Застосування ліофілізату дедиференційованих рослинних клітин для депігментації і/або освітлення шкіри

Номер патенту: 89487

Опубліковано: 10.02.2010

Автор: Мекідеш Ніколь

Є ще 4 сторінки.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Застосування щонайменше одного із ліофілізатів дедиференційованих рослинних клітин, де вказані дедиференційовані рослинні клітини є галофільними рослинними клітинами, в косметичній композиції, при якому визначений ліофілізат дозволяє депігментувати і/або освітлювати, захищати і відновлювати епідерміс.

2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що дедиференційовані рослинні клітини одержані методом культури in vitro.

3. Застосування за п. 2, яке відрізняється тим, що дедиференційовані рослинні клітини, одержані методом культури in vitro, є лініями клітин.

4. Застосування за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що солончаковою рослиною є морський критмум.

5. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, яке відрізняється тим, що ліофілізат депігментує і/або освітлює епідерміс, блокуючи діяльність тирозинази.

6. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, яке відрізняється тим, що ліофілізат захищає епідерміс шляхом зменшення вмісту вільних радикалів.

7. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, яке відрізняється тим, що ліофілізат відновлює епідерміс шляхом стимуляції розмноження клітин базального шару епідермісу.

8. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, яке відрізняється тим, що ліофілізат відновлює епідерміс шляхом уповільнення диференціації епідермісу.

9. Косметична композиція для місцевого використання, яка відрізняється тим, що вона включає на допустимому фізіологічному рівні щонайменше ліофілізат галофільних рослинних дедиференційованих клітин за будь-яким з пп. 1-8.

10. Косметична композиція для місцевого використання, яка відрізняється тим, що вона включає на прийнятному фізіологічному рівні щонайменше від 0,05 % до 2 % ліофілізату галофільних рослинних дедиференційованих клітин за будь-яким з пп. 1-8.

11. Косметична композиція для місцевого використання, яка відрізняється тим, що вона включає на прийнятному фізіологічному рівні щонайменше від 0,1 % до 1 % ліофілізату галофільних рослинних дедиференційованих клітин за будь-яким з пп. 1-8.

12. Косметична композиція для місцевого використання, яка відрізняється тим, що вона включає на прийнятному фізіологічному рівні щонайменше 0,5 % ліофілізату галофільних рослинних дедиференційованих клітин за будь-яким з пп. 1-8.

13. Композиція за одним з пп. 9-12, призначена для надання шкірі більш молодого вигляду.

14. Композиція за пп. 9-12, призначена для лікування пігментних плям.

15. Композиція за пп. 9-12, призначена для відбілювання шкіри негроїдного і азіатського типу.

Текст

1. Застосування щонайменше одного із ліофілізатів дедиференційованих рослинних клітин, де вказані дедиференційовані рослинні клітини є галофільними рослинними клітинами, в косметичній композиції, при якому визначений ліофілізат дозволяє депігментувати і/або освітлювати, захищати і відновлювати епідерміс. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що дедиференційовані рослинні клітини одержані методом культури in vitro. 3. Застосування за п. 2, яке відрізняється тим, що дедиференційовані рослинні клітини, одержані методом культури in vitro, є лініями клітин. 4. Застосування за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що солончаковою рослиною є морський критмум. 5. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, яке відрізняється тим, що ліофілізат депігментує і/або освітлює епідерміс, блокуючи діяльність тирозинази. 6. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, яке відрізняється тим, що ліофілізат захищає епідерміс шляхом зменшення вмісту вільних радикалів. C2 2 (11) 1 3 Шкіра - це захисна оболонка, яка являє собою границю між зовнішнім середовищем та іншими внутрішніми органами. Проте, вона не є герметичною і як абсорбуючий орган дозволяє розчиненим речовинам проходити через пори і волосяні мішечки. Шкіра захищає від холоду, спеки і опромінення; від тиску і тертя, від хімічних ушкоджень, від проникнення мікроорганізмів, від втрати води і тепла. Природний захист шкіри від ультрафіолетового опромінення відбувається завдяки коричневому пігменту - меланіну. Меланін присутній в клітинах основних шарів епідермісу - меланоцитах. Він синтезується з амінокислоти - тирозину, який модифікований ензимом - тирозиназою. Синтез меланіну спричиняють ультрафіолетові проміння. Потемнення кольору шкіри є першим природним захистом від сонця, якого надто недостатньо для найсвітліших тинів шкіри. Загар, що з'являється під дією ультрафіолету, є наслідком зростання меланінової активності у синтезі меланіну і накопичення меланіну в кератиноцитах. Кількість меланіну і число меланоцитів є генетично запрограмованими факторами, які дають шкірі кольору. Надлишкове і локалізоване вироблення меланіну спричиняє появу плям: веснянок, маски вагітності, сонячного або старечого лентиго і тому подібного. Дійсно, згідно з останньою номенклатурою, старечі плями є старечим лентиго, а сонячні лентиго - іншими плямами. «Старечі плями» - це маленькі, рівні і, як правило, круглі плями блідо-коричневого кольору, найчастіше, на обличчі, тильній частині долонь, грудях і передпліччях. їх появу спричиняє поєднання сонця і старіння. їх кількість зростає з віком. Під дією ультрафіолетового проміння, що повторюється, меланоцити, зрештою, виробляють надмірну кількість меланіну. Лентиго - це «веснянки», які не зникають взимку, коричневого кольору, маленькі і численні, розташовані дуже близько одна від одної. Найчастіше, вони знаходяться на обличчі, плечах і грудях. їх появу спричиняє надмірна доза ультрафіолету і їх утворення можливе, починаючи з самого раннього віку. «Маска вагітності» проявляється у вигляді великих коричневих плям неправильної форми, найчастіше, на обличчі, яке іноді приймає вигляд маски. Коли ці плями з'являються під час вагітності, їх називають хлоазма, в інших випадках - мелазма. Їх появу спричиняє гормональне стимулювання (вагітність, гормональна терапія) в поєднанні з ультрафіолетовим опроміненням. Всі ці типи плям також можуть бути пов'язані з генотипом і, таким чином, зі спадковістю. Коли існує проблема неестетичного вигляду внаслідок такої концентрації меланіну, особливо важливо мати препарат для місцевого використання, який дозолить запобігати їм і\або зменшувати їх. Виробники косметичних і фармацевтичних препаратів знаходяться у постійному пошуку акти 89487 4 вних неагресивних природних речовин, які дозволяють уповільнювати або блокувати синтез меланіну, безпосереднім чи посереднім шляхом, або уповільнювати чи блокувати перехід меланосом в кератиноцити і, таким чином, освітлювати плями, захищаючи ці зони від сонячної пігментації Також виробники косметичних препаратів шукають активні неагресивні природні речовини для того, щоб задовольнити зростаюче бажання людей з негроїдним і азіатським типом шкіри щодо її освітлення, пропонуючи їм продукцію для захисту шкіри. Для того, щоб уникнути недоліків інших існуючих стомлюючих і\або агресивних методів (лазер, кріотерапія) депігментації, ці активні природні речовини повинні одночасно захищати шкіру і\або стимулювати відновлення клітин, з яких вона складається. Дійсно, захист шкіри і\або стимулювання відновлення клітин шкіри дозволяє боротися одночасно проти фактора, який збільшує плями: старіння шкіри через численні причини. Першою причиною старіння шкіри є «запрограмоване» старіння, яке може прискорити стрес, зловживання палінням і певні захворювання. З роками шкіра втрачає свою еластичність, оскільки епідерміс виробляє все менше фібри колагену та еластину. Звідси прогресуюче послаблення сполучної тканини і в'ялість шкіри. Здатність відновлення епідермісу також має тенденцію до послаблення, він стає сухішим, тонкішим, тому що змінюється його метаболізм. З часом, шкіра набуває сірого вигляду, що дає тьмяний колір, проти якого засоби освітлення також можуть боротись. Другою причиною старіння є зменшення вироблення гормонів, що веде до поступового зменшення тканинної, клітинної і органічної діяльності. Такі гормони, як гормон росту (HGH), тестостерон, DHEA і мелатонін виробляються у великій кількості до двадцяти років і вони сприяють відновленню клітин. Наслідки цих різних причин старіння разом з впливом на навколишнє середовище (різні види забруднення: відпрацьовані гази, сигаретний дим, заводський дим, хімічні продукти тощо) ведуть до надлишкового продукування вільних радикалів, які націлені на різні компоненти клітини: протеїни, ліпіди, цукор і ДНК, в чому і полягає, таким чином, інша причина старіння шкіри. Певні зовнішні причини підштовхують їх до початку реакції, тому що вони постійно шукають інші молекули, з якими можуть з'єднуватись. Таким чином, вони атакують фібри колагену, клітинні мембрани і жировий шар шкіри. Вони змінюють генотип клітин так, що якість нових клітин шкіри погіршується. Тіло захищає себе проти цих агресорів за допомогою ензиматичних систем, протистоячи цим окисним реакціям (антиоксиданти). Але починаючи з двадцяти років механізми природного захисту поступово ослаблюються так, що шкіра не може більше захищати себе лише власними силами. Заявник відкрив дивовижно і несподівано, що ліофілізат дедиференційованих рослинних клітин дозволяє отримувати комбінацію шуканих результатів: він забезпечує повністю безпечну депігмен 5 тацію і\або освітлення епідермісу, його захищаючи і відновлюючи. Дедиференційовані клітини зберігають весь клітинний потенціал як первинні клітини. Вони виявляють всі гени їх геноми; таким чином, всі протеїни дозволяють кожному типу спеціалізованої клітини захищати себе від зовнішнього середовища. Винахід, таким чином, спрямований, по-перше, на використання у виробництві косметичної або фармацевтичної суміші щонайменше одного ліофілізату дедиференційованих рослинних клітин, тобто вищевказаного ліофілізату, що дозволяє депігментацію і\або освітлення, захист і відновлення епідермісу. Під «рослинною дедиференційованою клітиною» розуміють всі рослинні клітини, які не представляють жодного признаку спеціалізації і можуть відновлювати власними силами саджанець рослини, з якої вона походить. Вона може бути відділена від будь-якого зразка цілої рослини або органу, такого як листя, стебло, корені, пиляк, плоди і тому подібне, який називають експлантат. Переважно як експлантат використовують частину листя або насіння. Як правило, перевагу віддають розведенню експлантату in vitro. Під «культурою in vitro» розуміють набір методів з попереднього досліду, знайомого спеціалісту, який дозволяє в умовах, що повністю контролюються, відтворювати орган або цілу рослину на основі експлантату, вирощеного в або на певному поживному середовищі. Ці умови, які повністю контролюються, дозволяють повністю відтворювати і робити однорідними рослини. Зокрема, цей метод розведення дозволяє отримувати ідентичні клони в необмеженій кількості. Серед методів і середовищ розведення in vitro, які описані в попередньому досліді, можна процитувати, наприклад, середовища Gamborg (1968), Murashige і Skoog (1962), Morel (1970) і тому подібне, склад яких описаний у "Plant Culture Media: formulations and uses" авторів E.F. George, DJM Puttock і H.J. George (Exegetics Ltd 1987). Зокрема, переважно використовують рослинні дедиференційовані клітини солончакової рослини, такого виду як Salicornia ramossisima (солонець), Sueda vera, Beta maritime, Obione portulacoides, Armeria maritime, Crithmum maritimum (морський критмум), Ophrys sphegodes, Artemia vulgaris, Muscaris comosum, Eryngium maritimum, Saguisorba minor, Cochlearia officinalis, Fumaria officinajis, Vincetoxicum fullonum, Dispacus fullonum, Heracleum spondylium, Inula crithmoides, Inula brittanica, Inula viscosa, зокрема рослинні дедиференційовані клітини морського критмуму (Crithmum maritimum). Солончакові рослини, які також називають галофітами, є рослинами, що витримують багатий на сіль грунт. Вони розвинули систему захисту проти зовнішнього агресивного середовища, в якому вони знаходяться. Зокрема, галофіти є рослинами з морського берегу, які здатні витримувати багатий на сіль грунт, вологу і вітер. Вони постійно борються, щоб підтримувати осмотичний тиск в своїх клітинах; вода має тенденцію переносити плазмову мембрану в позаклітинну частину з найбільшим вмістом соди. 89487 6 У випадку використання солончакової рослини особливо важливо розвивати клітинну культуру in vitro, яка виробляє необмежену відтворювану біомасу для захисту цих видів, галофітів, яким загрожує забруднення з боку моря. В окремому варіанті винаходу також можливо змінювати певні умови культури (рН, температуру, навколишній газовий склад, склад середовища культури, освітлення). Дедиференційовані клітини намагатимуться при цьому продукувати певні внутрішньоклітинні субстанції. Друга сфера застосування винаходу - косметична або фармацевтична суміш для місцевого використання, яку характеризує те, що вона містить в основі, фізіологічно прийнятній, від 0,05 до 2%, переважно від 0,1 до 1%, особливо переважним чином 0,5% щонайменше один ліофілізат, як описано раніше. Дійсно, такий ліофілізат можна використовувати як єдиний активний препарат суміші згідно з винаходом. Проте, деякі ліофілізати можна додавати до основи суміші згідно з винаходом. В першому варіанті реалізації винаходу використовують щонайменше один ліофілізат рослинної дедиференційованої клітини для вироблення косметичної або фармацевтичної суміші, яка призначена для надання шкірі омолодженого вигляду. В другому варіанті реалізації винаходу використовують щонайменше один ліофілізат рослинної дедиференційованої клітини для вироблення косметичної або фармацевтичної суміші, призначеної для лікування плям, які називають лентиго. В третьому варіанті реалізації винаходу використовують щонайменше один ліофілізат рослинної дедиференційованої клітини для отримання косметичної або фармацевтичної суміші, призначеної для освітлення шкіри негроїдного та азіатського типу. Наступні приклади ілюструють винахід, проте вони не обмежують сферу його використання. Умовні позначення на кресленнях: Фіг.1: загальна морфологія, забарвлення в гематоксилін\еозин (HES) на відновленому епідермісі SKINETHIC® звичайному (кератиноцити) Фіг.2: загальна морфологія, забарвлення в гематоксилін\еозин (HES) на відновленому епідермісі SKINETHIC®, що містить меланоцити Фіг.3: маркування філагріну Фіг.4: маркування КІ-67 (оцінка мітотичного індексу) Приклад 1: Розведення in vitro дедиференційованих клітин морського критмуму на основі рослинної тканини: 1 - Отримання первинного калюсу За допомогою ножиць відбирають шматочки тканини у вибраній зоні (мінімум 3см) зі стебла або листя. Починаючи з цього етапу всі маніпуляції повинні відбуватись в стерильній атмосфері у витяжній шафі з ламінарним потоком. Для стерилізації рослинного матеріалу тканину занурюють на 30 секунд в етанол, потім видаляють розчинник, промивають тричі у 100мл стерильної Н2О, занурюють на 15 хвилин в гіпохлорит натрію, в який додано декілька крапель Tween 20, 7 89487 після чого промивають тричі у 100мл стерильної Н2О. Для того, щоб помістити тканину в культуру, фрагменти тканини розміщують у стерильній чашці Петрі (125мм) і розрізають на шматочки (2-3мм), видаляючи при цьому частини, що побілілі під дією жавелевої води. Таким чином отримані експлантати злегка надрізають і наполовину занурюють у живильне желеподібне середовище (Таблиця 1) 2 - Пересадження калюсу Починаючи з цього етапу всі маніпуляції повинні відбуватись в стерильній атмосфері у витяжній шафі з ламінарним потоком. Відбирають на рівні калюсу 2-3 клітинних згустки (1-2см) за допомогою шпателя. Ці згустки розміщують і розподіляють на новому середовищі. Склад середовища твердої культури: Таблиця 1 Макроелементи KNO3 (NH4)2SO4 СаСl2, 2H2O NaH2PO4, 2H2O MgSO4, 7H2O Мікроелементи MnSO4, Н2О ZnSO4, 7H2O Н3ВО3 КI Na2MoO4, 2H2O CuSO4, 5H2O FeSO4, 7H2O Вітаміни Міоінозит Нікотинова кислота D (+) - пантотенат кальцію (+) біотин Хлор гідрат піридоксалу Двохлористий тіамін Органічні сполуки Сахароза Фітогормони Нафталін оцтова кислота 2,4 Двохлориста феноксіоцтова кислота Кінетик Желююча речовина Агар мг/л 2500 134 150 300 250 мг/л 16,9 8,6 6,2 0,83 0,25 0,025 27,8 мг/л 100 1 1 0,01 1 1 г/л 30 мг/л 1,5 0,5 0,5 г/л 9 3 - Збільшення клітин калюсу у рідкому середовищі Інокулят Клітини калюсу переносять у рідке середовище, ідентичне твердому середовищу без агару (Таблиця 1). Їх вирощують в умовах збовтування (ПО обертів/хвилину) при температурі 25°С під постійним білим світлом (3500 люкс, лампа денного світла) в колбах Ерленмейера об'ємом 250мл із розрахунку 50мл на одну колбу Ерленмейера. 8 Їх розчинюють через 10-11 днів у пропорції 1¤4, тобто 100мл в 400мл. Виробництво сухого матеріалу: Клітини вирощують на основі розчину 1¤4 інокуляту в колбах Ерленмейера 5л, із розрахунку 2л культури на одну колбу Ерленмейера в умовах збовтування (110 обертів/хвилину) при температурі 25°С під постійним білим світлом (3500 люкс, лампа денного світла) 12-13 днів. Треба зауважити, що 2,4 двохлориста феноксіоцтова кислота у процесі обміну повністю метаболізується і її не буде у кінцевому продукті. Приклад 2: Отримання ліофілізату з де диференційованих клітин морського критмуму: Рідку клітинну культура в стані суспензії центрифугують для очищення клітин. Клітини просівають через сито 150-200mm, заморожують, потім ліофілізують в ліофілізаторі пластинкового типу. Приклад 3: Демонстрація на відновленому епідермісі SKINETHIC® при відсутності токсичності косметичного препарату, який містить ліофілізат де диференційованих клітин морського критмуму: Відновлений епідерміс SKINETHIC® є моделлю епідермісу людини, яку розробила і продає компанією Societe SkinEthic Laboratories (Ніца, Франція). 1. На відновленому епідермісі SKINETHIC® звичайному (складається лише з кератиноцитів): Кератиноцити людського походження були засіяні на полікарбонатний фільтр 0,63см2 у певному середовищі (модифікований MCDB 153) з добавками. Клітини вирощували протягом 14 днів у контакті з повітрям/рідиною, середовище культури змінювали кожні два дні. Епідерміс, утворений таким чином, використовували для вивчення, починаючи з 17 дня культури. Попередній аналіз було проведено для визначення часу контакту і кількості продукту, нанесеного на відновлений епідерміс, без цитотоксичності. Всі тести проведені двічі з: Лот 1: контрольним епідермісом, на який препарат не наноситься Лот 2: обробленим епідермісом, на який нанесений крем PXTS + 0,1% АК205 Лот 3: обробленим епідермісом, на який нанесений крем PXTS + 0,5% АК205 Лот 4: обробленим епідермісом, на який нанесений препарат ліофілізат клітинний АК205 АК205 = ліофілізат з дедиференційованих клітин морського критмуму, отриманий згідно з Прикладами 1 і 2. PXTS = крем для дуже сухої шкіри Епідерміс, закріплений в 10% формальдегідному розчині, був розміщений в парафінові блоки. Вертикальні зрізи в 4 мікрони забарвлені в гематоксиліні / еозині і сфотографовані під оптичним мікроскопом. Культури повинні представляти базальні, остеподібні, зернисті і рогові клітинні шари, неушкоджені та ортокератозні; епідермічне розшарування повинне бути рівномірним і нормальним. Клітини базального шару повинні поляризуватись вертикально. Численні гранули кератогіаліну по 9 89487 винні бути видимі (в ультрафіолеті) в зернистому шарі безпосередньо під роговим шаром. Препарати, крем PXTS + 0,1% АК205, крем PXTS + 0,5% АК205 і препарат ліофілізату клітин морського критмуму (АК205), розміщені, із розрахунку 2 mL на см2, на відновленому епідермісі, обробленому протягом 24 годин, у порівнянні з контрольним епідермісом, не призвели до жодного токсичного ефекту. Гістологічні зображення обробленого епідермісу після забарвлення гематоксиліном/еозином подібні до зображень контрольного епідермісу (порівняйте на кресленні 1). 2 - На відновленому епідермісі SKINETHIC®, що містить меланоцити: Кератиноцити людського походження і меланоцити були засіяні на полікарбонатні фільтри 0,63см2 у певному середовищі (модифікований MCDB 153) з добавками. Клітини вирощували протягом 10 днів у контакті з повітрям/рідиною, середовище культури змінювали кожні два дні. Епідерміс типу VI (негроїдний) таким же чином утворений використовували починаючи з 10 дня культури. Попередній аналіз був проведений для визначення часу контакту і кількості препарату, нанесеного на відновлений епідерміс, який не має цитотоксичності. Аналіз проведений двічі з: Лот 1: контрольним епідермісом, на який препарат не наноситься Лот 2: позитивним контрольним епідермісом, на який нанесена kojique кислота, 2% Лот 3: обробленим епідермісом, на який нанесений крем PXTS + 0,1% АК205 Лот 4: обробленим епідермісом, на який нанесений крем PXTS + 0,5% АК205 = ліофілізатом з дедиференційованих клітин морського критмуму, отриманим згідно з Прикладами 1 і 2. Епідерміс, закріплений в 10% формальдегідному розчині, був розміщений в парафінові блоки. Вертикальні розрізи в 4 мікрони забарвлені в гематоксиліні/еозині і сфотографовані під оптичним мікроскопом. Культури повинні представляти базальні, остеподібні, зернисті і рогові клітині шари, неушкоджені, ортокератозні, і епідермічне розшарування повинне бути рівномірним і нормальним. Клітини базального шару повинні поляризуватись вертикально. Численні гранули кератогіаліну повинні бути видимі (в ультрафіолеті) в зернистому шарі безпосередньо під роговим шаром. Препарати, крем PXTS + 0,1% АК205 і крем PXTS + 0,5% АК205, розміщені із розрахунку 2 mL на см2, на відновленому епідермісі, обробленому Негативний контрольний зразок Позитивний контрольний зразок КРЕМ PXTS+0,1% АК205 КРЕМ PXTS+0,5% АК205 10 протягом 24 годин, у порівнянні з контрольним епідермісом, не мали ніякої токсичності. Гістологічні зображення обробленого епідермісу після забарвлення гематоксиліном/еозином порівнянні з зображеннями контрольного епідермісу (порівняйте на рисунку 1). Приклад 4: Оцінка ефекту депігментації косметичного препарату, який містить ліофілізат дедиференційованих клітин морського критмуму на відновленому епідермісі SKINETHIC®, що містить меланоцити: 1 - Протокол експерименту Кератиноцити людського походження і меланоцити були засіяні на полікарбонатні фільтри 0,63см2 у певному середовищі (модифікований MCDB 153) з добавками. Клітини вирощували протягом 10 днів у контакті з повітрям/рідиною, середовище культури змінювали кожні два дні. Епідерміс типу VI (негроїдний), утворений таким чином, використовували, починаючи з 10 дня культури. Всі тести були проведені двічі з: Лот 1: контрольним епідермісом, на якому препарат не застосовували Лот 2: позитивним контрольним епідермісом, на який була нанесена kojique кислота, 2% Лот 3: обробленим епідермісом, на який був нанесений крем PXTS + 0,1% АК205 Лот 4: обробленим епідермісом, на який був нанесений крем PXTS + 0,5% АК205 АК205 - це ліофілізат дедиференційованих клітин морського критмуму, отриманий згідно з Прикладами 1 і 2. Оцінка внутріклітинного синтезу меланіну (якісне дослідження) була проведена за допомогою спектрометрії на 475nm після того, як клітини були приведені до стану суспензії, потім розчинені у NaOH (1N) і диметилсульфоксиді протягом 30 хвилин. Наприкінці періоду інкубації взяли проби середовища культури, потім епідерміс промили з фосфатним буферним соляним розчином PBS (Phosphate Buffer Saline) і ввели у контакт з Triton X-100 (Sigma, Франція) з концентрацією 1%, потім витримали в інкубації 10 хвилин. Ензиматична реакція була ініційована додаванням L-Dopamine (Sigma, Франція) з 10mМ в PBS, в якому не було Са2++ і Mg2+. Після 1 години інкубації при температурі 37°С в темному місці діяльність тирозинази була оцінена шляхом вимірювання абсорбції на 475nm за допомогою спектрофотометру. 2 - Результати а) дозування меланіну Отримані результати представлені у вигляді таблиці: Абсорбційна здатність (475 nm) 0,160±0,02 0,09±0,01 0,139±0,02 0,101±0,01 % -44 -13 -37 11 89487 Отримані результати показали, що застосування крему PXTS +0,5% АК205 призводить до значного зменшення проценту меланіну на рівні відновленого епідермісу, який містить меланоцити (-37%). Крем PXTS +0,1% АК205 дещо зменшує Негативний контрольний зразок Позитивний контрольний зразок КРЕМ PXTS+0,1% АК205 КРЕМ PXTS +0,5% АК205 цей процент (-13%) у порівнянні з позитивним контрольним зразком. б) Оцінка активності тирозинази Отримані результати представлені у вигляді таблиці: Абсорбційна здатність (475 nm) 0,245 ± 0,03 0,153 ±0,01 0,198 ±0,02 0,167 ±0,02 Отримані результати показали, що застосування крему PXTS +0,5% АК205 призводить до значного зменшення діяльності тирозинази на рівні відновленого епідермісу, який містить меланоцити (-32%), у порівнянні з позитивним контрольним зразком (-38%). Було спостережене незначне зменшення (-19%) піcля обробки кремом PXTS +0,1% АК205. На закінчення, в отримуваних експериментальних умовах, препарат - крем PXTS +0,5% АК205 показав яскраво виражену депігментацію відносно відновленого епідермісу, який містить меланоцити. Більш обмежена, але реальна дія спостерігалась при застосуванні крему PXTS +0,1% АК205. Приклад 5: Демонстрація на відновленому епідермісі SKINETHIC® ефекту проти вільних радикалів косметичного препарату, який містить ліофілізат диференційованих клітин морського критмуму: 1 - Навіщо дозувати малондіальдегід? В біологічних системах молекулярний кисень є стабільним і мало вступає в реакції. Він поводить себе як акцептор електронів і його відновлення закінчується виробництвом води. Але неповне відновлення О2 закінчується виробництвом вільних радикалів метаболітів, таких як аніон пероксид О2-, токсичний пергідроксид НО2- (в присутності двовалентного заліза реакція може привести до появи ОН-, дуже агресивного), або пероксид водню Н2О2. Дисмутаційний пероксид (SOD) захищає мембрани швидкою дисмутацією О2- в Н2О2. Н2О2, відносно стабільний, відновлюється у воду (Н2О) каталазою та пероксидазою. Ці вільні радикали, які з'явились від неповного відтворення О2, є чутливими до рівня подвійних зв'язків, що сприяють виникненню інших вільних радикалів внаслідок делокалізації електронів. Початок ланцюгової реакції з утворенням вільних радикалів відбуваються на рівні жирних поліненасичених кислот. Таким чином, реакція починається всередині клітинної мембрани і призводить до вивільнення малондіальдегідів (MDA), а також інших альдегідів і алканів, які є продуктами розпаду. Ці останні можуть з'явитись під час реакції з тіобарбітуратовою кислотою (ТВА). Дозуючи MDA, які є основними ознаками цитотоксичності, викликаної окисними процесами і стресами, отримуємо, таким чином, показник, що дозволяє визначити активність даної речовини проти у боротьбі з вільними радикалами. 2 - Протокол експерименту 12 % -38 -19 -32 Кератиноцити людського походження були засіяні на полікарбонатні фільтри 0,63см2 у певному середовищі (модифікований MCDB 153) з добавками. Клітини вирощували протягом 14 днів у контакті з повітрям/рідиною, середовище культури змінювали кожні два дні. Епідерміс, утворений таким чином, використовували для проведення дослідження, починаючи з 17 дня культури. Дослідження було проведено тричі після 24 годин з моменту контакту препарату з епідермісом: Лот 1: з негативним контрольним епідермісом, на якому не застосовували жодного препарату Лот 2: з обробленим епідермісом, на який був нанесений крем PXTS + 0,1% АК205 Лот 3: з обробленим епідермісом, на який був нанесений крем PXTS + 0,1% АК205 Лот 4: з обробленим епідермісом, на який був нанесений препарат - ліофілізат клітин (морського критмуму) Препарати, що вивчаються, використовувались на поверхні кожного обробленого епідермісу, із розрахунку 2 mL/cm2 Екстракція малондіальдегіду Після 24 контакту продукту з епідермісом останній перевели у стан суспензії У: -250 mL буферного розчину Tris 50 mМ, рН 8, який містить NaCl 0,1 М; Етилендіамінтетраоцтова кислота ЕДТК 20 mМ -25 mL додецильсульфонат натрію до 7% -300 mL НСl (0,1 N) -38 mL фосфовольфраматової кислота 1% у воді -300 mL тіобарбітурової кислоти 0,67% у воді Після однієї години інкубації у темряві при температурі 50°С і охолодження у льодяній воді у кожну трубку було додано 300мл n-бутанолу. Трубки були центрифуговані при 10000 g при температурі 0°С протягом 10 хвилин. Вища фаза була рекуперована для дозування MDA Дозування малондіальдегіду MDA MDA дозували шляхом флуоресценції після сепарації комплексної сполуки MDA-TBA за допомогою рідинної хроматографії високого тиску. - Насос Bischoff, модель 2.200 - Автоматичний інжектор Alcoot, модель 788, автоматичний дозатор - Колонка Ultrasep C18 (30 cm x 0,18) 6мм пористості - Детектор флуоресценції, jasco 821-FI 13 89487 Виявлення флуоресценції проведене з ініціюванням 515nm і емісією при 553nm. Використовуваний елюент складається з метанолу та води, 40:60 (об/об), при рН, відкоригованому за допомогою КОН 1М. Кількісний аналіз проведений шляхом порівняння з еталонними зразками, обробленими так само, як і зразки (0,125; 0,25; 0,5 і 1 mМ) за допомогою комп'ютерної програми ICS (Фіг.3) Дозування протеїнів Контрольний зразок КРЕМ PXTS +0,1% АК 205 КРЕМ PXTS + 0,5% АК 205 ЛЮФІЛІЗАТ КЛІТИН 14 Дозування протеїнів проведене згідно з методом BRADFORD. Підвищення абсорбційної здатності до 595nm пропорційне концентрації протеїнів, визначеної за допомогою спектрофотометру UNI САМ 8625. З - Результати а) фізіологічне ліпопероксидування Отримані результати представлені у вигляді таблиці: MDA (цМ/mg протеїнів) 652±31 638±47 620±32 594±57 % -2 (нз) -5 (нз) -9 (нз) нз: не значне Результати показують, що досліджені продукти не призводять до жодного вивільнення MDA в фізіологічних умовах у порівнянні з необробленим контрольним зразком. Контрольний зразок UVB(150mJ/cm") КРЕМ PXTS+ 0,1%АК 205 + UVB(150mJ/cm2) КРЕМ PXTS + 0,5% AK 205 + UVB(150mJ/cm2) ЛЮФІЛІЗАТ КЛІТИН + UVB(150mJ/cm2) б) Ліпопероксидування, спричинене ультрафіолетом Отримані результати представлені v вигляді таблиці: MDA (цМ/mg протеїнів) 652±31 832±63 660±51 % +28* -21** 625±42 -25** 602±37 -28** * відносно до негативного контрольного зразка ** відносно до позитивного контрольного зразка, опроміненого UVB Отримані результати показали значний захист, який надають продукти: крем PXTS + 0,1% АК 205, крем PXTS + 0,5% АК 205 і ліофілізат клітини (морського критмуму), що наносять на поверхню відновленого епідермісу SKINETHIC®, у порівнянні з ліпопероксидацією, яку спричиняє ультрафіолетове випромінювання «B»(150mJ/cm2). Продукування MDA зменшилось на 21% , 25% та 28% відповідно для крему PXTS + 0,1% АК 205, крему PXTS + 0,5% АК 205 та ліофілізату клітини (морського критмуму) у порівнянні з опроміненим епідермісом Якщо опромінення UVB (позитивний контрольний зразок) спричиняє збільшення продукування MDA на 28% , то застосування таких продуктів як крем PXTS + 0,1% АК205, крем PXTS + 0,5% АК 205 і ліофілізат клітини (морського критмуму) до опромінення дозволяє підтримувати продукування MDA на своєму фізіологічному рівні. Приклад 6: Демонстрація на відновленому епідермісі SKINETHIC® ефекту, який стимулює косметичний препарат, який містить ліофілізат дедиференційованих клітин морського критмуму: 1 - Критерії оцінки стимулювання Клітинна культура кератиноцитів людського походження дозволила детальніше описати спе цифічний вплив похідних вітаміну А на маркери поступової диференціації епідермісу: стимулюється видавлювання КІ-67 у надбазальному шарі, спричиняється видавлювання типових кератинів епідермічної гіперпроліферації (К19, К13), відбувається втрата полярності клітин бального шару, в той час як синтез філагрину, протеїну, який відповідає за укладання кератинів у роговий шар, уповільнюється. Гранули кератозгіаліну, розташовані у зернистому шарі, який багатий на філагрін, зникають за 24 години при наявності 0,05% ретинолової кислоти (кислота вітаміну А) в середовищі культури. Таким чином, ретиноїди, в цілому, спричиняють стимуляцію проліферації і уповільнення епідермічної модифікації [Rosdy, М. та інші, In Vitro Toxicology, Vol. 10 n°l, crop. 39-476 1997, "Retinoic acid inhibits epidermal differentiation when applied topically on the stratum corneum of epidermis formed in vitro by human keratinocytes grown on defined medium"]. Філагрін і протеїн КІ-67 можуть, таким чином, використовуватись як маркери епідермічної модифікації. 2 - Вивчення епідермічної диференціації Протокол Кератиноцити людського походження були засіяні на полікарбонатні фільтри 0,63см2 у певному 15 середовищі (модифікований MCDB 153) з добавками. Клітини вирощували протягом 14 днів у контакті з повітрям/рідиною, середовище культури змінювали кожні два дні. Епідерміс, утворений таким чином, використовували для проведення дослідження, починаючи з 17 дня культури. Дослідження було проведено тричі після 24 годин з моменту контакту препарату з епідермісом: Лот 1: з негативним контрольним епідермісом, на якому не застосовували жодного препарату Лот 2: з обробленим епідермісом, на який був нанесений крем PXTS + 0,1% АК205 Лот 3: з обробленим епідермісом, на який був нанесений продукт - крем PXTS + 0,5% АК205 Лот 4: з обробленим епідермісом, на який був нанесений продукт - ліофілізат клітин (морського критмуму) Контрольні зразки епідермісу, на яких не застосовували жодного продукту, і епідермісу, обробленого продуктом у процесі вивчення протягом 24 годин контакту, були заморожені при температурі -80°С. Після розміщення в парафінові блоки ці епідерміси були розрізані, потім оброблені імуногістохімічним способрм. Ця реакція була здійснена з моноклоновими антитілами, відновленими з філагріну. Результати затримання диференціації клітин епідермісу Порівняльний аналіз відновленого епідермісу контрольних зразків, оброблених продуктами кремом PXTS+0,1% AK 205, кремом PXTS+0,5% AK 205 та ліофілізатом клітин (морський критмум), виявив різницю у щільності маркерів філагріну на рівні зернистого шару (див. Фіг. 3) Дійсно, у фізіологічних умовах лікування епідермісу: - кремом PXTS+0,1% AK205 призвело до чіткого зменшення диференціації епідермісу, яке відзначається помітним зменшенням маркерів філагріну у порівнянні зі зразками, які не були оброблені продуктом; - кремом PXTS+0,5% AK 205 призвело до чіткого зменшення диференціації епідермісу, яке відзначається помітним зменшенням маркерів філагріну у порівнянні зі зразками, що не були оброблені, - ліофілізатом клітин (морський критмум) призвело до значного зменшення диференціації епідерми, яке відзначається явним зменшенням маркерів філагріну у порівняні зі зразками, що не були оброблені. Контрольний зразок Крем PXTS+0,1 % АК205 Крем PXTS+0,5 % АК205 Клітинний ліофілізат Підрахунок забарвлених у пігменті ядерних ситів всіх зразків після імуногістохімічної обробки виявили наступне: 89487 16 3 - Дослідження розмноження клітин базального шару епідермісу Протокол Кератини людського походження були засіяні на полікарбонатний фільтр 0,63см2 у певному середовищі (модифікований MCDB 153) з добавками. Клітини вирощувалися 14 діб у контакті з повітрям/рідиною, середовище культури змінювали кожні два дні. Епідерміс, сформований таким чином, використовували для проведення дослідження, починаючи з 17 дня культури. Активність продуктів була виявлена шляхом імуногістохімічного маркера. Випробовування було проведене тричі після 24 годинного контакту продукту з епідермісом: - Лот 1: з негативним контрольним епідермісом, на якому не застосовували жодного препарату; - Лот 2: з обробленим епідермісом, на який був нанесений крем PXTS+0,1% АК205; - Лот 3: з обробленим епідермісом, на який був нанесений крем PXTS+0,5% АК205; - Лот 4: з обробленим епідермісом, на який був нанесений продукт - ліофілізат клітин (морського критмуму) Контрольні зразки епідермісу, на яких не застосовували жодного продукту, і епідерми, оброблювані продуктом у процесі вивчення, протягом 24 годин контакту були закріплені у 10% формальдегіді. Після розміщення в парафінові блоки ці епідерміси були розрізані, потім оброблені імуногістохімічним способом. Ця реакція була здійснена з антитілом МІВІ (іммунотехнологія), пептидом, який рекомбінує ядерний антиген КІ-67. Результати були отримані методом пероксидаза-антипероксидаза після антигенної демаскації шляхом попередньої термічної обробки. Маркування хромогеном DAB виявляє коричневим кольором ядерні сита КІ-67 збільшення розщеплення клітин, вираженого в фазах: => G1 і S = латентні і синтезні фази клітини => G2 = фаза подвоєння клітинних компонентів => М = мітоз. Мітотичний індекс визначили шляхом підрахування кольорових ядерних ситів, із розрахунку 10 полів на скло оптичного мікроскопу, збільшення х 250, у порівнянні із зрізами зразків епідермісу. Результати: стимуляція розмноження клітин епідерми Отримані результати представлені у формі таблиці: Середня кількість забарвлених ядер на поле підрахунку мікроскопом 7±2 8±2 12±2 14±3 - крем PXTS+0,1 % АК205 викликав слабке, але показове посилення розмноження клітин базального рівня. Кількість забарвлених ядерних 17 ситів подібна кількості на необроблених контрольних зразках (див. Фіг.4) - крем PXTS+0,5 % АК205 викликав слабке, але показове посилення розмноження клітин базального рівня у порівнянні з необробленим контрольним зразком. Кількість забарвлених ядерних ситів вища за рівень на необробленрму контрольному зразку, (див. Фіг.4) 89487 18 - клітинний ліофілізат (морський критмум) викликав значне посилення розмноження клітин базального шару у порівнянні з необробленим контрольним зразком. Кількість забарвлених ядерних ситів значно вища за рівень на необробленому контрольному зразку (див. Фіг.4). 19 89487 20 21 89487 22 23 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 89487 Підписне 24 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Use of a lyophilisate of dedifferentiated plant cells for skin depigmentation and/or lightening

Автори англійською

Mekideche Nicole

Назва патенту російською

Применение лиофилизата дедиференцированных растительных клеток для депигментации и/или осветления кожи

Автори російською

Мекидеш Николь

МПК / Мітки

МПК: A61K 8/18, A61Q 19/02

Мітки: застосування, клітин, депігментації, ліофілізату, шкіри, рослинних, освітлення, дедиференційованих

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/12-89487-zastosuvannya-liofilizatu-dediferencijjovanikh-roslinnikh-klitin-dlya-depigmentaci-i-abo-osvitlennya-shkiri.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Застосування ліофілізату дедиференційованих рослинних клітин для депігментації і/або освітлення шкіри</a>

Подібні патенти