Рідкий склад гормона росту

1. Рідкий склад, що містить a) гормон росту; b) сіль лужного металу; c) сіль лужноземельного металу або сіль псевдолужноземельного металу; і d) цитратно/фосфатний буфер. 2. Склад за п. 1, в якому гормон росту являє собою людський гормон росту. 3. Склад за будь-яким з пп. 1, 2, в якому сіль лужного металу вибирають з групи, що складається з NaCl, KCl, Na2SO4, Na2CO3. 4. Склад за п. 3, в якому сіллю лужного металу є NaCl або Na2SO4. 5. Склад за будь-яким з пп. 1-4, в якому сіль лужноземельного металу вибирають з групи, що складається з СаСl3, MgCl2, MgSO4, NH4СО3. 6. Склад за п. 5, в якому сіллю лужноземельного металу є MgCl2. 7. Склад за будь-яким з пп. 1-6, в якому буфер являє собою натрій-цитратний/натрій-фосфатний буфер. 8. Склад за п. 7, в якому буфер знаходиться в концентрації, що варіює від 1 до 100 мМ або від 5 до 50 мМ, або від 10 до 20 мМ. 9. Склад за будь-яким з пп. 1-8, що додатково містить сурфактант. 10. Склад за п. 9, в якому сурфактантом є поліетилен-поліпропілен гліколь. 11. Склад за п. 10, в якому сурфактантом є Pluronic F 68. 2 (19) 1 3 Даний винахід стосується рідких складів гормона росту (GH) і, зокрема, рідких складів людського гормона росту (hGH) з поліпшеною хімічною і фізичною стійкістю. Рідкі склади гормона росту (GH) згідно з винаходом можна зберігати протягом тривалого часу при кімнатній температурі. Даний винахід також стосується способу отримання таких рідких складів GH, і до форм їх представлення. Людський гормон росту (hGH), відомий також як соматропін (INN міжнародна непатентована назва) або соматотропін, являє собою білковий гормон, що виробляється і секретується соматотропними клітинами переднього гіпофіза. Людський гормон росту відіграє ключову роль в соматичному рості в дитячому віці і в обміні речовин у дорослих за допомогою його впливу на метаболізм білків, вуглеводів і ліпідів. Людський гормон росту являє собою одиночний поліпептидний ланцюжок з 191 амінокислоти (Bewly et al., 1972), що має два дисульфідні зв'язки, один з яких знаходиться між Cys-53 і Cys-165, утворюючи в молекулі велику петлю, а інший зв'язок між Cys-182 і Cys-189 утворює маленьку петлю близько С-кінця. Послідовність ДНК, що підтверджує амінокислотну послідовність, була опублікована авторами Martial et al. (1979). Очищений hGH являє собою ліофілізовану форму білого аморфного порошку. Він легко розчиняється (в концентрації >10мг/л) у водних буферних розчинах з рівнем рН в діапазоні від 6,5 до 8,5. У розчині hGH існує, переважним чином, у вигляді мономера з наявністю невеликої фракції димерів і високомолекулярних олігомерів. За деяких умов hGH можна піддавати стимуляції для утворення більших кількостей димерів, тримерів і вищих олігомерів. Відомо декілька похідних hGH, в число яких входять похідні, що зустрічаються в природі, варіабельні продукти і продукти метаболізму, продукти розпаду, передусім біосинтетичних hGH і зроблені генетичними методами генно-інженерні похідні hGH. Один з прикладів похідних hGH, що зустрічаються в природі, являє собою GH-V, варіант гормона росту, що виявляється в плаценті Інші члени локусу гена описані в публікації Chen et al. (1989). Метіоніл-hGH був першою формою hGH, отриманою шляхом технології рекомбінантних ДНК. Ця сполука фактично являє собою похідне hGH, що має на N-кінці один додатковий метіоніновий залишок (Goeddel et al., 1979). Є публікації про те, що варіант hGH, що зустрічається в природі, що зветься 20-K-hGH, виявляється в гіпофізі, а також в кровотоці (Lewis et al., 1978; Lewis et al., 1980). Ця сполука, в якій відсутні 15 амінокислотних залишків від глутаміново'і кислоти Glu-32 до глутаміну Gln-46, є результатом альтернативного сплайсингу інформаційної рибонуклеїнової кислоти (DeNoto et al., 1981). Ця сполука має багато, але не всі біологічні властивості hGH. 89781 4 20-K-hGH виробляється в гіпофізі і секретується в кров. Його кількість становить приблизно 5% вироблення гормона росту у дорослих, і приблизно 20% вироблення гормона росту у дітей. Він має схожу активність по прискоренню росту, як у гормона росту 22 kD, і за опублікованим даними, має такий самий або більш високий ступінь ліполітичної активності в порівнянні з формою 22 kD. Він зв'язується з рецепторами гормона росту з афінністю, що дорівнює афінності гормона росту 22 kD, і в порівнянні з гормоном росту 22 kD має десяту частину його лактогенної (пролактиноподібної) біоактивності. На відміну від 22 kD, 20-k-hGH має слабку антиінсулінову активність. Ряд похідних hGH з'являються внаслідок протеолітичних модифікацій молекули. У первинний шлях метаболізму hGH входить протеоліз. Область hGH навколо 130-150 залишків є надзвичайно сприйнятливою до протеолізу, і описано декілька похідних hGH, що мають одноланцюгові розриви або делеції в цій області (ThorlaciusUssing, 1987). Ця область знаходиться у великій петлі hGH, і розпад пептидного зв'язку в цій області приводить до появи двох ланцюгів, які пов'язані за допомогою дисульфідного зв'язку в Cys-53 і Cys-165. Є публікації, що багато які з цих дволанцюгових форм мають підвищену біологічну активність (Singh et al., 1974). Штучним шляхом за допомогою ферментів виробляють багато похідних людського гормона росту. Для модифікації hGH в різних точках всієї молекули використовують ферменти трипсин і субтилізин, а також інші ферменти (Lewis et al., 1977; Graff et al, 1982). Один з таких похідних, що звуться дволанцюговим анаболічним білком (2-САР), утворювали шляхом регульованого протеолізу hGH з використанням трипсину (Becker et al., 1989). Було виявлено, що 2-САР має біологічні властивості, дуже відмінні від властивостей інтактної молекули hGH, оскільки активність по прискоренню росту hGH значною мірою зберігалася, і вплив на вуглеводний обмін частіше за все був відсутній. При відповідних умовах аспарагінові і глутамінові залишки в білках є сприйнятливими до реакцій дезамінування. Показано, що цей тип реакції, проведений у гіпофизарного hGH, приводить до перетворення аспарагіну Asn-152 в аспарагінову кислоту і також, в меншій мірі, до перетворення Gin-137 в глутамінову кислоту (Lewis et al., 1981). Показано, що дезамінований hGH має змінену сприйнятливість до протеолізу з ферментом субтилізином, і передбачається, що дезамінування може мати фізіологічне значення для напряму протеолітичного розщеплення hGH. Відомо, що при певних умовах зберігання біосинтетичний hGH розщеплюється, що приводить до дезамінування іншого аспарагіну (Asn-149). Він являє собою первинне вогнище дезамінування, але також відмічене дезамінування в Asn-152 (Becker et al., 1988). Повідомлень про дезамінування в біосинтетичному hGH в Gin-137 не було. 5 Метіонінові залишки в білках є сприйнятливими до окислення, передусім до сульфоокислення. Як той, що виробляється гіпофізом, так і біосинтетичний hGH переносять сульфоокислення в метіоніні Met-14 і Met-125 (Becker et al., 1988). Були повідомлення про окислення в Met-170 в гіпофізарному, але не в біосинтетичному hGH. Виявлено, що як у дезамінованого hGH, так і у Met-14 сульфоокисленого hGH виявляється повна біологічна активність (Becker et al., 1988). Усічені форми hGH виробляли як за допомогою дії ферментів, так і генетичними методами. У білка 2-САР, що утворювався регулювальними впливами трипсину, відсікають перші вісім залишків на N-кінці hGH. Інші усічені версії hGH отримують модифікацією гена перед експресією у відповідному хазяїні. Перші 13 залишків відсікають для отримання похідного, що має біологічні властивості, які відрізняються тим, (Gertler et al., 1986) що поліпептидний ланцюжок не розщеплений. При тому, що людський гормон росту спочатку отримували з гіпофізів трупів, ці препарати не були електорофоретично гомогенними, і в сироватці пацієнтів, лікованих препаратами, що мають ступінь гомогенності порядку 50%, з'являлися антитіла, імуногенність пояснювали наявністю неактивних компонентів. Технологія рекомбінантних ДНК дозволяла отримувати необмежену доставку hGH в ряді різних систем. Очищення hGH від культурального середовища полегшується присутністю тільки малих кількостей забруднювальних білків. Фактично було показано, що можливе очищення hGH в лабораторному масштабі шляхом єдиної стадії очищення на колонці для зворотно-фазової високоефективної рідинної хроматографії ВЕРХ (Hsiung et al. (1989)). Рекомбінантний людський гормон росту, rhGH, виробляється фірмою Serono International S.A. під товарним найменуванням SEROSTIM®, вказаний продукт отримав прискорене схвалення Управління з продовольства і ліків FDA для лікування втрати ваги і виснаження у хворих на СНІД. SAIZEN® є рекомбінантним людським гормоном росту, показаним при дефіциті GH у дітей, при синдромі Тернера у дівчат, а також хронічній нирковій недостатності у дітей. PROTROPIN®, що виробляється Genentech, Inc (South San Francisco, CA), за структурою трохи відрізняється від природної послідовності hGH, має додатковий метіоніновий залишок в N-кінці. Звичайно рекомбінантний hGH представлений на ринку у вигляді флаконів, що містять hGH плюс додаткові наповнювачі в ліофілізованій формі, наприклад, гліцин і маніт. У комплект входить флакон розріджувача, що дозволяє пацієнту розчиняти продукт до бажаної концентрації перед введенням дози. Рекомбінантний hGH також може бути представлений на ринку у вигляді інших відомих форм, таких як шприц-ручки. Для того, щоб hGH був комерційно доступним як лікарський препарат, необхідне виготовлення стійких складів. Такі склади повинні мати здатність зберігати активністьпротягом відповідного терміну зберігання і бути прийнятними для введення пацієнтам. 89781 6 Людський GH утворювали різними способами. У способі, наприклад, по патенту США 5,096,885 розкривається стійкий фармацевтично прийнятний склад, що містить hGH, що додатково містить гліцин, маніт, буфер і необов'язково неіонний сурфактант, з молярним співвідношенням hGH:гліцин, що становить 1:50. У патенті WO 93/19776 розкриваються склади GH для ін'єкцій, що містять цитрат як буферну речовину і, необов'язково, фактори росту, такі як інсуліноподібні фактори росту або епідермальний фактор росту, амінокислоти, такі як гліцин або аланін, маніт або інші цукрові спирти, гліцерин і/або консервант, такий як бензиловий спирт. У патенті WO 94/101398 розкривається склад GH, що містить hGH, буфер, неіонний сурфактант і, необов'язково, маніт, нейтральну сіль і/або консервант. У патенті ЕР-0131864 описаний водний розчин білків з молекулярною вагою, що перевищує 8500 дальтон, що мають захист від поверхневої адсорбції, від денатурації і від преципітації білка шляхом додавання прямого поліоксіалкіленового ланцюжка, що містить як стабілізуючий засіб поверхневоактивну речовину. У патенті ЕР-0211601 розкривається склад, що прискорює ріст, який містить водну суміш гормона, що прискорює ріст, і співполімерний блок, що містить поліоксіетилен-поліоксипропіленові одиниці, і має середню молекулярну вагу від близько 1100 до близько 40000, який до введення зберігає текучість гормона, що прискорює ріст, і його біологічну активність. У патенті WO 97/29767 розкривається рідкий склад, що містить гормон росту, двоводний тринатрієвий цитрат, хлорид натрію, гідроокис натрію, бензиловий спирт, Pluronic F-68, і вказаний склад має рН 5,6. У патенті США 5,567,677 розкриваються рідкі склади, що містять людський гормон росту, цитрат натрію, фосфат натрію, гліцин, маніт, необов'язково бензиловий спирт. Фармацевтичні препарати hGH виявляють тенденцію до нестійкості, особливо в розчині. З'являються різні форми хімічного розщеплення, такі як дезаміновані або сульфокислені форми hGH, і внаслідок фізичної нестійкості можуть з'являтися димерні або агреговані високомолекулярні різновиди (Becker et al, (1988); Becker et al., 1987; Pearlman and Nguyen (1989)). Як наслідок нестійкості в розчині hGH, звичайно фармацевтичні склади hGH являють собою ліофілізовану форму, яку перед використанням необхідно ресуспендувати. Ресуспендування звичайно здійснюють додаванням фармацевтично прийнятного розріджувача, такого як стерильна вода для ін'єкцій, стерильний фізіологічний розчин або відповідний стерильний фізіологічно прийнятний розріджувач. Ресуспендовані осади hGH переважно зберігають при 4°С, щоб звести до мінімуму реакції хімічного і фізичного розщеплення, однак деякий ступінь розщеплення буде спостерігатися під час такого зберігання, який може продовжуватися до 14 днів. 7 Особлива перевага забезпечує фармацевтичний склад hGH в рідкій формі, особливо склад, який зберігає стійкість hGH без утворення преципітату або агрегату або будь-яких інших твердих частинок протягом тривалого періоду часу. У зв'язку з цим метою даного винаходу є створення рідких складів гормона росту, які не утворюють в результаті небажані тверді частинки, і які мають тривалі терміни зберігання. Перший аспект даного винаходу відноситься до рідкого складу, що містить: a) гормон росту, або речовину, яка стимулює вивільнення або потенціює активність ендогенного hGH; b) сіль лужного металу; c) сіль лужноземельного металу або сіль псевдолужноземельного металу; і d) цитратно/фосфатний буфер. Другий аспект даного винаходу стосується способу отримання рідкого складу згідно з даним винаходом. У третьому аспекті, даний винахід стосується сублімованого складу, який ресуспендований таким чином, щоб отримати вищезазначений новий рідкий склад. У третьому аспекті даний винахід відноситься до застосування складу згідно з винаходом для введення гормона росту у вигляді монодози або мультидози. Четвертий аспект даного винаходу відноситься до форми представлення рідкого складу згідно з винаходом. Згідно з даним винаходом було виявлено, що хімічна і фізична стійкість гормона росту в рідкому складі може бути підвищена шляхом певного вибору мінеральних солей. Таким чином, отримані розчини можна зберігати протягом тривалого часу, наприклад, від близько 1 до 52 тижнів, або від 1 до 16 тижнів, або від 1-до 4 тижнів, переважно при кімнатній температурі. Додатково було виявлено, що можна отримати підвищену стійкість гормона росту в рідкому складі протягом тривалого часу з композицією згідно з п.1 формули винаходу. У зв'язку з цим даний винахід стосується рідкого складу, що містить: a) гормон росту, або речовину, яка стимулює вивільнення або потенціює активність ендогенного hGH; b) сіль лужного металу; c) сіль лужноземельного металу або сіль псевдолужноземельного металу; і d) цитратно/фосфатний буфер. В одному варіанті здійснення рідкі склади за винаходом можна використовувати для введення мультидози, внаслідок чого вказаний склад можна зберігати при кімнатній температурі на термін в 1 тиждень або більше. Гормон росту, який можна утворити згідно з даним винаходом, може бути отриманий з гормонів будь-яких видів, таких як з бичачого, свинячого, собачого або котячого, в залежності від призначення використання складу. Речовиною, що стимулює вивільнення або потенціює активність ен 89781 8 догенного hGH, є, наприклад, гормон, що стимулює вивільнення гормона росту. Наступні речовини можна переважно утворювати згідно з даним винаходом: a) людський гормон росту; b) фрагмент (а), що має агоністичну активність до рецептора hGH; c) варіант (а) або (b), який має послідовність, ідентичну щонайменше на 70% послідовності (а) або (b) і має агоністичну активність до рецептора hGH; d) варіант (а) або (b), що кодується послідовністю ДНК, яка гібридизується з комплементом нативної послідовності ДНК, що кодує (а) або (b) при помірно суворих умовах, і має агоністичну активність до рецептора hGH; або є) сіль або функціональне похідне (а), (b), (с) або (d), що мають агоністичну активність до рецептора hGH. Склад, що містить людський гормон росту, є переважним згідно з даним винаходом. У термін "людський гормон росту", або "hGH", що використовується в даному винаході, як вище відмічено, включають похідні природного походження і синтетичні похідні, що включають в себе людський гормон росту як 20 kD, так і 22 kD, GH-V, і інші члени локуса гена гормона росту, але не обмежуються вищеперерахованим, як описано детально в "Рівні техніки". hGH може являти собою гормон росту людини природного походження, або він може переважно бути рекомбінантним hGH. Рекомбінантний GH може експресуватися в будь-якому відповідному хазяїні, як прокаріотичному, так і еукаріотичному хазяїні. Особливо прийнятним для експресії hGH є, наприклад, клітина-хазяїн Е. соІі. Клітини дріжджів, комах, або клітини ссавців додатково є прийнятними для експресії рекомбінантного гормона росту. Експресія hGH переважно відбувається в клітинах людини або тварини, наприклад, в клітинах яєчника китайського хом'яка (СНО). Використовуваний в даному винаході термін "hGH" або "гормон росту" також включає в себе функціональні похідні, фрагменти, варіанти, аналоги, або солі, що зберігають біологічну активність гормона росту, тобто, діють як агоністи до рецептора гормона росту. Іншими словами, вони здатні зв'язуватися з рецептором гормона росту, щоб ініціювати активність рецепторної передачі сигналу. Використовувані в даному винаході терміни "функціональні похідні", або "хімічні похідні" охоплюють похідні, які можна виготовляти способами, відомими фахівцям в даній галузі техніки, з функціональних груп, що є боковими ланцюгами на Nабо С-кінцевих групах, і які включені в даний винахід при умові, що вони зберігають фармацевтичну прийнятність, і не порушують біологічну активність hGH, як вказано в даному винаході, тобто, не порушують здатність зв'язуватися з рецептором і ініціювати рецепторну передачу сигналу, і не додають токсичних властивостей композиціям, що їх містять. Якщо похідні зберігають біологічну активність hGH і залишаються фармацевтично прийнятними, то ці похідні можуть мати хімічні функціо 9 нальні групи, такі як вуглеводневі або фосфатні залишки. Наприклад, похідні можуть включати в себе аліфатичні складні ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп, шляхом реакції з аміаком або з первинними або вторинними амінами, Nацил похідними або вільними аміногрупами амінокислотних залишків, утворених з ацильними функціональними групами (наприклад, алканоїльною або карбоциклічною ароїльною групою) або 0ацильними похідними вільної гідроксильної групи (наприклад, похідними з серинових або треонінових залишків), утворених з ацильними функціональними групами. Такі похідні можуть також включати в себе, наприклад, поліетиленгліколеві бокові ланцюги, які можуть закривати антигенні ділянки і пролонгувати присутність молекули в рідких тканинах організму. Гормон росту, що являє собою дериват або комбінацію з комплексоутворювальною речовиною, може мати тривалу дію. Тому, переважний варіант здійснення даного винаходу відноситься до ПЕГильованих версій людського гормона росту. Гормони росту, створені генно-інженерними способами для прояву тривалої активності в організмі, також являють собою приклади похідних hGH, що входять в об'єм даного винаходу. Авторами (Lewis et al., 1979) був виділений і ідентифікований hGH, що є ацетильованим на Nкінці. Залишається неясно, чи служить ацилювання регуляторну роль або просто являє собою артефакт очищення. Разом з тим, передбачається, що ця молекула проявляє активність GH шляхом, що схожий на інші похідні hGH. Тому в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується людського гормона росту, який є ацетильованим на N-кінці. Переважно, склад згідно з даним винаходом містить димер людського гормона росту, вибираного з групи, що складається з дисульфідного димера, зв'язаного за допомогою міжланцюгових дисульфідних зв'язків, ковалентного незворотного недисульфідного димера, нековалентного димера, і їх суміші. Термін "солі", що використовується в даному винаході, відноситься як до солей карбоксильних груп, так і до кислих адитивних солей з аміногруп молекули hGH або їх аналогів. Солі карбоксильної групи можна утворювати способами, відомими в даній галузі техніки, і вони включають в себе неорганічні солі, наприклад, солі натрію, кальцію, амонію, тривалентного заліза або цинку, і т.п., і солі органічних основ, як, наприклад, утворені з амінами, такими як триетиламіном, аргініном або лізином, піперидином, прокаїном і тому подібними. Кислі адитивні солі включають в себе, наприклад, солі мінеральних кислот, таких як, наприклад, соляної кислоти або сірчаної кислоти, і солями органічних кислот, таких як, наприклад, оцтової кислоти або щавлевої кислоти. Будь-яка з вказаних солей має зберігати біологічну активність hGH, що належить до даного винаходу, тобто, здатність зв'язуватися з рецептором hGH і ініціювати рецепторну передачу сигналу. 89781 10 У додатковому переважному варіанті здійснення даний винахід стосується фрагмента людського гормона росту. Термін "фрагмент" гормона росту згідно з даним винаходом стосується будь-якої субпопуляції молекули, тобто, більш короткого пептиду, що зберігає бажану біологічну активність. Фрагменти можна легко отримати відсіканням амінокислот з будь-якого кінця молекули hGH і тестуванням отриманого в результаті фрагмента на наявність властивостей агоніста рецептора hGH. Існують відомі протеази для відсікання однієї амінокислоти одночасно або з N-кінця, або з С-кінця поліпептиду, і, таким чином, визначення фрагментів, що зберігають бажану біологічну активність, являє собою звичайну рутинну задачу. Переважно, фрагменти hGH згідно з даним винаходом можуть мати внутрішні делеції, при умові, що делеція не впливає на біологічну активність hGH, тобто на зв'язування і на ініціацію передачі сигналу за допомогою рецептора hGH. У фрагмента, що є переважним згідно з даним винаходом, відсутні 15 амінокислот від глутамінової кислоти (Glu) 32 до глутамінової кислоти 46. Фрагменти hGH можуть додатково мати усікання на С- або N-кінцях. Усічений hGH, що також є переважним згідно з даним винаходом, не має перших восьми залишків на N-кінці або перших 13 залишків на N-кінці людського гормона росту. Короткий С-кінцевий фрагмент hGH, що зберігає біологічну активність hGH, описаний в патенті США, див. 5,869,452. Тому, згідно з даним винаходом переважним є використання С-кінцевого фрагмента hGH. Фрагмент hGH 177-191, що містить амінокислотні залишки щонайменше від 177 до 191 hGH (LRIVQCRSVEGSCGF) є особливо переважним згідно з даним винаходом. Додатково переважними є похідні цього пептиду, такі як пептидні варіанти, описані в патенті США 6,335,319 або WO99/12969, наприклад, циклічні пептиди. Додатково, поліпептид, що має таку агоністичну активність рецептора hGH, чи є це hGH, його аналогом або варіантом, сіллю, функціональним похідним або його фрагментом, може також містити додаткові амінокислотні залишки, що фланкірують поліпептид hGH. При умові, що молекула, що отримується, зберігає агоністичні властивості рецептора hGH основного поліпептиду, загальноприйнятими експериментами можна визначити, чи впливають які-небудь фланкіруючі залишки на основні і нові властивості основного пептиду, тобто, на його агоністичні рецепторні властивості. Прикладом такого варіанту GH, переважного згідно з даним винаходом, є метіоніновий людський (Met-hGH) гормон росту, який має додатковий метіоніновий залишок на N-кінці людського гормона росту. Варіанти hGH, що є переважними згідно з даним винаходом, містять метіоніновий hGH, що являє собою людський гормон росту, що має додатковий метіоніновий залишок на N-кінці. Додатковий переважний варіант являє собою людський гормон росту, у якого відсутні 15 амінокислотних залишків від Glu32 до Glu46. 11 Термін "варіант" людського гормона росту згідно з даним винаходом відноситься до молекули, яка є по суті схожою як з повним білком, так і з його фрагментом. Варіант також може мати назву "мутеїн". Варіант може, наприклад, являти собою ізоформу hGH, таку, як варіант, отриманий альтернативним сплайсингом. Варіантні (полі-)пептиди можна легко виготовляти шляхом прямого хімічного синтезу варіанту пептиду, використовуючи способи, відомі в даній галузі техніки. Варіант людського гормона росту обов'язково буде мати активність зв'язування з hGH рецептором і ініціювання передачі сигналу, щонайменше схожу з активністю hGH, і тому передбачається, що його активність буде схожою з активністю до hGH. Варіанти амінокислотної послідовності людського гормона росту можна виготовляти шляхом мутацій в ДНК, які кодують похідні людського гормона росту, що синтезуються. Такі варіанти включають в себе, наприклад, делеції або вставки, або заміни залишків в межах амінокислотної послідовності. Також можна провести будь-яку комбінацію делеції, вставки і заміни для отримання кінцевої конструкції, при умові, що кінцева конструкція має бажану активність. Очевидно, що мутації, які будуть зроблені в ДНК, що кодує варіант пептиду, не повинні змінювати рамку зчитування. На генетичному рівні ці варіанти можна виготовляти сайт-направленим мутагенезом (що наводиться як приклад у Adelman et al., 1983) нуклеотидів в ДНК, що кодує молекулу пептиду, таким чином виробляючи ДНК, що кодує варіант, і потім експресуючи ДНК в рекомбінантній клітинній культурі. Варіанти звичайно виявляють щонайменше якісно ту ж саму біологічну активність, що й неваріантний пептид. "Аналог" людського гормона росту згідно з даним винаходом стосується штучної молекули, яка є по суті схожою як з повною молекулою, так і з її активним фрагментом. Аналог людського гормона росту, корисний для даного винаходу, буде проявляти активність GH. Типи замін, які можна проводити в людському гормоні росту згідно з даним винаходом, можуть бути засновані на аналізі частот амінокислотних замін між гомологічним білком різних видів. На основі такого аналізу в даному винаході можна дати визначення консервативним замінам, як обмінам в межах однієї з наступних п'яти груп: I. Малі, аліфатичні, неполярні або трохи полярні залишки: Ala, Ser, Thr, Pro, Glu II. Полярні, негативно-заряджені залишки і їх аміди: Asp, Asn, Glu, Gin III. Полярні, позитивно-заряджені залишки: His, Arg, Lys IV. Великі, аліфатичні неполярні залишки: Met, Leu, He, Val, Cys V. Великі ароматичні залишки: Phe, Туr, Тrр Вважається, що наступні заміни в межах вищезгаданих груп, є "високо консервативними": Asp/Glu His/Arg/Lys 89781 12 Phe/Tyr/Trp Met/Leu/Ile/Val Напівконсервативні заміни визначаються як обміни між двома з вищеперелічених груп (I)-(IV), які обмежені супергрупою (А), що містить вищеперелічені (І), (II), і (III), або супергрупою (В), що містить вищеперелічені (IV) і (V). Заміни не обмежені амінокислотами, що генетично кодуються або навіть тими, що зустрічаються в природі. Коли епітоп виготовляють синтезом пептиду, можна безпосередньо використовувати бажану амінокислоту. Альтернативно, амінокислоту, що генетично кодується, можна модифікувати шляхом її реакції із засобом отримання похідних органічного походження, здатним реагувати з вибраними боковими ланцюгами або кінцевими залишками. Цистеїлові залишки найчастіше реагують з альфа-галоацетатами (і відповідними амінами), такими як хлороцтова кислота або хлорацетоамід з отриманням карбоксиметилових або карбоксіамідометилових похідних. Цистеїлові залишки також отримані як деривати шляхом реакції з бромтрифторацетоном, алфа-бромо-бета-(5імідазоїл)пропіоновою кислотою, хлорацетилфосфатом, N-алкілмалеїмідами, 3-нітро-2піридилдисульфідом, метил-2піридилдисульфідом, р-хлорртутьбензоатом, 2хлорртуть-4-нітрофенолом або хлор-7-нітробензо2-окса-1,3-діазолом. Гістидилові залишки отримували як деривати реакцією з діетилпрокарбонатом при рівні рН 5,57,0, оскільки ця речовина є відносно специфічною для гістидилового бокового ланцюга. Також корисним є парабромфенацилу бромід; реакцію переважно проводять в 0,1Μ какодилаті натрію при рівні рН 6,0. Лізилові і аміно-кінцеві залишки реагують з янтарним або іншими карбоксильними кислотними ангідридами. Отримання дериватів з цими речовинами має ефект зміни заряду лізилових залишків. Інші відповідні реактиви для отримання дериватів залишків, що містять альфа-амінокислоти, включають в себе складні імідоефіри, такі як метилпіколінімідат; піридоксаль фосфат; піридоксаль; хлорборогідрид; тринітробензол сульфонову кислоту; О-метиліоссечовину; 2,4-пентадіон; і реакцію, каталізовану трансаміназами з гліоксилатом. Аргінілові залишки модифікували реакцією з одним або декількома загальноприйнятими реагентами, серед яких використовували фенілгліоксаль; 2,3-бутандіон; і нінгідрин. Отримання дериватів аргінілових залишків вимагає здійснення реакції в лужних умовах через високу рКа функціональної групи гуанідину. Крім того, ці реагенти можуть вступати в реакцію з лізиновими групами, а також з аргініновою епсилон-аміно групою. Специфічну модифікацію тирозилових залишків досліджували per se широко, виявляючи особливу цікавість до впровадження спектральних міток в тирозилові залишки шляхом реакції з ароматичними сполуками діазонію або тетранітрометану. Найчастіше використовували Nацетилімідазол і тетранітрометан для' утворення, відповідно, О-ацетилтирозилових різновидів і εнітро похідних. 13 Карбоксильні бокові групи (аспартилові або глутамілові) селективно модифікували шляхом реакції з карбодіімідами (R'N-C-N-R), такими як 1циклогексил-3-[2-морфолініл-(4етил)]карбодіімідом або 1-етил-3-(4-азоніа-4,4диметилпентил)карбодіімідом. Додатково, аспартилові і глутамілові залишки перетворювали в аспарагінілові і глутамінілові залишки шляхом реакції з іонами амонію. Глутамінілові і аспарагінілові залишки часто є дезамінованими до відповідних глутамілових і аспартилових залишків. Альтернативно, ці залишки є дезамінованими при помірно кислих умовах. Будьяка форма цих залишків входить в об'єм даного винаходу. Приклади здійснення амінокислотних замін в білках, можливого для використання, для отримання аналогів hGH для використання в даному винаході, включають в себе будь-які відомі етапи способу, такі, як представлені в патентах США RE 33,653; 4,959,314; 4,588,585 і 4,737,462, авторами Mark et al.; 5,116,943 авторами Koths et al.; 4,965,195 авторами Namen et al.; і 5,017,691 авторами Lee et al., і лізин-заміщені білки, описані в патенті США 4,904,584 (Shaw et al.). Додаткові варіанти гормона росту були описані, наприклад, в патенті США 6,143,523 (Cunningham et al.). Серед речовин, що зв'язуються і ініціюють передачу сигналів рецепторів людського гормона росту, які можна використовувати згідно з даним винаходом, знаходяться всі аналоги гормонів росту і міметиків, відомі в літературі, такі як, наприклад, розкриті в патентах США 5,851,992; 5,849,704; 5,849,700; 5,849,535; 5,843,453; 5,834,598; 5,688,666; 5,654,010; 5,635,604; 5,633,352; 5,597,709; і 5,534,617. Переважно, варіант hGH або аналог будуть мати основну послідовність, яка є тією ж самою, що і нативна послідовності або її біологічно активний фрагмент, який має амінокислотну послідовність, щонайменше на 70% ідентичну нативній амінокислотній послідовності і що зберігає її біологічну активність. Більш переважно, така послідовність ідентична щонайменше на 80%, щонайменше на 90%, або, найбільш переважно, щонайменше на 95% нативній послідовності. "Ідентичність" відображає взаємовідносини між двома або більше поліпептидними послідовностями або двома або більше олігонуклеотидними послідовностями, що визначаються порівнянням послідовностей. Загалом, ідентичність належить до точної відповідності по довжині порівнюваних послідовностей нуклеотиду нуклеотиду або амінокислоти амінокислоті з цих двох олігонуклеотидних або двох поліпептидних послідовностей, відповідно. Для послідовностей, у яких немає точної відповідності, можна визначити "% ідентичності". Загалом, суміщають дві послідовності, що порівнюються, щоб отримати максимальну кореляцію між послідовностями. Це може включати в себе вставку "пропусків" як в одну, так і в обидві послідовності для збільшення ступеня поєднання. Можна визначати % ідентичності на всьому протязі кожної з порівнюваних послідовностей (так зване загальне 89781 14 поєднання), яке особливо підходить для послідовностей однакової або дуже схожої довжини, або на більш коротких, певних протягах (так зване локальне поєднання), яке більше підходить для послідовностей нерівної довжини. Способи порівняння ідентичності і гомологічності двох або більше послідовностей є відомими в даній галузі техніки. Таким чином, можна використовувати програми, доступні у версії 9.1 Вісконсинського пакету аналізу послідовностей Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux J et al., 1984), наприклад, програми BESTFIT і GAP, для визначення % ідентичності між двома олігонуклеотидними, і % ідентичності і % гомологічності між двома поліпептидними послідовностями. Програма BESTFIT використовує алгоритм "локального поєднання" авторів Smith і Waterman (1981) і виявляє кращу єдину область подібності двох послідовностей. Інші програми для визначення ідентичності і/або подібності послідовностей також є відомими в даній галузі техніки, наприклад, сімейство програм BLAST (Altschul SF et al., 1990, Altschul SF et al., 1997, доступних на домашній сторінці NCBI в www.ncbi.nlm.nih.gov) і програма FASTA (Pearson WR, 1990; Pearson 1988). Переважними замінами для варіантів або мутеїнів згідно з даним винаходом є відомі як "консервативні" заміни. Консервативні амінокислотні заміни поліпептидів або білків гормона росту можуть включати в себе синонімічні амінокислоти в межах групи, що має досить схожі фізико-хімічні властивості, так, що заміна між членами групи буде зберігати біологічну функцію молекули (Grantham, 1974). Є очевидним, що у вищезгаданих послідовностях також можна здійснювати вставки і делеції амінокислот без зміни їх функції, особливо, якщо вставки або делеції залучають тільки декілька амінокислот, наприклад, менше тридцяти, і переважно, менше десяти, і амінокислоти, що є необхідними для функціональної конформації, наприклад, цистеїнові залишки, не видаляються або не переставляються. В об'єм даного винаходу входять білки і мутеїни, виготовлені таким шляхом делецій і/або вставок. Аналоги або варіанти згідно з даним винаходом також можна визначити у відповідності з наступним способом. ДНК нативної послідовності є відомою в попередньому рівні техніки і опублікована (Martial et al., 1979). Поліпептиди, що кодуються будь-якою нуклеїновою кислотою, такою як ДНК або РНК, яка гібридизується з комплементом нативної ДНК або РНК при високо суворих або помірно суворих умовах, при умові, що поліпептид зберігає біологічну активність нативної послідовності, вважаються що входять в об'єм даного винаходу. Умови суворості є функцією температури, що застосовується в експерименті гібридизації, молярності моновалентних катіонів і процента вмісту формаміду в розчині гібридизації. Для визначення ступеня суворості, що охоплює будь-який заданий набір умов, один набір використовує рівняння Meinkoth et al. (1984) для визначення стійкості гібридів з 100% ідентичністю, що виражається у ви 15 гляді температури плавлення Тm гібрида ДНКДНК: Тm=81,5°С+16,6(LogМ)+0,41(%GС)-0,61(%форм.)-500/L, в якому Μ являє собою молярність моновалентних катіонів, %GC означає процент від G і С нуклеотидів в ДНК, % форм, означає процент формаміду в розчині гібридизації, і L є довжиною гібрида в парах основ. На кожний 1°С пониження Тm від розрахункової температури для 100% ідентичності гібрида, кількість дозволених неспівпадінь збільшується приблизно на 1%. Таким чином, якщо Тm, що застосовується для будь-якого заданого експеримента гібридизації при вказаних концентраціях солі і формаміду, є на 10°С нижче за Тm, розрахункової для 100% гібрида згідно з рівнянням Meinkoth, гібридизація буде відбуватися, навіть якщо є до близько 10% неспівпадінь. Умови високої суворості, що використовуються в даному винаході, являють собою умови, толерантні до дивергенції послідовності до близько 15%, в той час як помірно суворими умовами є умови, толерантні до дивергенції послідовності до близько 20%. Приклади високо суворих (на 1215°С нижче за розрахункову Тm гібрида) і помірно суворих (на 15-20°С нижче за розрахункову Тm гібрида) умов, що не обмежують об'єм винаходу, використовують промивальний розчин 2 X SSC (стандартний цитрат сольового розчину) і 0,5% додецилсульфат натрію SDS при відповідній температурі нижче розрахункової Тm гібрида. Остаточна суворість умов залежить, передусім, від умов промивання, особливо, якщо умови гібридизації, що використовуються, являють собою умови, що дозволяють утворення менш стійких гібридів нарівні з стійкими гібридами. Умови промивання при високій суворості при цьому видаляють менш стійкі гібриди. Звичайна умова гібридизації, яку можна використати при умовах промивання від високо суворих до помірно суворих, описаних вище, являє собою гібридизацію в розчині 6 X SSC (або 6 X SSPE), 5 X реактиву Денхардта, 0,5% SDS, 100мкг/мл денатурованої фрагментованої ДНК сперми лосося при температурі, на приблизно від 20° до 25°С нижче за Тm. При використанні змішаних зондів замість SSC є переважним застосування тетраметиламонію хлориду (ТМАС) (Ausubel, 1987-1998). Хоч даний винахід стосується рекомбінантних способів отримання похідних людського гормона росту, ці похідні також можна отримати загальноприйнятими способами білкового синтезу, які є відомими фахівцям в даній галузі техніки. Склад по винаходу містить поліетиленполіпропілен гліколь. Цей полімер є неіонним сурфактантом. У даному винаході сурфактантом може називатися "тензіоактивний" або "тензіоактивне агент". У ще одному додатковому переважному варіанті здійснення склад містить поліетиленполіпропілен гліколь в концентрації, що варіює від 0,5 до 5мг/мл або від 1 до 2мг/мл або 1,5мг/мл. У переважному складі сурфактантом є плуроновий поліол, такий, як, наприклад, F68. Pluronic F68 є найбільш переважним згідно з даним винаходом. 89781 16 При складанні GH з сурфактантом Pluronic® F68 (BASF, також відомим, як Poloxamer 188) отримували стійкий склад, що не мав проблем преципітації, агрегації або утворення твердих частинок будь-якого виду. Pluronic F68 являє собою блок співполімеру окислу етилену (ЕО) і окислу пропілену (РО). Блок окислу пропілену (РО) є шаром сандвіча з двох блоків окислу етилену (ЕО). Плуронові сурфактанти синтезують двостадійним способом: 1. Утворюють гідрофоб бажаної молекулярної ваги шляхом регульованого додавання окислу пропілену до двох гідроксильних груп пропіленгліколю; і 2. Додають окисел етилену до сендвіча з гідрофобом між гідрофільними групами. У Pluronic F68 процент поліоксіетилену (гідрофільного) становить 80%, і молекулярна вага гідрофобу (поліоксипропілену) складає близько 1967 Да. Нижче перераховані звичайні властивості Pluronic F68: Середня молекулярна вага: 8400; Температура плавлення/застигання: 52°С; Фізичний стан при 20°С: тверде тіло; В'язкість (Brookfield), спз: 1000 [рідини при 25°С, пасти при 60°С і твердого тіла при 77°С] Поверхневий натяг, дин/см при 25°С; 0,1% концентрація: 50,3 0,01% конц.: 51,2 0,001% конц.: 53,6 Поверхневий натяг, дин/см при 25°С в порівнянні з Nujol; 0,1% конц.: 19,8 0,01% конц.: 24,0 0,01% конц.: 26,0 Час змочування по Дрейву, секунди, при 25°С 1,0% конц.: >360 0,1% конц.: >360 Висота піни Ross Miles, 0,1%, мм при 50°С: 35 Ross Miles, 0,1%, мм при 26°С: 40 У динаміці, 0,1%, мм в 400мл/в хвилину: >600 Температура помутніння у водному розчині, °С 1% конц.: >100 10% конц.:>100 ГЛБ (гідрофільно-ліпофільний баланс): 29. У складах по винаходу також можна використовувати інші полімери, що мають властивості, схожі з Pluronic F68. Поліетилен-поліпропілен гліколь можна використовувати в концентрації, що варіює від 0,5 до 5мг/мл або від 1 до 2мг/мл або 1,5мг/мл. Для фахівця в даній галузі техніки очевидно, що в доповнення до поліетилен-поліпропілен гліколю можна використовувати один або більше додаткових сурфактантів. 17 Склад по винаходу додатково містить стабілізуючий засіб. Стабілізуючий засіб може також діяти як засіб ізотонічності. "Засіб ізотонічності" є фізіологічно толерантним складом, який додає складу відповідної тонічності для запобігання чистому потоку води через клітинні мембрани, що знаходяться в контакті з складом. Для цих цілей звичайно використовують сполуки, такі як гліцерин, у відомих концентраціях. Інші відповідні стабілізуючі засоби включають в себе амінокислоти або білки (наприклад, гліцин або альбумін), солі (наприклад, хлорид натрію), і цукор (наприклад, дектрозу, сахарозу і лактозу), але не обмежені вищепереліченим. Стабілізуючий засіб (стабілізатор) або засоби ізотонічності, які можливо переважно використовувати згідно з даним винаходом, включають в себе нередукуючі цукри, що включають в себе сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелезитозу і рафінозу, маніт, ксиліт, еритрит, треїт, сорбіт і гліцерин. У переважному варіанті здійснення стабілізатором або засобом ізотонічності є сахароза. У додатковому переважному варіанті здійснення склад містить сахарозу в концентрації, що варіює від 10мг/мл до 100мг/мл або від 20мг/мл до 80мг/мл або близько 60мг/мл. Склади згідно з даним винаходом містять сіль лужних металів, що включає в себе NaCl, KCІ, Na2SO4, Na2CO3. У переважному варіанті здійснення сіллю лужного металу є NaCl або Na2SO4. Склади згідно з даним винаходом додатково містять сіль лужноземельного металу, що включає в себе СаСІ2, MgCl2, MgSO4, NH4CO3. У переважному варіанті здійснення сіллю лужноземельного металу є MgCl2. Склади по винаходу додатково включають в себе цитратно/фосфатний буфер. Цитратно/фосфатний буфер, який можна використовувати в об'ємі даного винаходу, може бути, наприклад, натрій-цитратним/натрій-фосфатним буфером. Термін "буфер" або "фізіологічно прийнятний буфер" відноситься до розчинів сполук з відомою безпекою для використання в фармацевтичних або ветеринарних складах, і до тих, які мають ефект збереження або регуляції рН складу в бажаному для складу діапазоні рН. Є переважним, що склади по винаходу містять цитрат/фосфат в концентрації в межах від 1 до 100 мМ або від 5 до 50 мМ або від 10 до 20 мМ. Згідно з даним винаходом є переважним, що рН складу знаходиться в діапазоні від 5 до 7 або від 5,5 до 6,5 або близько 6. Більш переважний рН складає від 5,5 до 5,9. Склади по винаходу являють собою рідину і тому містять водний розріджувач. Термін "водний розріджувач" відноситься до рідкого розчинника, який містить воду. Водні системи розчинника можуть складатися виключно з води, або можуть складатися з води, а також з одного або більше розчинників, що змішуються, і можуть містити розчинені речовини, що розчиняються, такі як цукор, буферні розчини, солі або інші ексципієнти. 89781 18 Склад може також містити один або більше за один неводний розчинник. Неводні розчинники, що загальновживано використовуються, являють собою коротколанцюгові органічні спирти, такі як метанол, етанол, пропанол, коротколанцюгові кетони, такі як ацетон, і полі-(спирти), такі як гліцерин. Склад по винаходу переважно додатково містить консервант. Додавання консерванту є особливо переважним, якщо гормон росту призначений для мультидозного введення. "Консервант" є сполукою, яку можна включати в склад, щоб по суті зменшити в ньому бактерійний вплив, таким чином, полегшуючи, наприклад, виготовлення складу багаторазового використання. Приклади потенційних консервантів включають в себе октадецилдиметилбензил амонію хлорид, гексаметонію хлорид, бензалконію хлорид (суміш хлоридів алкілбензилдиметил амонію, в яких алкільні групи є довголанцюговими сполуками), і бензетонію хлорид. Інші типи консервантів включають в себе ароматичні спирти, такі як феноловий, бутиловий і бензиловий спирти, алкілпарабен, такий як метил- або пропілпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол і м-крезол. Консервант в даному винаході також може бути бактеріостатичним. Термін "бактеріостатичний" відноситься до сполуки або композицій, що додаються до складу для дії як антибактерійний засіб. GH з консервантами, що містить склад даного винаходу, переважно відповідає встановленим законом або регулюючим керівним принципам для ефективності консервантів з тим, щоб являти собою комерційно життєздатний продукт багаторазового використання (мультидоза). Приклади бактеріостатиків включають в себе фенол, м-крезол, р-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловий спирт, алкілпарабен (метил, етил, пропіл, бутил і т.п.), бензалконію хлорид, бензетонію хлорид, дегідроацетат натрію і тимерозал. Переважною є присутність консерванту в концентрації в межах від 1 до 10мг/мл або від 2 до 5мг/мл або 3мг/мл. Переважним консервантом по винаходу є фенол. У другому аспекті, даний винахід стосується способу отримання рідкого складу, що включає стадію підготовки водного розчину компонентів складу згідно з даним винаходом. Даний винахід також стосується способу отримання рідкого складу, що включає стадію упаковки заздалегідь заданої кількості складу в стерильний контейнер. Звичайно така кількість знаходиться в мілілітровому діапазоні. Рідкий склад hGH для введення з терапевтичною метою також можна отримати комбінацією hGH і стабілізуючих засобів, що мають бажаний ступінь чистоти, з фізіологічно прийнятними наповнювачами, буферами або консервантами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Osoll A. Ed (1980)). Прийнятними наповнювачами є наповнювачі, які в концентраціях і дозуванні, що використовуються, є нетоксичними для пацієнта, і що включають в себе, наприклад, буфери, консер 19 ванти, антиоксиданти, модифікатори рівня рН і тонічності. Рідкий склад гормона росту, якщо це бажано, може також включати в себе один або більшу кількість інших стабілізуючих наповнювачів. Додаткові стабілізуючі наповнювачі можуть включати в себе, наприклад, амінокислоти, такі як гліцин або аланін, маніт або інші цукрові спирти, або гліцерин. Додатково, рідкий склад може включати в себе інші фактори росту, такі як інсуліноподібні фактори росту (ІФР) або ІФР-зв'язані білки. Підвищена стійкість hGH, що забезпечується складом, отриманим згідно з даним винаходом, дозволяє більш широко використовувати склади hGH, які можуть бути більш концентрованими, ніж склади, що звичайно використовуються. Термін "стійкість" відноситься до фізичної, хімічної, і конформаційної стійкості складів гормона росту даного винаходу (включаючи підтримку біологічної сили). Нестійкість білкового складу може бути викликана хімічним розщепленням або агрегацією білкових молекул, для утворення структури вищого порядку, деглікозилюванням, модифікацією глікозилювання, дезамінуванням, окисленням або будь-якою іншою структурною модифікацією, що знижує щонайменше одну біологічну активність поліпептиду GH, включеного в даний винахід. Аутоін'єктори відомі в даній галузі техніки, як, наприклад, аутоін'єктор під найменуванням Easyject®, який є особливо корисним для введення hGH. Відносно даного винаходу також можна використовувати безголкове введення, використовуючи спеціальні пристрої, що є відомими в даній галузі техніки. Додатковий аспект даного винаходу відноситься до фармацевтичної композиції, що містить склад по винаходу. Композиції в об'ємі даного винаходу включають в себе всі склади, що містять щонайменше один людський гормон росту або його похідне, аналог, або варіант згідно з даним винаходом в кількості, ефективній для досягнення заданої мети. При варіабельності індивідуальних потреб визначення оптимальних діапазонів ефективних кількостей кожного компонента входить в компетенцію фахівців в даній галузі техніки. Звичайне дозування містить від близько 0,001 до близько 0,1мг/кг маси тіла в день. Призначене пацієнтам лікування hGH можна поєднувати з іншими видами лікування, які можуть бути показані при цьому захворюванні. Рідкий склад по винаходу можна отримувати відновленням ліофілізованого препарата Гормона Росту у відповідному розріджувачі (наприклад, у воді для ін'єкцій) таким чином, що склад містить вищезгадані наповнювачі. Термін "вводять", або "введення" означає, що склад по винаходу вводять в організм пацієнта, щоб здійснювати лікування хвороби або стану. У переважному варіанті здійснення даного винаходу hGH вводять щодня в дозі від близько 0,1 до 10мг або від близько 0,5 до 6мг. В одному варіанті здійснення щоденна доза складає близько 0,15-0,3мг hGH в день, переважно при підшкірному введенні. У додатковому варіанті здійснення дозу 89781 20 людського гормона росту близько 1мг вводять щодня пацієнту. У додатковому варіанті здійснення hGH водять в дозах, що чергуються, коли перша доза вище, ніж друга доза. Переважно, перша доза складає близько 1мг, і друга доза складає близько 0,5мг. Щотижневе дозування складає переважно близько 6мг або близько 5мг або близько 4,5мг, в залежності від потреб пацієнта. Термін "пацієнт" означає ссавця, якому проводять лікування хвороби або стану. За походженням пацієнтами є людина, вівця, свиня, кінь, бик, кролик і т.п., але цей список не є вичерпним. Склад по винаходу підходить для багатьох різних режимів введення. Наприклад, введення може бути парентеральним, наприклад, підшкірним, внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, пероральним, внутрішньоочеревинним, у вигляді аерозолю, трансдермальним, інтратекальним, або ректальним шляхом введення. Доза, що вводиться, залежить від віку, стану здоров'я і маси тіла реципієнта, виду попереднього або паралельного лікування при його наявності, частоти лікування і характеру бажаного ефекту. Згідно з даним винаходом, переважними шляхами введення є підшкірний і внутрішньом'язові способи. При цьому розуміється, що відповідна доза композиції або складу згідно з даним винаходом буде залежати від віку, стану здоров'я і маси тіла реципієнта, виду паралельного лікування при його наявності, частоти лікування, і природи бажаного ефекту. Однак, найбільш переважну дозу без додаткового експериментування можна підігнати для індивідуального пацієнта, як це розуміється і визначається фахівцем в даній галузі техніки. Звичайно це охоплює регулювання стандартної дози, наприклад, зниження дози при низькій масі тіла у пацієнта. Сумарну дозу, необхідну для кожного лікування, можна вводити у вигляді багаторазових доз (мультидоза) або у вигляді єдиної дози ("монодоза"). Вираз "використання мультидози" має на меті включення в нього використання єдиного флакона, ампули або картриджа складу hGH, більш, ніж для однієї ін'єкції, наприклад для 2, 3, 4, 5, 6 або більше ін'єкцій. Ін'єкції можуть бути рознесені за часом, наприклад, на періоди в 6, 12, 24, 48 або 72 години. Даний винахід додатково стосується застосування складу згідно з даним винаходом для введення монодози. В альтернативному аспекті, даний винахід стосується застосування складу згідно з даним винаходом для введення мультидози. Звичайні мультидозні склади hGH компанії Serono (Saizen) містять 1,33, 3,33 або 8мг hGH. Звичайні мультидозні склади hGH компанії Lilly (Humatrope) містять 6, 12 або 24мг hGH. Звичайні мультидозні склади hGH компанії Pfizer (Genotropin) містять 5 або 12мг hGH. Звичайні мультидозні склади hGH компанії Novo Nordisk (Genotropin) містять 5, 10 або 15мг hGH. 21 Таким чином, в звичайних складах кількість hGH в одному флаконі становить 1,33, 3,33, 5, 6, 8, 10, 12, 15 або 24мг. Композиції можуть вводитися індивідуально або в комбінації з іншими лікарськими препаратами проти цього захворювання або проти інших симптомів. Склади hGH по винаходу можна дозувати у флакони. До терміну "флакон" належить широкий перелік резервуарів,що підходять для зберігання GH в твердій або рідкій формі в консервованому стерильному стані. Приклади флаконів, що використовуються в даному винаході, включають в себе ампули, картриджі, блістерні упаковки, або інші подібні резервуари, що підходять для доставки GH пацієнту за допомогою шприца, помпи (що включає в себе осмотичну), катетера, трансдермального пластиру, легеневого або трансмукозного аерозолю. Флакони, що підходять для упаковки продуктів для парентерального, легеневого, трансмукозного або трансдермального введення, є широко відомими і визнаними в даній галузі техніки. Підвищена стійкість складів hGH дозволяє провести тривале зберігання при відповідній температурі, такій як температура нижче за точку замерзання (наприклад, при -20°С), або вище за точку замерзання, переважно при 2-8°С, найбільш переважно при +5°С, або навіть при кімнатній температурі, наприклад при +25°С. Склади hGH, що використовуються для введення in vivo, повинні бути стерильними. Цього, наприклад, можна легко досягнути фільтрацією через стерильні фільтраційні мембрани. Лікарські препарати рідких складів hGH звичайно дозують в контейнер, що має порт стерильного доступу, наприклад, в м'яку упаковку внутрішньовенного розчину або у флакон, що має стопор, який можна проколоти голкою для підшкірного введення. У зв'язку з цим додатковий аспект даного винаходу стосується форми представлення рідкого складу даного винаходу, герметично закупореного всередину контейнера в стерильних умовах, що підходить для зберігання до використання. Склади по винаходу можна використовувати для лікування дефіциту GH у дітей, при втраті ваги і виснаженні у хворих на СНІД, при синдромі Тернера у дівчат, а також при хронічній нирковій недостатності у дітей. Опис даного винаходу наводиться в зв'язку з конкретними варіантами здійснення, разом з тим необхідно розуміти, що він може бути додатково модифікований. Ця заявка призначена охопити будь-які варіації, використання або адаптацію даного винаходу, що відповідають, загалом, принципам винаходу, і включаючи такі відхилення від даного розкриття, як що входять в об'єм відомої фахівцям в даній галузі техніки або загальноприйнятої практики, до яких належить даний винахід, і тому може належати до істотних ознак, сформульованих вище, як таких, що попадають в об'єм прикладеної формули винаходу. Всі посилання, що цитуються в даному винаході, що включають в себе статті в журналах або 89781 22 реферати, опубліковані або неопубліковані в патентних заявках США або в інших країнах, патенти, видані в США, або іноземні патенти, або будьякі інші посилання, на які в даному винаході дається посилання, наводяться повністю, включаючи всі дані, таблиці, фігури і текст, представлені в посиланнях, що цитуються. Додатково, повний зміст посилань, що цитуються в межах посилань, що цитуються, наводяться повністю в даному винаході. Після опису даного винаходу він може бути краще зрозумілий при зверненні до наступних прикладів схеми ілюстративних клінічних досліджень, що забезпечуються для ілюстрації, і не призначених обмежити об'єм даного винаходу. Приклад 2 наступних склади оцінювали в плані їх стійкості: Склад А: Компоненти r-hGH (мг/мл) Фосфат цитрату натрію з рівнем рН 5,8 (мМ) Сульфат натрію (мМ) Хлорид магнію (мм) Фенол (мг/мл) Pluronic F68 (мг/мл) Склад А 8,0 5,0 100,0 50 3,0 1,5. Склад В: Компоненти r-hGH (мг/мл) Фосфат цитрату натрію з рівнем рН 5,57 (мМ) Хлорид натрію (мМ) Хлорид магнію (мм) Фенол (мг/мл) Pluronic F68 (мг/мл) Склад В 8,0 5,0 171,0 5 3,0 0,2. Хімічну стійкість складів А і В оцінювали після зберігання зразків при температурі 40°С протягом тривалого часу, тобто довше 3 тижнів. Стійкість hGH визначали ЗФ-ВЕРХ (зворотнофазовою ВЕРХ). Таким чином, певну кількість незміненого, інтактного гормона росту отримували як похідне людського гормона росту від ступеня заміни основного піка. Іншими словами, ступінь заміни виводили від заміни основного піка людського гормона росту і розраховували, як процент від незмінного r-hGH в порівнянні з відповідним піком в нульовій відмітці часу. Результати: Склад А: - Після зберігання зразка протягом 1 місяця при 40°С, основний пік, виміряний для r-hGH, представляє 62% від відповідного піка в нульовій відмітці часу (тобто, 62% незміненого r-hGH виявлені після зберігання протягом 1 місяця при 40°С). - Після зберігання зразка протягом 1 місяця при кімнатній температурі (25°С), основний пік, виміряний для r-hGH, представляє 91% відповідного піка в нульовій відмітці часу (тобто, 91% не 23 89781 зміненого r-hGH виявлені після зберігання протягом 1 місяці при 25°С). Склад В: Після 3 тижнів зберігання при 40°С, основний пік, виміряний для r-hGH, представляє 69% відповідного піка в нульовій відмітці часу (тобто, 69% незміненого r-hGH виявлені після 3 тижнів зберігання при 40°С). Посилання: 1. Altschul S F et al., J МоІ Biol, 215, 403410,1990 2. Altschul S F et al., Nucleic Acids Res., 25:3893402,1997 3. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience (New York, 1987-1998) 4. Becker et al., Biotech nol. Appl. Biochem. 10:326 (1988) 5. Bewly et al., Int. J. Peptide and Protein Res. 4:281-287 (1972) 6. Chen et al., Genomics 4:479-497 (1989) 7. Devereux J et al., Nucleic Acids Res, 12, 387395,1984. 8. Gertler et al., Endocrinology 118:720 (1986) 9. Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979) 10. Graff et al., J. Biol. Chem. 257:2365 (1982) 11. Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974). 12. Hsiung et al., Biotechnology 7:267 (1989) 13. Lewis et al., Endocrinology 101:1587 (1977) 14. Lewis et al., J. Biol. Chem. 253:2679 (1978) Комп’ютерна верстка А. Рябко 24 15. Lewis et al., Endocrinology 104:1256 (1979) 16. Lewis et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 92:511 (1980) 17. Lewis et al., J. Biol. Chem. 256:11645 (1981) 18. Martial et al., Science 205:602-607 (1979) 19. Meinkoth J, Wahl G. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports. AnaІ Biochem. 1984 May 1;138(2):267-84. 20. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99,1990 21. Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85,2444-2448,1988 22. Pearlman and Nguyen (1989), In D. Marshak and D. Liu (eds), Therapeutic Peptides and Proteins, Formulations, Delivery and Targeting, Current Communications in Molecular Biology, Cold-Spring Harbour Laboratory, Cold SpringHarbour, New York, pp.23-30 23. Singh et al, Endocrinology 94:883 (1974) 24. Smith etal, Science 260:1640-1643 (1998) 25. Smith and Waterman J МоІ Biol, 147,195197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482489, 1981 26. Thorlacius-Ussing, Neuroendocrinology 43:233 (1987) 27. WO 93/19776 28. WO 94/101398 29.EP-0131864 30. EP-0211601 31. WO 97/29767 32. US-5,567,677 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601