Спосіб ліофілізації ентеровірусів

Спосіб ліофілізації ентеровірусів, що включає ліофільне висушування, який відрізняється тим, що перед початком ліофільного висушування до вірусовмісного матеріалу додають бентоніт, потім матеріал завантажують в ліофільну камеру, знижуючи температуру полиць до -50°С, при вакуумі 100 мм.рт.ст., з подальшим підвищенням температури полиць на 1°С після кожної години ліофілізації. Корисна модель відноситься до способу збереження ентеровірусів який може бути використана у вірусологічних лабораторіях санітарноепідеміологічних станцій та науково-дослідних інститутів. Тривале збереження ентеровірусів з науковою або діагностичною метою можливе лише при низьких температурах (~20-70°С). В таких умовах вірусвмісний матеріал здатний зберігатись протягом декількох років без суттєвого зниження титру [1]. Проте при зберіганні ентеровірусів в умовах "плюсових" температур, їх титр протягом ЗО діб істотно знижується, а через 90 діб дані віруси практично не виявляються [2]. Ліофільне висушування являє собою метод зневоднення заморожених до наднизьких температур (-50-70°С) біологічних об'єктів у глибокому вакуумі. Захисний ефект при впливі на віруси екстремальних факторів даного способу висушування та подальшого зберігання досягається шляхом фізико-хімічної модифікації структури вірусвмісного матеріалу за допомогою компонентів захисного середовища, що не утворюють з ним хімічно міцних зв'язків. При цьому жорсткість білкових структур підвищується за рахунок перерозподілу молекулярного оточення вірусів в середовищі висушування і в першу чергу за рахунок підвищення енергії зв'язування води, тобто, зниження запасів вільної води в системі. Найбільш близьким до способу що пропонується по технічній суті та досягаемому ефекту є спосіб стабілізації простих вірусів шляхом ліофілізації при низьких температурах в білкових захисних середовищах [3]. Однак даний спосіб має суттєві недоліки: По-перше, при використанні даного захисного середовища, при подальшому зберіганні часто відмічається бактеріальне та грибкове забруднення, оскільки ці середовища є добрим поживним субстратом для бактеріальної і грибкової мікрофлори. По-друге, в процесі сублімації відмічається руйнація близько 99,9% популяції та швидке зниження інфекційності при подальшому зберіганні в умовах "плюсових" температур. В основу корисної моделі, що заявляється, покладено розробку середовища захисту з максимально вираженими протективними властивостями щодо ентеровірусів та спосіб ліофільного висушування. Задача, яку вирішує корисна модель, що заявляється, полягає у створенні умов, що забезпечать мінімальну руйнацію ентеровірусів при сублімаційному висушуванні та подальшому зберіганні. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі ліофілізації ентеровірусів, що включає ліофільне висушування, згідно корисної моделі перед початком ліофільного висушування до вірусвмісного матеріалу додають бентоніт, а потім зразки поміщають у ліофільну камеру, температуру знижують до -50°С, при вакуумі 100 мм.рт.ст., кожну годину підвищуючи температуру полиць на 1°С. Запропонований спосіб здійснюється наступним чином: до вірусвмісного матеріалу у титрі не менш ніж 107-Ідю, додають 20 мкл на 1 мл вірусвмісного матеріалу 5% гелю бентоніту (при ю о О) О) 9405 родного алюмосилікату з групи глинистих мінералів монтморилонітів), який має високі сорбційні властивості щодо ентеровірусів. Для сорбції даної групи вірусів на даному природному сорбенті проводять струшування зразків протягом 3-5 хв., далі додають 1 мл завчасно приготованого стерильного захисного середовища (на 1л. - 250 мл 2% гідролізату лактальбуміну, 250 мл знежиреного молока, 250 мл 5% сахарози, 250 мл 1 % пептону). Суміш перемішують протягом 5 хв. Всі роботи слід проводити у ламінарному вірусологічному боксі. Зразки поміщають у ліофільну камеру, знижуючи температуру полиць до -50°С, в таких умовах матеріал має перебувати протягом однієї години, кожну годину слід підвищувати температуру полиць на 1°С. При використанні способу, що заявляється було отримано інфекційність ентеровірусів в титрі 4,75 -Іодю, динаміка стабільності титрів ліофілізованих вірусів Коксакі ВЗ при зберіганні наведена в таблиці 1. Як видно з таблиці 1, при внесенні бентоніту у розведений вірусвмісний матеріал підвищення виживання ентеровірусів не відмічається, лише попередня сорбція ентеровірусів на бентоніті з подальшим додаванням інших складових захисного середовища дозволяє отримати вище вказані результати. На фіг. 1, 2 наведено динаміку титрів ліофілізованих зразків вірусів Коксакі ВЗ при зберіганні в залежності від наявності (фіг. 1) чи відсутності (фіг.2) в захисному середовищі бентоніту. Провівши електронно-мікроскопічне дослідження ліофілізованих зразків ентеровірусів, нам не вдалось виявити пусті форми вірусів, що б свідчило про нуклеїновий тип інактивації. Імовірно, що інактивація даної групи вірусів при ліофільному висушуванні відбувається за рахунок руйнування капсиду. Очевидно, що сорбція на бентоніті забезпечує зміцнення капсидів ентеровірусів. Електронно-мікроскопічні дослідження показали, що бентоніт, використаний нами в якості стабілізатора при ліофільному висушуванні ентеровірусів, представлений електронно-щільними часточками діаметром від 10 до 500 нм. При контактуванні даного сорбенту з ентеровірусами, останні сорбуються на ньому і в такому виді підлягають сублімаційному висушуванні. Після ліофілізації ентеровіруси залишаються морфологічно не зміненими, що показано на фіг.З. Таким чином, запропонований спосіб дає можливість в значній ступені стабілізувати ентеровіруси в процесі ліофілізації. Одержані інфекційні титри після сублімаційного висушування в присутності бентоніту (>4,5-Ідю) відкривають перспективу збереження даної групи вірусів в ліофілізованому стані. Спосіб був апробований на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця, що дозволяє рекомендувати його для широкого впровадження. Література: 1. Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита. Глобальная програма по вакцинам и иммунизации ВОЗ // Женева. - Москва. -1998.-114 с. 2. Бондаренко В.И., Гирин В.И, Григорьева Л.В. и др. Экология энтеровирусов // К.: Здоровье, 1988.-168 с. 3. Andrew Robinson, Graham H.Farrar, and Christopher N. Wiblin. Vaccine Protocols // Totowa, NewJersej: Humana press, 1996. P.317. Таблиця 1 Динаміка стабільності титрів ліофілізованих вірусів Коксакі В при зберіганні Вірусвмісний матеріал Титр до ліофілізації 3 попередньою сорбцією вірусів на бентоніті Без попередньої сорбції вірусів на бентоніті Титр Коксакі ВЗ (-Іодю) доба 1 7 14 21 3,0 3,0 2,75 2,75 1,25 7,0 4,75 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,25 І ФІГ.1 2в 90 3,25 і * 21 60 7,0 з* U 28 Ш Фіг.2 9405 Фіг.З Комп'ютерна верстка М Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601