольная амплификация. страт был очень чистой амилачой. * Культуры инкубированы при 37 С ' Микроорганизм - донор продуцирона вращающемся вибраторе в пятилитвал 66,0 ферментных ед./л культуры. ровых копбах Эрленмейера, содержащих Насыщенные культуры Е. coFi CL 7001 I л культуральной среды (LE), до до(рСР 1) продуцировали 116,6 ед./л стижения плотности 0,8 (650 н м ) , культуры, тогда как после культивипосле чего добавили 150 мкг/мл хлоррования (амплификации) в течение 10 амфеникола. Это предотвратило даль5 ч с хлорамфениколом с последующим нейшую репликацию хромосомной ДНК, культивированием в течение 15 ч без но не репликацию содержащей ген амихлорамфеникола бактерии Е. cofi CL лазы плазмиды (рСР 1 ) . После ампли7001 (рСР 1) продуцировали 84,5 ед./л фикации (до 3000 копий) плазмиды по Это показывает, что метод насыщен15 ных культур обеспечивает достаточное сравнению с хромосомной ДНК хлорамфеникол был удален, чтобы мог проповышение продуцирования фермента. должаться синтез протеина. После Фермент, продуцированный бактерияамплификации клетки были отделены ми Е. соїі CL 7001 (рСР 1) идентифиот среды методом центрифугирования, цированный как альфа-амилаза, имеет 20 промыты для удаления хлорамфеникоследующие свойства. Он расщепляет ла и повторно культивированы для амилазу и амилопектин на глюкозу, продуцирования амилазы. мальтозу и мальтотриозу, главным образом мальтозу, и расщепляет циклоВыделение фермента. декстрин и мальтотриозу на глюкозу Для выделения альфа-амилазы в 25 и мальтозу. Кроме того, фермент расочень чистой форме применяли метод щепляет пуллулан на панозу и/или "осмотического шока". Способ, опиизо-панозу. санный X. С. Ней и Л. А. Хеппель в J. Віої. Chem 240, 3685-3692 (1965), Возникло предположение, что микзаключается в следующем. роорганизм Bacillus megaterium явля30 Сначала клетки культивировали в ется Baciflus circulaus. течение ночи, после чего их суспенП р и м е р 2. Клонирование тердировали в 25%-ном растворе сахаромостойкого гена альфа-амилазы. зы в 0,5 объема культуры и подвергМикроорганизмом-донором был исходли вибрации в течение 10 мин при ный штамм Bacillus, выделенный из 35 компоста и идентифицированный как 2й С, в результате такой обработки произошел плазмолиз клеток. Затем Bacillus coaguJaus. Он продуцирует добавили ЭДТА к 1 мм конечного расттеплостойкую альфа-амилазу и отличавора (чтобы стенки клеток стали ется следующими микробиологическими проницаемыми) и материал подвергли признаками: 40 вибрации в течение 10 мин при 24 С. морфология: палочки (0,6-1x2,5Суспензию центрифугировали и клетки 5,0 мкм)» подвижные, грамположибыстро повторно суспендировали в тельные и грамотрицательные, споры холодной (приблизительно 0°С) воде центральные или терминальные, не и подвергли вибрации при этой же •деформированные; 45 температуре еще 10 мин. Суспензию питательный бульон: хороший рост; снова центрифугировали и из всплывпитательный скошенный агар: хороший шего стюя можно было выделить 96% рост, нитевидные; раскидистые, крефермента. мово-белые; Дпя сравнения культивировали микпотребление органических кислот 50 лимонной: положительная реакция, мароорганизм - донор (Bacillus megaterium) и определили ферментативную лоновой: отрицательная; активность. Количество фермента на желатин: ожижение; 1 мп культуральной среды определили ° продуцирование ацетилметилкарбипо методу ДНС, причем одну ферментнола (ацетаина): положительная; 55 ную единицу определяли как количегидролич о-нитрофенилгалактозиди: ство фермента, продуцирующее 1 мг положительная; восстановленного сахара (с применевосстановление нитратов: положинием мальтозы в качестве эталона тельная, может получаться га-э; 7 1233805 Расщепленную ДНК смешивали и свякатапазная реакция: положительная; зывали с применением двух единиц продуцирование индола: отрицатель•ДНК лигазы фага ТА в смеси, содержаная; щей 60 мМ трнс -НС? СрН 8 ) , 10 мМ декарбоксилазная реакция на лисульфата магния, 10 мМ 2-меркаптозин : отрицательная; орнитин: отриэтанола и 0,1 мМ АТФ. Реакцию процательная ; аргинин: отрицательная; должали 10-15 ч при 10°С. После свяобразование сероводорода: отрицазывания аликвотные части 0,2 мкг тельная; ДНК смешали с АТФ для получения копотребление углеводов: потребляz нечной концентрации 10~ M. Эти аликет; 10 вотные части подвергли инкапсидации пуллулан потребляет на минимальin vitro и применили для инфицированой среде; ния штамма НВ 101 Е. со Hi. Было потребление многоатомных спиртов: получ-ено около 1 ,6x10 ПОЕ (пятнопотребляет глицерин, сорбитол, манобразующих единиц) иэ 1 мкг лямба нитол, инозитол; не потребляет адо1 ДНК. Некоторые из этих фагов прояви5 нитол, дульцитол; ли амилазнуго активность (обнаружение уреолиз: отрицательная; ' амилазной активности на чашках Петри потребление лецитина: отрицательвыделение « очистка фага аналогична ная; примеру 1). оптимальная температура роста 20 Наблюдалось довольно большое со50 С; максимальная температура росдержание продуцирующих амилазу фагов та 55-60 С, минимальная температура (1 в 400). Один был отобран, обознароста 15-25 С; чен "лямба NM 781 альфа Amy 1" и потребность в кислороде: аэробсдан на хранение в NC1B 12 февраля ный и анаэробный. 1980 г. как NC1B 8 11572. ° Штамм сдан на хранение в NC1B 12 февраля 1980 г., как NCIB № 11571 Повторное клонирование гена амилазы из лямбда NM 781 альфа Amy 1 в ДНК экстрагировали и подвергали плазмиду pBR 322. действию Е. со R I; Hind Ш; Rst I; Sal I; Bam HI и Bgl.n. Только BgX П 1 мкг ДНК лямбда NM 78! альфа Amy 1 30 и такое же количество ДНК плазмиды мог_ произвести много фрагментов в широком диапазоне молекулярных pBR 322 разрезали Eco R I при обычных весов. Однако можно было получить условиях. Связывание и трансформацию фрагменты с Eco R I и при концентвыполнили по методике, описанной в рации хлорида натрия менее 50 мМ. примере 1. Колонии Е. соРі, содержаПоэтому решили применять Eco R I 35 щне рекомбинантную плазмиду, обнарудля получения фрагментов для клонирожены по амилазной активности. Одна вания в Eco R I переносчика лямбда такая колония отобрана и обозначена ДНК (лямбда N - 781) . 11 Е. соїі CL 7002 (рСР 2) и сдана на хранение в NC1B 12 февраля 1980 г. Расщепление ДНК bacillus coagu40 под номером NC1B № 11573. laus и ДНК лямбда NM 781. Амплификация гена. 1,25 мкг ДНК лямбда NM 781 разреАмплификация кодирующего амилазу зали одной единицей Eco R І в 25 мкл гена лямбда NM 781 альфа Amy 1 и проследующего буферного раствора: 10 мМ дуцирование амилазы осуществлены тр*с -НСЄ (рН 7,5), 10 мМ 2-серкапто45 следующим образом. этанола, 10 мМ сульфата магния и Бактерия - хозяин (Е. соїі НВ 101) 100 мМ хлорида натрия. 2 мкг ДНК культивирована в LB среде с 2 мМ В. coagutaus разрезали тем же ферменхлорида магния при 37°С до достижетом в аналогичном буферном растворе ния оптической плотности 0,3 (650 нмХ за тем исключением, что концентрацию 50 Затем добавили фаг лямбда NM 78I хлорида натрия понизили до 50 мМ. альфа Amy 1, количество фагов было Инкубация продолжалась 2 ч при рассчитано так, чтобы множествен37 С и реакция была остановлена • О ность заражения составляла приблизинагреванием при 75 С в течение 10 мин. тельно 1-2, т.е. один или два фага Полноту расщепления контролировали 55 на одну бактериальную клетку. Затем методом электрофореза в 1%-ных агапродолжали культивирование при энеррозных гелях. гичном перемешивании при 37 С до поСвязывание и выделение рекомбинижения оптической плотности. Когда нантных фагов. 9 1 233805 10 оптическая плотность понизилась ниже-, зультате лнгации, была затем упако0,5» культуру собрали и положили вана in vitro и пятна были исследона лед. Культуру центрифугировали и ваны визуально путем посева на штамм всплывший слой испытали на амилазЕ. соїі Sup Е. Sup F. Пятна, поканую активность. зывающие амилаэную активность, были собраны и фаг очищен по описанной Амплификация и продуцирование методике. фермента Е. c o U CL 7002 (рСР 2) осуществлены по методам насыщенной Затем этот фаг был применен для культуры и амплификации хлорамфенилизирования штамма Е. coBi С 600 колом, как описано в примере 1, ,0 (CL 1205) по обычной методике, Лизогенные колонии были проварены визуАмилаэную активность определяли ально на крахмалсодержащей среде с по методу ДНС и в лизате фага и в применением метода окрашивания йодом. культурах Е. соPi, содержащих рекомЭтот штамм обозначен нами Е. со Pi бинантные плазниды. CL 7003 (лямбда альфа Amy 1) и сдан В табл. 1 представлены значения, на хранение в NC1B 6 марта 1980 г. полученные для амилазной активности под номером NC1B № 11586. в исходном штамме В. coagulaus , и распределение между внеклеточной и Амплификация гена осуществлена клеточной активностью. следующим образом. Приведены также активности, полуЛизогеи был выращен при 32 С в ченные с рекомбинантным фагом (лямбсреде LB до плотности 0,8 при 650 нм, да NM 781 альфа Amy 1) и штамм, созатем его центрифугировали и клетки держащий рекомбинантную плазмиду суспендировали в свежей среде LB, Е. с о К CL 7002 (рСР 2 ) . Достигнуто предварительно нагретой до А5 О. Попримерно трехкратное увеличение протом культуру инкубировали в водяной дуцирования фермента с применением бане при 45°С в течение 15 мин с церекомбинантного фага, и еще большее лью индуцирования литического цикла увеличение наблюдалось с плазмидой (так как ген иммунитета является (приблизительно в 300 раз). теплочувствительным), В случае применения фага (лямбда Затем продолжали инкубацию при NM 781 альфа Amy 1) весь фермент выэнергичном перемешивании при 37 С деляется вследствие лизиса клеток в течение 3 ч, после чего определяли и, следовательно, находится в кульамилазную активность во всплывшем туральной среде. В случае применения слое и в клетках. Значения приведены плазмиды большая часть фермента в табл. 1. 35 (96%) .находится в клетке. Этот эксперимент иллюстрирует метод "суб - субклонирования" из Повторное клонирование в дериват плазмиды в новый лямбда фаг. ДНК из фага лямбда, способный к лизису лямбда NM 781 альфа.Amy 1 может Е. co?i. быть так же легко субклонирована в Для иллюстрации приготовления 40 фаг лямбда ТА fig C1 857 Warn Earn системы переносчик - хозяин, содерSam или же донорная ДНК может быть жащей лямбда лизогенный Е. coEi, клонирована непосредственно в укапроведен следующий эксперимент. занный выше фаг, причем возможно Применен бактериофаг лямбда ТА любое количество вариантов описанtig CL 857 Warn Earn Sam (лямбда 45 ного способа. NM 989). Выделение и характеристика амилаЭтот фаг содержит ген ДНК лигазы зы, полученной из лямбда NM 781 альфа бактериофага ТА и способен к лизису Amy 1 Е. coli CL 7002 (рСР 2) и Е. сої і. Кроме того, он содержит Е. co£i CL 7003 (лямбда альфа Amy 1 ) . термочувствительный ген иммунитета 50 Как в примере 1, мы применили меи две амбермутации в гене Е и гене тод "осмотического удара" для выделеS соответственно. Мутация гена не ния фермента. Кроме того, так как дает бактерии лизироваться под дейфермент согласно этому примеру являствием инфекции этим фагом. Целью ется термостабильным, он мог быть субклонирования было заменить ген 55 далее очищен путем добавления к ДНК лигазы геном, кодирующим амилазу. водному 10 мМ раствору Са£ , подогреДНК фага и плаэмиды (рСР 2) были ва раствора до 80 С и выдержки в терасщеплены Eco R I и фрагменты были чение 10 мин; в результате такой связаны. ДНК фага, полученная в ре I I 1233805 12 рСР 2.3 и рС 194 были открыты обработки все протеины Е. coli осажHind Ш, смешаны и лигатированы для даются и можно получить альфа-амилазу образования новой плазмиды, обознав исключительно чистой форме, факченной рСН 1, содержащей кодирующий тически никакие другие ферменты не с альфа-амилазу ген и имеющей хлорамприсутствуют. феникольную и ампициллиновую сопроБыла определена специфичность альтивляемость, хотя уровень хлорамфефа-амилазы; она активна к амилозе никольной сопротивляемости в E.coFi и крахмалу, продуктами гидролиза явбыл низок. Препарат был применен ляются глюкоза, мальтоза и мальто(0 для трансформации Е. соїі НВ 101. триоза со следами компонентов с большим молекулярным весом. Этот фермент Штамм мутанта Bacillus sudtifis, не активен к.циклодектрину. Была обозначенный OB 1133, не проявляющий также исследована теплостойкость альфа-амилазной активности,был затем фермента и оказалось, что она очень обработан в соответствии с известным высока. Оптимальная температура акj 5 методом С. Чан и С. Когана для обтивности с 0,5£ амилозы находится в разования протопластов. Затем протоинтервале 80-90°С. С 8%-ным раствопласты были трансформированы рСН 1 римым крахмалом оптимальная темперапо методике трансформации в среде тура составляет около 100 С. полиэтилен-гликоля Чана и Когана Возможно, что микроорганизм Bacil- 3 0 (I biol). После этого протопласты были инlus coaguJaus фактически является кубированы в богатой среде в течение BacifZus Tichenitormis. і 1,5 ч, чтобы плазмида в бактерии П р и м е р 2 а . Субклонирование экспреесировала сопротивляемость плазмиды рСР 2 в плазмиду рС 194 и экспрессия новой плазмиды в Bacillus 2 5 к хлорамфениколу. Затем протопласты были посеяны subtitis. на регенерационную среду, к которой Рекомбинантная ДНК, полученная в был добавлен хлорамфеникол в количесоответствии с изобретением, может стве 20 мкг/мл. После инкубации в тебыть экспрессирована в бактерии - чение двух суток при 37 С появились хозяин, отличной от Е. coEi n а именколонии трансформированных клеток; но в штамме Bacillus subtiJis. эти колонии,'проявляющие альфа-амиПлазмида рСР 2 (пример 2) содерлазнута активность, были обнаружены жит фрагмент размерами 3,31 килобаз по методу окрашивания парами иода. из донора В. coaguTaus; кроме того, Один клон, обозначенный В. subtilis плазмида характеризуется тем, что 35 CL 8001 (рСН 1), сдан на хранение сообщает сопротивляемость к ампицил ЇЗ января (98! г. под номером NCJB лину и тетрациклину и содержит два № 11629. Исходный штамм QB 1133 тоже участка ограничения для каждого из сдан на хранение 13 января 1981 г. Есо R I и HindЇЇГ.Плазмида рСР 2 под номером NC1B № 11628. была расщеплена на 4 фрагмента Есо 40 R Ї и Hind И, обработана лигазой В. subtilis CL 8001 (рСН 1) стаи применена для трансформации НВ 101, билен только в присутствии хлорамфекак в предыдущих примерах. никола и может быть применен для продуцирования альфа-амилазы путем Получились новые плазмиды, обозкультивирования в среде, содержащей^ наченные нами рСР 2.3, имеющие фраг45 хлорамфеникол (20 мкг/мл). Альфа-амимент 2,64 килобаз ДНК В. coagulaus, лаза может быть легко выделена из причем указанный фрагмент содержит культурной жидкости. ген, кодирующий альфа-амилазу. ПлазПосле культивирования в течение мида рСР 2.3 имеет один участок для ночи в присутствии хлорамфеникола каждого Есо R I и Hind Ш и придает 5° количество продуцированной альфаампициллированную и терациклиновую амилазы было следующим, ед./л: сопротивляемость. всплывающий слой 136; клетки 14. П р и м е р 3. Клонирование бетаДля следующей стадии была выбрана амилазы. плазмида рС 194, которая известна 55 Микроорганизмом-донором был штамм своей способностью к репликации в Baci£?us cereus. Он сдан на хранение Bacillus subtilis. Плазмида рС Ї 94 в ферментативный исследовательский придает хлорамфеникольную сопротивинститут в Чиба-ши, Япония, 20 деляемость и икеет один участок Hindffl, 13 1233805 ' 14 1 кабря !973 г нод номером FERM-P ' получения лизогенных колоний по опи№ 2391, а также в Американскую колсанному выше методу. Штамм Е. соїі лекцию культур под номером АТСС С 600 лизогенный для этого рекомбиfr ЗМО*2 26 декабря 1974 г. Известно, нантного фага был выделен и обозначто он продуцирует как бета-амилачен Е. соН CL 7005 (лямбда бета 5 зу, так и альфа-1,6-глюкоэидазу. Amy 1 ) ; он сдан на хранение 15 сентября 1980 г. под номером NC1B Клонирование гена бета-амилазы в * 11603. лямбда NM 781. Амплификация гена амилазы. Принята такая же методика ограниЮ Во всех клонах и субклонах амилазчения, связывания и выделения, как ную активность определяли по методу в примере 2. ДНК (2 мкг) В. cereus ДНС. Бета-амилазная активность подбыла ограничена при обычных условитверждена хроматограммами ТСХ по ях ограничения ферментом Eco R I, присутствию единичного пятна мальтоДНК переносчика фага (1,25 лямбда зы после усвоения амилозы. NM 781) была разрезана тоже Eco R I. )5 Связывание и упаковка были осущестБыла осуществлена, по описанной влены, как описано выше. методике, амплификация гена бетаБыли обнаружены несколько рекомамилазы в различных клонах. бинантных фагов, проявляющих амилазВ табл. 2 представлена фёрментаную активность (приблизительно 1: 20 тивная активность исходных штаммов 500). Был отобран один из этих фагов по сравнению с активностью в трех (обозначенный "лямбда NM 781 бета клонах. Amy I") и сдан на хранение в NC1B Эта активность определена либо по 12 февраля- 1980 г. под номером NC1B № 11574. 25 Удара", описанному в примере 2. Повторное клонирование гена бетаП р и м е'р 4» Клонирование гена амилазы из лямбда NM 781 бета Amy 1 пулланазы. в плазмиду pBR 322. Микроорганизмом-донором был КїеЬsiella pucumoniaT, сданный на хранеС целью повышения продуцирования фермента этот первый клон бета-амила- 30 ние- в АТСС 6 июня 1963 г. под номером № 15050. зы был применен в качестве источника 2,25 i f r ДНК донора экстрагированы -k кодирующей бета-амилазу ДНК для суби фрагментированы Eco R І в обычных клонирования ее в мультикопию плазусловиях и 1,25 мкг ДНК лямбда NM 781 миды pBR 322, разрезаны этим же ферментом в таких 2 мкг ДНК лямбда Ш 781 бета 35 же условиях. Инкубация продолжалась Amy 1 и 1 мкг рВГ 322 были разрезаны 3 ч при 37°С, после чего реакцию Eco R I, смешаны и обработаны Т4 лиостановили путем нагрева в течение газой. Связывание и трансформация 10 мин при 75 С. Полноту ограничения осуществлены, как описано выше. определяли так, как описано в приОдна колония на 200 устойчивых 40 мере 2. к ампициллину колоний показала акОграниченные ДНК были связаны, тивность к разложению крахмала. Друвыделены и применены для инфекции гая выделена и обозначена Е. CoFi штамма Е. co?i HB 101 (согласно приCL 7004 (рСР 3) и сдана на хранение меру 2 ) . Получено около 2x10^ ПОЕ 15 сентября 1980 г. под номером NC1B (пятнообразующих единиц) на 1 мкг № 11602. ПЧК лямбда. Повторное клонирование гена бетаамилазы в дериват фага лямбда, способный к лизису Е. coBi, После двухсуточной инкубации при В качестве переносчика был приме37 С на чашках Петри, содержащих ВВІ 50 Триптиказу плюс 0,25% пуллулана, ненен термочувствительный лямбда Т4 Jig фаг С1 857 Warn Earn Sam (Лямбда. которые пятна показали пуллуланазNM 989), описанный в примере 2. Оконую активность, т.е. они были окруло 1 мкг ДНК плазмиды рСР 3 и 0,5мкг жены мутными кольцами, характерными ДНК фага были расщеплены, затем фрагдля "чрезмерно разросшихся" бактерий. менты связаны вместе и полученные Содержание продуцирующих пуллуланоэу части ДНК упакованы in vitro. Частифагов было порядка 1:2 500. цы фага, проявляющие амилазную активОдин был отобран и обозначен ность, были выделены и применены для "лямбда NM 781 Pul I м ; он сдан на 15 233805 и сдан на хранение 15 сентября хранение в NCI Б 9 апреля 1980 г. ; 1980 г. под номером NClB i 1160S. f под номером NC1B № 11593. Третий субклон создан путем ввеПуллуланззную активность опредедения фрагмента 6,1 килобаз в фаг ляли по методу ДНС, и продукт гидролиза пуллулана лизатами фага иденлямбда NM 989 согласно примеру 2. 5 тифицировали как мальтотриозу методом Этот клон назван Е. coti CI 7007 тонкослойной хроматографии. (лямбда Puf 2) и сдан па хранение 15 сентября 1980 г. под номером Лямбда NM 781 PuP 1 содержит больNC1B № 11606. шой фрагмент ДНК (из K¥ebsie!J!a pneumonike) 13,5 килобаз; этот фраг- (0 Уровень экспрессии и амплификации пуллуланазы был изучен у всех мент был снова расщеплен Eco R I на клонов. два фрагмента 6,1 и 7,4 килобаз. Затем субфрагмент 6,1 килобаз был повВ табл. 3 дана экспрессия пуллуторно клонирован в лямбда NM 781 и нанаэЪ! КЇеЬйіеїїа в клонах Е. coti установлено, что он содержит ген * 15 ( активность выражена в единицах мальтозы, эквивалентных 1 л культупуллуланазы. Этот новый рекомбинантры) . ный фаг назван лямбда NM 781 PuJ 2 и сдан на хранение 15 сентября 1980г. Как можно видеть из результатов, пуллуланазЪая активность индуцнруетпод номером NC1B № 11604. 20 ся мальтозой путем добавления 0,04% Субсерия 6,1 килобаз была затем мальтозы в срезу. Кроме того, для еще клонирована в мультикопию плазвыделения пуллуланазы необходима миды рАСУС 184 (дериват pBR 322 с г обработка Triton x І 00 мембранной Т с геном последнего и С т геном с фракции, и это указывает на то, что одним участком Eco R I ) . Этот новый 25 активность локализована в мембранах. клон назван Е. co2i CL 7006 (рСР 4) Т а б л и ц а Культура Всплывший слой Периплаз Клетки ма 1 Увеличение продуцирования фермен та В. coaguJaus 42 Лямбда NM 781 альфа Amy 1 144 Е. coZi CL 7002 (рСН 2) с Cm амплификапия 230 Е. соїі CL 7002 (рСН 2 ) , культивирование в течение ночи 276,2 Е. соїі CL 7003 (лямбда альфа Amy 1) 23 3,43' 5700 12960 141,2 232 320,6 I 162 26,1 Одна единица определена как количество фермента, дающее 1 мл эквивалента мальтозы на 1 мл мин при 50 С с применением в качестве субстрата 0,5% амилозы. Метод осмотического шока не был применен, но был осуществлен лизис, так что э^о значение представляет сумму амилазной активности в периплазме и клетках. 17 18 ?338О5 Т а б л и ц Культура Клеточная активность, ед./л (%) Общая активность, ед./л (%) Не определялась Внеклеточная активность, ед./л (%) а 1420 Bacifluscereus АТСС З П 0 2 * * Н20 Лямбда NM 781 бета Amy 1 80 Е. соїі CL 7004 (pCP 3 ) * * * 59 (77,2) 17,4 (22,8) 76,4 E. соїі CL 7005 (лямбда бета Amy 1) 19(44,2) 24 (55,8) 43 80 Клеточная активность: обработка лизоцимом с лизисом клеток . Культура выдержана в течение ночи при 30 С (дрожжевой экстракт, 1 %; бактотриптон 1%; хлорид натрия 0,5%). Культуры выдержаны в течение ночи при 37 С и в таком же составе культуральной среды. Культивирование при 32—»-45—*-37°С, активность определяли в всплывшем слое и в клетках после лизиса, как для Е. соїі лямбда Amy 1 в примере 2. Т а б л и ц а 3 Культура ВСПЛЫВШИЙ Мембраны СЛОЙ Увеличение продуцирования фермента г 1 4 KTebsieTta мальтоза 24 3,5 1 NM 781 Риї І 0,76 2,6 0,14 NM 781 Риї 1+ мальтоза 2,2 9,84 0,44 NM 781 Риї 2 9,6 23,8 1,19 NM 781 Риї 2+ мпльгота 8,6 26,7 1,28 Не определяли 3,4 0,123 *Ї:. гоїі CL 7006 fpCH 4) 2 0 123J8O5 Продолжение табл.З *Е. coti CL 7006 (pCP 4) + мальтоTo же Е. соїі CL 7007 (лямбда PuB 2) + мальтоза 114 4.Ї4 47 93,5 5,13 Культуры, выдержанные в течение ночи. Культивирование при 32—»-45—*37 С; активность измеряли в вспттывшем слое и в клетках после лизиса, как для лямбда альфа А 1 Е. со в примере 2. Редактор Г. Волкова Составитель Л, Чибисова Техред И.Попович Корректор М. Максимишинец Заказ 2787/59 Тираж 490 Подписное ВНИИЇЇИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий П3035, Москва, Ж-35, Раушская наб.» д. 4/5 Произволетвенно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектнаяs 4