Рекомбінантний вірус мvа та його застосування

1. Рекомбінантний вірус MVA, що містить та здатний до експресії антигену тирозинази (hTyr) людини. 2. Рекомбінантний вірус MVA за п.1, який відрізняється тим, що hTyr ген знаходиться під транскрипційним контролем раннього/пізнього промо C2 2 75410 1 3 75410 4 вакцин на основі вказаної експресійної системи. оскільки вона дозволяє отримати більше 80% Вірус коров'ячої віспи, що належить до роду клітин, що експресують потрібний ген [Elroy-Stein, Ортопоксвірусів родини Поксвірусів, був викорисО. & Moss, В. (1990) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 87, таний у якості живої вакцини для імунізації люди6743-6747]. Перевагу "вірус коров'ячої віспи/Т7ни у цілях продукування в нього імунітету проти РНК-полімераза" - гібридної системи, у порівнянні натуральної віспи. Успішна всесвітня вакцинація з іншими системами з тимчасовою експресією, вірусом віспи завершилася викорененням вірусу полягає, вірогідно, в її незалежності від трансповіспи, який є агентом, що спричинює віспу [The рту плазмід до ядра клітини. Раніше цю систему global eradication of smallpox. Final report of the використовували виключно в аналітичних цілях у global commission for the certification of smallpox вірусології та мікробіології [Buonocore, L. & Rose, eradication. History of Public Health, №4, Geneva: J.K. (1990) Nature 345, 625-628, Pattnaik, A.K. and World Health Organization, 1980]. З часу підписанWertz, G.W. (1991) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 88, ня декларації ВОЗ (Всесвітня організація охорони 1379-1383, Karshin, Α., Aiyar, J., Gouin, Α., Davidздоров'я, WHO) загальна вакцинація була зупиson, N. and Lester, H.A. (1991) FEBS Lett., 278, нена, за виключенням людей з високим ризиком 229-233, Ho, B.Y., Karshin, Α., Raymond, J., Branзараження поксовірусом (наприклад, лаборантів). chek, Т., Lester, H.A. and Davidson, N. (1992) Пізніше віруси коров'ячої віспи були також FEBS Lett., 301, 303-306, Buchholz, C.J., Retzler C, використані для конструювання вірусних вектоHomann, H.E. and Neubert, W.J. (1994) Virology, рів, що були призначені для експресії рекомбіна204, 770-776]. Однак у майбутньому можливі вантних генів та для можливого їх застосування в жливі зміни гібридної системи "вірус коров'ячої якості живих вакцин [Mackett, M., Smith, G.L., віспи/РНК-полімераза Т7", наприклад для продуMoss, В., 1982, P.N.A.S., USA 79, 7415-7419; кування рекомбінантних білків або рекомбінантSmith, G.L., Macket, M.& Moss, В., 1984, Biotechних вірусних частинок у цілях розробки нових nology & Genetic Engineering Reviews, 2, 383-407]. терапевтичних або профілактичних методів у Це дає можливість отримати ДНК-послідовності медицині, можуть зіштовхнутись з певними труд(гени), що кодують чужорідні антигени та вбудонощами, що зумовлені продуктивною реплікацією вані, за допомогою техніки рекомбінантних ДНК, рекомбінантного вектору, отриманого на основі до геному вірусу коров'ячої віспи. Якщо ген інтегвірусу коров'ячої віспи. рується в сайт вірусної ДНК, що не має вирішаВірус коров'ячої віспи є інфекційним для люльного значення для життєвого циклу вірусу, тоді дини, та іноді, після вакцинації, що проводилась у знову рекомбінантний вірус коров'ячої віспи, що якості профілактичної міри по боротьбі з натурапродукується, може бути інфекційним, тобто він льною віспою, у вакцинованих людей спостерігаможе інфікувати чужорідні клітини, в результаті лись серйозні ускладнення. Найбільш повний чого буде експресуватися інтегрована ДНКопис випадків ускладнень після вакцинації людей послідовність [Європейські патентні заявки приводиться у Національному звіті США, що ви№№83286 та 110385]. Отримані таким чином світлює спостереження за вакцинацією близько рекомбінантні віруси коров'ячої віспи можуть бути 12 мільйонів людей, що була проведена з виковикористані, з однієї сторони, в якості живих вакристанням вакцини, отриманої на основі штаму цин для профілактики інфекційних захворювань, Нью-Йоркського місцевого департаменту охорони та, з іншої сторони, в якості матеріалу для продуздоров'я (New York City Board of Health) вірусу кування гетерологічних білків в еукаріотичних коров'ячої віспи [Lane, J., Ruben, F., Neff, J. and клітинах. Millar, J. (1969) New Engl.J.Med., 281, 1201-1208]. Продукування рекомбінантного вірусу короТому, багатообіцяюча можливість використання в'ячої віспи, що експресує ген РНК-полімерази вірусу коров'ячої віспи в якості вектору для вигобактеріофагу Т7, дозволяє отримати експресійну товлення живих вакцин зіштовхується з проблесистему, яка може широко використовуватися мою безпеки та регламентації застосування цьодля синтезу рекомбінантних білків у клітинах ссаго вірусу. Окрім того, більшість рекомбінантних вців [Moss, В., Elroy-Stein, О., Mizukami, Т., Alexвірусів коров'ячої віспи, що описані у літературі ander, W.A., Fuerst, T.R., 1990, Nature 348, 91-92]. були отримані на основі штаму Western Reserve Всі методи експресії рекомбінантного гену певірусу коров'ячої віспи. З іншої сторони, відомо, редбачають синтез РНК-полімерази Т7 у цитощо цей штам має високий ступінь нейровірулентплазмі еукаріотичних клітин. При цьому, найбільш ності, а тому він є малопридатним для введення часто використовується схема тимчасової екслюдині та тваринам [Morita et al., Vaccine 5, 65-70 пресії [Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. & (1987)]. Moss, В., (1986) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 83, 8122Ризик для здоров'я людини або тварин, по8126, та заявка на патент США №7648971]. Спов'язаний із застосуванням вказаного вірусу в якочатку потрібний чужорідний ген вбудовують до сті вектору, може бути знижений шляхом викориплазміди під контроль промотору гену РНКстання у високому ступені атенуйованого полімерази Т7. Потім, використовуючи стандарт(послабленого) штаму вірусу коров'ячої віспи. ну техніку трансфекції, цю плазміду вводять до Декілька таких штамів вірусу коров'ячої віспи буцитоплазми клітин, інфікованих рекомбінантним ли спеціально розроблені для знищення небажавірусом коров'ячої віспи, що продукує РНКних побічних ефектів, що з'являлись у результаті полімеразу Т7. вакцинації проти віспи. Так, наприклад, модифіЦя схема трансфекції є досить простою, оскікований вірус коров'ячої віспи Анкара (MVA) був льки вона не потребує створення нових рекомбіотриманий шляхом тривалого серійного пасуваннантних вірусів, та до того ж є дуже ефективною, ня штаму Анкара вірусу коров'ячої віспи (CVA) на 5 75410 6 фібробластах куриних ембріонів [див. огляд Mayr, вищевказаний рекомбінантний вірус MVA, в A., Hochstein-Mintzel, V. and Stickl, H.(1975) Infecякому hTyr ген знаходиться під транскрипційним tion 3, 6-14; патент Швейцарії №568392]. Вірус контролем раннього/пізнього промотору р7.5 віMVA був депонований, у відповідності з вимогами русу коров'ячої віспи; Будапештського договору, в CNCM [Інститут Пасвищевказаний рекомбінантний вірус MVA, не тера, Національна колекція мікроорганізмів, 25 здатний реплікуватися у клітинах людини; rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, 15 еукаріотична клітина, інфікована in vitro або грудня 1987р. під номером допуску №1-721]. Моex vivo вищевказаним рекомбінантним вірусом дифікований вірус MVA відрізняється своїм висоMVA; ким ступенем послабленості, тобто він має знивикористання вищевказаного рекомбінантножену вірулентність або інфекційність, зберігаючи го вірусу MVA для продукування in vivo рекомбіпри цьому гарну імуногенність. Вірус MVA був нантного hTyr протеїну; проаналізований для того, щоб визначити, які вакцина, що містить вищевказаний рекомбісаме зміни є в його геномі у порівнянні з вірусом нантний вірус MVA у фізіологічно прийнятному дикого типу CVA. В результаті цього аналізу були носії; ідентифіковані шість головних делецій у генній використання вищевказаного рекомбінантноДНК (делеції І, II, III, IV, V та VI), всього 31000 пар го вірусу MVA для приготування вакцини; основ [Meyer, Η., Sutter, G. and Mayr A. (1991) вищевказаний рекомбінантний вірус MVA або J.Gen. Virol., 72, 1031-1038]. У своєму колі хазяїв вищевказана вакцина для імунізації живого оргавірус, що був отриманий, чітко обмежений лише нізму тварини, включаючи людину; клітинами птахів. Окрім того, MVA відрізняється вищевказаний рекомбінантний вірус MVA або своєю крайньою послабленістю. Дослідження на вакцина для попередження або лікування меларізних тваринах показали, що вірус MVA є авіруноми. лентним навіть у тварин з послабленим імунітеТермін "ген" означає ДНК-послідовність, яка том. Та ще важливіше, що штам MVA має чудові кодує білок або пептид. властивості, які були продемонстровані у широТермін "сторонній ген" означає ген, вбудовакомасштабних клінічних іспитах [Мауг et al., ний до ДНК-послідовності, в якій цей ген звичайZbl.Bakt.Hyg.L, Abt.Org., В 167, 375-390 (1987), но відсутній. Stickl et al., Dtsch. med. Wschr., 99, 2386-2392 Модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара (1974)]. Обстеження вище 120000 чоловік, вакци(MVA), що має обмежене коло хазяїв та є у винованих вірусом MVA, показали, що у цих пацієнщому ступені атенуйованим штамом вірусу коротів, включаючи пацієнтів з підвищеним ризиком в'ячої віспи, не здатний розмножуватись у клітизараження, були відсутні будь-які побічні ефекти. нах людини та в досліджених клітинних лініях Було винайдено, що реплікація MVA у клітибільшості інших ссавців. Однак, оскільки експренах людини блокується на пізній стадії інфікувансія вірусного гену не порушується в непермесивня, що сприяє попередженню зборки зрілих інфених клітинах, то у відповідності з даним винахокційних віріонів. Однак MVA здатний дом, рекомбінантні віруси MVA можуть бути експресувати вірусні та рекомбінантні гени на використані в якості абсолютно безпечних та високому рівні навіть у непермесивних клітинах, в ефективних експресійних векторів. результаті чого було запропоновано, що вірус Рекомбінантні віруси MVA, що кодують антиMVA може служити в якості ефективного та безгенну детермінанту печного вектору експресії генів [Sutter, G. and В одному з варіантів здійснення даний винаMoss, В. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89, хід відноситься до рекомбінантного вірусу MVA 10847-10851]. Нещодавно були розроблені нові коров'ячої віспи, що містить ген, який кодує чужосистеми векторів на основі вірусу MVA, що має рідний антиген, переважно патогенний агент; та чужорідні ДНК-послідовності, які вбудовані до до вакцин, що містять вказаний вірус у фізіологісайту делеції III в геномі MVA або в гені ТК чно прийнятній формі. Даний винахід також від[Sutter, G. та Moss, В (1995) Dev.Biol.Stand.Basel, носиться до способів отримання вказаного рекоKarger, 84, 195-200 та патент США №5185146]. мбінантного вірусу коров'ячої віспи MVA або Для подальшого більш перспективного виковакцин на основі цього вірусу та до використання ристання MVA, були проведені дослідження для цих вакцин для профілактики інфекційних захворозробки нових можливих шляхів введення чужорювань, викликаних вказаними патогенними агерідних генів до штаму MVA вірусу коров'ячої віспи нтами. з використанням техніки рекомбінантних ДНК. У переважному варіанті даного винаходу, чуОскільки зміна геному вірусу MVA не була метою жорідним геном, що вбудований до вірусу MVA, є цих досліджень, то необхідно було використати ген, що кодує nef ВІЛ. цей метод, який відповідав би цим цілям. У відАвторами даної заявки були сконструйовані повідності з даним винаходом, була здійснена рекомбінантні віруси MVA, які дозволяють здійсрекомбінація шляхом вбудовування чужорідної нити експресію гену nef ВІЛ-1 під контролем ранДНК-послідовності до вірусної ДНК точно в сайт нього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої натуральної делеції, що є в геномі MVA. віспи. Регуляторний білок Nef лентивірусів приДаний винахід включає, inter alia, до свого матів синтезується на ранній стадії реплікативнооб'єму (окремо або в комбінації): го циклу вірусу; при цьому було показано, що цей рекомбінантний вірус MVA, що містить та білок грає важливу роль в реплікації вірусу з виздатний експресувати антиген людської тирозисоким титром та індукуванні захворювань in vivo. нази (hTyr); Це дозволяє передбачити, що nef ВІЛ може грати 7 75410 8 вирішальну роль у патогенезі СНІДу. Молекулярготують у відповідній фізіологічне прийнятній фоні механізми, завдяки яким nef сприяє збільшенрмі. Це може бути зроблено, виходячи з досвіду ню інфекційності та патогенності вірусу ВІЛ, пототримання MVA-вакцин, призначених для протиребують додаткового дослідження. Однак віспяної вакцинації [як описано Stickl, Η. et al., очевидно, що nef є імуногенним, та nef(1974) Dtsch.med.Wschr., 99, 2386-2392]. Для цьо6 8 специфічний антиген може бути використаний у го близько 10 -10 частинок рекомбінантного MVA якості вакцини проти ВІЛ-інфекції та СНІДу. ліофілізують у 100мл забуференого фосфатом У відповідності з цим очевидно, що, з однієї фізіологічного розчину (PBS) у присутності 2% сторони, рекомбінантний вірус MVA, що експрепептону та 1% альбуміну людини в ампулі, пересує ген nef ВІЛ, може бути використаний у якості важно у скляній ампулі. Ліофілізат може містити профілактичної вакцини проти ВІЛ для імунізації наповнювачі (такі як маніт, декстран, цукор, глілюдини, а з іншої сторони, він може бути викорицин, лактоза або полівінілпіролідон) або інші достаний для імунотерапії ВІЛ-інфікованих пацієнтів бавки (такі як антиоксиданти, стабілізатори т.ін.), або хворих на СНІД. Окрім того, рекомбінантний які підходять для парентерального введення. вірус MVA, що експресує ген nef ВІЛ, може бути Потім скляну ампулу герметично запаюють, та ця використаний для продукування рекомбінантного ампула може бути залишена на зберігання протябілка ВІЛ. гом декількох місяців при температурі переважно В іншому переважному варіанті здійснення -20°С. даного винаходу чужорідним геном, вбудованим Для вакцинації або терапії ліофілізат може до вірусу MVA, є ген, що кодує тирозиназу людибути розчинений у 0,1-0,5мл водного розчину, ни. переважно фізіологічного розчину, та введений Авторами даної заявки були сконструйовані або парентерально, наприклад шляхом внутрішрекомбінантні віруси MVA, які дозволяють здійсньом'язової інокуляції або локально, наприклад нити експресію гену тирозинази людини під контшляхом інокуляції у саму пухлину або в область ролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу локалізації пухлини. Вакцини або терапевтичні коров'ячої віспи. Нещодавно тирозиназа людини засоби даного винаходу переважно вводять шлябула ідентифікована як меланомо-специфічний хом внутрішньом'язової ін'єкції [Мауr, A. et.al., пухлинний антиген, який сприяє генеруванню (1978) Zbl.Bakt.Hyg., I.Abt.Orig. В, 167, 375-390]. протипухлинних цитолітичних Т-лімфоцитів [BriСпосіб, доза та схема введення можуть бути опchard, V., et al., (1993) J.Exp.Med., 178, 489-495]. тимізовані власне фахівцем відомими способами. Оскільки серед нормальних клітин, вірогідно, лиДля того щоб отримати відповідну імунну відпоше меланоцити експресують ген тирозинази, то відь проти чужорідного антигену, бажано вводити очевидно, що тирозиназа є цінним антигеномвакцину декілька разів протягом тривалого періомішенню для імунотерапії меланоми. Тому рекоду часу. мбінантний вірус MVA, що експресує ген тирозиУ відповідності з даним винаходом рекомбінази людини, може бути використаний для пронантні віруси коров'ячої віспи MVA можуть бути дукування у пацієнтів, що страждають також використані для продукування гетерологічмеланомою, імунної відповіді, яка стимулює відних поліпептидів в еукаріотичних клітинах. Для торгнення пухлини або попереджуючої появи цього клітини інфікують рекомбінантними вірусаметастазів. Рекомбінантний вірус MVA, що ексми коров'ячої віспи. В інфікованих клітинах експресує ген тирозинази людини, може бути викопресуються гени, що кодують чужорідний поліперистаний безпосередньо в якості вакцини проти птид, в результаті чого продукується меланоми, чи цей вірус може бути використаний гетерологічний поліпептид, який потім виділяють. для продукування рекомбінантного білка тирозиМетоди, що використовуються для продукування нази, який може служити в якості антигену у вактаких гетерологічних поліпептидів, добре відомі цинних препаратах. В іншому прикладі, клітини, фахівцям [ЕР-А-206920 та ЕР-А-205939]. Поліпещо взяті з пухлини пацієнта, можуть бути модиптиди, продуковані за допомогою рекомбінантних фіковані in vitro з використанням у якості вектору вірусів MVA, більше підходять, виходячи з конкрекомбінантного вірусу MVA, що експресує ген ретних властивостей вірусів MVA, для використирозинази людини, а потім модифіковані клітитання у якості лікарських засобів для введення ни, що експресують тирозиназу, переносять зволюдині та тваринам. ротно в організм пацієнта для індукування у нього В іншому варіанті здійснення даного винахопротипухлинної імунної відповіді. Вакцина, отриду авторами винаходу були сконструйовані рекомана на основі рекомбінантного MVA, що експрембінантні віруси MVA, що дозволяють експресусує ген тирозинази людини, може бути викорисвати ген РНК-полімерази бактеріофага Т7 під тана або парентерально, або місцеве шляхом контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вівведення безпосередньо в область пухлини. Для русу коров'ячої віспи. Ефективність рекомбінантпопередження появи метастазів або для фенотиних вірусів MVA-pol T7 у якості експресуючих сиспічної зміни пухлини, наприклад зміни її розмірів, тем оцінювали за допомогою аналізу методом форми, консистенції, васкуляризації або інших короткочасної трансфекції для індукування ексознак, вакцина, отримана на основі рекомбінантпресії рекомбінантних генів під контролем промоного вірусу MVA, що експресує ген тирозинази тору РНК-полімерази Т7. Використовуючи в якослюдини, може бути введена до, під час або після ті гена-репортера ген хірургічного видалення пухлини. хлорамфеніколацетилтрансферази (CAT) E.coli, Для виготовлення вакцин у відповідності з автори винайшли, що MVA-pol Т7-індукована ексданим винаходом віруси коров'ячої віспи MVA пресія гену CAT є такою ж ефективною, як і екс 9 75410 10 пресія, індукована вірусом коров'ячої віспи/рої Т7, дукування білків, які необхідні для упаковки ретщо походить від компетентного по відношенню ровірусних векторів. Для цього гени gag, роl, env до реплікації штаму WR вірусу коров'ячої віспи. ретровірусу (наприклад, вірус лейкоза мишей Таким чином, гібридна система MVA-pol T7 (MLV)) вміщують в один або декілька експресійданого винаходу може бути використана в якості них векторів (наприклад, плазмід) під транскриппростої, ефективної та безпечної експресійної ційний контроль промотору РНК-полімерази Т7, системи для продукування поліпептидів у клітиразом з експресійним вектором, що несе ретровінах ссавців при відсутності вірусу коров'ячої вісрусну векторну конструкцію, можливо під транскпи. рипційним контролем промотору РНК-полімерази Ця експресійна система може бути також виТ7. користана в цілях генерування рекомбінантних [В WO 94/29437, WO 89/11539 та WO вірусних частинок для вакцинації або генної те96/07748] описані різні типи ретровірусних векторапії шляхом трансформації клітинних ліній, які рних конструкцій, які можуть бути упаковані з виінфіковані рекомбінантним вірусом MVA, що екскористанням системи для упаковки, яка описана пресує РНК-полімеразу Т7, тобто інфікованих вище. ДНК-конструкцією, що містить усі або деякі гени, Окрім того, рекомбінантний вірус MVA, що та геном або рекомбінантний геном, які необхідні експресує РНК-полімеразу Т7, може бути викоридля генерування вірусних частинок, наприклад, станий для продукування рекомбінантних білків, MVA-частинок або ретровірусних частинок під неінфікованих вірусних частинок, або інфекційних транскрипційним контролем промотору РНКмутантних вірусних частинок у цілях виготовленполімерази Т7. ня вакцин або терапевтичних засобів [Bucholz et Векторні системи на основі ретровірусів al., Virology, 204, 770-776 (1994) та ЕР-В 1складаються з двох компонентів: 356695]. Для цього вірусні гени (наприклад, гени 1) першим компонентом є власне ретровірусgag-pol та env вірусу ВІЛ-1) вміщували під трансний вектор, що представляє собою модифіковакрипційний контроль промотору Т7 в експресійний ретровірус (векторну плазміду), в якому гени, ний вектор (наприклад, у плазміду або інший рещо кодують вірусні білки, були замінені терапевкомбінантний вірус MVA). Потім цю конструкцію тичними генами та маркерними генами, які необвводили до клітин, що інфіковані рекомбінантним хідні для введення у клітину-мішень, оскільки вірусом MVA, який експресує РНК-полімеразу Т7. така заміна генів, що кодують вірусні білки, приГени рекомбінантного вірусу транскрибуютьводить до значного пошкодження вірусу, то цей ся з високим ступенем ефективності, в результаті вірус може бути "врятований" за допомогою дручого можуть бути отримані та очищені білки у гого компоненту в системі, який доповнює відсутвеликих кількостях. Окрім того, експресовані реність вірусних білків у модифікованому ретровікомбінантні вірусні білки (наприклад, env, gag русі; ВІЛ-1) можуть збиратися у вірусні псевдочастин2) другим компонентом є клітинна лінія, яка ки, які реплікуються та відділяються від клітини, продукує великі кількості вірусних білків, але при після чого вони можуть бути виділені з середоцьому не має здатності продукувати компетентвища з тканинною культурою. В іншому варіанті ний по реплікації вірус. Така клітинна лінія відома здійснення винаходу, вірусні білки (наприклад, як лінія клітин з дефектом упаковки та представвірусів ВІЛ, SIV та вірусу кору), що експресуються ляє собою клітинну лінію, трансфіковану однією MVA-pol T7 системою, можуть спасати додатково або декількома плазмідами, що несуть гени (гени введений мутантний вірус (який походить, наприgag, роl та env, що кодують поліпептиди), які заклад від ВІЛ, SIV, вірусу кору) шляхом подолання безпечують упаковку модифікованого ретровірудефекту інтеграції; а також інфікування, декапсисного вектора. дація, реплікація нуклеїнової кислоти, експресія Для генерування запакованого вектору, веквірусного гена, збирання, баддінг або інша стадія торну плазміду трансфікують у лінію клітин з дерозмноження вірусу дозволяють виконувати профектом упаковки. В цих умовах модифікований дукування і очищення вищезгаданого мутантного ретровірусний геном, що включає вбудовані тевірусу. рапевтичні та маркерні гени, транскрибується з Вірус MVA-pol T7 може бути також викорисвекторної плазміди та упаковується в модифікотано разом з ДНК-послідовностями, що несуть вані ретровірусні частинки (рекомбінантні вірусні ген потрібного антигена (наприклад, ген ВІЛ, nef, частинки). Потім цей рекомбінантний вірус викоtat, pol, gag, env або інші гени), необхідний для ристовують для інфікування клітин-мішеней, у імунізації. Спочатку кодуючу послідовність даного ДНК яких можуть інтегруватися геном вектора та антигена (наприклад ВІЛ, HCV, HPV, HSV, вірусу будь-які присутні в ньому маркерні або терапевкору, вірусу грипу або ін.) клонують під контролем тичні гени. Клітина, що інфікована такою рекомбіпромотора РНК-полімерази Т7 переважно в планантною вірусною частинкою, не може продукузмідний вектор, а отриману ДНК-конструкцію амвати новий векторний вірус, оскільки в цих пліфікують та очищують з використанням станклітинах відсутні вірусні білки. Однак ДНК вектор, дартних лабораторних процедур. Потім векторну що несе терапевтичні та маркерні гени, інтегруДНК інокулюють одночасно або з деяким інтерється в ДНК клітини, та може експресуватися в валом часу разом з MVA-pol Т7. В місці інокуляції інфікованих клітинах. потрібний рекомбінантний ген піддається тимчаУ відповідності з даним винаходом, рекомбісовій експресії в клітинах, які містять векторну нантний вірус MVA, що експресує РНКДНК і MVA-pol T7, і відповідний антиген презентуполімеразу Т7, може бути використаний для проється імунній системі хазяїна, стимулюючи анти 11 75410 12 ген-специфічну імунну відповідь. Ця схема, що [Neumann et al., EMBO J., 1, 841-845, (1982)]; передбачає використання вектора MVA-pol T7, шляхом мікроін'єкції [Graesmann et al., Meth. Enщо не реплікується, на основі вірусу коров'ячої zymology, 101, 482-492 (1983)]; шляхом викорисвіспи, є багатообіцяючим новим способом вакцитання ліпосом [Straubinger et al., Methodas in Enнації нуклеїновою кислотою, що забезпечує ефеzymology, 101, 512-527 (1983)]; за допомогою ктивну часову експресію даного антигена, але сферопластів [Schaffner, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, при цьому дозволяє уникнути потенціального 77, 2163-2167 (1980)], або якимось іншими відоризику конститутивної експресії гена. мими методами. При цьому більш бажаним меРекомбінантні віруси MVA, що походять від тодом трансфекції є осаджування фосфатом кавірусу коров'ячої віспи, можуть бути отримані, як льцію. описано нижче. Для кращого розуміння суті цього винаходу ДНК-конструкцію, яка містить ДНКнижче наводяться докладні приклади його втіпослідовність, що кодує чужорідний поліпептид, лення. Однак ці приклади не повинні розглядатиіфланковану MVA-ДНК послідовностями, суміжся як деяке обмеження об'єму винаходу. ними з природною делецією, наприклад делецією Фіг.1: Схематична карта генома MVA і плазII в геномі MVA, вводять в клітини, інфіковані віміди для інсерції чужорідної ДНК шляхом гомолорусом MVA, в результаті чого відбувається гомогічної рекомбінації: HindIII-рестрикційні сайти в логічна рекомбінація. геномі MVA вказані зверху. Вказана також HindlllПісля введення ДНК-конструкції в еукаріотичHindlll N-фрагмент (900п.о.), який перекриває ні клітини і після рекомбінації із заміною вірусної область делеції II в геномі MVA. ДНКДНК на чужорідну ДНК, рекомбінантний вірус копослідовності MVA, що примикають до делеції II ров'ячої віспи може бути виділено відомими спо(край 1 (flank 1)) та край 2 (flank 2)) були ампліфісобами, переважно за допомогою маркера [пор. ковані за допомогою полімеразної ланцюгової Nakano et al., Proc.Natl.Acag.Sc. USA.79, 1593реакції (PCR) та використані для конструювання 1596 (1982), Franke et al., Mol.Ctll.Biol, 1918-1924 інсерційної плазміди pUC IILZ. (1985), Chakrabarti et al., Mol.Ctll.BioL, 3403-3409 Фіг.2: pUC II LZ P7.5: плазмідний вектор MVA, (1985), Fathi et al.,Virologi 97-105 (1986)]. що призначений для інсерції в делецію II та місДНК-конструкція, що вводиться, може бути тить експресуючий P11-LacZ-кластер та ранлінійною або кільцевою. Більш бажаною є кільценій/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, ва ДНК, зокрема - плазміда. ДНК-конструкція місдля експресії потрібних генів, які можуть бути тить послідовності, що фланкують лівий і правий клоновані у Smal-сайт плазміди. краї природної делеції, наприклад делеції II в Фіг.3: pUC II LZdel P7.5: MVA-плазмідний векгеномі MVA [Altenburger W., Suter C.P., Altenburgтор для інсерції чужорідних генів в сайт делеції II er J. (1989) Arch.Virol, 105,15-27]. Чужорідну ДНКу геномі MVA, що містить експресійний Р11-LacZпослідовність вбудовують між послідовностями, кластер, що самоделетуючий, та ранній/пізній що фланкують природну делецію. Такою чужоріпромотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи для ексдною ДНК-послідовністю може бути ген, що кодує пресії потрібних генів, які можуть бути клоновані в терапевтичний поліпептид, наприклад, t-РА або Sma1/Not1-сайт клонування плазміди. інтерферон, або антигенну детермінанту патоФіг.4: Конструювання рекомбінантного вірусу генного агенту. Такими патогенними агентами MVA-pol T7: схематичні карти геному MVA (рестможуть бути віруси, бактерії і паразити, які морикційні HindIII-сайти ендонуклеази) та векторна жуть викликати захворювання, а також пухлинні плазміда pUC II LZ T7pol, за допомогою якої здійклітини, які безконтрольно розмножуються в орснюють інсерцію ген РНК-полімерази Т7 в сайт ганізмі і можуть приводити до утворення і зросделеції II в HindIII-фрагменті Ν геному MVA. тання пухлини. Приклади таких патогенних агенФіг.5: Саузерн-блот-аналіз ДНК вірусу MVAтів [описані Davis B.D. et al., Microbiology, 3rd ed., pol Т7. Harper International Edition]. Більш бажаними анФіг.6: Метаболічне мічення білків з використигенами патогенних агентів є віруси імунодефітанням [35S] метіоніну. Аналіз за допомогою елекциту людини (наприклад, ВІЛ-1 і ВІЛ-2), мікобактрофорезу в ПААГ з ДСН. Смуга 1: MVA-polT7; терії, що викликають туберкульоз, паразит смуга 2: MVA; смуга 3: клітини CV-1. Plasmodium falciparum і клітини меланоми. Фіг.7: САТ-аналіз: клітини CV-1 трансфікуваДля експресії ДНК-прослідовності або гена ли плазмідою, що містить ген CAT під контролем потрібна присутність регуляторних послідовноспромотору РНК-полімерази Т7б та інфікували тей, які необхідні для транскрипції генів, що привірусом MVA-T/pol абоWR-polT7. Лізати тестувасутні на ДНК-послідовності. Такі регуляторні посли на САТ-активність "С" означає хлорамфенікол, лідовності (що називаються промоторами) добре та 1-АсС та 3-АсС означають моно- та триацетивідомі спеціалістам, та прикладом таких послідольовані форми хлорамфеніколу. САТ-активність вностей може служити промотор гену вірусу ковиражали як процент ацетильованого продукта, ров'ячої віспи, що кодує поліпептид 11кДа [опиутвореного за 60 хвилин. сано в ЕР-А-198328], і промотор гена, що кодує Фіг.8: Конструювання MVA-LAIne/: схематичні 7,5кДа [описано в ЕРА-110385]. карти геному MVA (рестрикційні HindIII-сайти енДНК-конструкцію може бути введено в MVAдонуклеази) та векторної плазміди pUC II LZdel інфіковані клітини шляхом трансфекції, наприp7.5-LAlnef, за допомогою якої здійснюють інсерклад шляхом преципітації фосфатом кальцію цію гену nef ВІЛ-1 LAI в сайт делеції II в Hindlll [Graham et al. Virol., 52,456-467 (1973); Wigler et фрагмент N геному MVA. al.,Cell,777-785 (1979)]; шляхом електропорації Фіг.9: Конструювання MVA-hTYR: схематичні 13 75410 14 карти геному MVA (рестрикційні HindIII-сайти ензскрібання клітинних моношарів у середовищі та донуклеази) та векторної плазміди pUC II LZdel осадження клітинного матеріалу шляхом P7.5-TYR, за допомогою якої здійснюють інсерцію центрифугування при 3000об./хв. у центрифузі гену тирозинкінази в сайт делеції II в Hindlll Sorvall RC-3B за температури 4°С протягом п'яти фрагметі N геному MVA. хвилин. Неочищений вірусний препарат зберігали Приклади за температури -20°С перед подальшою оброб1. Культивування та очистка вірусів кою (наприклад, очисткою вірусу). 1.1. Культивування вірусів MVA 1.2. Очистка вірусів Вірус MVA є у високому ступені ослабленим Для того щоб отримати по можливості чистий вірусом коров'ячої віспи, отриманим від штаму вірусний препарат, який не містить компонентів, вірусу коров'ячої віспи Анкара (CVA) в результаті специфічних для цієї хазяйської клітини, проводовготривалого серійного ласування на культурі дили стадії очистки способом, аналогічним [опипервинних фібробластів курячого ембріону (CEF). саному Joklik Virology, 18, 9-18 (1962)]. НеочищеІз загальним оглядом історії продукування, власний вірусний вихідний матеріал витримували за тивостей та використання штаму MVA можна температури -20°С, а потім відтаювали та один ознайомитись у коротких [публікаціях Мауr et al., раз суспендували в PBS (10-20-кратний об'єм in Infection, 3, 6-14 (1975)]. Завдяки атенуації в осаду), після чого суспензію центрифугували, як CEF, в цій пташиній клітині-хазяїні вірус MVA реописано вище. Щойно отриманий осад суспендуплікується з високим титром. Однак у клітинах вали в десяти об'ємах буферу Трис 1 (10мМ ссавця ріст MVA сильно обмежений, та звичайне Трис-НСІ, рН=9,0), та суспензію швидко обробутворення бляшек під дією вірусу не виявляєтьляли ультразвуком (Labsonic L., B.Braun Biotech ся. Тому вірус MVA був культивований на клітиInternational, Melsungen, Germany; 2 10 секунд нах CEF. У цілях отримання клітин CEF 11-денні при 60Ват та при кімнатній температурі) в цілях ембріони виділяли з інкубованих курячих яєць, подальшого дезінтегрування клітинного дебрису кінцівки видаляли, та ембріони подрібнювали та та вивільнення вірусних часток з клітинного мадисоціювали в розчині, що містить 0,25% трипситеріалу. Ядра клітин та більшу частину клітинного ну, за температури 37°С протягом 20 хвилин. дебрісу видаляли шляхом швидкого центрифугуОтриману клітинну суспензію фільтрували та вання суспензії (роторна центрифуга Sorvall GSA клітини осаджували шляхом центрифугування від DuPont Co., D-6353 Bad Nawieim, FRG; 3 хвипри 2000об./хв. у центрифузі Sorvall RC-3B за лини при 3000об./хв. та температурі 10°С). Осад кімнатної температури протягом 5 хвилин, а потім знову один раз суспендували в буфері Трис 1, ресуспендували в 10 об'ємах середовища А (сеобробляли ультразвуком та центрифугували, як редовище Ігла (DMEM), що отримується, наприописано вище. Зібрані супернатанти, що містять клад, від Life Technologies GmbH, Eggenstein, вільні вірусні частки, об'єднували та покривали Germany), після чого знову осаджували шляхом градієнтом 10мл 36% сахарози в 10мМ Трис-НСІ центрифугування при 2000 об/хв. у центрифузі з рН=9,0, а потім центрифугували в центрифузі Sorvall RC-3B за кімнатної температури протягом Beckman SW 27/SW 28 при 13500об./хв. протягом 5 хвилин. Після центрифугування клітинний осад 80 хвилин за температури 4°С. Потім супернапереносили в середовище А, що містить 10% тант відкидали, а осад, що містить вірусні частки, фетальну сироватку теляти (FCS), пеніцилін розчиняли в 10мл 1мМ Трис-НСІ з рН=9,0, гомо(100одиниць/мл), стрептоміцин (100мг/мл) та генізували шляхом швидкої обробки ультразву2мМ глутамін, у результаті чого отримували кліком (2 10 секунд за кімнатної температури з витинну суспензію, що містить 500000 клітин/мл. користанням пристрою, описаного вище) та Клітини CEF, отримані у такий самий спосіб, нананосили на градієнт 20-40% сахарози (сахароза носили шляхом розпилення на чашки для кульв 1мл Трис-НСІ, рН=9,0) для подальшої очистки. тивування клітин. Ці клітини культивували в сеГрадієнт центрифугували в роторній центрифузі редовищі А в інкубаторі з СО2 за 37°С протягом Beckmann SW41 при 13000об./хв. протягом 50 1-2 днів залежно від потрібної щільності клітин та хвилин за температури 4°С. Після центрифугувикористовували для інфікування або відразу, вання дискретні смуги, що містять вірусні частки, або після одного клітинного пересіву. Детальний збирали шляхом піпетування після зменшення опис отримання первинних культур може бути об'єму вищевказаної смуги. Отриманий розчин знайдено [в роботі R.I.Freshney, "Culture of animal сахарози розводили трьома об'ємами PBS та cell", Alan R. Liss Verlag New York 1983. Chapter II, вірусні частки знову осаджували шляхом cтop. 99]. центрифугування (Beckmann SW27/28, 60 хвилин Віруси MVA інфікували наступним чином. Кліпри 13500об./хв., температура 4°С). Осад, який тини CEF культивували в 175см флаконах для складався головним чином з чистих вірусних часкультивування клітин. При 90-100% суцільності ток, ресуспендували в PBS та врівноважували до середовище видаляли, та клітини інкубували середніх концентрацій вірусу, що складає в серепротягом однієї години з суспензією вірусу MVA дньому 1-5 109МЕ/мл. Розчин очищеного вірус(0,01 одиниць інфекції (ME) на клітину, ного вихідного матеріалу зберігали при -80°С та 0,02мл/см) в середовищі А. Потім додавали довикористовували або відразу, або розводили фодатково кількість середовища А (0,2мл/см) та сфатно-буферним фізіологічним розчином для флакони інкубували за температури 37°С протяпроведення подальших експериментів. гом 2-3 днів (доки 90% клітин не починали прояв1.3. Клонування вірусу MVA ляти цитопатогенний ефект). Неочищений вірусДля генерування гомогенних вихідних вірусний вихідний матеріал був отриманий шляхом них препаратів вірус MVA, отриманий від Prof. 15 75410 16 Anton Мауr, клонували шляхом лімітуючого розP7.5 (Фіг.3). З використанням Smal-сайту, ця векведення протягом трьох подальших пересівів у торна плазміда може бути використана для встаклітини CEF, культивовані на 96-лункових планвки ДНК-послідовностей, кодуючих чужорідний шетах для культивування тканини. Клон F6 MVA ген під транскрипційним контролем промотору відбирали та ампліфікували в CEF з отриманням Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, в геном MVA. Після маточних розчинів вірусу, які служать у якості цього потрібний рекомбінантний вірус виділяли вихідного матеріалу для генерування рекомбінашляхом скринінгу на експресію β-галактозидазної нтних вірусів MVA, описаних у даній патентній активності та подальше його культивування призаявці, а також для генерування рекомбінантних зводило до самоделеції знову сконструйованого вірусів MVA, описаних раніше [Sutter, G. та Mose, Pll-LacZ-експресуючого кластера в результаті В., (1992) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 89, 10847гомологічної рекомбінації. 10851; Sutter, G., Wyatt, L, Foley, P., Bennink, J. та 2.2. Конструювання та характеристика рекоMoss, В., (1994), Vaccine 12, 1032-1040; Hirsch, V., мбінантного вірусу MVA-роlТ7 Fuerst, Т., Sutter, G., Carroll, M., Yang, L., 3,1 kbp-ДНК-фрагмент, що містить повний ген Golgstein, S., Piatak, M., Elkins, W., Alvord, G., РНК-полімерази бактеріофагу Т7 під контролем Montefiori, D., Moss, B. and Lifson, J., (1986) J. раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'яVirol., 70 3741-3752]. чої віспи, вирізали ферментом EcoRI з плазміди 2. Конструювання та характеристика рекомpTF7-3 [Fruest, T.P., Niles, E.G., Studier, F.W. and бінантних вірусів MVA Moss, В., (1986), P>N>A>S> USA, 83, 8122-8126], 2.1. Конструювання векторних плазмід модифікували шляхом інкубування ДНКУ цілях генерування рекомбінантих вірусів полімерази фрагментом Кленова для продукуMVA були сконструйовані нові векторні плазміди. вання тупих кінців та клонували в унікальний Вбудовування чужорідних генів у геном MVA Smal-сайт рестрикції LZ pUCII з утворенням плаздійснювали точно в сайт природної делеції II в змідного вектору переносу pUCII-LZ-pol T7 (Фіг.4). геномі MVA. Послідовності MVA-ДНК, фланкуючи В якості транскрипційного регулятору для екссайт 2500п.о.-делеції у HindIII-фрагменті Ν геномі пресії гену РНК-полімерази Т7 був вибраний ранMVA [Altenburger, W. Suter, СР. та Altenburger, ній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, J.(1989), J.Arch. Virol., 105, 15-27], були ампліфі(наприклад, Р11) ця промоторна система дозвоковані за допомогою полімеразної ланцюгової ляє експресувати рекомбінантні гени безпосеререакції та клоновані в сайт множинного клонудньо після інфікування клітин-мішеней. LZ-pol Т7вання плазміди pUC18. Праймерами для лівого плазміда pUCII, яка забезпечує введення чужорі600п.о.-ДНК-краю є: 5'-CAG CAG GGT АСС СТС дних генів у сайт делеції II геному MVA, була виАТС СТА CAG GAC GTT СТС-3' та 5'-CAG CAG користана для генерування вірусу MVA-pol T7. CCC GGG TAT TCG ATG АТТ АТТ ТТТ ААС ААА Клітини CEF інфікували вірусом MVA при ATA ACA-3' (сайти для рестриктуючих ферментів множинності інфекції ТСГО50=0,05 на клітину та Крпі та Smal підкреслені). Праймерами для пратрансфікували ДНК плаз-LZ-pol Т7-плазміди pUвого 550 п.о.-ДНК-краю є: 5'-CAG CAG CTG CAG CII, як описано раніше [Sutler, G., Wyatt, L., Foley, GAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3' та 5'P., Bennink, J. та Moss, В., (1994), Vaccine 12, CAG CAG GCA TGC CGA CGA АСА AGG AAC 1032-1040]. Рекомбінантний вірус MVA, експреTGT AGC AGA-3' (сайти для рестриктуючих ферсуючий PHK-полімеразу Т7 та сумісно експресументів PstI та SphI підкреслені). Між цими краями ючий Р-галактозидазу (P7.5-pol T7 MVA), відбиMVA ДНК, вставленій в pUC18, вбудовували ген рали в результаті проведення п'яти послідовних lacZ Escherichia coli під контролем пізнього проциклів очистки методом бляшек у клітинах CEF, мотору Р11 вірусу коров'ячої віспи (отриманого пофарбованих 5-бром-4-хлор-3-індоліл-β-Dшляхом гідролізу ферментом pill LZ, [Sutter, С. галактозидом (300мкг/мл). Рекомбінантні віруси and Moss, В. (1992) PNAS USA 89, 10847-10851]) ампліфікували шляхом інфікування моношарів з використанням BamHI-сайта, в результаті чого CEF, та ДНК аналізували за допомогою PCR для отримували інсерційний MVA-вектор pUCII LZ підтвердження генетичної однорідності вірусного (Фіг.1). Після цього 289п.о.-фрагмент, що містить штаму. Саузерн-блот-аналіз вірусної ДНК MVAранній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої вісpol T7 продемонстрував стабільну інтеграцію пи разом з Smal-сайтом для клонування (отримарекомбінантних генів у сайт делеції II в геномі ним шляхом рестрикції ферментами EcoRI та MVA (Фіг.5). Для спостереження за експресією Xbal з плазмідного вектору pSC11 [Chakrabarti та РНК-полімерази Т7 шляхом рекомбінантного ін., 1985, Molecular та Cellular Biology 5, 3403MVA-pol T7 були проаналізовані мічені [35S] меті3409]), вставляли Smal-сайт pUCII з отриманням оніном поліпептиди від вірус-інфікованої культури MVA-вектора pUCII LZ P7.5 (Фіг.2). Для конструютканини. Моношари клітинної лінії нирок мавпи вання векторної плазміди, яка дозволяє виділяти CV-1, культивовані в 12-лункових планшетах, рекомбінантні віруси MVA шляхом часового синінфікували вірусом при множинності інфекції тезу репортерного ферменту-β-галактозидази, ТСГО50=20 на клітину. Через 3-5 годин після інфі330п.о.-ДНК-фрагмент від 3'-кінця відкритої рамки кування середовище видаляли, та культури один зчитування LacZ. Ε. coli ампліфікували за допораз промивали Імл середовища, що не містить могою PCR (праймери 5'-CAG CAG GTC GAC метіоніну. В кожну лунку додавали 0,2мл середоCCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC-3' та 5'-GGG вища, що не містить метіоніну, разом з 50мкКи GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT [35S] метіоніном та середовище інкубували протяCAG-3') та клонували в Sall та Pstl-сайти pCU II гом 30 хвилин за 37°С. Цитоплазматичні екстракLZ P7.5 з отриманням MVA-вектору pUC II LZdel ти інфікованих клітин отримували шляхом інкубу 17 75410 18 вання кожної лунки в 0,2мл 0,5% буферу для лірусу коров'ячої віспи. зису Nonidet P-40 протягом 10 хвилин при 37°С, Клітини CEF, інфіковані вірусом MVA при та зразки аналізували шляхом електрофорезу в множинності зараження TCID50=0,05 (TCID - сеПААГ з ДСН. Метаболічне мічення клітин CV-1 редня цитопатогенна доза) на клітину, трансфікувірусом MVA-pol T7 виявило синтез двох додатвали ДНК плазміди pUC II LZdel-P7.5-LAInef, як кових поліпептидів (і) білку розміром біля описано раніше [Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., 116000Да, що представляє собою сумісно ексBennink, J., Moss, B. (1994) Vaccine, 12, 1032пресовану β-галактозидазу Е.соlі, яка дозволяє 1040]. Рекомбінантні віруси MVA, що містять ген проводити скринінг на рекомбінантний вірус; та nef та сумісно маркерний ген LacZ E.coli, що сумі(іі) білка з очікуваним розміром 98000Да, що відсно експресується з часовою регуляцією, відбиповідає РНК-полімеразі бактеріофагу Т7 (Фіг.6). рали шляхом проведення послідовних циклів При цьому було відмічено, що MVA-T7pol продуочистки методом бляшек у клітинах CEF, пофаркує велику кількість β-галактозидази. Експеримебованих 5-бром-4-хлор-3-індоліл-β-Dнти з in vivo-міченням продемонстрували дуже галактозидом (300мкг/мл). Після цього рекомбівисокий рівень експресії Pll-LacZ-ген-вмісній нантні віруси, що містять ген nef та мають делеконструкції, введеній у геном MVA в сайт делеції тований маркерний ген LacZ, виділяли шляхом 11, що свідчить про те, що рекомбінантні гени у проведення ще трьох додаткових послідовних векторному вірусі MVA можуть бути експресовані циклів очистки методом бляшек, здійснюючи з великою ефективністю в тому випадку, якщо скринінг на непофарбовані фокуси вірусу у клітивони вбудовані саме в цій локус геному MVA. нах CEF у присутності 5-бром-4-хлор-3-індоліл-βЕфективність рекомбінантних вірусів MVA-pol D-галактозида (300мкг/мл). Потім рекомбінантні T7 як експресуючих систем у порівнянні з рекомвіруси ампліфікували шляхом інфікування монобінантним WR-T7pol вірусом vTF7-3 (Fuerst та ін., шарів, та MVA-LAInef-вірусну ДНК аналізували за 1986) оцінювали шляхом котрасфекції ДНК плаздопомогою PCR для того, щоб упевнитись у генемідного вектору, що походить від pTM1 [Moss, В., тичній гомогенності вірусного штаму. СаузернEIroy-Stein, О., Mizukami, Т., Alexander, W.A., Fuблот-аналіз вірусної ДНК підтвердив генетичну erst T.R. (1990) Nature, 348, 91-92], та містить ген стабільність MVA-LAInef та явно продемонстру(клонований у Ncol- та ВатHl-сайти множинного вав інтеграцію гену nef та делецію маркерного клонування рТМ1) хлорамфеніколацетилтрансгену LacZ Ε. coli в сайті делеції 11 у вірусному ферази (CAT) E.coli під контролем промотору геномі. РНК-полімерази Т7 (РТ7). Трансфіковані та інфіЕфективна експресія рекомбінантного білку ковані клітини CV-1 суспендували в 0,2мл 0,25Μ Nef була підтверджена за допомогою ВестернТрис-НСІ (рН=7,5). Після трьох циклів заморожублот-аналізу білок-продукуючих лізатів клітин вання-відтаювання лізати освітлювали шляхом CEF, інфікованих вірусом MVA-LAInef з викорисцентрифугування, а потім визначали вміст білка в танням мишачих mАВ проти Nef ВІЛ-1 (люб'язно супернатантах, та зразки, що містять 0,5; 0,25; наданих K.Krohn та використаних [як описано 0,1мкг повного білку, аналізували на ферментну Ovod, V., Lagerstedt, Α., Ranki, Α., Gombert, F., активність методом, [описаним Mackett, Μ., Smith, Spohn, R., Tahtinen, M., Jung, G., Krohn, K. (1992) G.L. Moss, В., (1984), J.Virol, 49, 857-864]. Після AIDS, 6, 25-34]. авторадіографії кількість мічених плям оцінювали 1,9п.о. -ДНК-фрагмент, що містить повний з використанням візуалізуючої аналітичної сисген, кодуючий тирозиназу людини [кДНК-клон теми Fuji. Отримані результати проілюстрували, тирозинази 123.В2 виділяли з клітинної лінії мещо шляхом використання у високому ступені ателаноми SK29-MEL пацієнта SK29 (AV), GenBank нуйованого вектору MVA на основі вірусу коро№ допуску UO1873; Brichard, V., Van Pel, Α., в'ячої віспи може бути отримана система "вірус Wölfel, Т., Wölfel, С, De Plaen, Ε., Lethe, В, Coulie, коров'ячої віспи-РНК-полімераза Т7", яка являP. та Boon, В. (1993), J.Exp.Med., 178, 489-495] ється такою ж ефективною, як і при використанні отримували з плазміди pcDNAI/Amp-Туr [Wölfel, досить компетентного по реплікації рекомбінанта Т., Van Pel, Α., Brichard, V., Schneider, J., Seliger, на основі вірусу коров'ячої віспи (Фіг.7). В., Meyer zum Buschenfelde, K., та Boon, T. (1994) 648п.о.-ДНК-фрагмент, що містить повний ген Eur.J.ImmunoL, 24, 759-764] шляхом гідролізу nef LAI ВІЛ-1, отримували за допомогою PCR з ферментом EcoRl, а потім модифікували шляхом плазмідною ДНК (pTG1166, люб'язно наданою інкубування з ДНК-полімеразою Кленова для "заМ.-Р. Kіеnу, Transgene S.A., Strasbourg; для PCR туплення кінців" та клонували у Smal-cawr pUC II використовували наступні праймери: 5'-CAG CAG LZdel P7.5, в результаті чого отримували вектор GGA ТСС ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA pUC II LZdel P7.5-TYR (Фіг.9). Ця плазміда може AGT AGT-3' та 5'-CAG CAG GGA TCC ATG TCA бути використана для конструювання рекомбінаGCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3'), гідролізунтного вірусу MVA, який експресує ген тирозинавали рестриктуючою ендонуклеазою ВатНІ, мози людини під контролем раннього/пізнього продифікували шляхом інкубування з ДНКмотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. полімеразою Кленова для "затупіння кінців", та Клітини CEF, інфіковані вірусом MVA при клонували в Smal-сайт pUC II LZ-del P7.5, в ремножинності зараження TCID50=0,5 на клітину, зультаті чого отримували вектор pUC II LZdel трансфікували ДНК плазміди pUC II LZdel P7.5P7.5-LAInef (Фіг.8). Ця плазміда може бути викоTYR, як описано в літературі [Sutter, G., Wyatt, L., ристана для конструювання рекомбінантного віFoley, P., Bennink, J., Moss, В., (1994) Vaccine 12, русу MVA, який експресує ген nef ВІЛ-1-LAI під 1032-1040]. Рекомбінантний вірус MVA, стабільно контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 віекспресуючий ген тирозинази людини та сумісно 19 75410 експресуючий, з часовою регулюцією, ген LacZ E coli, відбирали шляхом проведення послідовних циклів методом бляшек у клітинах CEF, пофарбованих 5-бром-4-хлор-3-індоліл-β-Dгалактозидом (300мкг/мл). Після цього рекомбінантні віруси, які експресують ген, що кодує тирозиназу людини та має делетований маркерний ген LacZ, виділяли шляхом проведення ще трьох додаткових послідовних циклів очистки методом бляшек, здійснюючи скринінг на непофарбовані фокуси вірусу в клітинах CEF у присутності 5бром-4-хлор-3-індоліл-β-D-галактозида (300мкг/мл). Потім рекомбінантні віруси ампліфікували шляхом інфікування моношарів CEF, та MVA-hTYR-вірусну ДНК аналізували за допомогою PCR для того, щоб упевнитися в генетичній гомогенності вірусного штаму. Саузерн-блотаналіз вірусної ДНК підтвердив генетичну стабільність MVA-hTYR та явно продемонстрував інтеграцію рекомбінантного гену тирозинази та делецію маркерного гену LacZ Ε coli в сайт делеції II у вірусному геномі. Ефективна експресія рекомбінантної тирозинази людини була підтверджена за допомогою Вестерн-блот-аналізу білок-продукуючих лізатів клітин CEF, інфікованих вірусом MVA-hTYR з використанням кролячих поліклональних антитіл (люб'язно наданих V.Hearmg, та використаних, [як описано, Jimenez., M., Kameyama, K., Maloy, L., Tomita, Υ., Hearing, V. (1988) P.N.A.S. USA 85, 3830-3834] або мишачих моноклональних антитіл (люб'язно представлених L. Old та використаних, [як описано, Chen, Y., Stockert, E., Tsang, S., Coplan, K. Old, L. (1995) P.N.A.S. USA 92, 8125-8129], направлених проти тирозинази. Перелік послідовностей (1) Загальна інформація: (і) Заявник: (A) Назва: GSF-Forschungszentrum fuer Umwelt und Gesundehiet GmbH (B) Вулиця: Ingolstaeder Landstr. 1, Neunerberg (C) Місто: Oberschleissheim (E) Країна: Німеччина (F) Поштовий індекс: 85764 (ii) Назва винаходу: Рекомбінантний вірус MVA та його використання (ііі) Кількість послідовностей: 8 (іν) Тип комп'ютерного зчитування: (A) Тип носія: гнучкий диск (B) Комп'ютер: PC сумісний з IBM (C) Операційна система: PC-DOS/MS-DOS (D) Програмне забезпечення: Patentln Release #1,0 Version # 1,30 (ЕРО) (vi) Данні попередньої заявки: (A) Номер заявки: DK 0782/95 (B) Дата подання: 04 липня 1995р. (2) Данні послідовності SEQ ID №1: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 33 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одно ланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №1: 20 (2) Данні послідовності SEQ ID №2: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 42 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №2: (2) Данні послідовності SEQ ID №3: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 36 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №3: (2) Данні послідовності SEQ ID №4: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 36 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №4: (2) Данні послідовності SEQ ID №5: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 33 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №5: (2) Данні послідовності SEQ ID №6: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 33 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №6: (2) Данні послідовності SEQ ID №7: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 39 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотна (C) Ланцюговість: одно ланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності SEQ ID №7: (2) Данні послідовності SEQ ID №8: (і) Характеристика послідовності: (A) Довжина: 39 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотна 21 (C) Ланцюговість: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис.= "ДНК-праймер" 75410 22 (хі) Опис послідовності SEQ ID №8: 23 75410 24 25 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 75410 Підписне 26 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601