Спосіб підвищення сорбційної здатності плівок-підкладок в електронній мікроскопії ентеровірусів

Спосіб підвищення сорбційної здатності плівок-підкладок в електронній мікроскопії ентеровірусів, що включає нанесення вірусовмісного матеріалу, який відрізняється тим, що сітки з плівкою-підкладкою поміщають на краплину 0,05% розчину бентоніту, яка знаходиться на парафінізованій стрічці, потім сітки з плівкою-підкладкою переносять на краплину вірусовмісного матеріалу, яку розташовують на тій же парафінізованій стрічці. Корисна модель відноситься до способу індикації ентеровірусів у різних вірусовмісних середовищах шляхом електронної мікроскопії і може бути використана у лабораторіях електронної мікроскопії науково-дослідних інститутів, санітарно-епідеміологічних станцій, інших закладах, що займаються дослідницькою або діагностичною роботою. Методи електронної мікроскопії відіграють важливу роль у вивченні будови вірусів та їх компонентів, ідентифікації вірусів та при діагностичних дослідженнях вірусних інфекцій. При електронній мікроскопії ентеровірусів часто зустрічаються методичні труднощі, пов'язані з дрібним розміром вірусних частинок (близько 28нм), типовою ікосаедричною будовою усіх видів даної групи вірусів, необхідністю роботи при великих збільшеннях (50-100000 і більше. В таких умовах, аналізуючи матеріал, можна легко помилитись та сприйняти вірусні часточки за невірусні продукти розпаду. Найбільша складність виникає при дослідженні вірусвмісного матеріалу з низьким титром (нижче 7,0-6,0 -Ідю), при таких умовах виявити та ідентифікувати віруси дуже важко, а процес концентрації ентеровірусів потребує не лише реактивів, ультрацентрифуги, але й значні затрати часу. Часто для отримання препаратів з високою концентрацією об'єктів на плівці-підкладці використовують ряд модифікацій методики теплового прикріплення [1]. Для досягнення даної мети було використано також методи фільтрації вірусвмісного матеріалу в агар. Найбільш близьким до способу що пропонується по технічній суті та досягаемому ефекту є спосіб сенсибілізації плівок-підкладок білком А з наступним нашаровуванням специфічної антисироватки [2]. Даний спосіб спочатку був використаний для виявлення деяких фітовірусів, потім його було запропоновано для індикації вірусів тварин та людини, в тому числі і ентеровірусів. Описаний вище спосіб є достатньо чутливим, проте має ряд недоліків. По-перше, використання даного способу потребує значних матеріальних затрат. По-друге, його чутливість і специфічність є залежною від якості і специфічності імунних сироваток. По-третє, ефективність даного способу в значній мірі залежить від гідрофобності, товщини і якості плівок-підкладок. В основі корисної моделі, що заявляється, покладено розробку способу виявлення ентеровірусів у вірусвмісному матеріалі з низьким титром (нижче 6,5 -Ідю) шляхом електронної мікроскопії з використанням на поверхні плівокпідкладок бентоніту - природнього алюмосилікату з групи глинистих мінералів монтморилонітів, який має високі сорбційні властивості щодо цих вірусів. Задача, яку вирішує корисна модель, є отримання препаратів з високою концентрацією об'єкта на плівці-підкладці. Поставлена задача вирішується тим, що у СО о О) О) 9903 відомому способі сенсибілізації плівок-підкладок, який включає нанесення матеріалу на плівкупідкладку, згідно корисної моделі, сітки з плівкоюпідкладкою поміщають на краплину 0,05% розчину бентоніту, яка знаходиться на парафінізованій стрічці, потім сітки з плівкою-підкладкою переносять на краплину вірусвмісного матеріалу, яку розташовують на тій же парафінізованій стрічці. Запропонований спосіб здійснюється наступним чином: після одержання 5% гелю бентоніту за відомою методикою [3] проводять розведення даного алюмосилікату у фізіологічному розчині до отримання 0,05% концентрації, ресуспензують протягом 5хв. для переведення у дрібнодисперсний стан, рН доводять до 4,0-4,5 за допомогою НСІ, оскільки деякі види ентеровірусів сорбуються на даному алюмосилікаті лише при кислих значеннях рН. ЮОмкл отриманого 0,05% розчину бентоніту наносять на парафініровану плівку, на яку поміщають мідні або нікелеві сітки (200-300mesh) з формваровою або колодієвою плівкоюпідкладкою. Час контакту бентоніту та плівкипідкладки повинен становити в межах 5-10хв. Далі сітки з сорбованими часточками бентоніту переносять на краплину вірусвмісного матеріалу, що знаходиться на парафіновій стрічці. Час контакту має складати не менш як 5хв. Надлишок вірусвмісного матеріалу з плівки-підкладки забирається високо пористим фільтрувальним папером. Всі роботи рекомендовано проводити у вірусологічному ламінарному боксі. При використанні даного способу вдалось отримати препарати з високою концентрацією ентеровірусів на плівці-підкладці. Електронномікроскопічні дослідження показали що близько 60-70% віріонів знаходяться в сорбованому на бентоніті стані, діаметр часточок бентоніту складає від 10-до 500нм. Мінімальний титр вірусів, при якому, використовуючи даний носій на плівці-підкладці можна було виявити у вірусвмісному матеріалі вірусні часточки, становив 4,5-4,75 -\дюНа фігурах 1-2 показано вірусні часточки сорбовані на бентоніті, титр вірусвмісного матеріалу, що брали для даного дослідження становив 4,75 -Ідю- Контрастування проводили фосфорно вольфрамовою кислотою (рН=2,0) протягом 1-2хв., збільшення 60000. На фігурі З зображено поверхню плівки-підкладки з нанесеним носієм - бентонітом, контрастування фосфорно вольфрамовою кислотою (рН=2,0) протягом 1-2хв., збільшення 20000. Таким чином запропонований спосіб виявлення ентеровірусів з використанням бентоніту в якості носія на плівці-підкладці є достатньо чутливим, дешевим та зручним у виконанні. Спосіб був апробований в лабораторії електронної мікроскопії кафедри мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця та в лабораторії вірусології і бютехнолопі Національного аграрного університету, що дозволяє рекомендувати його для широкого впровадження. Література 1. Стефанов СБ., Биофизика, №4, 1962. 2. Shukia D.D, Gough K.H. "J. Gen. Virol.", 1979, №45, P.533-534. 3. Широбоков В.П., Гирин В.Н., Якименко A.I. и др. Применение бентонита для выявления энтеровирусов у человека и во внешней среде, Киев, 1986,21с. 9903 Комп'ютерна верстка Л Литвиненко Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601