Спосіб генерування інфекційного клону на основі геному рнк-вірусу з позитивним ланцюгом родини arteriviridae, молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, модифікований рнк-вірус, вакцина, що його включає, та к

Даний винахід стосується області РНК-вірусів і інфекційних клонів, отриманих із РНК-вірусів. Крім того даний винахід стосується вакцин і діагностичних аналізів, розроблювальних шляхом використання і модифікації таких інфекційних клонів РНК-вірусів. Технологія рекомбінантних ДНК являє собою надзвичайно різноманітні і потужні методи молекулярної біології, здійснювані за допомогою модифікації нуклеїнових кислот на рівні ДНК, і дозволяє аналізувати і модифікувати геноми на молекулярному рівні. Відповідно до цього, віруси, через малий розмір їх геному, є особливо відповідними для таких маніпуляцій. Однак, техніка рекомбінантних ДНК не може бути безпосередньо застосована до неретровірусних РНК-вірусів, оскільки реплікація цих вірусів не включає стадію проміжних ДНК. У випадку таких вірусів, перед застосуванням технології рекомбінантних ДНК, повинні бути розроблені інфекційні клони (наприклад, ДНК-копії або in vitro-транскрибовані РНК-копії або їх похідні), які можуть бути введені в геном цих вір усів для генерування модифікованого вірусу. Інфекційні клони можуть бути отримані за допомогою конструювання повнорозмірної (що має довжину геному) кДНК (це поняття використовується в даному описі в широкому значенні і включає ДНК-копію РНК, а не тільки ДНК-копію мРНК) досліджуваного вірусу, після чого інфекційний транскрипт синтезується in vivo у клітинах, трансфекованих повнорозмірною кДНК, але, при цьому, інфекційні транскрипти можуть бути також отримані шляхом in vitroтранскрипції з in vitro-лігованих фрагментів кДНК, які складають повний вірусний геном. В усіх випадках, транскрибована РНК несе всі модифікації, які були введені в кДНК, і може бути використана для подальшого переносу модифікованого таким чином вірусу. Інфекційні кДНК-клони і інфекційні in vitro-транскрипти були генеровані для великої кількості РНК-вірусів із позитивним ланцюгом (див. огляд Воуеr & Наеnnі, Virology 198, 415-426), які мають геном розміром аж до 12 т.п.о. або трохи більше. Довжина вірусного гена Pestiviruses на сьогоднішній день є найбільшим геномом РНКвірусу з позитивним ланцюгом, із якого були отримані інфекційні клони (Moormann et al., J.Vir.70:763-770). Проблеми, пов'язані з довжиною вірусного геному, полягають не тільки у важкості одержання і збереження довгих і стабільних кДНК-клонів у бактеріях, але також і в інфекційності вихідного РНК-транскрипта, реплікація якого у клітині-хазяїні повинна бути здійснена без допомоги звичайно асоційованих вірусних білків, зв'язаних із реплікацією вірусу. Для досягнення успішного зараження, вірусні транскрипти повинні взаємодіяти з білками, які кодуються вірусом, цілком ймовірно, із вірусною репліказою і компонентами клітини-хазяїна, такими як, трансляційний комплекс; а тому структура вірусни х транскриптів повинна, по можливості, найбільш точно імітувати структур у РНК-віриону. Додаткові проблеми можуть виникнути в зв'язку з тими РНК-вірусами з позитивним ланцюгом, які реплікуються згідно з механізмом субгеномної інформаційної РНК, транскрибованої з 3'-кінця геному і з тими РНК-вірусами з позитивним ланцюгом, які генеруються в процесі реплікації дефектних частинок, що інтерферують, таких як, "голі" капсиди або "порожні" вірусні частинки з оболонкою, які містять декілька структурних білків, і тільки частину геному. Присутність неповних фрагментів вірусної РНК або, наприклад, матриксних або нуклеокапсидних білків, які взаємодіють або інтерферують із транскрибуємою вірусною РНК або з репликативною проміжною вірусною РНК, і руйнуючих її стр уктуру, буде призводити до припинення синтезу повнорозмірного ланцюга РНК, і, тим самим, до продукування інфекційного вірусу, який містить повну геномну РНК. Лелістадський вірус (LV), називаний також вірусом репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV, довжина геному 15,2т.п.о.), є членом родини Arteriviridae, яка також включає вірус артриту коней (EAV, довжина геному 12,7т.п.о.), вірус підвищення рівня лактат-дегідрогенази (LDV, довжина геному, принаймні, 14,2т.п.о.), і вірус геморагічної лихоманки мавп (SHFV, довжина геному приблизно 15 т.п.о.) (Meulenberg et al., 1993a; Plagemann & Moennig, 1993). Нещодавно, Міжнародний комітет по таксономії вірусів вирішив включити цю родину в новий ряд вірусів, Nidovirales, разом із вірусами Coronaviridae (довжина геному 28-30т.п.о.) і Toro viridae (довжина геному від 26 до 28т.п.о.). Ряд Nidovirales являє собою РНК-віруси з оболонкою, які містять геном РНК із позитивним ланцюгом, і синтезують 3'-гніздову серію субгеномних РНК в процесі реплікації. Субгеномні РНК коронавірусів і артеривірусів містить лідерну послідовність, яка починається з 5'-кінця вірусного геному (Spaan et al., 1988; Plagemann & Moennig, 1993). Субгеномні РНК торовірусів не мають лідерної послідовності (Snijder & Horzinek, 1993). Відкриті рамки зчитування (ОРС) 1а і 1b, які кодують РНК-залежну РНК-полімеразу, експресуються з геномною РНК, тоді як, більш дрібні ОРС у 3 і кінця геномів Nidovirales, які кодують структурні білки, експресуються із субгеномних мРНК. PRRSV (лелістадський вірус) був уперше виділений у 1991 році Wensvoort et al, (1991) і було показано, що він є етнологічним агентом, який викликає нове невідоме захворювання, таке як, репродуктивно-респіраторний синдром свиней (PRRS) , Основними симптомами захворювання є утр уднення дихання у свиней і викидні у свиноматок. Хоча основні спалахи цього захворювання, які спостерігалися вперше в США в 1987р. і в Європі в 1991p., носили обмежений характер, цей вірус усе ще викликає економічні втрати в поголів'я свиней у США, Європі і Азії. PRRSV переважно розвивається в альвеолярних макрофагах легень (Wensvoort et al., 1991). Декілька клітинних ліній, таких як CL2621, і інші клітинні лінії, клоновані з клітинної лінії нирок мавп МА-104 (Benfield et al., 1992, Collins et al., 1992; Kim et al., 1993), також є сприйнятливі до цього вірусу. Деякі добре відомі штами PRRSV є доступними під реєстраційними номерами CNCM 1-1102,1-1140, 1-1387,1-1388, ЕСАСС V93070108, або АТСС VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 і VR 2402. Геном PRRSV був цілком або частково секвенований (Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al., 1993a, Murt-haugh et al., 1995)., і цей геном, крім РНК-залежнЬї РНК-полімерази (ОРС 1а і 1b), кодує: шість стр уктурних білків, із яких чотири оболонкових глікопротеїна позначені GР2 (ОРС2), GP 3 (OPC3), GP4 (OPC4) і GP 5 (OPC5); неглікозилований мембранний білок Μ (ОРС6); і н уклеокапсидний білок N (ОРС7) (Meulenberg et al., 1995, 1996; van Nieuwstadt et al., 1996). Імунологічна характеризація і нуклеотидне секвенування штамів ЕР і US PRRSV дозволили ідентифікувати серед штамів PRRSV невеликі антигенні різниці, локалізовані в структурних вірусних білках (Nelson et al., 1993; Wensvoort et ai., 1992; Murtaugh et al., 1995). Свині можуть бути інфіковані PRRSV шля хом ороназального введення. Вірус в легенях поглинається альвеолярними макрофагами легень, і реплікація вірусу PRRSV у цих клітинах завершується через 9 годин. За 12 годин PRRSV із легень потрапляє в легеневі лімфатичні вузли, а через 3 дні він потрапляє в периферичні лімфовузли, кістковий мозок, і в селезінку. В ци х ділянках, лише декілька ліній клітин давали позитивне забарвлення на вірусний антиген. Цей вірус є присутнім у крові протягом, принаймні, 21 дня, а часто і більш тривалий час. Через 7 днів, у крові виробляються антитіла проти PRRSV. Спільна присутність вірусу і антитіла в PRRSV-інфІкованих свиней вказує на те, що, незважаючи на присутність антитіла, вірусна інфекція зберігається протягом тривалого періоду часу, хоча і на низькому рівні. Протягом, принаймні, 7 тижнів, популяція альвеолярних клітин у легенях відрізняється від популяції в нормальних легенях SPF. Для інфікування свиней вірусом PRRSV ороназальним способом і продукування нормальної імунної відповіді у свиней потрібна присутність вірусної оболонки, яка, крім іншої дії, викликає продукування нейтралізуючих антитіл, спрямованих проти одного або декількох оболонкових білків; такі антитіла можуть робити вірус неінфекційним. Проте, після поглинання альвеолярними макрофагами, цей вірус також продукує "голі" капсиди, сконструйовані з РНК, інкапсулованої білками·Μ та/або Ν, які іноді містять один із глікопротеїнів. Внутрішньоклітинна і позаклітинна присутність цих неповних вірусних частинок або (іноді) голих капсидів може бути продемонстрована за допомогою електронної мікроскопії. В деяких випадках, можуть бути виявлені голі капсиди без нуклеїнової кислоти, що міститься в них. Голі капсиди поширюються по організму з кровотоком, і поглинаються з крові макрофагами селезінки, лімфатичних вузлів і кісткового мозку. Ці "голі", але інфекційні вірусні капсиди не можуть бути нейтралізовані антитілами, вироблюваними організмом свині, чим і пояснюється персистентність вірусної інфекції в присутності антитіл. Таким чином, потомство макрофагів від інфікованих клітин кісткового мозку поширює вірусну інфекцію на нові ділянки організму тварин. Оскільки не всі клітини лінії диференційовання макрофагів кісткового мозку є інфікованими, то лише невелика кількість макрофагів у периферичних ділянках є інфікована і продукує вірус. Капсиди PRRSV, які складаються тільки з білків ОРС7, можуть бути утворені у відсутності інших вір усних білків, наприклад, шляхом інфікування макрофагів химерним веісгорним вірусом "псевдорабівірус-ОРС7". Вірус PRV був підданий маніпуляції так, щоб він містив ОРС7-генетичну інформацію PRRSV. Через 18 годин після інфікування, цитоплазма інфікованих клітин містить велику кількість невеликих порожніх сферичних стр уктур, які мають розмір нуклеокапсидів вірусу PRRS. Таким чином даний винахід відноситься до інфекційного клону, який походить від вірусу з довжиною геному, що значно перевищує максимальну довжину геному РНК-вірусів із позитивним ланцюгом, із яких дотепер одержували інфекційні клони. В експериментальній частині даної заявки описано одержання інфекційного клону, на основі або клону, який походить, від вірусу PRRSV, із довжиною геному 15,2т.п.о., однак, такі клони можуть бути також отримані з вірусів LDV і SHFV, що також мають довжину геному від приблизно 15т.п.о., і з вірусу EAV, хоча довжина його геному значно менша/ а також із вірусів із більш довгим геномом, таких як, Coronavirjdae або Toroviridae. Даний винахід також стосується способу продукування інфекційних клонів, який дозволяє уникнути проблем, які виникають при синтезі вірусного ланцюга РНК, і зв'язаних із присутністю фрагментів неповної вірусної РНК, або наприклад, матриксних або нуклеокапсидних білків, які взаємодіють або інтерферують із РНК-транскриптом, які транскрибуються, або з репликативною проміжною РНК, і руйнуючи її структур у, що перешкоджає синтезу повнорозмірного РНК-ланцюга, і, тим самим, продукуванню інфекційного вірусу. Даний винахід стосується способу генерування інфекційних клонів шляхом трансфекцкії клітин-хазяїв, які є, в основному, не сприйнятливими до інфікування вірусом дикого типу, рекомбінантною нуклеїновою кислотою, отриманою на основі геному зазначеного вірусу, із наступним "порятунком" потомства інфекційного вірусу з зазначеної клітини-хазяїна шляхом його пасививання на клітини або шляхом спільного культивування з клітинами, які є сприйнятливими до цього вірусу. В порівнянні з клітинами, які звичайно використовуються для реплікації досліджуваних вірусів, клітини, що є, в основному, не сприйнятливими, можуть бути лише злегка сприйнятливими, або зовсім не сприйнятливими до досліджуваного вірусу, але вони можуть бути абсолютно сприйнятливими до інших вірусни х штамів. Даний винахід стосується способу продукування інфекційних клонів шляхом трансфекції клтин-хазяїв, які не є сприйнятливими до інфікування вірусом дикого типу, що дозволяє уникнути генерування голих капсидів або неповних вірусних частинок, які містять РНК-фрагменти і матриксні або нуклеокапсидні білки, які перешкоджають синтезу вірусного РНК-ланцюга. "Порятунок" інфекційного вірусу з трансфекованих таким чином клітин-хазяїв здійснюють шляхом пасивування на клітини, які є сприйнятливими до цього вірусу. В експериментальній частині описаний спосіб такого одержання інфекційного клону PRRSV, але цей спосіб може бути також застосований до інших РНК-вірусів із позитивним ланцюгом. Даний винахід також передбачає можливість генерування модифікованого інфекційного клону шля хом застосування технології рекомбінантних ДНК. Такими модифікаціями можуть бути одиночні або множинні мутації, заміни, делеції або інсерції, або їх комбінації, які можуть бути здійснені з використанням технології рекомбінантних ДНК, відомої фахівцям. Таким чином, даний винахід стосується модифікованих РНК-вірусів, які можуть бути використані для дослідження РНК-вірусів і для виготовлення вакцин. Даний винахід також стосується інфекційних клонів, які походять, наприклад, від Arteriviridae, такого як, PRRSV, який може бути використаний в якості моновакцини проти захворювання, що викликається вірусом, на основі якого був отриманий цей клон. Так, наприклад, інфекційний клон на основі PRRSV може бути використаний для дослідження маркерів вірулентності або серологічних маркерів PRRSV. Відомими серологічними маркерами PRRSV є, наприклад, маркери, локалізовані, наприклад, на будь-якому із структурних білків PRRSV, що кодуються ОРС2-7, але вони можуть бути також виявлені в білках, що кодуються ОРС 1а і 1b. Маркери вірулентності присутні в ОРС 1а і 1b, які кодують неетруктурні білки PRRSV, але вони можуть бути також виявлені в білках, які кодуються ОРС2-7. Шляхом модифікації геному інфекційного клону, що стосується цих маркерів, можна одержати PRRSV, який не є або є значно менше вірулентним, ніж його батьківський штам, та/або цей штам модифікують шля хом делеції або введення серологічних маркерів так, щоб можна було здійснювати серологічну диференціацію між вакцинованими свинями і свинями, інфікованими вірусом дикого типу. Такі модифікації здійснюють, наприклад, із використанням інфекційних клонів PRRSV, у яких нуклеотидну послідовність, яка кодує ОРС7-білок N, замінюють ОРС7-білком АТСС VR2332 або LDV. Даний винахід також стосується інфекційних клонів, наприклад, клонів, які походять від вірусів Arteri viridae, таких як, PRRSV, які можуть бути використані в якості системи доставки або в якості вірусної векторної вакцини для широкого ряду антигенів. В таких клонах присутні гетерологічні послідовності нуклеїнових кислот, які не відповідають патогенній послідовності досліджуваного вірусу. Ці гетерологічні послідовності нуклеїнових кислот можуть, наприклад, походити від послідовностей, які кодують будь-який обраний антиген. Таким антигеном є білок або пептид, який може індукувати імунітет проти патогена. Оскільки цей вірус інфікує макрофаги, і клітини лінії диференціювання макрофагів у кістковому мозку поширюють антиген-вміщуючий вірус через своє клітинне потомство, то ця вірусна векторна вакцина інфікує клітини, які є центральними стосовно імунної системи, і може презентувати антигени для подальшого процесування. Векторна вірусна вакцина інфікує антигенпрезентуючі клітини подібно дендритним макрофагам або клітинам Купфера або іншим клітинам імунної системи, і може здійснювати це як (неповністю) вірусна частинка з оболонкою або як гола капсидна частинка. Оскільки інфікування голим капсидом або неповною вірусною частинкою забезпечує персистентну інфекцію, то імунологічний бустер-ефект буде викликати тривалий (через безперервну стимуляцію на низькому рівні) імунітет проти патогенів, із яких були відібрані антигени. Цей вірус може бути використаний в якості антигену-носія шляхом введення інформації для епітопів інших патогенних мікроорганізмів або речовин. Деякі з таких векторних вакцинних вірусів, що несуть чужорідну епітопну інформацію, можуть бути змішані і введені одночасно. Це дозволяє забезпечувати активний імунітет проти декількох різних антигенів одного патогена, або активний імунітет проти декількох різних патогенів. Даний винахід також стосується інфекційних клонів, наприклад, отриманих від вірусу Arteriviridae, такого як, PRRSV, який може бути використаний в якості вакцини подвійного призначення. Так, наприклад, інфекційний клон на основі PRRSV може бути використаний для створення вакцини з метою захисту від PRRSV і від іншого патогена, просто шляхом розробки векторної вакцини разом із розробкою одноцільової вакцини спрямованої проти PRRS. Спеціальна вакцина подвійного призначення може бути розроблена так, щоб вона забезпечувала захист проти респіраторного захворювання у свиней шляхом введення в PRRSвакцини антигенів, які походять від будь-яких інших респіраторних патогенів широкого ряду, які, як відомо, інфікують свиней. Даний винахід також стосується вакцин, як одного призначення, так і подвійного призначення або до векторних вакцин, які є безпечними в тому значенні, що вони не можуть впливати на навколишнє середовище. Безпека вакцини (яка не впливає на навколишнє середовище) може бути забезпечена шляхом видалення інформації, яка відноситься до вірусних білків, і яка є необхідною для продукування інфекційного вірусу з оболонкою. Цей вірус повинен розмножуватися в клітинній лінії, яка конститутивно експресує зазначений білок. Вірус, який реплікується в цій комплементарній клітинній лінії, має повну оболонку, і здатний інфікувати макрофаги у свиней. Після одного циклу реплікації, вірусне потомство, що не містить інформації для білка оболонки, більше не здатне інфікувати інші клітини, на відміну від вір усу з оболонкою. Інфікування макрофагів, які знаходяться в організмі ще можливо під дією голого капсиду або неповної вірусної частинки. Даний винахід також стосується вірусних антигенів і білків, які можуть бути зібрані з клітинних культур, інфікованих модифікованими РНК-вірусами даного винаходу. Такі антигени можуть бути використані для діагностичних аналізів, таких як, ELISA або діагностичних аналізів іншого типу, відомих експерту в даній області. Ці аналізи можуть бути використані у вигляді незалежних тестів для первинної діагностики або у вигляді супровідних тестів, застосовуваних для популяцій тварин, які були вакциновані ідентифікувальною або маркерною вакциною, отриманою на основі РНК-вірусів даного винаходу. Експериментальна частина Продукування кДНК-клонів, із яких інфекційні РНК можуть бути транскрибовані in vitro, стало головним інструментом для молекулярно-генетичних аналізів вірусів, які містять РНК із позитивним ланцюгом. Ця технологія може застосовуватися до вірусів, які містять РНК із позитивним ланцюгом, і РНК-геном яких може функціонувати як мРНК і ініціювати повний цикл інфікування після його введення в клітини-хазяїни. Для ряду вірусів були описані інфекційні клони, що полегшило дослідження з генної експресії, реплікації, функціонуванню вірусних білків, і рекомбінації РНК-вірусів (див.о гляд Воуег & Наеппі, 1994). Крім того, ці клони можуть бути використані для розробки нових вірусних векторів і вакцин. Інфекційний кДНК-клон для Arteri viruseg не був описаний дотепер. У даній заявці описане продукування інфекційного клону PRRSV і його перше застосування для одержання химерних вірусів PRRSV. Матеріали і методи Клітини і віруси Штам Ter Huurne PRRSV (або LV) {депонований у CNCM, Париж, під номером доступу 1-1102) був виділений у 1991p. (Wensvoort et al., 1991), і культивований у первинних альвеолярних макрофагах або в клітинах CL2621. У цьому дослідженні використовували пасаж 6 штама Ter Huurne (TH), а також похідний штам LV4.2.1, який був адаптований для росту на клітинах CL2621 шляхом серійного пасивування. Альвеолярні макрофаги підтримували - на ростовому середовищі RPMI-1640 (Flow), а клітини CL2621 підтримували на мінімальному підтримуючому середовищі Хенкса (Gibco BRL/Life Technologies). Клітини ВНК21 підтримували на мінімальному підтримуючому середовищі Дульбекко. Для експериментів по трансфекції, клітини ВНК-21 культивували на мінімальному підтримуючому середовищі Глазго (Gibco BRL/Life Technologies) відповідно до методу Liljestrom і Garoff(1993). Виділення вірусних РНК Внутрішньоклітинну РНК виділяли з альвеолярних макрофагів або клітин CL2621, через 24 години після інфікування вірусом PRRSV при множинності зараження 1, як описано раніше (Meulenberg et al., 1993a). Для виділення геномної РНК віриону, віриони були очищені на градіантах сахарози як описано Nieuwsstadt і ін. (1996) і ресуспендовані в TNE (0,01Μ Трис-НСІ, рН 7,2, 0,1Μ NaCI, 1мМ EDTA). 1мл протеїназного буфера К (100мМ Трис-НСІ, рН 7,2,25мМ EDTA, 300мМ NaCI, 2% (мас/об.) ДСН) і 0,4мг протеїнази К (Boehringer Mannheim) додавали до 1мл очищених вірионів PRRSV (108 TCID50). Цю реакційну суміш інкубували при 37°С протягом 30 хвилин. РНК екстрагували один раз сумішшю фенолу і хлороформу (1:1), і осаджували етанолом. РНК зберігали в етанолі при – 20°C. Одну десяту частину цього препарату використовували в реакціях зворотної транскрипції (RT). Клонування 5'- і 3'-кінців геному PRRSV 5'-кінець вірусного геному PRRSV клонували з використанням модифікованого методу одноланцюгового лігування в одноланцюгову кДНК (SLIC; Edwards et al., 1991). Одну десяту частину віриону РНК, отриману як описано вище, використовували в реакції RT з праймером 11U113 (5’-TACAGGTGCCTGATCCAAGA 3’), комплементарним нуклеотидам 1232-1251 геному. Реакцію RT здійснювали в кінцевому об'ємі 20мкл, як було описано раніше (Meulenberg et al., 1993b). Потім 2мкл 6М NaOH додавали до RT-реакційної суміші, і РНК гідролізували протягом 30 хвилин при 37°С. Одноланцюгову кДНК очищали з використанням набору Boehringer Mannhiem для високого ступеня очищення PCR-продукту. Очищен у кДНК осаджували етанолом, ресуспендували в ТЕ, і лігували з якірним праймером ALG3 (5'-CACGAATTC ACTATCGATTCTGGATCCTTC 3’). Цей праймер містить EcoRI-, Clal, і BamHI-сайти, а його 3'-кінець модифікований аміно-блокувальною групою для попередження самолігування. Одноланцюговий кДНК-продукт був лігований із 4пмоль ALG3 у 50мм Трис-НСІ (рН 8,0), 10мм МпСІ2, 10мкг/мл BSA, 25% ПЕГ, 1,0мм гексамінхпориду кобальту, 40мкМ АТР, і 0,5мкл (10од.) РНК-лігази Т4 (New England Biolabs), протягом ночі при кімнатній температурі. Одну третин у реакційної суміші для лігування використовували в якості матриці для PCR із використанням праймерів LV69 (5'-AGGTCGTCGACGGGCCCCGTGAT-CGGGTACC-3’) і ALG4 (S'-GAAGGATCCAGAATCGATAG). Праймер LV69 комплементарний нуклеотидам 594-615 геному LV, а праймер ALG4 комплементарний якірному праймеру ALG3. Умови PCR були описані Meulenberg et al., (1993b), і отриманий продукт був гідролізований ферментами EcoRI і Sail і клонований у pGEM-4Z. Аналогічну стратегію використовували для клонування 5’-кінців LV-геному з внутрішньоклітинної РНК LV. З цих експериментів було використано 10мкг повної клітинної РНК, виділеної з клітин CL2621, інфікованих LV. 5'кДНК-клони секвенували, і один клон, pABV387, який містить подовження у 10 нуклеотидах, у порівнянні з опублікованою послідовністю PRRSV (Meulenberg et al., 1993a), використовували для проведення наступних експериментів. 3’ кінець кДНК-кпону, який містить довгий poly (А)-хвіст, конструювали за допомогою зворотної транскрипції РНК LV із використанням праймера LV76 (5’-TCTAGGAATTCTAGACGATCG(T)3'), який містить EcoRI-, Xbal-, і Pvul-сайти. Після реакції зворотної транскрипції проводили PCR із використанням праймера LV75 (5r-TCTAGGAATTCTAGACGATCGT-3 r), який ідентичний праймеру LV76, за винятком роІу(Т)-хвоста; і праймера 39U70R (5'-GGAGTGGH AACCTCGTCAA-3'), значеннєвого праймера, відповідного нуклеотидам 14566-14585 геному LV і який містить Hpal-сайт. Отримані PCR-продукти гідролізували ферментами НраІ і EcoRI і клонували в кДНК-клон pABV39, рестриктований тими ж ферментами (фіг.1). Два клони кДНК, які містять роІу(А)-хвіст із 45A (pABV382) і 109A (pABV392) і правильну геномну кДНК-послідовність, як було оцінено за допомогою олігонуклеотидного секвенування, використовували для конструювання повнорозмірного геномного кДНК-клону. Аналіз послідовності Олігонуклеотидні послідовності визначали з використанням набору для секвенування PRISMÔ Ready Reaction Dye DeoxyÔ Terminator Cycle Sequencing Kit і автоматичного секвенатору Applied Biosystems. Конструювання повнорозмірньк геномних кДНК-клонів PRRSV кДНК-кпони, генеровані раніше для визначення нуклеотидної послідовності геному LV (Meulenberg et al., 1993а), лігували разом у відповідних рестрикційних сайтах, вказаних на фіг.1. Плазміду pABV254 конструювали з клонів pABV 25, 11, 12 і 100, і використовували в попередньому дослідженні (den Boon et al., 1996), Стандартні процедури клонування здійснювали як описано Sambrook і ін. (1989). В результаті були отримані три плазміди, які містять кДНК-послідовності LV, які перекриваються, у висококопійній плазміді pGEM-4Z. Плазміди pABV331 і pABV369 складалися з нуклеотидів 5-6015 геному LV. В серії з 6 незалежних кДНК-клонів, які були секвеновані в цій області, була виявлена різниця в нуклеотидах положення 3462 у відношенні 1:1. Ця різниця в нуклеотидах призводила до заміни амінокислоти в положенні 1084 у ОРС 1А (Leu замість Pro). Оскільки неможливо було передбачити вплив цієї амінокислоти на інфекційність, то був також клонований Leu-кодуючий кДНК-фрагмент у pABV331 шляхом заміни в EcoPV-(нуклеотид 3403) і SасІІ(нуклеотид 3605) сайті, що призводило до одержання плазміди pABV369. Плазміда pABV384 складається з нуклеотидів 5168-9825 геному LV. Оскільки поки не існує відповідного кДНК-клону, який перекривався б з плазмідами pABV20 і pABVS, і який можна було б, у кінцевому рахунку лігува ти з кДНК-послідовностями pABV331 і pABV369, то були генеровані два нових кДНК-фрагменти за допомогою RT-PCR. В одній PCR використовували значеннєвий праймер LV59 (5'-TCGGAATCTAGATCTCACGTGGTGC AGCTGCTG 3’), що відповідає нуклеотидам 5169-5186, і антизначеннєвий праймер 61U303 (5і-OATCAAC ACCTGTGCAGACC 3 і), комплементарний нуклеотидам 6078-6097. В іншій PCR використовували значеннєвий праймер 61U526R (5'ТТССТТСТСТ-GGCGC ATGAT 3'), що відповідає нуклеотидам 5936-5955, і праймер LV60 (5’GTACTGGTACCGGATCCGTGAGGATGTTGC 3’), комплементарний нуклеотидам 6727-6745. Ці два PCRфрагменти лігували разом у pABV20 із використанням Xbal-сайта, введеного в LV59, внутрішнього Apol-сайта (нуклеотиди 6006), і BamHI-сайта в нуклеотиді 6740, який був також введений у праймер LV60. Новий кДНКфрагмент був цілком секвенований і не містив ніякої мутації, яка призводила б до різниці в амінокислотах у порівнянні з опублікованою послідовністю (Meulenberg et al., 1993а). Плазміда pABV368 включала нуклеотиди 8274-13720 геному PRRSV. Оскільки додаткове лігування кДНК-фрагментів у pGEM-4Z призводило до одержання нестабільних клонів, то вставки pABV331/369, pABV384 і pABV368 лігували з 5’- і 3' кДНКфрагментами в рОК12 (Viera & Messing, 1991). Передбачалося, що плазмідний вектор є більш відповідним для клонування чужорідних послідовностей кДНК великого розміру, оскільки він є більш низкокопійним, ніж pGEM4Z. Плазміди переносили в штам DH5a E.coli, культивований при 32°С в присутності 15мкг/мл канаміцину для збереження, по Можливості, низької кількості копій. Спочатку, кДНК-фрагменти pABV382 ((Α) 45) і DABV392 ((А)109) вирізали шляхом гідролізу ферментом EcoRI, і цей сайт модифікували полімеразою Кленова (Pharmacia) для затуплення кінців із наступним гідролізом ферментом ВаmНІ. Ці фрагменти клонували в рОК12, пдролізований ферментами ВаmНІ і Fspl, де останній сайт був також модифікований для затуплення кінця, і одержували pABV394 і pABV395. Аналогічним способом був видалений промотор РНК-полімерази Т7, присутній у рОК1 Після цього, кДНК-фрагменти pABV368 і pBV384 лігували з 3' кінцем кДНК-кітонів з використанням ВсlІ-сайта (нуклеотид 13394), Seal-сайта (нуклеотид 8657) і ВаmНІ- і Bglll-сайтів у фланкуючих або векторних послідовностях. В результаті цього були отримані плазміди pABV401 і pABV402 (фіг.1). 5'-кДНК-клон, який містить промотор РНК-полімерази Т7, безпосередньо лігований із 5'-кінцем геному LV, ампліфікували за допомогою PCR із pABV387 з використанням праймерів LV83 (5'GAATTC ACTAGTTAATACGACTC ACTA-TAGATGATGTGTAGGGTATTCC 3’) і LV69. LV83 складається з (у напрямку 5’®3') EcoRI- і Spel-сайта, промоторної послідовності РНК-полімерази Т7, проте G для ініціації транскрипції, і нуклеотидів 1-19 геному LV. PCR-фрагмент клонували в EcoRI- і Sall-сайт рОК12, в результаті чого одержували плазміду pABV396. Правильність послідовності pABV396 оцінювали шляхом олігонуклеотидного сeквенування. Потім, кДНК-фрагменти LV плазміди pABV331 і pABV369 вирізали ферментами Apal і ВаmНІ, і лігували в pABV396, гідролізовану ферментами АраІ і ВаmНІ. І нарешті, отримані 5'-кДНК-фрагменти кпонували в pABV401 і pABV402 із використанням Spel-сайта, розташованого вище промотора РНК-полімерази Т7, і унікального Pmll-сайта в положенні 5168 вірусного геному. Таким чином, кДНК-клони, які мають довжину, рівну довжині геному, були отримані як клони, що відповідають вірусам, подібним батьківському штаму, і химерним вірусам, які містять чужорідні відкриті рамки зчитування. Продукування мутантних вір усів, які містять Расl- та/або Swal-сайти Для введення унікального Pad-сайта в кДНК-клон геномної довжини безпосередньо нижче гена ОРС7, обидва нуклеотиди Τ і А в положеннях 14987 і 14988 заміняли на нуклеотид А в реакції PCR із використанням значеннєвого праймера LV108 (5'GGAGTGGTTMCCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACC AGA-GCC 3’) з антизначеннєвим праймером LV 112 (5'CCATTC ACCTGACTGTTTAATTAACTTGC ACCCTGA 3’), і значеннєвого праймера LV111 (5'TCAGGGTGCAAGTTAATTAAAC AGTC AGGTGAATGG 3')С LV75. Аналогічно, унікальний Swal-сайт створювали шляхом заміни G в положенні 14980 на Т, а Т в положенні 14985 на А з допомогою PCR із використанням праймерів LV108 і LV110 (5’-GCTGACTGTC AATTTAAATTGC ACCCTGAC 3’) і праймерів LV109 (5’GTCAGGGTGC AATTTAAATTGACAGTC AGG 3’) і LV111. PCR-фрагменти лігували в pABV395 з використанням створених Расі- і Swal-сайтів, і фланкуючих НраІ- і Xbal-сайтів, в результаті чого одержували плазміди pABV427 і pABV426, відповідно. Потім цей фрагмент вбудовували в плазміду pABV414 з використанням тих же самих унікальних Нраl- і Xbal-сайтів, в результаті чого одержували плазміди pABV437 і pABV442 (див. фіг.4). Для детекції мутації маркерів у вір усі, виділеному з транскриптів pABV437 і pABV422, РНК виділяли із супернатантів альвеолярних макрофагів інфікованих свиней. Цю РНК використовували в PCR із зворотною транскриптазою для ампліфікації фрагмента, який має приблизно 0,6т.п.о. (який простягається від нуклеотиду 14576 до роІу(А)-хвоста різної довжини) з використанням праймерів LV76, LV75 і 39U70R. Присутність генетичного маркера детектували шля хом гідролізу PCR-фрагментів ферментами Расі або Swal. In vitro-транскрипція і трансфекція РНК Плазміди pABV414, p ABV416, які містять повнорозмірний геномний кДНК-фрагмент LV, лінеаризували ферментом Pvul, і цей фрагмент був розташований безпосередньо нижче poly (А) хвоста. Плазміду pABV296, яка складалася з ОРС4 у експресувальному векторі вірусу лісів Семлікі pSFVI (Meulenberg et al., 1997), лінеаризували ферментом Spel, і ця плазміда слугувала в якості контролю в експериментах по in vitroтранскрипції і трансфекції. Лінеаризовані плазміди осаджували етанолом, і 1,5мкг цих плазмід використовували для in vitro-транскрипції РНК-полімерази Т7 (плазміди pABV414, DABV416) або РНКполімерази Sp6 (pABV296) у відповідності із способами, описаними для SFV Liljestrom & Garoff (1991 і 1993). In vitro-транскрибовану РНК осаджували ізопропанолом, промивали 70% етанолом, і берегли при -20°С аж до її використання. Клітини ВНК-21 висівали в лунки М6 (приблизно 10б клітин/лунку), і трансфекували 2,5 мікрофамами РНК, змішаними з 10мкл ліпофектину в оптимальній кількості, як описано Liljestrom & Garoff (1993). Альтернативно, РНК вводили в клітини ВНК-21 шляхом електропорації. У цьому випадку, 10мкг in vitroтранскрибованої РНК або 10мкг внутрішньоклітинної РНК LV трансфекували приблизно в 10 7 клітин ВНК-21 з використанням умов електропорації, описаних Liljestrom & Garoff (16). Середовище збирали через 24 години після трансфекції, і переносили в клітини CL2621 для "порятунку" інфекційного вірусу. Трансфековані і інфіковані клітини тестували на експресію LV-специфічних білків за допомогою імунопероксидазного аналізу моношару клітин (ІРМА), в основному, як описано Wensvoort і ін. (1986). Моноклональні антитіла (Mabs) 122,13, 122,59, 122,9 і 122,17, спрямовані проти білків GP3, GP4, Μ і N (van Nieuwstadt et al., 1996), були використані для забарвлення в ІРМА. Результати Реконструювання 5'-кінцевої послідовності геномної PHKLV Хоча інфекційність in vitro транскрибованих РНК із зрізаними 5'-кінцями була описана в літературі (Davis et al., 1989, Klump et al., 1990), проте, в основному, варто визнати, що для одержання інфекційних клонів необхідна повна вірусна послідовність, що включає самі крайні 5'- і 3'-кінці. Для клонування 5'-кінця геному LV використовували модифікований метод одноланцюгового лігування в одноланцюгову кДНК (SLIC; Edwards et al., 1991). Внутрішньоклітинну РНК, виділену з клітин CL2621, інфікованих LV і РНК LV, виділену з очищених вірионів, піддавали зворотній транскрипції з використанням праймера LV69, комплементарного 5'-кінцю ОРС 1А. Продукт першого ланцюга кДНК лігували з якірним праймером ALG3, 3'-кінець якого блокували щоб уникнути самолігування. Ліговані продукти ампліфікували за допомогою PCRі клонували. Дванадцять клонів, які походять від внутрішньоклітинної РНК LV, і отриманих в результаті проведення двох незалежних PCR, і чотирнадцять клонів, які походять від РНК віриону, і отриманих в результаті проведення двох незалежних PCR, були секвеновані. З цих 26 кДНК-клонів, 22 клони містили подовження у 10 нуклеотидах (5’ ATGATGTGTA 3’) у порівнянні з кДНК-послідовністю, опублікованою раніше (Meulenberg et al., 199*38), а в 4 клонах були відсутні від одного до трьох нуклеотидів у 5'-кінця цієї додаткової послідовності (таблиця 1). Цей факт наводить на думку, що зазначені десять нуклеотидів являють собою самий крайній 5'-кінець геному LV, а тому ці нуклеотиди були включені у кДНК-клон геномної довжини. Конструювання кДНК-клонів LV, що мають довжину, рівну довжині геному Для конструювання кДНК-клону LV, що має довжину, рівну довжині геному, кДНК, які були виділені і секвеновані раніше (Meulenberg et al., 1993a), приєднували в загальних рестрикційних ферментних сайтах у відповідності із стратегією, проілюстрованою на фіг.1. Крім того, для складання кДНК-клонів геномної довжини були сконструйовані нові кДНК-фрагменти. Один кДНК-фрагмент, який охоплює нуклеотиди 5168-6740, був створений за допомогою RT-PCR з метою лігування кДНК-послідовностей із клонів pABV5 і pABV20. Промотор РНК-полімерази Т7 для in vitro-транскрипції був приєднаний безпосередньо до 5’-кінця геному LV за допомогою PCR, і цей новий кДНК-фрагмент, клонований у pABV396, вставляли в кДНК клон з геномною довжиною. Повторне секвенування нуклеотидів 3420-3725 на шести нових і незалежних кДНК-клонах вказувало на те, що амінокислоти 1084 у ОРС1а, Leu і Pro, присутні у співвідношенні 1:1. Оскільки неможливо передбачити вплив цих амінокислот на інфекційність РНК, транскрибованої з кінцевого кДНК-клону геномної довжини, то для конструювання цього клону були використані обидва з них. На 3'-кінці були використані два різних кДНК-клони. Спочатку був виділений 3'-кінець кДНК- клонів, які містять poly (A)-хвости максимально з 20 A (Meulenberg et al., 1993a). Проте, виходячи з даних досліджень по визначенню довжини роІу(А)-хвостів родинних вірусів, таких як, LDV (Chen et al., 1994), передбачалося, що цілий роІу(А)-хвіст значно довший. Тому були отримані нові 3'-кінцеві кДНК-клони з використанням праймера LV76, який містить подовження із 40 залишків Т. Ці кДНК-клони секвенували, в результаті чого було виявлено, що вони містять подовження з 40109 залишків А. Для одержання кДНК-клону геномної довжини використовували кДНК-клон, який містить найбільш довгий роІу(А)-хвіст (109 залишків A; pABV392). Оскільки довгі гомополімерні хвости можуть перешкоджати реплікації плазміди в E.coli (Deng & Wu, 1981), то для використання в наступних стадіях клонування, був також відібраний другий клон, pABV382, який містить 45 залишків А. Проведені раніше спостереження показали, що збереження кДНК-клонів геномної довжини у висококопійних плазмідах сприяє акумуляції мутацій або розподілів, які призводять до втрати інфекційності транскриптів, синтезованих із цих клонів (Lai et al., 1991, Rice et al., 1987, Sumiyoshi et al., 1992). При спробі лігувати більш великі фрагменти кДНК клонів 331/339, 384 і 368 pABV у 5’- і 3'-кінці в pGEM-4Z спостерігалася також нестабільність плазмід, а тому, ці клони, у кінцевому рахунку, були з'єднані один з одним у низькокопійному векторі рОК12 (Viera & Messing, 1991). В результаті цього були отримані кДНК-клони геномної довжини pABV414/415 і 416, які можуть бути стабільно розмножені в E.coli у використовуваних умовах культивування. Будь-якої різниці в стабільності кДНК-клонів геномної довжини, що містять 45 або 109 залишків А, не спостерігалося. Інфекційність РНК LV LV зростає переважно у свинячих альвеолярних макрофагах. Дотепер, клітинна лінія CL2621 або інші клони, які походять від клітинних ліній нирки мавпи МА104, являють собою лінії, які, як було вказано, поширюють LV (Benfield et al., 1992; Collins et al., 1992; Kim et al., 1993). Отже, клітини CL2621 були використані з метою визначення оптимальних умов для трансфекції РНК LV. РНК, виділену із LV-інфікованих клітин CL2621, трансфекували в клітини CL2621 у різних дозах із застосуванням різних методів, таких як, методи з використанням ліпофектину, ліпофектаміну, DEAE-декстрану, і електропорація. Клітини скринували на цитопатичну дію і наявність бляшок через 7 днів після трансфекції, але ці ознаки інфекційного вірусу не були виявлені. Крім того, LV-специфічні антигени не могли бути детектовані в ІРМА з використанням LVспецифічних Mab. PHK, транскрибована in vitro із pABV296, була використана в цих експериментах в якості контролю. Плазміда pABV296 складається з гена ОРС4, кодуючого GP4, і вбудованого у експресувальний вектор pSFV1 (Meulenberg et al., 1997). Ефективність трансфекції PHK pABV296 тестували шляхом забарвлення трансфекованих клітин у ІРМА із використанням GP4, - специфічних Mab. Найбільш висока ефективність трансфекції, отримана для 0,01% позитивних клітин CL2621, була досягнута шляхом електропорації, тоді як, 80-90% позитивних клітин одержували з використанням умов, аналогічних тим, які були використані для клітин ВНК-21. Ці результати вказують на те, що клітини CL2621 не придатні для експериментів по трансфекції, тоді як клітини ВНК-21 (не сприйнятливі до інфікування вірусом дикого типу) зненацька виявилися дуже відповідними для цієї мети. Тому для тесту на інфекційність PHK LV були використані клітини ВНК-21. 2мкг РНК, виділених із клітин ІV-інфікованих CL2621, трансфекували приблизно в 106 клітин ВНК-21 із використанням ліпофектину відповідно до умов, описаних для SFV (Liijestrom & Garoff, 1993). Через двадцять чотири години після трансфекції, клітини забарвлювали LV-специфічними Mab 122.17, спрямованими проти білка N вірусу LV. Приблизно 3-10 окремих клітин давали позитивне забарвлення, але інфекційних центрів або бляшок, які, як передбачалося, передаються від клітини до клітини, не спостерігалося. Трансфекція контрольних РНК, транскрибованих із PABV296 з використанням цих умов, призводила до одержання 60-70% позитивних клітин ВНК-21. Супернатант клітин ВНК-21, трансфекованих внутрішньоклітинною РНК LV і РНК pABV296, переносили на клітини CL2621. Через 3-4 дня, бляшки спостерігалися в клітинах, які були інкубовані із супернатантом від клітин ВНК-21, трансфекованих внутрішньоклітинною РНК LV, але не спостерігалися в клітинах, які були інкубовані з супернатантом від клітин ВНК-21, трансфекованих РНК pABV296. Бляшки були позитивно забарвовані LV-слецифічними mab у ІРМА. Аналогічні результати були отримані у випадку використання РНК, виділеної з очищених вірионів LV. Крім того, кількість позитивно забарвлених штамів клітин зростала в 2-4 рази у тому випадку, коли клітини були трансфековані шляхом електропорації. Ці дані вказують на те, що вірус LV не інфікує клітини ВНК-21, оскільки в них, цілком ймовірно, відсутній рецептор для LV. Проте, після введення геномної РНК в клітини ВНК-21, продукувалися нові інфекційні вірусні частинки, які виділялися в середовище. І знову, повторне інфікування вже трансфекованих клітин ВНК-21 цими частинками, що є "голими" капсидами або частинками з повною або неповною оболонкою, виявилося неможливим. In vitro-синтез інфекційної РНК Оскільки клітини ВНК-21 є, в принципі, не сприйнятливими до PRRSV дикого типу, і особливо відповідними для "порятунку" вірусу від внутрішньоклітинної РНК LV, на відміну від сприйнятливих клітин CL2621, то клітини ВНК-21 були використані для тесту, проведеного з метою визначення, чи є РНК, транскрибована з кДНК-клонів геномної довжини, інфекційною. Плазміди pABV414/416 були лінеаризовані ферментом Pvul і транскрибовані in vitro з використанням РНК-полімерази Т7. Pvul-сайт був локалізований безпосередньо нижче роІу(А)-хвоста, так, що транскрибована РНК містила 2 невірусних нуклеотиди в 3'-кінця (фіг.2). Крім того, транскрипти повинні містити невірусний G у 5'-кінця, який є сайтом ініціації транскрипції РНК-полімерази Т7. Приблизно 2,5мкг in vitro-транскрибованої РНК трансфекували в клітини ВНК-21 разом з 2мкг внутрішньоклітинної РНК LV, використовуваної в якості позитивного контролю для наступного "порятунку" вір усу в клітинах CL2621 і РНК pABV296, використовуваної в якості позитивного контролю для трансфекції РНК у клітини ВНК-21, і в якості негативного контролю для наступного "порятунку" вірусу в клітинах CL2621. Через 24 години після трансфекції, супернатант клітин збирали, і клітини фіксували і забарвлювали в ІРМА з використанням Nспецифічних Mab 122,17. У лунках з клітинами ВНК-21, які були трансфековані внутрішньоклітинною РНК LV, спостерігалося лише декілька позитивних клітин, тоді як в лунках з клітинами ВНК-21, які були трансфековані РНК, транскрибованою з pABV414/416, спостерігалося 800-2700 позитивних клітин. Для того, щоб перевірити, чи виділяється інфекційний вірус із клітин, для інфікування клітин CL2621 використовували супернатанти. Бляшки продукувалися у культурах CL2621, які були інфіковані супернатантом від клітин ВНК-21, трансфекованих вн утрішньоклітинною РНК LV і транскриптами pABV414/415. Наявність бляшок, забарвлених позитивно в ІРМА з використанням моноклональних антитіл проти білків Ν, Μ, GP4 і GP3, дає підставу припустити, що всі ці білки були експресовані належним чином. В культурах CL2621, інкубованих із супернатантом від клітин ВНК-21, трансфекованих РНК, транскрибованою з pABV296, ні бляшок, ні забарвлення не спостерігалося. Тому, ці результати ясно свідчать про те, що трансфекція РНК, транскрибованою з повнорозмірних геномних кДНК-клонів pABV414 і pABV416, у клітини ВНК-21 призводить до продукування і вивільнення інфекційного LV. Більш того, у випадку, коли транскрипти pABV414 і pABV416 трансфековані в клітини ВНК-21 шляхом електропорації, а не з використанням ліпофектину, то спостерігалося 2-4-кратне збільшення клітин, які позитивно забарвлюються LV-специфічними Mab. Титр рекомбінантних вірусів у супернатанті від цих підданих електропорації клітин ВНК-21 складав приблизно 105 ТСID50/мл. Криві росту інфекційного вірусу, що реплікуються, порівнювали з кривими росту для Ter Huurne і LV4.2.1: Характеристики росту "врятованого" вірусу Попередні експерименти по трансфекції і інфікуванню дозволили припустити, що врятовані рекомбінантні віруси, позначені VABV414 і VABV416, інфікують і зростають однаково добре у свинячих альвеолярних макрофагах, тоді як, на клітинах CL2621, вони зростають повільніше, ніж вірус, врятований із клітин ВНК-21, трансфекованих вн утрішньоклітинною РНК LV. Цю внутрішньоклітинну РНК LV виділяли з клітин CL2621, інфікованих LV4.2.1, які були адаптовані для росту на CL2621. Для більш ретельного дослідження здатності до росту VABV414 і VABV416, для клітин CL2621 і для свинячих альвеолярних макрофагів були побудовані криві росту, і ці криві порівнювали з кривими росту для LV дикого типу, що був лише пасажований на свинячі альвеолярні макрофаги (ТН), і з кривими росту для вірусу LV4.2.1, культивованого на клітинах CL2621. Швидкості росту цих дво х рекомбинантних вірусів не відрізнялися один від одного, і ці віруси розвивалися однаково добре незалежно від того, чи походять вони безпосередньо від ВНК-21, або вони були, крім того, пасажовані на свинячі альвеолярні макрофаги (фіг.3). Ти три (7,1-7,9 ТСID50/мл) у свинячих альвеолярних макрофагах досягали пікових значень через 32 години після інфікування, тоді як титри в CL2621 зростали повільніше, і не досягали пікових значень навіть через 96 годин після інфікування. ТН-вірус мав такі ж характеристики росту, як і рекомбінанти. На противагу цьому, CL2621 адаптований вірус LV4.2.1 зростав на клітинах CL2621 швидше, ніж віруси vABV414, vABV416 і ТН (фіг.3). В цілому, ці результати свідчать про те, що характеристики росту рекомбінантних вірусів аналогічні характеристикам росту вірусу ТН. Цього треба було очікувати, оскільки кДНК-послідовність, яка була використана для конструювання інфекційних клонів, була отримана від батьківського "не адаптованого" вірусу ТН. Введення генетичного маркера в інфекційний клон LV Для демонстрації того, що кДНК-клон геномної довжини може бути використаний для продукування мутантних вірусів L V, унікальні Расі- і Swal-сайти були введені безпосередньо нижче гена ОРС7 за допомогою PCR-спрямованого мутагенезу (фіг.4). У тому випадку, коли РНК, транскрибовану з повнорозмірного геномного кДНК-клону pABV437, який містить Pad-сайт, і кДНК-клон pABV442, який містить Swal-сайт, трансфекували в клітини ВНК-21, і супернатант від цих клітин переносили на свинячі альвеолярні макрофаги і клітини CL2621 через 24 години після трансфекції, то продукувався інфекційний вірус. Врятовані віруси VABV437 і vVABV442 мали характеристики росту у свинячих альвеолярних макрофагах і в клітинах CL2621, аналогічні характеристикам росту батьківського вірусу VABV414 (дані не наводяться). Специфічна область приблизно в 0,6т.п.о. (нуклеотиди 14576 - poly(A)-хвіст) була ампліфікована за допомогою зворотної транскрипції і PCR вірусної РНК, виділеної із супернатанту свинячих альвеолярних макрофагів, інфікованих VABV414 і VABV416. Гідроліз ферментом Расі показав, що цей рестрикційний сайт дійсно є присутнім у фрагменті, який походить від VABV437, але відсутній у фрагменті, який походить від VABV414. Аналогічним чином була продемонстрована присутність Swal-сайта в VABV442 (дані не наводяться). Таким чином, можна виключити можливість забруднення вірусом дикого типу, що підтверджує ідентичність vABV437 і vABV442. Обговорення Сучасна технологія рекомбінантних ДНК дає можливість аналізувати і модифікувати геноми на молекулярному рівні, і, тим самим, більш глибоко вивчити їх організацію і експресію. У випадку РНК-вірусів, для цього потрібно створення кДНК-клонів геномної довжини, із яких можуть бути синтезовані інфекційні транскрипти. У більшості випадків, попередньою умовою для конструювання інфекційних клонів є ідентифікація послідовностей на кінцях відповідного вірусного геному, що, мабуть, мають вирішальне значення для реплікації вірусної РНК. У попередньому дослідженні було показано, що LV містить poly (А) -хвіст у 3'-кінця (Meulenberg et al., 1993а). У даній роботі була точно визначена послідовність 5’-кінця геному LV. Хоча було описано декілька способів визначення 5'-кінця геномної вірусної РНК або мРНК, проте, більшість із цих способів мають істотні обмеження. У випадку фла вівірусів і пестивірусів був використаний спосіб, який заснований на циркуляризації геномної РНК. Проте, цей спосіб вимагає проведення додаткових аналізів для визначення границі між 5'- і 3'-кінцями геному. Ме тод швидкої 5-ампліфікації кінців кДНК (5’ RACE) заснований на додаванні гомополімерного хвоста під дією термінальної дезоксирибонуклеотид-трансферази (ТdT) до першого ланцюга кДНК. Проте, ця реакція приєднання хвоста не є досить ефективною, і крім того, цей спосіб вимагає додаткових аналізів, оскільки неможливо зробити висновок про те, чи представляє перший нуклеотид хвоста вірусн у послідовність, або він є вже частиною ферментативно доданого хвоста. У даному дослідженні була визначена сама крайня частина 5'-хвоста вірусного геному шляхом лігування олігонуклеотиду, який має конкретно певну послідовність, із продуктом подовження першого ланцюга праймера, і шляхом ампліфікації за допомогою PCR. Подовження в 10 нуклеотидів (ATGATGTGTA) у порівнянні з опублікованою послідовністю було виявлено у декількох незалежних клонах, і тому було зроблене припущення, що вони являють собою найбільш крайні 5'-кінцеві нуклеотиди вірусного геному. Усе це разом дає лідерну послідовність у 221 нуклеотидів, які по своїй довжині аналогічні лідерній послідовності EAV (207 нуклеотидів; den Boon et al., 1991), SHFV (208 нуклеотидів Zeng et al., 1995), але є більш довгими, ніж лідерна послідовність LDV (155 нуклеотидів; Chen et al., 1994). Проте, не існує будь-якої гомології між лідерними послідовностями цих артерівірусів. Найбільш крайня ділянка 5'-кінця була введена в кДНК геномної довжини для створення інфекційного клону. Головні проблеми, які виникають при генеруванні інфекційних клонів, зв'язані зі стабільністю вірусних послідовностей при клонуванні в бактерії, а також при генеруванні правильних 5 і- і 3'-кінців. Хоча початкові спроби складання кДНК-клону геномної довжини в pGEM-4Z виявилися невдалими, проте, геномний кДНКфрагмент із довжиною в 15207 нуклеотидів від LV залишався стабільним у низькокопійній плазміді рОК12 і дотепер, поки не вдалося генерувати найбільш довгий інфекційний клон РНК-вірусу з позитивним ланцюгом. Транскрипти кДНК-клонів геномної довжини містили 5'-кеп-структур у і додатковий невірусний G на 5'-кінці і невірусні CG на З'-кінці, але ці подовження не елімінували їх інфекційності. Декілька проведених досліджень виявили зниження початкової інфекційності РНК, транскрибованих із повнорозмірних кДНК-клонів, що було обумовлено додатковими не автентичними послідовностями або на 54 або на 3'-кінці або неповним утворенням кеп-структури. Транскрипти повнорозмірної кДНК LV, у якої були відсутні кеп-структури, були не інфекційними. Оскільки інфекційність транскриптів інфекційних кДНК-клонів майже завжди тестували в клітинних лініях, які є сприйнятливими до вірусу, ми не могли продемонструвати інфекційність транскриптів від кДНК-клонів геномної довжини або РНК LV, виділеної з клітин CL2621 шляхом трансфекції цих РНК у клітини CL2621. Це було обумовлено недостатньою ефективністю трансфекції в клітинах CL2621, в результаті чого синтез ланцюга вірусної РНК утр уднюється, мабуть, через взаємодію з неповними РНК-фрагментами або капсидними білками в результаті повторного інфікування клітин CL2621 дефектними інтерферувальними частинками такими як, "голі" капсиди, які містять тільки фрагменти вірусного геному. Проте, трансфекція транскриптів від повнорозмірних кДНК-клонів і внутрішньоклітинної РНК LV у клітини ВНК-21 призводила до продукування і вивільнення інфекційного вірусу, який може бути "врятований" у клітинах CL2621. Повторного інфікування клітин ВНК-21 "голими" капсидами не відбувається, а тому перешкоди для синтезу повнорозмірної вірусної РНК не виникає. Специфічна інфекційність складає приблизно 400-1500 позитивних клітин на одинмкг у in vitro-транскрибованої РНК, тоді як, для одногомкг внутрішньоклітинної РНК LV було отримано 2-5 позитивних клітин. Проте, ці специфічні інфекційності не можуть дорівнюватися, оскільки геномну РНК LV представляє дуже невелика фракція внутрішньоклітинної РНК, виділеної з LV-інфікованих клітин CL2621. Крім того, кількість геномної РНК, виділеної з вірионів, які були використані для трансфекції, було занадто мало для проведення точної кількісної оцінки. Крім того, клітини ВНК-21 оцінювали на продукування антигену в ІРМА з використанням LV-специфічних Mab, що необов'язково корелює з продукуванням інфекційного вірусу. Це очевидно з того факту, що супернатант клітин ВНК-21, трансфекованих 2мкг внутрішньоклітинної РНК LV, містив більш високі титри бляшкоутворюючих одиниць оцінених для клітин CL2621, ніж супернатант від клітин ВНК-21, трансфекованих 2,5мкг транскрипту повнорозмірних кДНК-клонів. Хоча раніше, для ряду вірусів було показано, що довжина роІу(А)-хвоста впливає на інфекційність вірусних транскриптів (Holy & Abouhaid&r, 1993; Sarow, 1989), проте, ми не спостерігали якоїсь різниці в інфекційності між транскриптами від геномних кДНК-клонів, які містять хвіст із 45 або 109 залишків. Можливо, що хвіст із залишків 45А, в основному, являє собою граничну довжину, нижче якої стабільність відповідних транскриптів змінюється. У цьому клоні була виявлена різниця в амінокислоті 1084 у ОРС1а, яка дає Pro і Leu у співвідношенні 1:1. Ця амінокислота не впливає на інфекційність, оскільки транскрипти повнорозмірних нДНК-клонів, які містять цей кодон Leu або Pro, не виявляють будь-якої різниці у інфекційності клітин ВНК-21. Інфекційний клон геномної довжини використовували для генерування химерного вірусу, що експресує нуклеокапсидний білок PRRSV штама АТСС VR2332. Крім того, інфекційний клон геномної довжини використовували для генерування химерного вірусу, що експресує нуклеокапсидний білок мишиного вірусу LDV. Химерні віруси можна відрізнити від батьківських вірусів за допомогою використання штам-специфічних Mab, оскільки вони не забарвлюються моноклональними антитілами, які специфічно реагують із білком N (ОРС7) штаму Ter Huurne PRRSV. Крім того, химерний вірус, у якому білок N вірусу PRRSV замінений на білок N вірусу LDV, не реагує з антитілами свиней-конвалесцентів, які реагують із білком N PRRSV. Оскільки всі PRRSV-інфіковані свині виробляють антитіла, спрямовані проти білка N PRRSV, то химерні віруси можуть бути використані у майбутньому для розробки нових "живих" вакцин проти PRRSV, і крім того, вони можуть бути використані в якості векторної системи, яка специфічно спрямована на свою нову клітину-хазяїна, альвеолярний макрофаг легень. У цьому зв'язку слід зазначити, що початкові спроби забезпечити імунітет з використанням "вбитого" вірусу або рекомбінантних субодиниць, виявилися невдалими. Єдиною ефективною вакциною проти PRRS, що є на сьогоднішній день, є модифікована ''ж ива" вакцина, отримана на основі штаму US (Gorcyca et al;, 1995). Проте, свиней, вакцинованих цим модифікованим "живим" продуктом, неможливо вщрізнити від свиней, інфікованих вірусом дикого типу. Тому, інфекційний клон PRRSV був включений у так називану маркерну вакцину за допомогою сайт-направленого мутагенезу геному, так, щоб вакцинованих свиней можна було відрізнити від свиней, заражених вірусом дикого типу, виходячи з різниць у їх сироваткових антитілах. Інфекційний клон LV, описаний у даній заявці, є найбільш довгим інфекційним клоном, який коли-небудь, був отриманий від РНК-вірусу з позитивним ланцюгом і є першим у родині артерівірусів. Генерування цього інфекційного клону з PRRSV відкриває нові можливості для вивчення патогенезу, кола хазяїв (тропизму), а також реплікації і транскрипції цього вірусу., Артерівіруси і коронавіруси мають загальний специфічний механізм транскрипції", називаний також транскрипцією за участю лідерної послідовності в якості затравки, де зазначений механізм передбачає генерування так називаної "гніздової" серії субгеномних РНК, які містять загальну 5'-лідерну послідовність (Spaan et al., 1988; Plagemann & Mqennig, 1991). Транскрипція за участю лідерної послідовності в якості затравки є складним процесом, що ще цілком не вивчений. Дослідження вірусологів, що спеціалізуються в області коронавірусів, спрямовані на виявлення розглянутого механізму транскрипції за участю лідерної послідовності в якості затравки, обмежені аналізами і сайт-направленим мутагенезом кДНК дефектних інтфферувальних РНК, оскільки великий розмір геному (28-30 т.п.о.) утруднює конструювання інфекційного клону. Інфекційний клон від PRRSV може бути використаний в якості системимоделі для вивчення і виявлення невідомого механізму транскрипції і реплікації артерівірусів і коронавірусів. Інфекційні клони, які походять від PRRSV, можуть бути також використані в якості системи доставки або векторного вакцинного вірусу для чужорідних антигенів, введених у геном-PRRSV, оскільки цей вірус інфікує макрофаги і клітини лінії диференціювання макрофагів у кістковому мозку, а також інші клітини імунної системи, і сприяє розподілу антиген-вміщуючого вір усу по клітинах їх потомства. У конкретному прикладі антигенів, які містять фрагменти білка ОРС7 або білка N Arteriviruses або PRRSV, ці антигени будуть (понад) експресуватися на зовнішній поверхні клітинної мембрани інфікованої клітини, і тим самим ще більш підсилювати імунну відповідь. Такий імунологічний бустер-ефект буде продукувати Тривалий (завдяки постійній стимуляції на низькому рівні) імунітет проти патогенів. Можна використовувати вірус в якості антигену-носія при збиранні інформації для епітопів інших патогенних організмів або речовин. Декілька модифікованих вірусів PRRS, які несуть чужорідну епітопну інформацію, можуть бути змішані і введені Одночасно. Це забезпечує активний імунітет проти декількох різних епітопів одного пaтогена, або активний імунітет проти декількох різних патогенів. Безпека вакцин на основі модифікованого PRRSV (таких, які не забруднюють навколишнє середовище) може бути забезпечена шляхом видалення інформації, що Стосується тих вір усних білків, які необхідні для продукування інфекційного вірусу з Оболонкою. Цей вірус повинний бути розмножений у клітинній лінії, яка конститутивно експресує цей білок оболонки. Вірус, який реплікується в цій комплементарній клітинній лінії, має цілу оболонку і здатний інфікувати макрофаги у свиней. Після одного циклу реплікації, потомствений вірус, у якого відсутня інформація, що стосується білка оболонки, більше не здатний інфікувати інші клітини у відмінність від вірусу з цілою оболонкою. Інфікування макрофагів у даному організмі все ще можливе за допомогою голого капсиду. Таким чином, ця вакцина буде зберігатися у вакцинованій тварині, і не буде поширюватися на інших тварин. Напису до малюнків Фіг.1. Конструювання кДНК-клону LV геномної довжини. Верхня частина (А) ілюстр ує злиття кДНК-клонів, які були попередньо секвеновані (Meulenberg et al,, 1993а) у pGEM-4Z. Зазначено число використовуваних pABV-кпонів і рестрикційних сайтів. Чорні блоки представляють ті частини кДНК-клонів, які були ; злиті в наступній стадії клонування. Світло-сірі блоки, позначені RT, являють собою кДНК-клони, генеровані за допомогою RT-PCR, а темно-сірий блок являє собою новий кДНК-клон, генерований за допомогою PCR. Нижня частина (В) ілюструє складання більш великих кДНК-клонів pABV331/369, pABV384 і pABV368 із 5кінцевим клоном pABV396, що містить промотор РНК-полімерази Т7, і 3'-кінцевим клоном pABV395, який містить poly(А)-хвіст, у низькокопійному векторі рОК12. Також зазначені рестрикційні сайта усередині і поза сайту множинного клонування рОК12. Далі представлені сайта рестрикції ендонуклеазою: А, АраІ; Ар, АроІ; У, BamHI; Bg, Bglll; Bs, BspEI; Bc, Bcll; Ε, EcoRI; Еc, EcoRV; Η, Hindlll; К, Kpnl; Ν, Narl; Nc, Ncol; S, Sad I; Sp, Spel; Sa, Sall; Sc, Seal; P, Pstl; Pm, Pmll; X, Xbal; Xh, Xhol. Фіг.2. Кінцеві послідовності клонованої повнорозмірної кДНК LV і інфекційної РНК, транскрибованої з цього кДНК-клону. кДНК-клони геномної довжини лінеаризувапи ферментом Pvul і транскрибували в присутності синтетичного кеп-аналогу m 7G(5')ppp(5')G із РНК-полімеразою Т7. Отримана РНК повинна містити один додатковий нуклеотид (G) у 5'-кінця і два додаткових н уклеотиди (GC) у 3’ кінця. Стрілки в РНК відповідають 5'і 3'-кінцевим нуклеотидам, що відповідає автентичній РНК-послідовності LV. Фіг.3. Криві росту ТН вірусу L V дикого типу і LV4.2.1 і рекомбінантні віруси vABN/414 і VABV416 в альвеолярних макрофагах свиней (А) і клітинах CL2621 (В). Рекомбінантні віруси VABV414 і VABV416, продуковані в клітинах ВНК-21, були використані або безпосередньо (ВНК), або після розмноження в альвеолярних макрофагах свиней (РАМ). Вір ус ТН одержували в альвеолярних макрофагах свиней (РАМ), a LV4.2.1 одержували в клітинах CL2621 (CL). Клітинні культури інфікували зазначеними вірусами при множинності зараження 0,05 і збирали в зазначені інтервали часу. Титри вірусу (TCIDso/мл) визначали для альвеолярних макрофагів свиней або клітин CL2621 шляхом титрування в кінцевій точці. Фіг.4. Введення унікальних Расі- і Swal-сайтів в інфекційний кДНК-клон LV. Расі- і Swal-сайти створювали за допомогою PCR-спрямованого мутагенезу, як докладно описано в главі "Матеріали і методи". кДНКфрагменти, які містять Расі- і Swal-сайти, були замінені в pABV414 із використанням її унікальних НЬаі- і ХЬаІсайтів, які зазначені. В результаті були отримані pABV437 і pABV442 відповідно. ЛІТЕРАТУРА Benfield, D.A. , Ε. Nelson, Ε. Collins, J.E., Harris, L , Goyal, S.M., Robison, D., Christianson, W.T., Morrison, R.B., Gorcyca, D.E., and Chladek, D.W.. (1992). Characterization of swine infertility and respiratory syndrome virus (Isolate ATCC-VR2332) J. Vet. Diagn. In vest. 4,127-133. Boyer, J., and Haenni, A. (1994) Infectious transcripts and cDMA clones of RMA viruses. Virology, 198, 415-426. Chen, Z, Faaberg, K.S., and Plagemann, P.G.W. (1994) Determination of the 5' end of the lactate dehydrogenase-elevating-virus genome by two independent approaches. J. Gen. Virdl. 75, 925-930. Collins, J.E., Benfield, D.A., Christianson, W.T., Harris, .Ii., Hennings,; J.C., Shaw, D.P., Goyal, S.M., McCullough, S., Morrison, R.B., Joo, H.S., Gorcyca, D.E., Chladek, D.W. (1992). Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (Isolate ATCC-VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs. J. of Vet. Diagn. In vest. 4, 117-126. Conzelmann, K.K., Visser, И., van Woensel, P., and Тіel, H.J. (1993). Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the Arterivirus group. Virology 193, 329-339. den Boon, J.A., Paaberg. K.S., Meulenberg, J.J.M., Wassenaar, A.L.M., Plagemann, P.G-W., Gorbalenya, A.E., and -Snijder, E.J. (1995) Processing and evolution of the N-terminal region of the arterivirus replicase ORPIa protein: identification of two papainlike cysteine proteases. J. Virol. 69:4500-4505. Davis, N.L., Willis, LV.,-Smith, J.F., and Johns ton, R.E. (1989). In vitro synthesis of infectious Venezuelan equine encephalitis virus RMA of an insect virus. Proc. NatiAcad. Sci. USA 83, 63-66. Deng, R., and Wu, R. (1981). An improved procedure for utilizing terminal transferase to add homopolymers to the 3' termini of DNA. Nucleic Acids Res.9, 4173-4188. Edwards, J.B.D.M., Delort, J., and Mallet, J. (1991) Oligodeoxyribonucleotide ligation to single-stranded cDMAs; A new tool for cloning 5' ends of mRNAs and for contructing cDMA libraries by in vitro amplification. Nucleic Acids Res. 19, 5227-5232. Gorcyca, D., Schlesinger, K., Chladek, D., et al., (1995) Proc. Am. Assoc. or Swine Pract., Ohama, NE, 1-22. Holy, S., and Abouhaidar, M.G. (1993). Production of infectious in vitro transcripts from a full-length clover yellow mosaic virus cDNA clone. i7. Gen. Virol., 74, 781-784. Kirn, H.S., Kwang, J., and Yoon, I.Y. (1993). Enhanced, replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in a homogeneous subpopulation of MA-1D4 cell line. Arch. Viro. 133, 477-483. Klump, W.M., Bergmann, I., Muller, B.C., Ameis, D., and Kandolf, R. (1990) Complete nucleotide sequence of infectious coxsaekie-virus B3 cDNA: Two initial 5'uridine residues are regained during plus-strand RNA synthesis. J. Virol. 64, 1573-1583. Lai, C.J., Zhao, В., Hori, H., and Bray, M. (1991) Infectious RNA transcibed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus. Proc. Natl. Acad. Sc-i. USA 88, 5139-5143. Liljestrom, P. and Garoff, H. (1991). A new generation of animal cell expression vectors based on the Semliki Forest virus replicon. Biotechnol. 9, 1356-1361. Liljestrom, P., and Garoff, H. (1993) Expression of proteins using Semliki Forest virus vectors, p.16.xx.l-16.xx.00 In: Current protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Struhi (Eds.). Greene Publishing associates and Wiley interscience, New York. Meulenberg, J.J.M., Hulst, M.M., de Meijer, E.J., Moonen, P.L.J.M., den Besten, Α., de Kluyver, E.P., Wensvoort, G., and Moormann, R.J.M. (1993a). Leiysiad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS) is related to LDV and EAV. Virology 192, 62, 74. Meulenberg, J.J.M., de Meijer, E.J., and Moormann, R.J.M. (1993b). Subgenomic RNAs of Leiystad virus contain a conserved junction sequence. «J. of Gen. Viro. 74, 1697-1701. Meulenberg, J.J.M., Petersen-den Besten, Α., de Kluyver, E.P., Moormann, R.J.M., Wensvoort, G (1995). Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Leiystad virus. Virology 206, 155-163. Meulenberg, J.J.M., and Petersen-den Besten (1996) Identification and characterization of a sixth structural protein of Leiystad virus: The glycoprotein GP; encoded by ORF2 is incorporated in virus particles. Virology, in press. Meulenberg et al., 1997 Murtaugh, M.P., Elam, M.R., and Kakach (1995) Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Leiystad virus strains of the PRRS virus. Arch. Virol., 140, 1451-1460. Nelson, E.A., Christopher-Hennings, J., Drew, Т., Wensvoort, G., Collins, J.E., and Benfield, D.A. (1993). Differentiation of United states and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies. J. of Clin. MicroJbio. 31, 3184-3189. Plagemann, P.G.W., and Moennig, V. (1991). Lactate dehydrogenase-elevating virus, equine arteritis virus, and simian hemorrhagic fever virus: a new group of positive-strand RNA viruses. Adv. in Virus. Res. 41, 99-192. Rice, С.М., Levis, R., Strauss., J.H., and Huang, H.V. (1987). Production of infectiuos RNA transcripts from Sindbis virus cDNA clones: mapping of lethal mutations, rescue of a temperature-sensitive marker, and irr-vitro mutagenesis to generate defined mutants. І7. Virol., 61, 3809-3819. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor NY. Samow, P. (1989) Role of 3'end sequences in infectivity of polio-virus transcripts made in vitro. «J. Virol., 63. 467-470. Snijder, E.J., and Horzinek, M.C. (1993). Toroviruses: replication, evolution and comparison with other members of the coronavirus-like superfamily. J. Gen. Virol., 74, 2305-2316. Spaan, W.J.M., Ca vanagh, D., and Horzinek, M.C. (1988) Coronaviruses: Structure and genome expression. J. Gen. Virol. 69, 2939-2952. Sumiyoshi, H., Hoke, C.H., and Trent, D.W. (1992). Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J". Virol., 66, 5425-5431. van Nieuwstadt, A.P., Meulenberg, J.J.M., van Essen-Zandbergen, Α., Petersen-den Besten, Α., Bende, R.J., Moormann, R.J.M., and Wensvoort, G. (1996). Proteins encoded by ORFs 3 and 4 of the genome of Leiystad virus (Arteri viridae) are structural proteins of the virion. І7. Virol., 70, 4767-4772. Viera, J., and Messing, J. (1991) New pUC-derived cloning vectors with different selectable markers and DMA replication origins. Gene, 100, 189-194. Wensvoort, G., de Kluyver, E.P., Luijtze, E.A., de Besten, Α., Harris, L, Collins, J.E., Christianson, W.T., and Chladek, D. (1992) Antigenic comparison of Leiysfcad virus and swine infertility ans respiratory (SIRS) virus. J. Vet Diagn. Invest. 4, 134-138. Wensvoort, G., Terpstra, C, Boonstra, J., Bloemraad, M., and Van Zaane, D. (1986) Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis. Vet. Microbiol. 12, 101-108. Wensvoort, G., Terpstra, С, Pol, J.M.A., Ter Laak., E.A., Bloemraad, Μ., de Kluyver, E.P., Kragten, C, van Buiten, L., den Besten, Α., Wagenaar, P., Broekhuijsen, J.M., Moonen, P.L.J.M., Zetstra, Т., de Boer, E.A., Tibben, H.J., de Jong, M.F., van 't Veld, P., Greenland, G.J.R., van Gennep, J.A., Voets, M.Th., Verheijden, J.H.M., and Braamskamp, J. (1991). Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Leiystad virus. Vet. Quart. 13, 121-130. Zeng, L, Godeny, E.K., Meth ven, S.L, and Brinton, M.A (1995) Analysis of simian hemorrhagic fever virus (SHFV) subgenomic RNAs, junction sequences and 5" leader. Virology 207, 543-548. Таблиця 1 Нуклеотидна послідовність S'-кінцевих клонів LV Послідовність 1) ATGATGTGTAGGG..... TGATGTGTAGGG..... GATGTGTAGGG..... ATGTGTAGGG..... № клонів 22 1 2 1 1) Підкреслені нуклеотиди являють собою додаткові послщовності, що не були виявлені в кДНК-клонах, і не були виділені і секвенвані раніше (Meulenberg et al., 1993a).