Рекомбінантний вірус мvа

1. Рекомбінантний вірус MVA, що містить та здатний експресувати антиген nef ВІЛ. 2. Рекомбінантний вірус MVA за п.1, який відрізняється тим, що ген nef ВІЛ знаходиться під транскрипційним контролем раннього/пізнього про C2 2 (19) 1 3 75411 4 таний у якості живої вакцини для імунізації людиО. & Moss, В. (1990) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 87, ни у цілях продукування в нього імунітету проти 6743-6747]. Перевагу "вірус коров'ячої віспи/Т7натуральної віспи. Успішна всесвітня вакцинація РНК-полімераза" - гібридної системи, у порівнянні вірусом віспи завершилася викориненням врусу з іншими системами з тимчасовою експресією, віспи, який є агентом, що спричинює захворюполягає, вірогідно, в її незалежності від трансповання на віспу [The global eradication of smallpox. рту плазмід до ядра клітини. Раніше цю систему Final report of the global commission for the використовували виключно в аналітичних цілях у certification of smallpox eradication. History of Public вірусології та мікробіології [Buonocore, L. & Rose, Health, №4, Geneva: World Health Organization, J.K. (1990) Nature 345, 625-628, Pattnaik, A.K. and 1980]. З часу підписання декларації ВОЗ (ВсесвіWertz, G.W. (1991) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 88, тня організація охорони здоров'я, WHO) загальна 1379-1383, Karshin, Α., Aiyar, J., Gouin, Α., вакцинація була зупинена, за виключенням люDavidson, N. and Lester, H.A. (1991) FEBS Lett., дей з високим ризиком зараження поксовірусом 278, 229-233, Ho, B.Y., Karshin, Α., Raymond, J., (наприклад, лабо-рантів). Branchek, Т., Lester, H.A. and Davidson, N. (1992) Пізніше віруси коров'ячої віспи були також FEBS Lett, 301, 303-306, Buchholz, C.J., Retzler C, використані для конструювання вірусних вектоHomann, H.E. and Neubert, W.J. (1994) Virology, рів, що були призначені для експресії рекомбіна204, 770-776]. Однак у майбутньому можливі вантних генів та для можливого їх застосування в жливі зміни гібридної системи "вірус коров'ячої якості живих вакцин [Mackett, M., Smith, G.L., віспи/РНК-полімераза Т7", наприклад для продуMoss, В., 1982, P.N.A.S., USA 79, 7415-7419; кування рекомбінантних білків або рекомбінантSmith, G.L., Macket, M.& Moss, В., 1984, них вірусних частинок у цілях розробки нових Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, 2, терапевтичних або профілактичних методів у 383-407]. Це дає можливість отримати ДНКмедицині, можуть зіштовхнутись з певними трудпослідовності (гени), що кодують чужорідні антинощами, що зумовлені продуктивною реплікацією гени та вбудовані, за допомогою техніки рекомбірекомбінантного вектору, отриманого на основі нантних ДНК, до геному вірусу коров'ячої віспи. вірусу коров'ячої віспи. Якщо ген інтегрується в сайт вірусної ДНК, що не Вірус коров'ячої віспи є інфекційним для люмає вирішального значення для життєвого циклу дини, та іноді, після вакцинації, що проводилась у вірусу, тоді знову рекомбінантний вірус коров'ячої якості профілактичної міри по боротьбі з натуравіспи, що продукується, може бути інфекційним, льною віспою, у вакцинованих людей спостерігатобто він може інфікувати чужорідні клітини, в лись серйозні ускладнення. Найбільш повний результаті чого буде експресуватися інтегрована опис випадків ускладнень після вакцинації людей ДНК-послідовність [Європейські патентні заявки приводиться у Національному звіті США, що ви№№83286 та 110385]. Отримані таким чином світлює спостереження за вакцинацією близько рекомбінантні віруси коров'ячої віспи можуть бути 12 мільйонів людей, що була проведена з виковикористані, з однієї сторони, в якості живих вакристанням вакцини, отриманої на основі штаму цин для профілактики інфекційних захворювань, Нью-Йоркського місцевого департаменту охорони та, з іншої сторони, в якості матеріалу для продуздоров'я (New York City Board of Health) вірусу кування гетерологічних білків в еукаріотичних коров'ячої віспи [Lane, J., Ruben, F., Neff, J. and клітинах. Millar, J. (1969) New Engl.J.Med., 281, 1201-1208]. Продукування рекомбінантного вірусу короТому, багатообіцяюча можливість використання в'ячої віспи, що експресує ген РНК-полімерази вірусу коров'ячої віспи в якості вектору для вигобактеріофагу Т7, дозволяє отримати експресійну товлення живих вакцин зіштовхується з проблесистему, яка може широко використовуватися мою безпеки та регламентації застосування цьодля синтезу рекомбінантних білків у клітинах ссаго вірусу. Окрім того, більшість рекомбінантних вців [Moss, В., Elroy-Stein, О., Mizukami, Т., вірусів коров'ячої віспи, що описані у літературі Alexander, W.A., Fuerst, T.R., 1990, Nature 348, 91були отримані на основі штаму Western Reserve 92]. Всі методи експресії рекомбінантного гену вірусу коров'ячої віспи. З іншої сторони, відомо, передбачають синтез РНК-полімерази Т7 у цитощо цей штам має високий ступінь нейровірулентплазмі еукаріотичних клітин. При цьому, найбільш ності, а тому він є малопридатним для введення часто використовується схема тимчасової екслюдині та тваринам ]Morita et al, Vaccine 5, 65-70 пресії [Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. & (1987)]. Moss, В., (1986) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 83, 8122Ризик для здоров'я людини або тварин, по8126, та заявка на патент США №7648971]. Спов'язаний із застосуванням вказаного вірусу в якочатку потрібний чужорідний ген вбудовують до сті вектору, може бути знижений шляхом викориплазміди під контроль промотору гену РНКстання у високому ступені атенуйованого полімерази Т7. Потім, використовуючи стандарт(послабленого) штаму вірусу коров'ячої віспи. ну техніку трансфекції, цю плазміду вводять до Декілька таких штамів вірусу коров'ячої віспи буцитоплазми клітин, інфікованих рекомбінантним ли спеціально розроблені для знищення небажавірусом коров'ячої віспи, що продукує РНКних побічних ефектів, що з'являлись у результаті полімеразу Т7. вакцинації проти віспи. Так, наприклад, модифіЦя схема трансфекції є досить простою, оскікований вірус коров'ячої віспи Анкара (MVA) був льки вона не потребує створення нових рекомбіотриманий шляхом тривалого серійного ласуваннантних вірусів, та до того ж є дуже ефективною, ня штаму Анкара вірусу коров'ячої віспи (CVA) на оскільки вона дозволяє отримати більше 80% фібробластах куриних ембріонів [див. огляд Mayr, клітин, що експресують потрібний ген [Elroy-Stein, A., Hochstein-Mintzel, V. and Stickl, H.(1975) 5 75411 6 Infection 3, 6-14; патент Швейцарії №568392]. пційним контролем раннього/пізнього промотору Вірус MVA був депонований, у відповідності з р7.5 вірусу коров'ячої віспи; вимогами Будапештського договору, в CNCM вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, не [Інститут Пастера, Національна колекція мікроорздатний реплікуватися у клітинах людини; ганізмів, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris еукаріотична клітина, інфікована in vitro або Cedex 15, 15 грудня 1987р. під номером допуску ex vivo вищевказаним рекомбінантним вірусом №1-721]. Модифікований вірус MVA відрізняється MVA; своїм високим ступенем послабленості, тобто він вакцина, що містить вищевказаний рекомбімає знижену вірулентність або інфекційність, нантний вірус MVA у фізіологічно прийнятному зберігаючи при цьому гарну імуногенність. Вірус носії; MVA був проаналізований для того, щоб визнавикористання вищевказаного рекомбінантночити, які саме зміни є в його геномі у порівнянні з го вірусу MVA для приготування вакцини; вірусом дикого типу CVA. В результаті цього анавищевказаний рекомбінантний вірус MVA або лізу були ідентифіковані шість головних делецій у вищевказана вакцина для імунізації живого оргагенній ДНК (делеції І, II, III, IV, V та VI), всього нізму тварини і людини; 31000 пар основ [Meyer, Η., Sutter, G. and Mayr A. вищевказаний рекомбінантний вірус MVA або (1991) J.Gen. Virol., 72, 1031-1038]. У своєму колі вакцина для попередження або лікування ВІЛ хазяїв вірус, що був отриманий, чітко обмежений інфекції або СНІДу; лише клітинами птахів. Окрім того, MVA відрізнявикористання вищевказаного рекомбінантноється своєю крайньою послабленістю. Досліго вірусу MVA для продукування рекомбінантного дження на різних тваринах показали, що вірус nef ВІЛ протеїну. MVA є авірулентним навіть у тварин з послаблеТермін "ген" означає ДНК-послідовність, яка ним імунітетом. Та ще важливіше, що штам MVA кодує білок або пептид. має чудові властивості, які були продемонстроТермін "сторонній ген" означає ген, вбудовавані у широкомасштабних клінічних іспитах [Mayr ний до ДНК-послідовності, в якій цей ген звичайet al., Zbl.Bakt.Hyg.L, Abt.Org., В 167, 375-390 но відсутній. (1987), Stickl et al., Dtsch. med. Wschr., 99, 2386Модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара 2392 (1974)]. Обстеження вище 120000 чоловік, (MVA), що має обмежене коло хазяїв та є у вивакцинованих вірусом MVA, показали, що у цих щому ступені атенуйованим штамом вірусу коропацієнтів, включаючи пацієнтів з підвищеним рив'ячої віспи, не здатний розмножуватись у клітизиком зараження, були відсутні будь-які побічні нах людини та в досліджених клітинних лініях ефекти. більшості інших ссавців. Однак, оскільки експреБуло винайдено, що реплікація MVA у клітисія вірусного гену не порушується в непермесивнах людини блокується на пізній стадії інфікуванних клітинах, то у відповідності з даним винахоня, що сприяє попередженню зборки зрілих інфедом, рекомбінантні віруси MVA можуть бути кційних віріонів. Однак MVA здатний використані в якості абсолютно безпечних та експресувати вірусні та рекомбінантні гени на ефективних експресійних векторів. високому рівні навіть у непермесивних клітинах, в Рекомбінантні віруси MVA результаті чого було запропоновано, що вірус В одному з варіантів здійснення даний винаMVA може служити в якості ефективного та безхід відноситься до рекомбінантного вірусу MVA печного вектору експресії генів [Sutter, G. and коров'ячої віспи, що містить ген, який кодує чужоMoss, В. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89, рідний антиген, переважно патогенний агент; та 10847-10851]. Нещодавно були розроблені нові до вакцин, що містять вказаний вірус у фізіологісистеми векторів на основі вірусу MVA, що має чно прийнятній формі. Даний винахід також відчужорідні ДНК-послідовності, які вбудовані до носиться до способів отримання вказаного рекосайту делеції III в геномі MVA або в гені ТК мбінантного вірусу коров'ячої віспи MVA або [Sutter, G. та Moss, В (1995) Dev.Biol.Stand.Basel, вакцин на основі цього вірусу та до використання Karger, 84, 195-200 та патент США №5185146]. цих вакцин для профілактики інфекційних захвоДля подальшого більш перспективного викорювань, викликаних вказаними патогенними агеристання MVA, були проведені дослідження для нтами. розробки нових можливих шляхів введення чужоУ переважному варіанті даного винаходу, чурідних генів до штаму MVA вірусу коров'ячої віспи жорідним геном, що вбудований до вірусу MVA, є з використанням техніки рекомбінантних ДНК. ген, що кодує nef ВІЛ. Оскільки зміна геному вірусу MVA не була метою Авторами даної заявки були сконструйовані цих досліджень, то необхідно було використати рекомбінантні віруси MVA, які дозволяють здійсцей метод, який відповідав би цим цілям. У віднити експресію гену nef ВІЛ-1 під контролем ранповідності з даним винаходом, була здійснена нього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої рекомбінація шляхом вбудовування чужорідної віспи. Регуляторний білок Nef лентивірусів приДНК-послідовності до вірусної ДНК точно в сайт матів синтезується на ранній стадії реплікативнонатуральної делеції, що є в геномі MVA. го циклу вірусу; при цьому було показано, що цей Даний винахід включає, inter alia, до свого білок грає важливу роль в реплікації вірусу з виоб'єму (окремо або в комбінації): соким титром та індукуванні захворювань in vivo. рекомбінантний вірус MVA, що містить та Це дозволяє передбачити, що nef ВІЛ може грати здатний експресувати nef ВІЛ антиген; вирішальну роль у патогенезі СНІДу. Молекулярвищевказаний рекомбінантний вірус MVA, в ні механізми, завдяки яким nef сприяє збільшенякому nef ВІЛ антиген знаходиться під транскриню інфекційності та патогенності вірусу ВІЛ, пот 7 75411 8 ребують додаткового дослідження. Однак очевивіспяної вакцинації [як описано Stickl, Η. et al., дно, що nef є імуногенним, та nef-специфічний (1974) Dtsch.med.Wschr., 99, 2386-2392]. Для цьоантиген може бути використаний у якості вакцини го близько 106-108 частинок рекомбінантного MVA проти ВІЛ-інфекції та СНІДу. ліофілізують у 100мл забуференого фосфатом У відповідності з цим очевидно, що, з однієї фізіологічного розчину (PBS) у присутності 2% сторони, рекомбінантний вірус MVA, що експрепептону та 1% альбуміну людини в ампулі, пересує ген nef ВІЛ, може бути використаний у якості важно у скляній ампулі. Ліофілізат може містити профілактичної вакцини проти ВІЛ для імунізації наповнювачі (такі як маніт, декстран, цукор, глілюдини, а з іншої сторони, він може бути викорицин, лактоза або полівінілпіролідон) або інші достаний для імунотерапії ВІЛ-інфікованих пацієнтів бавки (такі як антиоксиданти, стабілізатори т.ін.), або хворих на СНІД. Окрім того, рекомбінантний які підходять для парентерального введення. вірус MVA, що експресує ген nef ВІЛ, може бути Потім скляну ампулу герметично запаюють, та ця використаний для продукування рекомбінантного ампула може бути залишена на зберігання протябілка ВІЛ. гом декількох місяців при температурі переважно В іншому переважному варіанті здійснення -20°С. даного винаходу чужорідним геном, вбудованим Для вакцинації або терапії ліофілізат може до вірусу MVA, є ген, що кодує тирозиназу людибути розчинений у 0,1-0,5мл водного розчину, ни. переважно фізіологічного розчину, та введений Авторами даної заявки були сконструйовані або парентерально, наприклад шляхом внутрішрекомбінантні віруси MVA, які дозволяють здійсньом'язової інокуляції або локально, наприклад нити експресію гену тирозинази людини під контшляхом інокуляції у саму пухлину або в область ролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу локалізації пухлини. Вакцини або терапевтичні коров'ячої віспи. Нещодавно тирозиназа людини засоби даного винаходу переважно вводять шлябула ідентифікована як меланомо-специфічний хом внутрішньом'язової ін'єкції [Mayr, A. et.al., пухлинний антиген, який сприяє генеруванню (1978) Zbl.Bakt.Hyg., I.Abt.Orig. В, 167, 375-390]. протипухлинних цитолітичних Т-лімфоцитів Спосіб, доза та схема введення можуть бути оп[Brichard, V., et al., (1993) J.Exp.Med., 178, 489тимізовані власне фахівцем відомими способами. 495]. Оскільки серед нормальних клітин, вірогідДля того щоб отримати відповідну імунну відпоно, лише меланоцити експресують ген тирозинавідь проти чужорідного антигену, бажано вводити зи, то очевидно, що тирозиназа є цінним антигевакцину декілька разів протягом тривалого періоном-мішенню для імунотерапії меланоми. Тому ду часу. рекомбінантний вірус MVA, що експресує ген тиУ відповідності з даним винаходом рекомбірозинази людини, може бути використаний для нантні віруси коров'ячої віспи MVA можуть бути продукування у пацієнтів, що страждають мелатакож використані для продукування гетерологічномою, імунної відповіді, яка стимулює відторгних поліпептидів в еукаріотичних клітинах. Для нення пухлини або попереджуючої появи метасцього клітини інфікують рекомбінантними вірусатазів. Рекомбінантний вірус MVA, що експресує ми коров'ячої віспи. В інфікованих клітинах ексген тирозинази людини, може бути використаний пресуються гени, що кодують чужорідний поліпебезпосередньо в якості вакцини проти меланоми, птид, в результаті чого продукується чи цей вірус може бути використаний для продугетерологічний поліпептид, який потім виділяють. кування рекомбінантного білка тирозинази, який Методи, що використовуються для продукування може служити в якості антигену у вакцинних претаких гетерологічних поліпептидів, добре відомі паратах. В іншому прикладі, клітини, що взяті з фахівцям [ЕР-А-206920 та ЕР-А-205939]. Поліпепухлини пацієнта, можуть бути модифіковані in птиди, продуковані за допомогою рекомбінантних vitro з використанням у якості вектору рекомбінавірусів MVA, більше підходять, виходячи з конкнтного вірусу MVA, що експресує ген тирозинази ретних властивостей вірусів MVA, для викорислюдини, а потім модифіковані клітини, що екстання у якості лікарських засобів для введення пресують тирозиназу, переносять зворотно в орлюдині та тваринам. ганізм пацієнта для індукування у нього протипуВ іншому варіанті здійснення даного винахохлинної імунної відповіді. Вакцина, отримана на ду авторами винаходу були сконструйовані рекооснові рекомбінантного MVA, що експресує ген мбінантні віруси MVA, що дозволяють експресутирозинази людини, може бути використана або вати ген РНК-полімерази бактеріофага Т7 під парентерально, або місцеве шляхом введення контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вібезпосередньо в область пухлини. Для поперерусу коров'ячої віспи. Ефективність рекомбінантдження появи метастазів або для фенотипічної них вірусів MVA-pol T7 у якості експресуючих сисзміни пухлини, наприклад зміни її розмірів, фортем оцінювали за допомогою аналізу методом ми, консистенції, васкуляризації або інших ознак, короткочасної трансфекції для індукування ексвакцина, отримана на основі рекомбінантного пресії рекомбінантних генів під контролем промовірусу MVA, що експресує ген тирозинази людитору РНК-полімерази Т7. Використовуючи в якосни, може бути введена до, під час або після хіруті гена-репортера ген ргічного видалення пухлини. хлорамфеніколацетилтрансферази (CAT) E.coli, Для виготовлення вакцин у відповідності з автори винайшли, що MVA-pol Т7-індукована ексданим винаходом віруси коров'ячої віспи MVA пресія гену CAT є такою ж ефективною, як і ексготують у відповідній фізіологічне прийнятній фопресія, індукована вірусом коров'ячої віспи/рої Т7, рмі. Це може бути зроблено, виходячи з досвіду що походить від компетентного по відношенню отримання MVA-вакцин, призначених для протидо реплікації штаму WR вірусу коров'ячої віспи. 9 75411 10 Таким чином, гібридна система MVA-pol T7 (MLV)) вміщують в один або декілька експресійданого винаходу може бути використана в якості них векторів (наприклад, плазмід) під транскриппростої, ефективної та безпечної експресійної ційний контроль промотору РНК-полімерази Т7, системи для продукування поліпептидів у клітиразом з експресійним вектором, що несе ретровінах ссавців при відсутності вірусу коров'ячої вісрусну векторну конструкцію, можливо під транскпи. рипційним контролем промотору РНК-полімерази Ця експресійна система може бути також виТ7. користана в цілях генерування рекомбінантних [В WO 94/29437, WO 89/11539 та WO вірусних частинок для вакцинації або генної те96/07748] описані різні типи ретровірусних векторапії шляхом трансформації клітинних ліній, які рних конструкцій, які можуть бути упаковані з виінфіковані рекомбінантним вірусом MVA, що екскористанням системи для упаковки, яка описана пресує РНК-полімеразу Т7, тобто інфікованих вище. ДНК-конструкцією, що містить усі або деякі гени, Окрім того, рекомбінантний вірус MVA, що та геном або рекомбінантний геном, які необхідні експресує РНК-полімеразу Т7, може бути викоридля генерування вірусних частинок, наприклад, станий для продукування рекомбінантних білків, MVA-частинок або ретровірусних частинок під неінфікованих вірусних частинок, або інфекційних транскрипційним контролем промотору РНКмутантних вірусних частинок у цілях виготовленполімерази Т7. ня вакцин або терапевтичних засобів [Bucholz et Векторні системи на основі ретровірусів al., Virology, 204, 770-776 (1994) та ЕР-В 1складаються з двох компонентів: 356695]. Для цього вірусні гени (наприклад, гени 1) першим компонентом є власне ретровірусgag-pol та env вірусу ВІЛ-1) вміщували під трансний вектор, що представляє собою модифіковакрипційний контроль промотору Т7 в експресійний ретровірус (векторну плазміду), в якому гени, ний вектор (наприклад, у плазміду або інший рещо кодують вірусні білки, були замінені терапевкомбінантний вірус MVA). Потім цю конструкцію тичними генами та маркерними генами, які необвводили до клітин, що інфіковані рекомбінантним хідні для введення у клітину-мішень, оскільки вірусом MVA, який експресує РНК-полімеразу Т7. така заміна генів, що кодують вірусні білки, приГени рекомбінантного вірусу транскрибуються з водить до значного пошкодження вірусу, то цей високим ступенем ефективності, в результаті вірус може бути "врятований" за допомогою дручого можуть бути отримані та очищені білки у гого компоненту в системі, який доповнює відсутвеликих кількостях. Окрім того, експресовані реність вірусних білків у модифікованому ретровікомбінантні вірусні білки (наприклад, env, gag русі; ВІЛ-1) можуть збиратися у вірусні псевдочастин2) другим компонентом є клітинна лінія, яка ки, які реплікуються та відділяються від клітини, продукує великі кількості вірусних білків, але при після чого вони можуть бути виділені з середоцьому не має здатності продукувати компетентвища з тканинною культурою. В іншому варіанті ний по реплікації вірус. Така клітинна лінія відома здійснення винаходу, вірусні білки (наприклад, як лінія клітин з дефектом упаковки та представвірусів ВІЛ, SIV та вірусу кору), що експресуються ляє собою клітинну лінію, трансфіковану однією MVA-pol T7 системою, можуть спасати додатково або декількома плазмідами, що несуть гени (гени введений мутантний вірус (який походить, наприgag, рої та env, що кодують поліпептиди), які заклад від ВІЛ, SIV, вірусу кору) шляхом подолання безпечують упаковку модифікованого ретровірудефекту інтеграції; а також інфікування, декапсисного вектора. дація, реплікація нуклеїнової кислоти, експресія Для генерування запакованого вектору, веквірусного гена, збирання, баддінг або інша стадія торну плазміду трансфікують у лінію клітин з дерозмноження вірусу дозволяють виконувати профектом упаковки. В цих умовах модифікований дукування і очищення вищезгаданого мутантного ретровірусний геном, що включає вбудовані тевірусу. рапевтичні та маркерні гени, транскрибується з Вірус MVA-pol T7 може бути також викорисвекторної плазміди та упаковується в модифікотано разом з ДНК-послідовностями, що несуть вані ретровірусні частинки (рекомбінантні вірусні ген потрібного антигена (наприклад, ген ВІЛ, nef, частинки). Потім цей рекомбінантний вірус викоtat, pol, gag, env або інші гени), необхідний для ристовують для інфікування клітин-мішеней, у імунізації. Спочатку кодуючу послідовність даного ДНК яких можуть інтегруватися геном вектора та антигена (наприклад ВІЛ, HCV, HPV, HSV, вірусу будь-які присутні в ньому маркерні або терапевкору, вірусу грипу або ін.) клонують під контролем тичні гени. Клітина, що інфікована такою рекомбіпромотора РНК-полімерази Т7 переважно в планантною вірусною частинкою, не може продукузмідний вектор, а отриману ДНК-конструкцію амвати новий векторний вірус, оскільки в цих пліфікують та очищують з використанням станклітинах відсутні вірусні білки. Однак ДНК вектор, дартних лабораторних процедур. Потім векторну що несе терапевтичні та маркерні гени, інтегруДНК інокулюють одночасно або з деяким інтерється в ДНК клітини, та може експресуватися в валом часу разом з MVA-pol T7. В місці інокуляції інфікованих клітинах. потрібний рекомбінантний ген піддається тимчаУ відповідності з даним винаходом, рекомбісовій експресії в клітинах, які містять векторну нантний вірус MVA, що експресує РНКДНК і MVA-pol T7, і відповідний антиген презентуполімеразу Т7, може бути використаний для проється імунній системі хазяїна, стимулюючи антидукування білків, які необхідні для упаковки ретген-специфічну імунну відповідь. Ця схема, що ровірусних векторів. Для цього гени gag, рої, env передбачає використання вектора MVA-pol T7, ретровірусу (наприклад, вірус лейкоза мишей що не реплікується, на основі вірусу коров'ячої 11 75411 12 віспи, є багатообіцяючим новим способом вакциристання ліпосом [Straubinger et al., Methodas in нації нуклеїновою кислотою, що забезпечує ефеEnzymology, 101, 512-527 (1983)]; за допомогою ктивну часову експресію даного антигена, але сферопластів [Schaffner, Proc.Natl.Acad.Sci. при цьому дозволяє уникнути потенціального USA,77, 2163-2167 (1980)], або якимось іншими ризику конститутивної експресії гена. відомими методами. При цьому більш бажаним Рекомбінантні віруси MVA, що походять від методом трансфекції є осаджування фосфатом вірусу коров'ячої віспи, можуть бути отримані, як кальцію. описано нижче. Для кращого розуміння суті цього винаходу ДНК-конструкцію, яка містить ДНКнижче наводяться докладні приклади його втіпослідовність, що кодує чужорідний поліпептид, лення. Однак ці приклади не повинні розглядатиіфланковану MVA-ДНК послідовностями, суміжся як деяке обмеження об'єму винаходу. ними з природною делецією, наприклад делецією Фіг.1: Схематична карта генома MVA і плазII в геномі MVA, вводять в клітини, інфіковані віміди для інсерції чужорідної ДНК шляхом гомолорусом MVA, в результаті чого відбувається гомогічної рекомбінації: HindIII-рестрикційні сайти в логічна рекомбінація. геномі MVA вказані зверху. Вказана також HindlllПісля введення ДНК-конструкції в еукаріотичHindlll N-фрагмент (900п.о.), який перекриває ні клітини і після рекомбінації із заміною вірусної область делеції II в геномі MVA. ДНКДНК на чужорідну ДНК, рекомбінантний вірус копослідовності MVA, що примикають до делеції II ров'ячої віспи може бути виділено відомими спо(край 1 (flank 1)) та край 2 (flank 2)) були ампліфісобами, переважно за допомогою маркера [пор. ковані за допомогою полімеразної ланцюгової Nakano et al., Proc.Natl.Acag.Sc. USA.79, 1593реакції (PCR) та використані для конструювання 1596 (1982), Franke et al., Mol.Cfll.Biol, 1918-1924 інсерційної плазміди pUC IILZ. (1985), Chakrabarti et al., Mol.Cfll.BioL, 3403-3409 Фіг.2: pUC II LZ P7.5: плазмідний вектор MVA, (1985), Fathi et al.,Virologi 97-105 (1986)]. що призначений для інсерції в делецію II та місДНК-конструкція, що вводиться, може бути тить експресуючий P11-LacZ-кластер та ранлінійною або кільцевою. Більш бажаною є кільценій/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, ва ДНК, зокрема - плазміда. ДНК-конструкція місдля експресії потрібних генів, які можуть бути тить послідовності, що фланкують лівий і правий клоновані у Smal-сайт плазміди. краї природної делеції, наприклад делеції II в Фіг.3: pUC II LZdel P7.5: MVA-плазмідний векгеномі MVA [Altenburger W., Suter СР., Altenburger тор для інсерції чужорідних генів в сайт делеції II J. (1989) Arch. Virol, 105,15-27]. Чужорідну ДНКу геномі ΜVA, що містить експресійний Ρ11-LacZпослідовність вбудовують між послідовностями, кластер, що самоделетуючий, та ранній/пізній що фланкують природну делецію. Такою чужоріпромотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи для ексдною ДНК-послідовністю може бути ген, що кодує пресії потрібних генів, які можуть бути клоновані в терапевтичний поліпептид, наприклад, t-РА або SmaI/Not1-сайт клонування плазміди. інтерферон, або антигенну детермінанту патоФіг.4: Конструювання рекомбінантного вірусу генного агенту. Такими патогенними агентами MVA-pol T7: схематичні карти геному MVA (рестможуть бути віруси, бактерії і паразити, які морикційні HindIII-сайти ендонуклеази) та векторна жуть викликати захворювання, а також пухлинні плазміда pUC II LZ T7pol, за допомогою якої здійклітини, які безконтрольно розмножуються в орснюють інсерцію ген РНК-полімерази Т7 в сайт ганізмі і можуть приводити до утворення і зросделеції II в HindIII-фрагменті Ν геному MVA. тання пухлини. Приклади таких патогенних агенФіг.5: Саузерн-блот-аналіз ДНК вірусу MVAтів описані Davis B.D. et al. (Microbiology, 3rd ed., pol T7. Harper International Edition). Більш бажаними анФіг.6: Метаболічне мічення білків з використигенами патогенних агентів є віруси імунодефітанням [35S] метіоніну. Аналіз за допомогою елекциту людини (наприклад, ВІЛ-1 і ВІЛ-2), мікобактрофорезу в ПААГ з ДСН. Смуга 1: MVA-polT7; терії, що викликають туберкульоз, паразит смуга 2: MVA; смуга 3: клітини CV-1. Plasmodium falciparum і клітини меланоми. Фіг.7: САТ-аналіз: клітини CV-1 трансфікуваДля експресії ДНК-прослідовності або гена ли плазмідою, що містить ген CAT під контролем потрібна присутність регуляторних послідовноспромотору РНК-полімерази Т7б та інфікували тей, які необхідні для транскрипції генів, що привірусом MVA-T/pol або WR-polT7. Лізати тестувасутні на ДНК-послідовності. Такі регуляторні посли на САТ-активність "С" означає хлорамфенікол, лідовності (що називаються промоторами) добре та 1-АсС та 3-АсС означають моно- та триацетивідомі спеціалістам, та прикладом таких послідольовані форми хлорамфеніколу. САТ-активність вностей може служити промотор гену вірусу ковиражали як процент ацетильованого продукта, ров'ячої віспи, що кодує поліпептид 11кДа [опиутвореного за 60 хвилин. сано в ЕР-А-198328], і промотор гена, що кодує Фіг.8: Конструювання MVA-LAIne/: схематичні 7,5кДа [описано в ЕРА-110385]. карти геному MVA (рестрикційні HindIII-сайти енДНК-конструкцію може бути введено в MVAдонуклеази) та векторної плазміди pUC II LZdel інфіковані клітини шляхом трансфекції, наприp7.5-LAlnef, за допомогою якої здійснюють інсерклад шляхом преципітації фосфатом кальцію цію гену nef ВІЛ-1 LAI в сайт делеції II в Hindlll [Graham et al. Virol., 52,456-467 (1973); Wigler et фрагмент N геному MVA. al.,Cell,777-785 (1979)]; шляхом електропорації Фіг.9: Конструювання MVA-hTYR: схематичні [Neumann et al., EMBO J., 1, 841-845, (1982)]; карти геному MVA (рестрикційні HindIII-сайти еншляхом мікроін'єкції [Graesmann et al., Meth. донуклеази) та векторної плазміди pUC II LZdel Enzymology, 101, 482-492 (1983)]; шляхом викоP7.5-TYR, за допомогою якої здійснюють інсерцію 13 75411 14 гену тирозинкінази в сайт делеції II в Hindlll Sorvall RC-3B за температури 4°С протягом п'яти фрагметі N геному MVA. хвилин. Неочищений вірусний препарат зберігали Приклади 1. за температури -20°С перед подальшою обробКультивування та очистка вірусів кою (наприклад, очисткою вірусу). 1.1. Культивування вірусів MVA 1.2. Очистка вірусів Вірус MVA є у високому ступені ослабленим Для того щоб отримати по можливості чистий вірусом коров'ячої віспи, отриманим від штаму вірусний препарат, який не містить компонентів, вірусу коров'ячої віспи Анкара (CVA) в результаті специфічних для цієї хазяйської клітини, проводовготривалого серійного ласування на культурі дили стадії очистки способом, аналогічним опипервинних фібробластів курячого ембріону (CEF). саному Joklik [Virology, 18, 9-18 (1962)]. НеочищеІз загальним оглядом історії продукування, власний вірусний вихідний матеріал витримували за тивостей та використання штаму MVA можна температури -20°С, а потім відтаювали та один ознайомитись [у коротких публікаціях Mayr et al., раз суспендували в PBS (10-20-кратний об'єм in Infection, 3, 6-14 (1975)]. Завдяки атенуації в осаду), після чого суспензію центрифугували, як CEF, в цій пташиній клітині-хазяїні вірус MVA реописано вище. Щойно отриманий осад суспендуплікується з високим титром. Однак у клітинах вали в десяти об'ємах буферу Трис 1 (10мМ ссавця ріст MVA сильно обмежений, та звичайне Трис-НСІ, рH=9,0), та суспензію швидко обробутворення бляшек під дією вірусу не виявляєтьляли ультразвуком (Labsonic L., B.Braun Biotech ся. Тому вірус MVA був культивований на клітиInternational, Melsungen, Germany; 2 10 секунд нах CEF. У цілях отримання клітин CEF 11-денні при 60Ват та при кімнатній температурі) в цілях ембріони виділяли з інкубованих курячих яєць, подальшого дезінтегрування клітинного дебрису кінцівки видаляли, та ембріони подрібнювали та та вивільнення вірусних часток з клітинного мадисоціювали в розчині, що містить 0,25% трипситеріалу. Ядра клітин та більшу частину клітинного ну, за температури 37°С протягом 20 хвилин. дебрісу видаляли шляхом швидкого центрифугуОтриману клітинну суспензію фільтрували та вання суспензії (роторна центрифуга Sorvall GSA клітини осаджували шляхом центрифугування від DuPont Co., D-6353 Bad Nawieim, FRG; 3 хвипри 2000об./хв. у центрифузі Sorvall RC-3B за лини при 3000об./хв. та температурі 10°С). Осад кімнатної температури протягом 5 хвилин, а потім знову один раз суспендували в буфері Трис 1, ресуспендували в 10 об'ємах середовища А (сеобробляли ультразвуком та центрифугували, як редовище Ігла (DMEM), що отримується, наприописано вище. Зібрані супернатанти, що містять клад, від Life Technologies GmbH, Eggenstein, вільні вірусні частки, об'єднували та покривали Germany), після чого знову осаджували шляхом градієнтом 10мл 36% сахарози в 10мМ Трис-НСІ центрифугування при 2000об./хв. у центрифузі з рН=9,0, а потім центрифугували в центрифузі Sorvall RC-3B за кімнатної температури протягом Beckman SW 27/SW 28 при 13500об./хв. протягом 5 хвилин. Після центрифугування клітинний осад 80 хвилин за температури 4°С. Потім супернапереносили в середовище А, що містить 10% тант відкидали, а осад, що містить вірусні частки, фетальну сироватку теляти (FCS), пеніцилін розчиняли в 10мл 1мМ Трис-НСІ з рH=9,0, гомо(100одиниць/мл), стрептоміцин (100мг/мл) та генізували шляхом швидкої обробки ультразву2мМ глутамін, у результаті чого отримували кліком (2 10 секунд за кімнатної температури з витинну суспензію, що містить 500000клітин/мл. користанням пристрою, описаного вище) та Клітини CEF, отримані у такий самий спосіб, нананосили на градієнт 20-40% сахарози (сахароза носили шляхом розпилення на чашки для кульв 1мл Трис-НСІ, рН=9,0) для подальшої очистки. тивування клітин. Ці клітини культивували в сеГрадієнт центрифугували в роторній центрифузі редовищі А в інкубаторі з СО2 за 37°С протягом Beckmann SW41 при 13000об./хв. протягом 50 1-2 днів залежно від потрібної щільності клітин та хвилин за температури 4°С. Після центрифугувикористовували для інфікування або відразу, вання дискретні смуги, що містять вірусні частки, або після одного клітинного пересіву. Детальний збирали шляхом піпетування після зменшення опис отримання первинних культур може бути об'єму вищевказаної смуги. Отриманий розчин знайдено [в роботі R.I.Freshney, "Culture of animal сахарози розводили трьома об'ємами PBS та cell", Alan R. Liss Verlag New York 1983. Chapter II, вірусні частки знову осаджували шляхом стор.99]. центрифугування (Beckmann SW27/28, 60 хвилин Віруси MVA інфікували наступним чином. Кліпри 13500об./хв., температура 4°С). Осад, який тини CEF культивували в 175см флаконах для складався головним чином з чистих вірусних часкультивування клітин. При 90-100% суцільності ток, ресуспендували в PBS та врівноважували до середовище видаляли, та клітини інкубували середніх концентрацій вірусу, що складає в серепротягом однієї години з суспензією вірусу MVA дньому 1-5 109МЕ/мл. Розчин очищеного вірус(0,01 одиниць інфекції (ME) на клітину, ного вихідного матеріалу зберігали при -80°С та 0,02мл/см) в середовищі А. Потім додавали довикористовували або відразу, або розводили фодатково кількість середовища А (0,2мл/см) та сфатно-буферним фізіологічним розчином для флакони інкубували за температури 37°С протяпроведення подальших експериментів. гом 2-3 днів (доки 90% клітин не починали прояв1.3. Клонування вірусу MVA ляти цитопатогенний ефект). Неочищений вірусДля генерування гомогенних вихідних вірусний вихідний матеріал був отриманий шляхом них препаратів вірус MVA, отриманий від Prof. зскрібання клітинних моношарів у середовищі та Anton Mayr, клонували шляхом лімітуючого розосадження клітинного матеріалу шляхом ведення протягом трьох подальших пересівів у центрифугування при 3000об./хв. у центрифузі клітини CEF, культивовані на 96-лункових план 15 75411 16 шетах для культивування тканини. Клон F6 MVA ген під транскрипційним контролем промотору відбирали та ампліфікували в CEF з отриманням Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, в геном MVA. Після маточних розчинів вірусу, які служать у якості цього потрібний рекомбінантний вірус виділяли вихідного матеріалу для генерування рекомбінашляхом скринінгу на експресію β-галактозидазної нтних вірусів MVA, описаних у даній патентній активності та подальше його культивування призаявці, а також для генерування рекомбінантних зводило до самоделеції знову сконструйованого вірусів MVA, описаних раніше [Sutter, G. та Mose, P11-LacZ-експресуючого кластера в результаті В., (1992) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 89, 10847гомологічної рекомбінації. 10851; Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. 2.2. Конструювання та характеристика рекота Moss, В., (1994), Vaccine 12, 1032-1040; Hirsch, мбінантного вірусу MVA-роlТ7 V., Fuerst, Т., Sutter, G., Carroll, M., Yang, L., 3,1 kbp-ДНК-фрагмент, що містить повний ген Golgstein, S., Piatak, M., Elkins, W., Alvord, G., РНК-полімерази бактеріофагу Т7 під контролем Montefiori, D., Moss, B. and Lifson, J., (1986) J. раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'яVirol., 70 3741-3752]. чої віспи, вирізали ферментом EcoRI з плазміди 2. Конструювання та характеристика рекомpTF7-3 [Fruest, T.P., Niles, E.G., Studier, F.W. and бінантних вірусів MVA Moss, В., (1986), P>N>A>S>USA, 83, 8122-8126], 2.1. Конструювання векторних плазмід модифікували шляхом інкубування ДНКУ цілях генерування рекомбінантих вірусів полімерази фрагментом Кленова для продукуMVA були сконструйовані нові векторні плазміди. вання тупих кінців та клонували в унікальний Вбудовування чужорідних генів у геном MVA Smal-сайт рестрикції LZ pUCII з утворенням плаздійснювали точно в сайт природної делеції II в змідного вектору переносу pUCII-LZ-pol T7 (Фіг.4). геномі MVA. Послідовності MVA-ДНК, фланкуючи В якості транскрипційного регулятору для екссайт 2500п.о.-делеції у HindIII-фрагменті Ν геномі пресії гену РНК-полімерази Т7 був вибраний ранMVA (Altenburger, W. Suter, СР. та Altenburger, ній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. У J.[1989], J.Arch. Virol., 105, 15-27), були ампліфіпротилежність до більш сильного пізнього промоковані за допомогою полімеразної ланцюгової тора вірусу віспи (наприклад, Р11) ця промоторна реакції та клоновані в сайт множинного клонусистема дозволяє експресувати рекомбінантні вання плазміди pUC18. Праймерами для лівого гени безпосередньо після інфікування клітин600п.о.-ДНК-краю є: 5'-CAG CAG GGT АСС СТС мішеней. LZ-pol Т7-плазміда pUCII, яка забезпеАТС СТА CAG GAC GTT СТС-3' та 5'-CAG CAG чує введення чужорідних генів у сайт делеції II CCC GGG TAT TCG ATG АТТ АТТ ТТТ ААС ААА геному MVA, була використана для генерування ATA ACA-3' (сайти для рестриктуючих ферментів вірусу MVA-pol T7. Крпі та Smal підкреслені). Праймерами для праКлітини CEF інфікували вірусом MVA при вого 550п.о.-ДНК-краю є: 5'-CAG CAG CTG CAG множинності інфекції TCID50=0,05 на клітину та GAA TCA TCC ATT CCA CTG ЛАТ AGC-3' та 5'трансфікували ДНК плаз-LZ-pol Т7-плазміди CAG CAG GCA TGC CGA CGA АСА AGG AAC pUCII, як описано раніше [Sutler, G., Wyatt, L., TGT AGC AGA-3' (сайти для рестриктуючих ферFoley, P., Bennink, J. та Moss, В., (1994), Vaccine ментів PstI та SphI підкреслені). Між цими краями 12, 1032-1040]. Рекомбінантний вірус MVA, ексMVA ДНК, вставленій в pUC18, вбудовували ген пресуючий РНК-полімеразу Т7 та сумісно експреlacZ Escherichia coli під контролем пізнього просуючий Р-галактозидазу (P7.5-pol T7 MVA), відмотору Р11 вірусу коров'ячої віспи [отриманого бирали в результаті проведення п'яти шляхом гідролізу ферментом pill LZ, Sutter, С. and послідовних циклів очистки методом бляшек у Moss, В. (1992) PNAS USA 89, 10847-10851] з клітинах CEF, пофарбованих 5-бром-4-хлор-3використанням BamHI-сайта, в результаті чого індоліл-β-D-галактозидом (300мкг/мл). Рекомбіотримували інсерційний MVA-вектор pUCII LZ нантні віруси ампліфікували шляхом інфікування (Фіг.1). Після цього 289п.о.-фрагмент, що містить моношарів CEF, та ДНК аналізували за допоморанній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої вісгою PCR для підтвердження генетичної однорідпи разом з Smal-сайтом для клонування (отриманості вірусного штаму. Саузерн-блот-аналіз віруним шляхом рестрикції ферментами EcoRI та сної ДНК MVA-pol T7 продемонстрував стабільну Xbal з плазмідного вектору pSCll [Chakrabarti та інтеграцію рекомбінантних генів у сайт делеції II в ін., 1985, Molecular та Cellular Biology 5, 3403геномі MVA (Фіг.5). Для спостереження за екс3409]), вставляли Smal-сайт pUCII з отриманням пресією РНК-полімерази Т7 шляхом рекомбінанMVA-вектора pUCII LZ P7.5 (Фіг.2). Для конструютного MVA-pol T7 були проаналізовані мічені [35S] вання векторної плазміди, яка дозволяє виділяти метіоніном поліпептиди від вірус-інфікованої курекомбінантні віруси MVA шляхом часового синльтури тканини. Моношари клітинної лінії нирок тезу репортерного ферменту-β-галактозидази, мавпи CV-1, культивовані в 12-лункових планше330п.о.-ДНК-фрагмент від 3'-кінця відкритої рамки тах, інфікували вірусом при множинності інфекції зчитування LacZ. Ε. coli ампліфікували за допоТСID50=20 на клітину. Через 3-5 годин після інфімогою PCR (праймери 5'-CAG CAG GTC GAC кування середовище видаляли, та культури один CCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC-3' та 5'-GGG раз промивали Імл середовища, що не містить GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT метіоніну. В кожну лунку додавали 0,2мл середоCAG-3') та клонували в Sail та Pstl-сайти pCU II вища, що не містить метіоніну, разом з 50мкКи LZ P7.5 з отриманням MVA-вектору pUC II LZdel [35S] метіоніном та середовище інкубували протяP7.5 (Фіг.3). З використанням Smal-сайту, ця векгом 30 хвилин за 37°С. Цитоплазматичні екстракторна плазміда може бути використана для встати інфікованих клітин отримували шляхом інкубувки ДНК-послідовностей, кодуючих чужорідний вання кожної лунки в 0,2мл 0,5% буферу для 17 75411 18 лізису Nonidet P-40 протягом 10 хвилин при 37°С, контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 віта зразки аналізували шляхом електрофорезу в русу коров'ячої віспи. ПААГ з ДСН. Метаболічне мічення клітин CV-1 Клітини CEF, інфіковані вірусом MVA при вірусом MVA-pol T7 виявило синтез двох додатмножинності зараження TCID50=0,05 (TCID - секових поліпептидів (і) білку розміром біля редня цитопатогенна доза) на клітину, трансфіку116000Да, що представляє собою сумісно ексвали ДНК плазміди pUC II LZdel-P7.5-LAInef, як пресовану β-галактозидазу Е.соlі, яка дозволяє описано раніше [Sutter, G., Wyatt, L, Foley, P., проводити скринінг на рекомбінантний вірус; та Bennink, J., Moss, B. (1994) Vaccine, 12, 1032(іі) білка з очікуваним розміром 98000Да, що від1040]. Рекомбінантні віруси MVA, що містять ген повідає РНК-полімеразі бактеріофагу Т7 (Фіг.6). nef та сумісно маркерний ген LacZ E.coli, що суміПри цьому було відмічено, що MVA-T7pol продусно експресується з часовою регуляцією, відбикує велику кількість β-галактозидази. Експеримерали шляхом проведення послідовних циклів нти з in vivo-міченням продемонстрували дуже очистки методом бляшек у клітинах CEF, пофарвисокий рівень експресії P11-LacZ-ген-вмісній бованих 5-бром-4-хлор-3-індоліл-β-Dконструкції, введеній у геном MVA в сайт делеції галактозидом (300мкг/мл). Після цього рекомбі11, що свідчить про те, що рекомбінантні гени у нантні віруси, що містять ген nef та мають делевекторному вірусі MVA можуть бути експресовані тований маркерний ген LacZ, виділяли шляхом з великою ефективністю в тому випадку, якщо проведення ще трьох додаткових послідовних вони вбудовані саме в цій локус геному MVA. циклів очистки методом бляшек, здійснюючи Ефективність рекомбінантних вірусів MVA-pol скринінг на непофарбовані фокуси вірусу у клітиT7 як експресуючих систем у порівнянні з рекомнах CEF у присутності 5-бром-4-хлор-3-індоліл-βбінантним WR-T7pol вірусом vTF7-3 (Fuerst та ін., D-галактозида (300мкг/мл). Потім рекомбінантні 1986) оцінювали шляхом котрасфекції ДНК плазвіруси ампліфікували шляхом інфікування мономідного вектору, що походить від pTMl [Moss, В., шарів, та MVA-LAInef-вірусну ДНК аналізували за EIroy-Stein, О., Mizukami, Т., Alexander, W.A., допомогою PCR для того, щоб упевнитись у генеFuerst T.R. (1990) Nature, 348, 91-92]), та містить тичній гомогенності вірусного штаму. Саузернген (клонований у Ncol- та ВатНІ-сайти множинблот-аналіз вірусної ДНК підтвердив генетичну ного клонування pTMl) хлорамфеніколацетилтрастабільність MVA-LAInef та явно продемонструнсферази (CAT) Е.соlі під контролем промотору вав інтеграцію гену nef та делецію маркерного РНК-полімерази Т7 (РТ7). Трансфіковані та інфігену LacZ Ε. coli в сайті делеції 11 у вірусному ковані клітини CV-1 суспендували в 0,2мл 0,25Μ геномі. Трис-НСІ (рН=7,5). Після трьох циклів заморожуЕфективна експресія рекомбінантного білку вання-відтаювання лізати освітлювали шляхом Nef була підтверджена за допомогою Вестернцентрифугування, а потім визначали вміст білка в блот-аналізу білок-продукуючих лізатів клітин супернатантах, та зразки, що містять 0,5; 0,25; CEF, інфікованих вірусом MVA-LAInef з викорис0,1мкг повного білку, аналізували на ферментну танням мишачих mАВ проти Nef ВІЛ-1 люб'язно активність методом, [описаним Mackett, Μ., Smith, наданих K.Rrohn та використаних [як описано G.L. Moss, В., (1984), J.Virol, 49, 857-864]. Після Ovod, V., Lagerstedt, Α., Ranki, Α., Gombert, F., авторадіографії кількість мічених плям оцінювали Spohn, R., Tahtinen, M., Jung, G., Krohn, K. (1992) з використанням візуалізуючої аналітичної сисAIDS, 6, 25-34]. теми Fuji. Отримані результати проілюстрували, 2.4. Конструювання та характеристика рекощо шляхом використання у високому ступені атембінантного вірусу MVA-LAInef нуйованого вектору MVA на основі вірусу коро1,9п.о. -ДНК-фрагмент, що містить повний в'ячої віспи може бути отримана система "вірус ген, кодуючий тирозиназу людини [кДНК-клон коров'ячої віспи-РНК-полімераза Т7", яка являтирозинази 123.В2 виділяли з клітинної лінії меється такою ж ефективною, як і при використанні ланоми SK29-MEL пацієнта SK29 (AV), GenBank досить компетентного по реплікації рекомбінанта № допуску UO1873; Brichard, V., Van Pel, Α., на основі вірусу коров'ячої віспи (Фіг.7). Wolfel, Т., Wolfel, С, De Plaen, E., Lethe, В., Coulie, 2.3. Конструювання та характеристика рекоP. та Boon, В. (1993), J.Exp.Med., 178, 489-495] мбінантного вірусу MVA-LAInef отримували з плазміди pcDNAI/Amp-Туr [Wölfel, 648п.о.-ДНК-фрагмент, що містить повний ген Т., Van Pel, Α., Brichard, V., Schneider, J., Seliger, nef LAI ВІЛ-1, отримували за допомогою PCR з В., Meyer zum Buschenfelde, K., та Boon, T. (1994) плазмідною ДНК (pTG1166, люб'язно наданою Eur.J.ImmunoL, 24, 759-764] шляхом гідролізу М.-Р. Kіеnу, Transgene S.A., Strasbourg; для PCR ферментом EcoRl, а потім модифікували шляхом використовували наступні праймери: 5'-CAG CAG інкубування з ДНК-полімеразою Кленова для "заGGA ТСС ATG GGT GGC AAG TGG ТСА ААА туплення кінців" та клонували у Smal-cawr pUC II AGT AGT-3' та 5'-CAG CAG GGA ТСС ATG ТСА LZdel P7.5, в результаті чого отримували вектор GCA GTT СТТ GAA GTA СТС CGG-3'), гідролізуpUC II LZdel P7.5-TYR (Фіг.9). Ця плазміда може вали рестриктуючою ендонуклеазою ВатНІ, мобути використана для конструювання рекомбінадифікували шляхом інкубування з ДНКнтного вірусу MVA, який експресує ген тирозинаполімеразою Кленова для "затупіння кінців", та зи людини під контролем раннього/пізнього проклонували в Smal-сайт pUC II LZ-del P7.5, в ремотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. зультаті чого отримували вектор pUC II LZdel Клітини CEF, інфіковані вірусом MVA при P7.5-LAInef (Фіг.8). Ця плазміда може бути викомножинності зараження TCID50=0,5 на клітину, ристана для конструювання рекомбінантного вітрансфікували ДНК плазміди pUC II LZdel P7.5русу MVA, який експресує ген nef ВІЛ-1-LAI під TYR, як описано в літературі [Sutter, G., Wyatt, L., 19 75411 Foley, P., Bennink, J., Moss, В., (1994) Vaccine 12,1032-1040]. Рекомбінантний вірус MVA, стабільно експресуючий ген тирозинази людини та сумісно експресуючий, з часовою регулюцією, ген LacZ E coli, відбирали шляхом проведення послідовних циклів методом бляшек у клітинах CEF, пофарбованих 5-бром-4-хлор-3-індоліл-β-Dгалактозидом (300мкг/мл). Після цього рекомбінантні віруси, які експресують ген, що кодує тирозиназу людини та має делетований маркерний ген LacZ, виділяли шляхом проведення ще трьох додаткових послідовних циклів очистки методом бляшек, здійснюючи скринінг на непофарбовані фокуси вірусу в клітинах CEF у присутності 5бром-4-хлор-3-індоліл-β-D-галактозида (300мкг/мл). Потім рекомбінантні віруси ампліфікували шляхом інфікування моношарів CEF, та MVA-hTYR-вірусну ДНК аналізували за допомогою PCR для того, щоб упевнитися в генетичній гомогенності вірусного штаму. Саузерн-блотаналіз вірусної ДНК підтвердив генетичну стабільність MVA-hTYR та явно продемонстрував інтеграцію рекомбінантного гену тирозинази та делецію маркерного гену LacZ Ε coli в сайт делеції II у вірусному геномі. Ефективна експресія рекомбінантної тирозинази людини була підтверджена за допомогою Вестерн-блот-аналізу білок-продукуючих лізатів клітин CEF, інфікованих вірусом MVA-hTYR з використанням кролячих поліклональних антитіл, люб'язно наданих V.Hearmg, та використаних, [як описано, Jimenez., M., Kameyama, К., Maloy, L., Tomita, Υ., Hearing, V. (1988) P.N.A.S. USA 85, 3830-3834] або мишачих моноклональних антитіл, люб'язно представлених L. Old та використаних, [як описано, Chen, Y., Stockert, E., Tsang, S., Coplan, K. Old, L. (1995) P.N.A.S. USA 92, 81258129], направлених проти тирозинази. Перелік послідовностей (1) Загальна інформація: (і) Заявник: (A) Назва: GSF-Forschungszentrum fuer Umwelt und Gesundehiet GmbH (B) Вулиця: Ingolstaeder Landstr. 1, Neunerberg (C) Місто: Oberschleissheim (E) Країна: Німеччина (F) Поштовий індекс: 85764 (ii) Назва винаходу: Рекомбінантний вірус MVA та його використання (iii) Кількість послідовностей: 8 (iv) Тип комп'ютерного зчитування: (A) Тип носія: гнучкий диск (B) Комп'ютер: PC сумісний з IBM (C) Операційна система: PC-DOS/MS-DOS (D) Програмне забезпечення: Patentln Release # 1,0 Version # 1,30 (ЕРО) (vi) Данні попередньої заявки: (A) Номер заявки: DK 0782/95 (B) Дата подання: 04 липня 1995р. (2) Данні послідовності SEQ ID №1: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 33 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна 20 (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №1: (2) Данні послідовності SEQ ID №2: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 42 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №2: (2) Данні послідовності SEQ ID №3: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 36 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №3: (2) Данні послідовності SEQ ID №4: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 36 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №4: (2) Данні послідовності SEQ ID №5: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 33 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис.7опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №5: (2) Данні послідовності SEQ ID №6: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 33 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №6: (2) Данні послідовності SEQ ID №7: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 39 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №7: (2) Данні послідовності SEQ ID №8: 21 (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 39 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна 75411 22 (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №8: 23 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 75411 Підписне 24 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601