Мутанти fgf21 та їх застосування

Реферат: Винахід стосується мутантного поліпептиду FGF21, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4, в якій в позиції 98 знаходиться аргініновий залишок, а в позиції 171 - гліциновий залишок. UA 102395 C2 (12) UA 102395 C2 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ця заявка претендує на пріоритет попередньої заявки США № 61/058,861, поданої 4 червня 2008 р., попередньої заявки США № 61/058,919, поданої 4 червня 2008 р., попередньої заявки США № 61/164,364, поданої 27 березня 2009 р. і попередньої заявки США № 61/175,736, поданої 5 травня 2009 р., кожну з яких включено в цей опис за посиланням у всій їх повноті. Галузь техніки Даний винахід стосується молекул нуклеїнової кислоти, кодуючих мутантні поліпептиди FGF21, мутантних поліпептидів FGF21, фармацевтичних композицій, що містять мутантні поліпептиди FGF21, і способів лікування метаболічних розладів з використанням таких нуклеїнових кислот, поліпептидів чи фармацевтичних композицій. Рівень знань FGF21 – це секретований поліпептид, що належить до підродини факторів росту фібробластів (FGF), яка включає FGF19, FGF21 і FGF23 (Itoh et al., 2004, Trend Genet. 20: 56369). FGF21 є атипічним FGF в тому відношенні, що він не залежить від гепарину і функціонує як гормон в регуляції метаболізму глюкози, ліпідів і енергії. FGF21 було виділено з бібліотеки печінкової кДНК як фактор, секретований печінкою. Він в значній кількості експресується в печінці і підшлунковій залозі і є єдиним представником родини FGF, який експресується головним чином в печінці. Трансгенні миші з надекспресією FGF21 демонструють метаболічні фенотипи повільної швидкості росту, низьких рівнів глюкози і тригліцеридів у плазмі, а також відсутності пов'язаного з віком діабетом типу 2, гіперплазії острівців підшлункової залози та ожиріння. Фармакологічне введення рекомбінантного білку FGF21 в моделях на гризунах і приматах мало своїм результатом нормалізовані рівні глюкози в плазмі, знижені рівні тригліцеридів і холестерину, а також поліпшені переносимість глюкози і чутливості до інсуліну. До того ж, FGF21 знижує вагу тіла і вміст жиру за рахунок збільшення витрат енергії, фізичної активності і швидкості метаболізму. Експериментальні дослідження забезпечують підтримку для фармакологічного введення FGF21 для лікування діабету 2 типу, ожиріння, дизліпідемії та інших метаболічних станів і розладів у людей. Людський FGF21 має короткий період напівжиття in vivo. У мишей період напівжиття людського FGF21 становить 1-2 години, у яванських макак від 2,5 до 3 годин. При розробці білку FGF21 для використання в лікуванні діабету 2 типу було б бажаним збільшити період його напівжиття. Білок FGF21 з подовженим періодом напівжиття можна було б вводити пацієнтам не так часто. Саме такі білки і описуються тут. Сутність винаходу Даний винахід пропонує виділений поліпептид, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 4, додатково містить заміщення будь-якої амінокислоти на: аланіновий залишок в позиції 45, лейциновий залишок в позиції 86, лейциновий залишок в позиції 98, аланіновий залишок в позиції 111, аланіновий залишок в позиції 129, гліциновий залишок в позиції 170, проліновий залишок в позиції 171 чи сериновий залишок в позиції 172 або їх комбінації. В одному варіанті здійснення виділений поліпептид містить заміщення будь-якої амінокислоти на: лейциновий залишок в позиції 98, проліновий залишок в позиції 171 або і лейциновий залишок в позиції 98, і проліновий залишок в позиції 171. В іншому варіанті здійснення виділений поліпептид містить заміщення будь-якої амінокислоти на лейциновий залишок в позиції 98 і проліновий залишок в позиції 171. Даний винахід пропонує також виділений поліпептид, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 4, яка має: (а) щонайменше одне амінокислотне заміщення, а саме: (і) глютаміновий, ізолейциновий чи лізиновий залишок в позиції 19; (іі) гістидиновий, лейциновий чи фенілаланіновий залишок в позиції 20; (ііі) ізолейциновий, фенілаланіновий, тирозиновий чи валіновий залишок в позиції 21; (iv) ізолейциновий, фенілаланіновий чи валіновий залишок в позиції 22; (v) аланіновий чи аргініновий залишок в позиції 150; (vi) аланіновий чи валіновий залишок в позиції 151; (vіi) гістидиновий, лейциновий, фенілаланіновий чи валіновий залишок в позиції 152; (vіiі) аланіновий, аспарагіновий, аспарагінової кислоти, цистеїновий, глютамінової кислоти, глютаміновий, проліновий чи сериновий залишок в позиції 170; (іх) аланіновий, аргініновий, аспарагіновий, аспарагінової кислоти, цистеїновий, глютамінової кислоти, глютаміновий, гліциновий, гістидиновий, лізиновий, сериновий, треоніновий, триптофановий чи тирозиновий залишок в позиції 171; (х) лейциновий чи треоніновий залишок в позиції 172; чи (хі) аргініновий залишок або залишок глютамінової кислоти в позиції 173; і (b) щонайменше одне амінокислотне заміщення, а саме: (і) аргініновий, глютамінової кислоти чи лізиновий залишок в позиції 26; (іі) аргініновий, глютамінової кислоти, глютаміновий, лізиновий чи треоніновий залишок в позиції 45; (ііі) треоніновий залишок в позиції 52; (iv) цистеїновий, глютамінової кислоти, гліциновий чи сериновий залишок в позиції 58; (v) аланіновий, аргініновий, 1 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 глютамінової кислоти чи лізиновий залишок в позиції 60; (vi) аланіновий, аргініновий, цистеїновий чи гістидинові залишок в позиції 78; (vіi) цистеїновий чи треоніновий залишок в позиції 86; (vіiі) аланіновий, аргініновий, глютамінової кислоти, лізиновий чи сериновий залишок в позиції 88; (іх) аргініновий, цистеїновий, глютамінової кислоти, глютаміновий, лізиновий чи треоніновий залишок в позиції 98; (х) аргініновий, аспарагінової кислоти, цистеїновий чи глютамінової кислоти залишок в позиції 99; (хі) лізиновий чи треоніновий залишок в позиції 111; (хіі) аргініновий, аспарагінової кислоти, глютамінової кислоти, глютаміновий, гістидиновий чи лізиновий залишок в позиції129; або (хііі) аргініновий, глютамінової кислоти, гістидиновий, лізиновий чи тирозиновий залишок в позиції 134; та їх комбінації. В одному варіанті здійснення залишком в позиції 98 є аргінін, а залишком в позиції 171 – пролін, а в іншому варіанті здійснення такий поліпептид може містити амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 85 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID №: 4, але в якій щонайменше одне амінокислотне заміщення з (a)(i)-(xi) та (b)(i)-(xiii) більше не модифікується. Даний винахід додатково пропонує виділений поліпептид, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 4, яка має щонайменше одне амінокислотне заміщення, а саме: (а) глютаміновий, лізиновий чи ізолейциновий залишок в позиції 19; (b) гістидиновий, лейциновий чи фенілаланіновий залишок в позиції 20; (с) ізолейциновий, фенілаланіновий, тирозиновий чи валіновий залишок в позиції 21; (d) ізолейциновий, фенілаланіновий чи валіновий залишок в позиції 22; (е) аланіновий чи аргініновий залишок в позиції 150; (f) аланіновий чи валіновий залишок в позиції 151; (g) гістидиновий, лейциновий, фенілаланіновий чи валіновий залишок в позиції 152; (h) аланіновий, аспарагінової кислоти, цистеїновий чи проліновий залишок в позиції 170; (і) аланіновий, аргініновий, аспарагінової кислоти, цистеїновий, глютамінової кислоти, глютаміновий, гліциновий, гістидиновий, лізиновий, сериновий, треоніновий, триптофановий чи тирозиновий залишок в позиції 171; (j) лейциновий залишок в позиції 172; або (k) аргініновий залишок чи залишок глютамінової кислоти в позиції 173; та їх комбінації. В одному варіанті здійснення залишком в позиції 171 є пролін, а в іншому варіанті здійснення цей поліпептид може містити амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 85 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID №: 4, але в якій щонайменше одне амінокислотне заміщення з (a)-(k) більше не модифікується. Даний винахід пропонує також виділений поліпептид, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 4, яка має щонайменше одне амінокислотне заміщення, а саме: (а) аргініновий, глютамінової кислоти чи лізиновий залишок в позиції 26; (b) аргініновий, глютамінової кислоти, глютаміновий, лізиновий чи треоніновий залишок в позиції 45; (с) треоніновий залишок в позиції 52; (d) глютамінової кислоти, гліциновий чи сериновий залишок в позиції 58; (е) аланіновий, аргініновий, глютамінової кислоти чи лізиновий залишок в позиції 60; (f) аланіновий, аргініновий чи гістидиновий залишок в позиції 78; (g) аланіновий залишок в позиції 88; (h) аргініновий, глютамінової кислоти, глютаміновий, лізиновий чи треоніновий залишок в позиції 98; (і) аргініновий, аспарагінової кислоти, цистеїновий чи глютамінової кислоти залишок в позиції 99; (j) лізиновий чи треоніновий залишок в позиції 111; (k) аргініновий, аспарагіновий, аспарагінової кислоти, глютамінової кислоти, глютаміновий, гістидиновий чи лізиновий залишок в позиції 129; або (l) аргініновий, глютамінової кислоти, гістидиновий, лізиновий чи тирозиновий залишок в позиції 134; та їх комбінації. В одному варіанті здійснення залишком в позиції 98 є аргінін, а в іншому варіанті здійснення цей поліпептид може містити амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 85 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID №: 4, але в якій щонайменше одне амінокислотне заміщення з (a)-(l) більше не модифікується. В різних варіантахздійснення описаний тут поліпептид може додатково містити щонайменше одне амінокислотне заміщення, а саме: (а) фенілаланін, пролін, аланін, серин чи гліцин в позиції 179; (b) глютамінова кислота, гліцин, пролін чи серин в позиції 180; чи (с) лізин, гліцин, треонін, аланін, лейцин чи пролін в позиції 181, і може додатково містити від 1 до 10 амінокислотних залишків, зрощених з С-кінцем поліпептиду, і може бути будь-якою амінокислотою, наприклад, одним чи більше залишків, вибраних з групи, що включає гліцин, пролін та їх комбінації. В різних варіантах здійснення описані тут поліпептиди можуть додатково містити (а) амінотермінальне відсічення з не більше ніж 8 амінокислотних залишків, де такий поліпептид є здатним знижувати рівень глюкози у крові у ссавця; (b) карбоксил-термінальне відсічення з не більше ніж 12 амінокислотних залишків, де такий поліпептид є здатним знижувати рівень глюкози у крові у ссавця; чи (с) аміно-термінальне відсічення з не більше ніж 8 амінокислотних залишків і карбоксил-термінальне відсічення з не більше ніж 12 амінокислотних залишків, де такий поліпептид є здатним знижувати рівень глюкози у крові у ссавця. 2 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В певних варіантах здійснення описані тут поліпептиди можуть бути ковалентно зв'язаними з одним чи більше полімерів, таких як PEG (поліетилен гліколь). В інших варіантах здійснення поліпептиди за цим винаходом можуть зрощуватись з гетерологічною амінокислотною послідовністю, факультативно через лінкер, такою як GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID №: 23). Ця гетерологічна амінокислотна послідовність може бути IgG постійним доменом чи його фрагментом, такою як амінокислотна послідовність SEQ ID №: 13. Такі злиті поліпептиди, описані тут, можуть також утворювати мультимери. Даний винахід пропонує також фармацевтичні композиції, що містять описані тут поліпептиди і фармацевтично прийнятний агент для приготування лікарської форми. Такі фармацевтичні композиції можуть бути використані у способі для лікування метаболічного розладу, який передбачає введення пацієнту, що потребує того, фармацевтичної композиції за цим винаходом. Метаболічні розлади, які можуть лікуватись, включають діабет і ожиріння. Також пропонуються виділені молекули нуклеїнової кислоти, кодуючі описані тут поліпептиди, а також вектори, що містять такі молекули нуклеїнової кислоти, і клітини-хазяї, що містять такі молекули нуклеїнової кислоти. Усічені форми поліпептиду з послідовністю SEQ ID №: 4 також охоплюються цим винаходом. В різних варіантах здійснення такий поліпептид може включати: (а) аміно-термінальне усічення з не більше ніж 8 амінокислотних залишків, де цей поліпептид є здатним знижувати рівень глюкози у крові у ссавця; (b) карбоксил-термінальне усічення з не більше ніж 12 амінокислотних залишків, де цей поліпептид є здатним знижувати рівень глюкози у крові у ссавця; або (с) амінотермінальне усічення з не більше ніж 8 амінокислотних залишків і карбоксил-термінальне усічення з не більше ніж 12 амінокислотних залишків, де цей поліпептид є здатним знижувати рівень глюкози у крові у ссавця. Даний винахід додатково пропонує виділений злитий білок, який може включати: (а) IgG постійний домен; (b) лінкерну послідовність, зрощену з IgG постійним доменом; і (с) мутант FGF21, який зрощений з лінкерною послідовністю і включає амінокислотну послідовність SEQ ID №: 4, де аргініновий залишок було замінено на лейциновий залишок в позиції 98, а гліциновий залишок було замінено на проліновий залишок в позиції 171. В одному варіанті здійснення лінкерна послідовність може являти собою GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID №: 23), а в іншому IgG постійний домен може являти собою SEQ ID №: 13. В іншому варіанті здійснення лінкерна послідовність являє собою GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID №: 23), а IgG постійний домен являє собою SEQ ID №: 13. В ще іншому варіанті здійснення N-кінець лінкеру є зрощеним з Скінцем IgG постійного домену, а N-кінець мутанту FGF21 є зрощеним з С-кінцем лінкеру. Описані злиті білки можуть бути мультимерами. В різних варіантах здійснення злитого білку компонент мутант FGF21 може включати щонайменше одне амінокислотне заміщення, а саме: (а) фенілаланін, пролін, аланін, серин чи гліцин в позиції 179; (b) глютамінова кислота, гліцин, пролін чи серин в позиції 180; або (с) лізин, гліцин, треонін, аланін, лейцин чи пролін в позиції 181, і може додатково включати від 1 до 10 амінокислотних залишків, зрощених з С-кінцем мутанту FGF21, і ці від 1 до 10 амінокислотних залишків можуть бути будь-якою амінокислотою, наприклад одним чи більше залишками, вибраними з групи, що містить гліцин, пролін та їх комбінації. В ще інших варіантах здійснення злитого білку компонент мутант FGF21 може включати: (а) аміно-термінальне усічення з не більше ніж 8 амінокислотних залишків, де цей поліпептид є здатним знижувати рівень глюкози у крові у ссавця; (b) карбоксил-термінальне усічення з не більше ніж 12 амінокислотних залишків, де цей поліпептид є здатним знижувати рівень глюкози у крові у ссавця; або (с) аміно-термінальне усічення з не більше ніж 8 амінокислотних залишків і карбоксил-термінальне усічення з не більше ніж 12 амінокислотних залишків, де цей поліпептид є здатним знижувати рівень глюкози у крові у ссавця. В іншому варіанті здійснення компонент мутант FGF21 злитого білку може містити амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 85 % ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID №: 4, але в якій аргініновий і гліциновий залишки більше не модифікуються. Даний винахід пропонує також фармацевтичні композиції, що містять описаний тут злитий білок і фармацевтично прийнятний агент для приготування лікарської форми. Такі фармацевтичні композиції можуть бути використані у способі для лікування метаболічного розладу, який передбачає введення пацієнту, що потребує того, фармацевтичної композиції за цим винаходом. Метаболічні розлади, які можуть лікуватись, включають діабет і ожиріння. Також пропонуються виділені молекули нуклеїнової кислоти, кодуючі описаний тут злитий білок, а також вектори, що містять такі молекули нуклеїнової кислоти, і клітини-хазяї, що містять такі молекули нуклеїнової кислоти. 3 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Конкретні варіанти здійснення даного винаходу стануть більш зрозумілими з наступного докладного опису певних варіантів здійснення і формули винаходу. Короткий опис малюнків На Фіг. 1А-1В показані результати проби на активність ELK-люциферази, виконаної з мутантами FGF21 з усіченням 7-181 і 8-181 (Фіг. 1A) та мутантами FGF21 з усіченням 1-172, 1171, 1-169 і 1-164 (Фіг. 1B); на кожному малюнку показані результати, отримані з контрольним FGF21 людини. На Фіг. 2 показані результати проби на активність ELK-люциферази, виконаної з контрольним FGF21 людини та мутантами FGF21 з усіченням 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 і 1-149. На Фіг. 3 показані рівні глюкози у крові, визначені у мишей після ін'єкції PBS (фосфатносольовий буферний розчин) (залитий стовпчик), контрольного FGF21 людини (порожній стовпчик) або мутантів FGF21 з усіченням 8-181 (сірий стовпчик) чи 9-181 (фактурний стовпчик). На Фіг. 4 показаний відсоток змін рівнів глюкози у крові, визначених у мишей після ін'єкції PBS (залиті кружки), контрольного Fc-FGF21 (WT) (порожні кружки) чи усічених злитих білків FcFGF21, що містять амінокислотні залишки 5-181 (залиті трикутнички) чи 7-181 (порожні трикутнички). На Фіг. 5 показаний відсоток змін рівнів глюкози у крові, визначених у мишей після ін'єкції PBS (залиті кружки), контрольного Fc-FGF21 (WT) (порожні кружки) чи усічених злитих білків FcFGF21, що містять амінокислотні залишки 1-175 (залиті трикутнички) чи усіченого білку FcFGF21, що містить амінокислотні залишки 1-171 (порожні трикутнички). На Фіг. 6А-6D показані результати аналізу за допомогою рідинної хроматографії-мас спектрометрії (LC-MS) контрольного зразка Fc(5)FGF21 людини і зразків Fc(5)FGF21, взятих від мишей через 6 годин (Зразок D6; Фіг. 6B), 24 години (Зразок D24; Фіг. 6C) і 48 годин (Зразок D48; Фіг. 6D) після ін'єкції. На Фіг. 7А-7D показані результати аналізу за допомогою LC-MS контрольного зразка FGF21(3)Fc людини, отриманого від ссавця (Фіг. 7А) і зразків FGF21(3)Fc, взятих від мишей через 6 годин (Зразок Е6; Фіг. 7B), 24 години (Зразок Е24; Фіг. 7C) і 48 годин (Зразок Е48; Фіг. 7D) після ін'єкції. На Фіг. 8А-8D показані результати аналізу за допомогою LC-MS контрольного зразка Fc(15)FGF21 (Фіг. 8А) і зразків Fc(15)FGF21, взятих від мишей через 6 годин (Фіг. 8B), 24 години (Фіг. 8C) і 48 годин (Фіг. 8D) після ін'єкції. На Фіг. 9А-9D показані результати аналізу за допомогою LC-MS контрольного зразка FGF21(15)Fc (Фіг. 9А) і зразків FGF21(15)Fc, взятих від мишей через 6 годин (Фіг. 9B), 24 години (Фіг. 9C) і 48 годин (Фіг. 9D) після ін'єкції. На Фіг. 10А-10D показані сайти розщеплення, ідентифіковані за допомогою LC-MS зразка Fc(15)FGF21 (Фіг. 10А, SEQ ID №: 24) і зразка FGF21(15)Fc (Фіг. 10B, SEQ ID №: 25) злитих білків, введених мишам шляхом ін'єкції. На Фіг. 11 показані рівні глюкози у крові, визначені у мишей після ін'єкції PBS (залитий стовпчик), Fc(15)FGF21 (порожній стовпчик) чи мутантів Fc(15)FGF21 G170E (сірий стовпчик), Fc(15)FGF21 P171A (фактурний стовпчик), Fc(15)FGF21 S172L (діагонально заштрихований стовпчик), Fc(15)FGF21 G170E/P171A/S172L (горизонтально заштрихований стовпчик) чи Fc(15)FGF21 G151A (діагонально заштрихований стовпчик). На Фіг. 12 показано відсоток змін рівнів глюкози у крові, визначених у мишей після ін'єкції PBS (залиті кружки), Fc(15)FGF21 (порожні кружки) чи мутантів Fc(15)FGF21 – Fc(15)FGF21 G170E (залиті трикутнички), Fc(15)FGF21 P171A (порожні трикутнички), Fc(15)FGF21 S172L (залиті ромбики), Fc(15)FGF21 G170E/P171A/S172L (порожні ромбики) чи Fc(15)FGF21 G151A (залиті квадратики). На Фіг. 13 показані рівні глюкози у крові, визначені у мишей після ін'єкції PBS (залитий стовпчик), Fc(15)FGF21 (порожній стовпчик) чи мутантів Fc(15)FGF21 – Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V (сірий стовпчик), Fc(15)FGF21 G170E (діагонально заштрихований стовпчик), Fc(15)FGF21 G170E/P171A (сірий діагонально заштрихований стовпчик) чи Fc(15)FGF21 G170E/S172L (діагонально заштрихований стовпчик). На Фіг. 14 показано відсоток змін рівнів глюкози у крові, визначених у мишей після ін'єкції PBS (залиті квадратики), Fc(15)FGF21 (порожні квадратики) чи мутантів Fc(15)FGF21 – Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V (залиті перевернені трикутнички), Fc(15)FGF21 G170E (порожні перевернені трикутнички), Fc(15)FGF21 G170E/P171A (залиті кружки) чи Fc(15)FGF21 G170E/S172L (порожні кружки). На Фіг. 15 показані рівні глюкози у крові, визначені у мишей після ін'єкції PBS (залитий стовпчик) чи мутантів Fc(15)FGF21 – Fc(15)FGF21 G170E (порожній стовпчик), Fc(15)FGF21 5 4 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 G170A (сірий стовпчик), Fc(15)FGF21 G170C (діагонально заштрихований стовпчик), Fc(15)FGF21 G170D (сірий і білий стовпчик), Fc(15)FGF21 G170N (залитий діагонально заштрихований стовпчик) чи Fc(15)FGF21 Gl 70S (діагонально заштрихований стовпчик). На Фіг. 16 показано відсоток змін рівнів глюкози у крові, визначених у мишей після ін'єкції PBS (залиті кружки) чи мутантів Fc(15)FGF21 – Fc(15)FGF21 G170E 10 (порожні кружки), Fc(15)FGF21 G170A (залиті трикутнички), Fc(15)FGF21 G170C (порожні трикутнички), Fc(15)FGF21 G170D (залиті ромбики), Fc(15)FGF21 G170C (порожні ромбики) чи Fc(15)FGF21 G170S (залиті перевернені трикутнички). На Фіг. 17 показані рівні глюкози у крові, визначені у мишей після ін'єкції PBS (залитий стовпчик) чи мутантів Fc(15)FGF21 – Fc(15)FGF21 G170E (порожній стовпчик), Fc(15)FGF21 15 P171E (сірий стовпчик), Fc(15)FGF21 P171H (залитий діагонально заштрихований стовпчик), Fc(15)FGF21 P171Q (поперечно заштрихований стовпчик), Fc(15)FGF21 P171T (фактурний стовпчик) чи Fc(15)FGF21 P171Y (сірий поперечно заштрихований стовпчик). На Фіг. 18 показано відсоток змін рівнів глюкози у крові, визначених у мишей після ін'єкції PBS (залиті кружки) чи мутантів Fc(15)FGF21 – Fc(15)FGF21 G170E 10 (порожні кружки), Fc(15)FGF21 P171E (залиті трикутнички), Fc(15)FGF21 P171H (порожні трикутнички), Fc(15)FGF21 P171Q (залиті ромбики), Fc(15)FGF21 P171T (порожні ромбики) чи Fc(15)FGF21 P171Y (залиті квадратики). На Фіг. 19А-19D показані результати аналізу за допомогою LC-MS контрольного зразка Fc(15)FGF21 (Фіг. 19А) і зразків Fc(15)FGF21, взятих від мишей через 6 годин (Фіг. 19B), 24 години (Фіг. 19C) і 48 годин (Фіг. 19D) після ін'єкції. На Фіг. 20А-20D показані результати аналізу за допомогою LC-MS контрольного зразка Fc(15)FGF21 G170E (Фіг. 20А) і зразків Fc(15)FGF21 G170E, взятих від мишей через 6 годин (Фіг. 20B), 24 години (Фіг. 20C) і 48 годин (Фіг. 20D) після ін'єкції. На Фіг. 21А-21D показані результати аналізу за допомогою LC-MS контрольного зразка Fc(15)FGF21 P171A (Фіг. 21А) і зразків Fc(15)FGF21 P171A, взятих від мишей через 6 годин (Фіг. 21B), 24 години (Фіг. 21C) і 48 годин (Фіг. 21D) після ін'єкції. На Фіг. 22А-22D показані результати аналізу за допомогою LC-MS контрольного зразка Fc(15)FGF21 S172L (Фіг. 21А) і зразків Fc(15)FGF21 S172L, взятих від мишей через 6 годин (Фіг. 22B), 24 години (Фіг. 22C) і 48 годин (Фіг. 22D) після ін'єкції. На Фіг. 23А-23D показані ідентифіковані за допомогою LC-MS сайти розщеплення злитих білків Fc(15)FGF21 (Фіг. 23A, SEQ ID №: 24), Fc(15)FGF21 G170E (Фіг. 23B, SEQ ID №: 26), Fc(15)FGF21 P171A (Фіг. 23C, SEQ ID №: 27) і Fc(15)FGF21 S172L (Фіг. 23D, SEQ ID №: 28), введених мишам шляхом ін'єкції. На Фіг. 24А-24С показані результати проби на активність ELK-люциферази, виконаної з мутантами FGF21 – FGF21 L99R, FGF21 L99D і FGF21 A111T (Фіг. 24A); мутантами FGF21 FGF21 A129D, FGF21 A129Q і FGF21 A134K (Фіг. 24B); і мутантами FGF21 FGF21 A134Y, FGF21 A134E і FGF21 A129K (Фіг. 24C); на кожному малюнку показані результати, отримані з контрольним FGF21 людини. На Фіг. 25А-25D показані результати проби на активність ELK-люциферази, виконаної з мутантами Fc-FGF21 – Fc-FGF21 P171G, Fc-FGF21 P171S і Fc-FGF21 P171T (Фіг. 25A); мутантами Fc-FGF21 – Fc-FGF21 P171Y, Fc-FGF21 P171W, and Fc-FGF21 P171C (Фіг. 25B); Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 A45K/G170E and FGF21 A45K (Фіг. 25С); і Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 P171E, and Fc(15)FGF21 A45K/G170E (Фіг. 25D); на кожному малюнку показані результати, отримані з контрольним FGF21 людини. На Фіг. 26А-В показана агрегація як функція часу для зрілого FGF21 дикого типу і різних мутантів FGF21; на Фіг. 26А показана зміна відсотку агрегації для контрольного FGF21 (WT, залиті ромбики) і FGF21 A45K (залиті кружки) після інкубації 65 мг/мл білку при 4 °C впродовж 1, 2 і 4 днів; на Фіг. 26А показана зміна відсотку агрегації для контрольного FGF21 (WT) та FGF21 P78C, P78R, L86T, L86R, L98C, L98R, A111T, A129D, A129Q, A129K, A134K, A134Y і A134E (всі є позначеними на малюнку) після інкубації 65 мг/мл білку при 4 °C впродовж 1, 6 і 10 днів. На Фіг. 27 показані результати проби на активність ELK-люциферази, виконаної з контрольним FGF21 людини і мутантами FGF21 – FGF21 A45K, FGF21 L52T і FGF21 L58E. На Фіг. 28А графічно представлена зміна рівнів агрегації для мутантів Fc(15)FGF21 – Fc(15)FGF21 6-181/G170E (залиті ромбики), Fc(15)FGF21 A45K/G170E (порожні квадратики), Fc(15)FGF21 P171E (залиті трикутнички), Fc(15)FGF21 P171A (хрестики), Fc(15)FGF21 G170E (порожні трикутнички) і контрольного FGF21 (залиті кружки) після інкубації при 4 °C впродовж 1, 4 і 8 днів; на Фіг. 28В результати інкубації представлені у вигляді діаграми. На Фіг. 29 показані рівні глюкози у крові, визначені у мишей після ін'єкції PBS (розчинник) (залиті кружки) чи мутантів Fc(15)FGF21 – Fc(15)FGF21 A45K/G170E (порожні кружки), 5 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Fc(15)FGF21 A45K/P171G (залиті трикутнички) чи Fc(15)FGF21 L98R/P171G (порожні трикутнички). На Фіг. 30 графічно представлені результати проби на активність ELK-люциферази, виконаної з FGF21 людини (залиті кружки, суцільна лінія), Fc-FGF21 (порожні кружки, суцільна лінія) і Fc-FGF21 L98R/P171G (залиті трикутнички, пунктирна лінія). На Фіг. 31 графічно представлено відсоток агрегатів з високою молекулярною вагою, який спостерігався після 9 днів при кімнатній температурі (Фіг. 31А) і при 4 °C (Фіг. 31В) для FGF21 (залиті кружки, суцільна лінія), Fc-FGF21 (порожні кружки, суцільна лінія) і Fc-FGF21 L98R/P171G (залиті трикутнички, пунктирна лінія). На Фіг. 32 представлена серія записів мас-спектрометрії MALDI, яка показує зміни, що спостерігаються в Fc-FGF21 L98R/P171G через різні інтервали впродовж 168-годинного періоду. На Фіг. 33 графічно показано відсоток змін рівнів глюкози у крові мишей ob/ob для контролю (PBS, порожні кружки), зрілого FGF21 дикого типу (залиті квадратики) і мутантів FGF21 – L98R, P171G (перевернені залиті трикутнички); L98R, P171G, 182P (порожні ромбики) і L98R, P171G, 182G (залиті кружки). На Фіг. 34 графічно показано відсоток змін рівнів глюкози у крові мишей ob/ob для контролю (залиті кружки) і мутантів FGF21 – L98R, P171G (залиті трикутнички); L98R, P171G, 182G, 183G (порожні трикутнички) і L98R, P171G, 182Р (порожні ромбики). На Фіг. 35 графічно показано відсоток змін рівнів глюкози у крові мишей ob/ob для PBS контролю (порожні кружки) і мутантів FGF21 – L98R, P171G (залиті квадратики); L98R, P171G, Y179S (порожні трикутнички), L98R, P171G, Y179A (перевернені залиті трикутнички), L98R, P171G, 180S (порожні ромбики) і L98R, P171G, A180G (залиті кружки). На Фіг. 36 графічно показано відсоток змін рівнів глюкози у крові мишей ob/ob для PBS контролю (залиті кружки) і мутантів FGF21 – L98R, P171G (порожні квадратики); L98R, P171G, Y179F (залиті трикутнички) і L98R, P171G, A180Е (порожні ромбики). На Фіг. 37 схематично представлена постановка 6-тижневого дослідження на Rhesus мавпах, яке передбачало ескалацію дози. Затінені позначення стосуються зразків крові, взятих натще, а фактурні позначення – зразків крові, взятих в нагодованому стані. На Фіг 38А-D представлена серія графіків, які показують, як макаки-резус були рандомізовані на профілі OGTT (оральний тест на переносимість глюкози), площу під кривими OGTT і вагу тіла. На Фіг 38А показані вихідні рівні глюкози в OGTT1, залитий квадратик відповідає групі А, залитий кружок, суцільна лінія відповідає групі В і порожній кружок, пунктирна лінія відповідає групі С до розподілення груп на розчинник чи активні сполуки. На Фіг 38А показані вихідні рівні глюкози в OGTT2, залитий квадратик відповідає групі А, залитий кружок, суцільна лінія відповідає групі В і порожній кружок, суцільна лінія відповідає групі С до розподілення груп на розчинник чи активні сполуки. На Фіг 38С вихідні рівні глюкози для OGTT1 і OGTT2 показані через ППК: фактурний стовпчик відповідає групі А, затінений стовпчик відповідає групі В, а порожній стовпчик відповідає групі С. Фіг. 38D показує вихідну вагу тіла: фактурний стовпчик відповідає групі А, затінений стовпчик відповідає групі В, а порожній стовпчик відповідає групі С. На Фіг. 39 графічно представлений вплив розчинника, FGF21 і Fc-FGF21(RG) на вагу тіла у макак-резус; затінені стовпчики 1 і 2 відповідають тижням 1 і 2 на низькій дозі, порожні стовпчики 3 і 4 відповідають тижням 3 і 4 на середній дозі, а залиті стовпчики 5 і 6 відповідають тижням 5 і 6 на високій дозі; фактурні стовпчики 7, 8 і 9 відповідають тижням 7-9 під час періоду вимивання. На Фіг. 40 наведено графік, який показує відсоток зміни інсуліну натще по відношенню до вихідних рівнів у макак-резус на розчиннику, FGF21 і Fc-FGF21(RG) натще; затінені стовпчики 1 і 2 відповідають тижням 1 і 2 на низькій дозі, порожні стовпчики 3 і 4 відповідають тижням 3 і 4 на середній дозі, а залиті стовпчики 5 і 6 відповідають тижням 5 і 6 на високій дозі, а фактурні стовпчики 7 і 8 відповідають тижням 7 і 8 під час періоду вимивання. На Фіг. 41 наведено графік, який показує вплив розчиннику, FGF21 і Fc-FGF21(RG) у високих дозах на рівень інсуліну в нагодованому стані у макак-резус під час 5 і 6 тижнів дослідження; залиті стовпчики відповідають тижню 5, а затінені – тижню 6. На Фіг. 42 наведено графік, який показує профілі глюкози в OGTT5, проведеному в кінці двотижневого періоду на високій дозі Fc-FGF21(RG); залиті кружки, суцільна лінія відповідає розчиннику; порожній квадратик, пунктирна лінія відповідає FGF21; і залитий трикутник, суцільна лінія відповідає Fc-FGF21(RG). На Фіг. 43 наведено графік, який показує профілі інсуліну в OGTT5, проведеному в кінці двотижневого періоду на високій дозі Fc-FGF21(RG); залиті кружки, суцільна лінія відповідає 6 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розчиннику; порожній квадратик, пунктирна лінія відповідає FGF21; і залитий трикутник, суцільна лінія відповідає Fc-FGF21(RG). На Фіг. 44 наведено графік, який показує ППК1-3 для глюкози при OGTT у макак-резус в кінці кожного дозового періоду (на низькій, середній і високій дозі); порожні стовпчики відповідають ППК3, визначеній для показників глюкози при OGTT3, залиті стовпчики відповідають ППК4, визначеній для показників глюкози при OGTT4, і затінені стовпчики відповідають ППК5, визначеній для показників глюкози при OGTT5. На Фіг. 45 наведено графік, який показує вплив розчиннику, FGF21 і Fc-FGF21(RG) на відсоток зміни від вихідних показників рівні тригліцеридів натще в кожній групі макак-резус; затінені стовпчики 1 і 2 відповідають тижням 1 і 2 на низькій дозі, порожні стовпчики 3 і 4 відповідають тижням 3 і 4 на середній дозі, а залиті стовпчики 5 і 6 відповідають тижням 5 і 6 на високій дозі; фактурні стовпчики 7, 8 і 9 відповідають тижням 7-9 під час періоду вимивання. На Фіг. 46 наведено графік, який показує рівні тригліцеридів у плазмі в кожній групі макакрезус, визначені під час п'ятого і шостого тижнів дослідження на високих дозах розчиннику, FGF21 і Fc-FGF21(RG); затінені стовпчики відповідають тижню 5, а залиті – тижню 6. На Фіг. 47 наведено графік, який показує рівні FGF21 у окремої мавпи, визначені до введення препаратів і через 5, 12, 19 і 26 днів після введення, причому зразки брались приблизно через 21 годину після кожної ін'єкції. На Фіг. 48 наведено графік, який показує рівні Fc-FGF21(RG) у окремої мавпи, визначені до введення препаратів і через 5, 12, 19 і 26 днів після введення, причому зразки брались приблизно через 5 днів після кожної ін'єкції. На Фіг. 49 наведено графік, який показує середні концентрації FGF21 і Fc-FGF21(RG), визначені за результатами трьох OGTT, проведених після кожного з періодів на низькій, середній і високій дозах; затінені стовпчики відповідають OGTT3 на низькій дозі, залиті стовпчики відповідають OGTT4 на середній дозі і порожні стовпчики відповідають OGTT5 на високій дозі. Докладний опис винаходу Білок FGF21 людини з посиленими властивостями, такими як подовжений період напівжиття та/або зменшена агрегація, може бути отриманий за допомогою способів, описаних тут, і стандартних методів молекулярної біології. Факультативно, період напівжиття може бути ще більше подовжений шляхом зрощення антитіла чи його частини з N-термінальним чи Стермінальним кінцем послідовності FGF21 дикого типу. Можливо також подовжити період напівжиття чи зменшити агрегацію білку FGF21 дикого типу шляхом введення в цей білок амінокислотних заміщень. Такі модифіковані білки називаються тут мутантами чи мутантами FGF21 і саме вони становлять варіанти здійснення даного винаходу. Методи рекомбінантних нуклеїнових кислот, використовувані тут, в тому числі в Прикладах, є загалом тими, що наведені в довіднику Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) або в книзі Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994), обидва включені в даний опис за посиланням для будь-якої мети. 1. Загальні дефініції Термін "виділена молекула нуклеїнової кислоти" стосується молекули нуклеїнової кислоти за цим винаходом, яку (1) було відділено від щонайменше приблизно 50 % білків, ліпідів, вуглеводнів чи інших матеріалів, з якими вона природно знаходиться, коли загальна нуклеїнова кислота виділяється з клітин-джерел; яка (2) не зв'язана зі всім полінуклеотидом чи його частиною, з якими "виділена молекула нуклеїнової кислоти" зв'язана у природі; яка (3) функціонально зв'язана з полінуклеотидом, з яким вона не зв'язується у природі; яка (4) не трапляється у природі як частина більшої полінуклеотидної послідовності. Переважно, виділена молекула нуклеїнової кислоти за цим винаходом є суттєво вільною від будь-яких інших контамінуючих молекул нуклеїнової кислоти чи інших контамінантів, які знаходяться в їх природному оточенні і які могли б перешкоджати її використанню в отриманні поліпептидів чи в її терапевтичних, діагностичних, профілактичних чи науково-дослідних застосуваннях. Термін "вектор" використовується для позначення будь-якої молекули (наприклад, нуклеїнової кислоти, плазміди чи вірусу), використовуваної для передачі кодуючої інформації клітині-хазяїну. Термін "вектор експресії" стосується вектору, що є придатним для трансформації клітинихазяїна і містить послідовності нуклеїнових кислот, які спрямовують та/або контролюють експресію вставлених гетерологічних послідовностей нуклеїнових кислот. Експресія включає, не обмежуючись ними, такі процеси, як транскрипція, трансляція і сплайсинг РНК, коли присутні інтрони. 7 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "функціонально зв'язаний" використовується тут для позначення розміщення фланкуючих послідовностей, коли ці фланкуючі послідовності мають таку конфігурацію чи так складені, щоб виконувати свою звичайну функцію. Отже, фланкуюча послідовність, функціонально зв'язана з кодуючою послідовністю, може бути здатною здійснювати реплікацію, транскрипцію та/або трансляцію кодуючої послідовності. Наприклад, кодуюча послідовність є функціонально зв'язаною з промотором, коли промотор є здатним спрямовувати транскрипцію цієї кодуючої послідовності. Фланкуюча послідовність не обов'язково має бути стичною з кодуючою послідовністю, доки вона функціонує правильно. Так, наприклад, проміжні, досі не трансльовані послідовності можуть бути присутніми між послідовністю промотору і кодуючою послідовністю, і послідовність промотору все-таки може вважатись "функціонально зв'язаною" з кодуючою послідовністю. Термін "клітина-хазяїн" використовується для позначення клітини, яку було трансформовано або яка є здатною бути трансформованою послідовністю нуклеїнової кислоти, щоб потім експресувати потрібний ген, що становить інтерес. Цей термін включає потомство материнської клітини незалежно від того, чи є це потомство ідентичним по морфології чи по генетичним характеристикам з вихідною материнською клітиною, доки є присутнім потрібний ген. Термін "виділений поліпептид" стосується поліпептиду за цим винаходом, який (1) було відділено від щонайменше приблизно 50 % білків, ліпідів, вуглеводнів чи інших матеріалів, з якими вона природно знаходиться, коли загальна нуклеїнова кислота виділяється з клітиниджерела; (2) не зв'язаний (ковалентним чи не ковалентним зв'язком) зі всім поліпептидом чи його частиною, з якими "виділений поліпептид" зв'язаний у природі; (3) функціонально зв'язаний (ковалентним чи не ковалентним зв'язком) з поліпептидом, з яким він не зв'язується у природі; або (4) не трапляється у природі. Переважно, виділений поліпептид є суттєво вільним від інших контамінуючих поліпептидів чи інших контамінантів, які знаходяться в їх природному оточенні і які могли б перешкоджати її використанню в отриманні поліпептидів чи в її терапевтичних, діагностичних, профілактичних чи науково-дослідних застосуваннях. Термін "такі, що трапляються у природі", коли використовується у зв'язку з біологічними матеріалами, такими як молекули нуклеїнової кислоти, поліпептиди, клітини-хазяї і т.п., стосується матеріалів, які знаходять у природі і які не піддавались маніпуляціям людиною. Подібно до цього, "такі, що не трапляються у природі", як цей термін тут використовується, стосується матеріалів, які не знаходять у природі або які були модифіковані структурно чи синтезовані людиною. При використанні у зв'язку з нуклеотидами термін "такі, що трапляються у природі" стосується основ аденіну (А), цитокіну (С), гуаніну (G), тиміну (T) і урацилу (U). При використанні у зв'язку з амінокислотами термін "такі, що трапляються у природі" стосується 20 амінокислот аланіну (A), цистеїну (C), аспарагінової кислоти (D), глютамінової кислоти (E), фенілаланіну (F), гліцину (G), гістидину (H), ізолейцину (I), лізину (K), лейцину (L), метіоніну (M), аспарагіну (N), проліну (P), глютаміну (Q), аргініну (R), серину (S), треоніну (T), валіну (V), триптофану (W) і тирозину (Y). Термін "поліпептид FGF21" стосується природного поліпептиду дикого типу, який експресується у людей. Для цілей даного опису термін "поліпептид FGF21" може використовуватись взаємозамінно, щоб стосуватись будь-якого поліпептиду FGF21 повної довжини, наприклад з послідовністю SEQ ID №: 2, яка містить 209 амінокислотних залишків і яка кодується нуклеотидною послідовністю SEQ ID №: 1; будь-якої зрілої форми цього поліпептиду, наприклад з послідовністю SEQ ID №: 4, яка містить 181 амінокислотний залишок, яка кодується нуклеотидною послідовністю SEQ ID №: 3 і в якій було видалено 28 амінокислотних залишків на аміно-термінальному кінці поліпептиду FGF21 повної довжини (тобто, які складають сигнальний пептид), та їх варіанти. Терміни "поліпептид-мутант FGF21" і "мутант FGF21" стосуються варіанту поліпептиду FGF21, в якому природну амінокислотну послідовність FGF21 було модифіковано. Такі модифікації включають, не обмежуючись ними, одне чи більше амінокислотне заміщення, включаючи заміщення аналогами амінокислот, які не трапляються у природі, і усічення. Так, поліпептид-мутант FGF21 включає, не обмежуючись ними, спрямовані на сайт мутанти FGF21, усічені поліпептиди FGF21, стійкі до протеолізу мутанти FGF21, мутанти FGF21, що зменшують агрегацію, комбінаційні мутанти FGF21 і злиті білки FGF21, як тут описується. Для цілей ідентифікації конкретних усічень і амінокислотних заміщень в мутантах FGF21 за цим винаходом нумерація амінокислотних залишків, усічених чи мутованих, відповідає нумерації зрілого поліпептиду FGF21 зі 181 залишком. В інших варіантах здійснення даного винаходу поліпептид-мутант FGF21 містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 85 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID №: 4, але в якій ті конкретні залишки, що забезпечують бажану 8 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 властивість поліпептиду-мутанту FGF21, наприклад стійкість до протеолізу, подовжений період напівжиття чи зменшена агрегація та їх комбінації, не піддаються подальшій модифікації. Іншими словами, за виключенням залишків в послідовності мутанту FGF21, які були модифіковані, щоб забезпечити стійкість до протеолізу, зменшену агрегацію чи інші властивості, можуть бути модифіковані приблизно 15 % всіх інших амінокислотних залишків в послідовності мутанту FGF21. Наприклад, в мутанті FGF21 Q173E можна модифікувати до 15 % всіх амінокислотних залишків, крім залишку глютамінової кислоти, який було заміщено на глютамін в позиції 173. В ще інших варіантах здійснення поліпептид-мутант FGF21 містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше приблизно на 90 % чи приблизно на 95, 96, 97, 98 чи 99 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID №: 4, але в якій конкретні залишки, що забезпечують поліпептиду-мутанту FGF21 стійкість до протеолізу чи зменшену агрегацію не піддавались подальшій модифікації. Такі поліпептиди-мутанти FGF21 володіють щонайменше однією активністю поліпептиду FGF21 дикого типу. Даний винахід охоплює також молекулу нуклеїнової кислоти, кодуючу поліпептид-мутант FGF21, що містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше приблизно на 85 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID №: 4, але в якій конкретні залишки, що забезпечують бажану властивість поліпептиду-мутанту FGF21, наприклад стійкість до протеолізу, подовжений період напівжиття чи зменшену агрегацію, не піддавались подальшій модифікації. Іншими словами, за виключенням нуклеотидів, що кодують залишки в послідовності мутанту FGF21, які були модифіковані, щоб забезпечити стійкість до протеолізу, зменшену агрегацію чи інші властивості, можуть бути модифікованими приблизно 15 % всіх інших нуклеотидів в послідовності мутанту FGF21. Наприклад, в мутанті FGF21 Q173E до 15 % всіх нуклеотидів, крім тих, що кодують залишок глютамінової кислоти, який було замінено на глютамін в позиції 173, можуть бути модифікованими. Даний винахід охоплює також молекулу нуклеїнової кислоти, кодуючу поліпептид-мутант FGF21, що містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше приблизно на 90 % або приблизно на 95, 96, 97, 98 чи 99 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID №: 4, але в якій конкретні залишки, що забезпечують поліпептиду-мутанту FGF21 стійкість до протеолізу чи зменшену агрегацію, не піддавались подальшій модифікації. Такі мутанти FGF21 володіють щонайменше однією активністю поліпептиду FGF21 дикого типу. Даний винахід охоплює також молекулу нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка є щонайменше приблизно на 85 % ідентичною нуклеотидній послідовності SEQ ID №: 3, але в якій нуклеотиди, кодуючі амінокислотні залишки, що забезпечують кодованому поліпептиду-мутанту FGF21, наприклад стійкість до протеолізу, зменшену агрегацію чи інші властивості, не піддавались подальшій модифікації. Іншими словами, за виключенням залишків в послідовності мутанту FGF21, які були модифіковані, щоб забезпечити стійкість до протеолізу, зменшену агрегацію чи інші властивості, можуть бути модифікованими приблизно 15 % всіх інших амінокислотних залишків в послідовності мутанту FGF21. Наприклад, в мутанті FGF21 Q173E до 15 % всіх амінокислотних залишків, крім залишку глютамінової кислоти, який було замінено на глютамін в позиції 173, можуть бути модифікованими. Даний винахід охоплює також молекулу нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка є щонайменше приблизно на 90 % або приблизно на 95, 96, 97, 98 чи 99 % ідентичною нуклеотидній послідовності SEQ ID №: 3, але в якій нуклеотиди, кодуючі амінокислотні залишки, що забезпечують поліпептиду-мутанту FGF21 стійкість до протеолізу чи зменшену агрегацію, не піддавались подальшій модифікації. Такі молекули нуклеїнової кислоти кодують поліпептидимутанти FGF21, які володіють щонайменше однією активністю поліпептиду FGF21 дикого типу. Термін "біологічно активний поліпептид-мутант FGF21" стосується будь-якого описаного тут поліпептиду-мутанту FGF21, який володіє активністю поліпептиду FGF21 дикого типу, такою як здатність знижувати рівень глюкози, інсуліну, тригліцеридів чи холестерину у крові; зменшувати вагу тіла; поліпшувати толерантність до глюкози, енергетичні витрати чи чутливість до інсуліну, незалежно від типу чи кількості модифікацій, які були введені в поліпептид-мутант FGF21. Поліпептиди-мутанти FGF21, які володіють дещо зниженим рівнем активності FGF21 відносно поліпептиду FGF21 дикого типу, можуть тим не менш вважатись біологічно активними поліпептидами-мутантами FGF21. Терміни "ефективна кількість" і "терапевтично ефективна кількість" стосуються кількості поліпептиду-мутанту FGF21, яка використовується для підтримання спостережуваного рівня однієї чи більше біологічної активності поліпептиду FGF21 дикого типу, такої як здатність знижувати рівень глюкози, інсуліну, тригліцеридів чи холестерину у крові; зменшувати вагу тіла; поліпшувати толерантність до глюкози, енергетичні витрати чи чутливість до інсуліну. 9 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "фармацевтично прийнятний носій" чи "фізіологічно прийнятний носій", як він тут використовується, стосується одного чи більше матеріалів рецептури препарату, придатних для здійснення чи посилення доставки поліпептиду-мутанту FGF21. Термін "антиген" стосується молекули чи частини молекули, яка здатна зв'язуватись антитілом і, додатково, яка здатна бути використаною у тварини для продукції антитіл, що здатні зв'язуватись з епітопом цього антигену. Антиген може мати один чи більше епітопів. Термін "нативний Fс" стосується молекули чи послідовності, що є послідовністю не антигензв'язуючого фрагменту, який є результатом розщеплення цільного антитіла чи отриманий іншим способом, в мономерній чи мультимерній формі, і може містити шарнірну ділянку. Вихідне імуноглобулінове джерело нативного Fc переважно має людське походження і може бути будьяким з імуноглобулінів, хоча кращими є IgG1 і IgG2. Нативні молекули Fс складаються з мономерних поліпептидів, які можуть бути зв'язаними в димерні чи мультимерні форми ковалентним (наприклад, дисульфідні зв'язки) і не ковалентним зв'язком. Кількість міжмолекулярних дисульфідних зв'язків між мономерними субодиницями нативних молекул Fс становить від 1 до 4 в залежності від класу (наприклад, IgG, IgA, and IgE) чи підкласу (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 і IgGA2). Одним прикладом нативного Fс є димер з дисульфідним зв'язком, що є результатом розщеплення IgG папаїном (дивись Ellison et al., 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). Термін "нативний Fс", як він тут використовується, є родовим для мономерних, димерних і мультимерних форм. Приклад поліпептидної послідовності Fс представлений в SEQ ID №: 13. Термін "варіант Fс" стосується молекули чи послідовності, яку модифіковано з нативної Fс, але яка все ще містить сайт зв'язування для рецептору реутилізації, FcRn (неонатальний Fc рецептор). Міжнародні публікації №№: WO 97/34631 і WO 96/32478 описують показові варіанти Fc, а також взаємодію з рецептором реутилізації і вважаються включеними в цей опис за посиланням. Отже, термін "варіант Fс" може включати молекулу чи послідовність, які були гуманізовані з нелюдського нативного Fc. Більш того, нативний Fc містить ділянки, які можуть бути видалені, оскільки вони забезпечують структурні особливості чи біологічну активність, які не є необхідними для злитих молекул мутантів FGF21 за цим винаходом. Отже, термін "варіант Fс" означає молекулу чи послідовність, яка не має одного чи більше сайтів чи залишків нативного Fc або в якому один чи більше сайтів чи залишків Fc були модифіковані, що впливає на (чи є задіяним в): (1) утворення дисульфідного зв'язку, (2) несумісність з обраною клітиноюхазяїном, (3) N-термінальну гетерогенність після експресії в обраній клітині-хазяїні, (4) глікозилювання, (5) взаємодію з комплементом, (6) зв'язування з Fc рецептором, іншим ніж рецептор реутилізації, (7) антитіло-залежну клітинну цитотоксичність (ADCC). Варіанти Fc далі будуть описані більш докладно. Термін "Fc домен" охоплює нативний Fc і варіанти Fc і послідовності, як було визначено раніше. У випадку молекул нативного Fc і варіантів Fc термін "Fc домен" включає молекули в мономерній чи мультимерній формі незалежно від того, відщеплені вони від цільного антитіла чи отримані у інший спосіб. В певних варіантах здійснення даного винаходу Fc домен може бути злитим з FGF21 чи мутантом FGF21 (включаючи усічену форму FGF21 чи мутанту FGF21) через, наприклад, ковалентний зв'язок між Fc доменом і послідовністю FGF21. Такі злиті білки можуть утворювати мультимери через асоціацію Fc доменів, і як ці злиті білки, так і їх мультимери є елементом новизни даного винаходу. 2. Сайт-специфічні мутанти FGF21 Термій "сайт-специфічний мутант FGF21" чи "заміщений мутант FGF21" стосується поліпептиду-мутанту FGF21, що має амінокислотну послідовність, яка відрізняється від амінокислотної послідовності поліпептидної послідовності FGF21, що трапляється у природі, наприклад SEQ ID №№: 2 і 4 та їх варіанти. Сайт-специфічні мутанти FGF21 можуть утворюватись шляхом введення амінокислотних заміщень, консервативних чи не консервативних, і використання амінокислот природного чи неприродного походження в конкретних позиціях поліпептиду FGF21. "Консервативне амінокислотне заміщення" може включати заміщення нативного амінокислотного залишку (тобто, залишку, що знаходиться в даній позиції послідовності поліпептиду FGF21 дикого типу) не нативним залишком (тобто, залишком, що не знаходиться в даній позиції послідовності поліпептиду FGF21 дикого типу), так що це не має впливу чи має незначний вплив на полярність чи заряд амінокислотного залишку в цій позиції. Консервативні амінокислотні заміщення охоплюють також амінокислотні залишки, що не трапляються в природі, які типово включаються під час хімічного синтезу пептидів, а не шляхом синтезу в біологічних системах. Вони включають пептидоміметики та інші зворотні чи перевернені форми амінокислотних фрагментів. 10 UA 102395 C2 5 10 Залишки, що трапляються у природі, можна поділити на класи на основі спільних властивостей бокових ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) нейтральні гідрофільні: Cys, Ser, Thr; (3) кислотні: Asp, Glu; (4) основні: Asn, Gin, His, Lys, Arg; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: Gly, Pro; і (6) ароматичні: Trp, Tyr, Phe. Консервативні заміщення можуть включати обмін представника одного з цих класів на іншого представника того самого класу. Неконсервативні заміщення включати обмін представника одного з цих класів на представника іншого класу. Бажані амінокислотні заміщення (консервативні чи неконсервативні) можуть визначатись спеціалістами в цій галузі на момент, коли такі заміщення є бажаними. Показовий (не обмежуючий) перелік амінокислотних заміщень наведено в Таблиці 1. 15 Таблиця 1 Амінокислотні заміщення Вихідний залишок Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His lie Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val 20 25 30 Показове заміщення Val, Leu, lie Lys, Gin, Asn Gln Glu Ser, Ala Asn Asp Pro, Ala Asn, Gin, Lys, Arg Leu, Val, Met, Ala, Phe lie, Val, Met, Ala, Phe Arg, Gin, Asn Leu, Phe, lie Leu, Val, lie, Ala, Tyr Ala Thr, Ala, Cys Ser Tyr, Phe Trp, Phe, Thr, Ser lie, Met, Leu, Phe, Ala 3. Усічені поліпептиди FGF21 Один варіант здійснення даного винаходу стосується усічених форм зрілого поліпептиду FGF21. Цей варіант виник з намагання ідентифікувати усічені поліпептиди FGF21, що є здатними забезпечити активність подібного, а в певних випадках і вищого, ступеня, ніж активність не усічених форм зрілого поліпептиду FGF21. Як він тут використовується, термін "усічений поліпептид FGF21" стосується поліпептиду FGF21, в якому амінокислотні залишки були видалені з аміно-термінального (чи Nтемінального) кінця поліпептиду FGF21, амінокислотні залишки були видалені з карбоксилтермінального (чи С-темінального) кінця поліпептиду FGF21 чи амінокислотні залишки були видалені з обох аміно-термінального і карбоксил-термінального кінців поліпептиду FGF21. Різні усічення, описані тут, були отримані, як викладено в Прикладах 3 і 6. Активність N-термінально усічених поліпептидів FGF21 і С-термінально усічених поліпептидів FGF21 може бути визначена в пробах на ELK-люциферазу in vitro, як описано в Прикладі 4. Конкретні деталі проб in vitro, які можуть бути використані для оцінки активності усічених поліпептидів FGF21, можна знайти в Прикладі 4. Активність усічених поліпептидів FGF21 за цим винаходом можна оцінити також за допомогою проби in vivo, такої як з використанням мишей ob/ob, як показано в Прикладах 5 і 7. Загалом, щоб оцінити активність in vivo усіченого поліпептиду FGF21, його можна ввести 11 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 піддослідній тварині інтраперитонеально. Після бажаного періоду інкубації (наприклад, через 1 годину чи більше) береться зразок крові для визначення у ньому рівня глюкози. Конкретні деталі проб in vivo, які можуть бути використані для оцінки активності усічених поліпептидів FGF21, можна знайти в Прикладах 5 і 7. а. N-термінальні усічення В певних варіантах здійснення даного винаходу N-термінальні усічення включають 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 чи 8 амінокислотних залишків з N-термінального кінця зрілого поліпептиду FGF21. Як показано, наприклад, в Прикладі 5 і на Фіг. 3, усічені поліпептиди FGF21, що мають Nтермінальні усічення менше ніж 9 амінокислотних залишків, зберігають здатність зрілого поліпептиду FGF21 знижувати рівень глюкози у крові у індивіда. Відповідно, в конкретних варіантах здійснення, даний винахід охоплює усічені форми зрілого поліпептиду FGF21 чи поліпептидів-мутантів FGF21, що мають N-термінальні усічення з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 чи 8 амінокислотних залишків. b. С-термінальні усічення В певних варіантах здійснення даного винаходу С-термінальні усічення включають 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 чи 12 амінокислотних залишків з С-термінального кінця зрілого поліпептиду FGF21. Як показано, наприклад, в Прикладі 4 і на Фіг. 1В, усічені поліпептиди FGF21, що мають С-термінальні усічення менше ніж 13 амінокислотних залишків, демонстрували ефективність на рівні щонайменше 50 % від ефективності FGF21 дикого типу в пробі на ELK-люциферазу in vitro, засвідчуючи, що ці мутанти FGF21 зберігають здатність зрілого поліпептиду FGF21 знижувати рівень глюкози у крові у індивіда. Відповідно, в конкретних варіантах здійснення, даний винахід охоплює усічені форми зрілого поліпептиду FGF21 чи поліпептидів-мутантів FGF21, що мають С-термінальні усічення з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 чи 12 амінокислотних залишків. с. N-термінальні і С-термінальні усічення В певних варіантах здійснення даного винаходу усічені поліпептиди FGF21 можуть мати комбінацію N-термінальних і С-термінальних усічень. Усічені поліпептиди FGF21, що мають комбінацію N-термінальних і С-термінальних усічень, поділяють активність відповідних усічених поліпептидів FGF21, які мають тільки С-термінальні усічення чи тільки N-термінальні усічення. Іншими словами, усічені поліпептиди FGF21, що мають N-термінальні усічення, менші ніж 9 амінокислотних залишків, і С-термінальні усічення, менші ніж 13 амінокислотних залишків, володіють подібною чи більш високою активністю щодо зниження рівня глюкози у крові порівняно з усіченими поліпептидами FGF21, що мають N-термінальні усічення, менші ніж 9 амінокислотних залишків, чи усіченими поліпептидами FGF21, що мають С-термінальні усічення, менші ніж 13 амінокислотних залишків. Відповідно, в конкретних варіантах здійснення, даних винахід охоплює усічені форми зрілого поліпептиду FGF21 чи поліпептидів-мутантів FGF21, що мають як N-термінальні усічення з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 чи 8 амінокислотних залишків, так і С-термінальні усічення з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 чи 12 амінокислотних залишків. Як у випадку всіх мутантів FGF21 за даним винаходом, усічені поліпептиди FGF21 можуть факультативно містити аміно-термінальний залишок метіоніну, який може бути введений шляхом спрямованої мутації чи як результат бактеріальної експресії. Усічені поліпептиди FGF21 за цим винаходом можуть отримуватись, як описано в Прикладах 3 і 6. Спеціалістам в цій галузі знайомі стандартні методи молекулярної біології, і вони можуть використати ці знання, разом з даним описом, щоб отримувати і використовувати усічені поліпептиди FGF21 за цим винаходом. Стандартні методи можуть бути використані для рекомбінантної ДНК, синтезу олігонуклеотидів, тканинної культури і трансформації (наприклад, електропорація, ліпофекція). Дивись, наприклад, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, який включено в даний опис за посиланням для будь-яких цілей. Ферментативні реакції і методики очистки можуть здійснюватись у відповідності до технічних вимог виробника, як загалом і діється в цій галузі, або як описано тут. Коли специфічні дефініції не наводяться, номенклатура, використовувана у зв'язку з аналітичною хімією, хімією органічного синтезу, медичною і фармацевтичною хімією, а також у зв'язку з лабораторними процедурами і методиками, описаними тут, є добре відомою і широко вживаною в цій галузі. Стандартні методи можуть бути використані для хімічного синтезу, хімічних аналізів, приготування фармацевтичних препаратів, складання рецептури і доставки препаратів, а також для лікування пацієнтів. Усічені поліпептиди FGF21 за цим винаходом можуть також зрощуватись з іншою субстанцією, яка може надати додаткових властивостей усіченому поліпептиду FGF21. В одному варіанті здійснення даного винаходу усічений поліпептид FGF21 може зрощуватись з послідовністю Fc. Таке зрощення може здійснюватись за допомогою відомих методів молекулярної біології та/або запропонованих тут рекомендацій. Корисні властивості таких 12 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 злитих поліпептидів, а також методи для їх отримання більш докладно будуть обговорюватись далі. 4. Стійкі до протеолізу мутанти FGF21 Як описано в Прикладі 8, було встановлено, що зрілий FGF21 піддається розкладанню in vivo, що є наслідком протеолітичної атаки. Було встановлено, що розкладання in vivo зрілого FGF21 призводить до скороченого ефективного періоду напівжиття, а це може несприятливо відбитись на терапевтичному потенціалі молекули. Відповідно, було проведене цільове дослідження для ідентифікації мутантів FGF21, які демонструють резистентність до протеолізу. В результаті цього дослідження було встановлено, що сайти в зрілому поліпептиді FGF21, особливо чутливі до протеолізу, включають пептидний зв'язок між амінокислотними залишками в позиціях 4-5, 20-21, 151-152 і 171-172. Широке, але сфокусоване і цілеспрямоване дослідження було виконане для ідентифікації конкретних заміщень, які усувають спостережуваний протеолітичний ефект, не ушкоджуючи активність білку до неприйнятного ступеня. В Таблицях 8 і 11 наведені певні з мутантів, які були отримані і піддані тестуванню. Як описано в, наприклад, Прикладах 13 і 14, не всі мутанти FGF21 демонстрували ідеальний профіль; певні мутанти забезпечували стійкість до протеолізу, але за рахунок погіршеної активності FGF21. Інші мутації зберігали активність FGF21, але не забезпечували стійкість до протеолізу. Кілька мутантів, включаючи, наприклад, FGF21 P171G, зберігали рівень активності, близький до FGF21 дикого типу, але при цьому демонстрували стійкість до протеолітичного розкладання. Одним з критеріїв відбору для ідентифікації бажаних, стійких до протеолізу мутантів FGF21 була суттєво така сама або більш висока активність у порівнянні з активністю FGF21 дикого типу. Відповідно, інший варіант здійснення даного винаходу спрямований на отримання мутантів FGF21, що є стійкими до протеолізу і все ще зберігають активність, яка суттєво така сама або більш висока активність у порівнянні з активністю FGF21 дикого типу. Хоча в певних випадках це є менш бажаним, мутанти FGF21, що є стійкими до протеолізу, але демонструють дещо знижену активність, становлять ще інший варіант здійснення даного винаходу. В певних випадках може бути бажаним підтримувати якийсь ступінь протеолізу, і, відповідно, мутанти FGF21, які дозволяють, щоб певний ступінь протеолізу мав місце, становлять ще один варіант здійснення даного винаходу. Як і всі мутанти FGF21 за цим винаходом, стійкі до протеолізу мутанти FGF21 за цим винаходом можуть бути отримані, як тут описано. Спеціалістам в цій галузі знайомі стандартні методи молекулярної біології, і вони можуть використати ці знання, разом з даним описом, щоб отримувати і використовувати стійкі до протеолізу мутанти FGF21 за цим винаходом. Стандартні методи можуть бути використані для рекомбінантної ДНК, синтезу олігонуклеотидів, тканинної культури і трансформації (наприклад, електропорація, ліпофекція). Дивись, наприклад, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, який включено в даний опис за посиланням для будь-яких цілей. Ферментативні реакції і методики очистки можуть здійснюватись у відповідності до технічних вимог виробника, як загалом і діється в цій галузі, або як описано тут. Коли специфічні дефініції не наводяться, номенклатура, використовувана у зв'язку з аналітичною хімією, хімією органічного синтезу, медичною і фармацевтичною хімією, а також у зв'язку з лабораторними процедурами і методиками, описаними тут, є добре відомою і широко вживаною в цій галузі. Стандартні методи можуть бути використані для хімічного синтезу, хімічних аналізів, приготування фармацевтичних препаратів, складання рецептури і доставки препаратів, а також для лікування пацієнтів. Стійкі до протеолізу мутанти FGF21 за цим винаходом можуть також зрощуватись з іншою субстанцією, яка може надати додаткових властивостей стійким до протеолізу мутантам FGF21. В одному варіанті здійснення даного винаходу стійкий до протеолізу мутант FGF21 може зрощуватись з IgG послідовністю Fc, наприклад SEQ ID №: 13. Таке зрощення може здійснюватись за допомогою відомих методів молекулярної біології та/або запропонованих тут рекомендацій. Корисні властивості таких злитих поліпептидів, а також методи для їх отримання більш докладно будуть обговорюватись далі. 5. Мутанти FGF21зі зменшеною агрегацією Як описано в Прикладі 15, однією властивістю поліпептиду FGF21 дикого типу є його схильність до агрегації. При концентраціях понад приблизно 5 мг/мл агрегація при кімнатній температурі відбувається з високою швидкістю. Як показано і описано тут, швидкість агрегації для поліпептиду FGF21 дикого типу залежить як від концентрації, так і від температури. Агрегація може виявитись перепоною при роботі з FGF21 дикого типу при концентраціях, які обумовлюються контекстом терапевтичного препарату. Відповідно, було проведене цільове дослідження для ідентифікації мутантів FGF21, які демонструють знижену агрегацію. Отримані 13 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мутанти FGF21 були потім піддані тестуванню на схильність до агрегації при різних концентраціях. Широке, але сфокусоване і цілеспрямоване дослідження було виконане для ідентифікації конкретних заміщень, які усувають чи зменшують спостережуваний ефект агрегації FGF21 дикого типу, не ушкоджуючи активність білку до неприйнятного ступеня. Цей підхід для ідентифікації придатних мутантів, що зменшують агрегацію, є описаним в Прикладі 15. В Таблиці 16 наведені певні мутанти, які були отримані і піддані тестуванню. Як описано в, наприклад, Прикладі 17, не всі мутанти FGF21 демонстрували ідеальний профіль. Деякі мутанти, такі як FGF21 L58E, мали порушену активність FGF21 і далі не досліджувались. Інші мутації, такі як FGF21 A134E, зберігали активність FGF21, але не забезпечували властивості зниженої агрегації. Кілька мутантів, такі як FGF21 L98R, зберігали активність FGF21 і демонстрували також знижену агрегацію. Один мутант, FGF21 A45K, неочікувано демонстрував посилену активність FGF21 і в той самий час мав властивість зниженої агрегації. Одним з критеріїв відбору при ідентифікації мутантів FGF21 з бажано зниженою агрегацією було те, щоб активність мутанту FGF21 була подібною до активності FGF21 дикого типу чи більш сильною. Відповідно, інший варіант здійснення даного винаходу стосується мутантів FGF21, що мають знижені агрегаційні властивості, але все ще зберігають активність FGF21, що є подібною до активності FGF21 дикого типу чи більш сильною. Хоча в певних випадках це є менш бажаним, мутанти FGF21, що мають знижені властивості агрегації, але демонструють дещо знижену активність FGF21, складають інший варіант здійснення даного винаходу. В певних випадках може бути бажаним підтримувати певний ступінь агрегації, і, відповідно, мутанти FGF21, які дозволяють, щоб певний ступінь агрегації мав місце, також складають ще інший варіант здійснення даного винаходу. Як і всі мутанти FGF21 за цим винаходом, мутанти FGF21 зі зниженою агрегацією за цим винаходом можуть бути отримані, як тут описано. Спеціалістам в цій галузі знайомі стандартні методи молекулярної біології, і вони можуть використати ці знання, разом з даним описом, щоб отримувати і використовувати мутанти FGF21 зі зниженою агрегацією за цим винаходом. Стандартні методи можуть бути використані для рекомбінантної ДНК, синтезу олігонуклеотидів, тканинної культури і трансформації (наприклад, електропорація, ліпофекція). Дивись, наприклад, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, який включено в даний опис за посиланням для будь-яких цілей. Ферментативні реакції і методики очистки можуть здійснюватись у відповідності до технічних вимог виробника, як загалом і діється в цій галузі, або як описано тут. Коли специфічні дефініції не наводяться, номенклатура, використовувана у зв'язку з аналітичною хімією, хімією органічного синтезу, медичною і фармацевтичною хімією, а також у зв'язку з лабораторними процедурами і методиками, описаними тут, є добре відомою і широко вживаною в цій галузі. Стандартні методи можуть бути використані для хімічного синтезу, хімічних аналізів, приготування фармацевтичних препаратів, складання рецептури і доставки препаратів, а також для лікування пацієнтів. Мутанти FGF21 зі зниженою агрегацією за цим винаходом можуть також зрощуватись з іншою субстанцією, яка може надати додаткових властивостей мутантам FGF21 зі зниженою агрегацією. В одному варіанті здійснення даного винаходу мутант FGF21 зі зниженою агрегацією може зрощуватись з IgG послідовністю Fc, наприклад SEQ ID №: 13. Таке зрощення може здійснюватись за допомогою відомих методів молекулярної біології та/або запропонованих тут рекомендацій. Корисні властивості таких злитих поліпептидів, а також методи для їх отримання більш докладно будуть обговорюватись далі. 6. Комбінаційні мутанти FGF21 Як вже зазначалось, послідовність FGF21 дикого типу володіє певними властивостями, які можуть створювати значні перешкоди, коли FGF21 використовується як терапевтична молекула. Серед цих перешкод – чутливість цього білку до розкладання і його схильність до агрегації при високій концентрації. Після виснажливих намагань ідентифікувати поліпептиди FGF21, які долають кожну з цих перешкод, було проведене цільове дослідження для визначення того, чи можуть комбінуватись амінокислотні заміщення, що забезпечують стійкість до протеолізу, з тими, що забезпечують зменшену агрегацію, у адитивний чи синергічний спосіб в єдиній поліпептидній послідовності при збереженні рівня активності, який є таким самим чи вищим, ніж активність FGF21 дикого типу. Це становило значну проблему, оскільки в цій галузі відомо, що введення багатьох мутацій в даний поліпептид може негативно впливати на експресію, активність і наступне отримання такого білку. Нами було встановлено, як продемонстровано, наприклад, в Прикладах 19 і 20, що бажані властивості кількох мутантів FGF21 дійсно можуть комбінуватись в адитивний чи синергічний спосіб з утворенням мутанту FGF21 з посиленими фармацевтичними властивостями. Мутанти 14 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 FGF21, що є стійкими до протеолізу, мають знижену швидкість агрегації і все ще зберігають активність на такому ж чи вищому рівні у порівнянні з FGF21 дикого типу – саме такі мутанти описуються тут. Одним з критеріїв відбору при ідентифікації бажаних комбінаційних мутантів FGF21 було те, щоб активність мутанту FGF21 була подібною до активності FGF21 дикого типу чи більш сильною. Відповідно, інший варіант здійснення даного винаходу стосується мутантів FGF21, що є стійкими до протеолізу і мають знижені агрегаційні властивості, але все ще зберігають активність FGF21, що є подібною до активності FGF21 дикого типу чи більш сильною. Хоча в певних випадках це є менш бажаним, мутанти FGF21, що є стійкими до протеолізу і мають знижені властивості агрегації, але демонструють дещо знижену активність FGF21, складають інший варіант здійснення даного винаходу. В певних випадках може бути бажаним підтримувати певний ступінь протеолізу та/або агрегації, і, відповідно, мутанти FGF21, які дозволяють, щоб певний ступінь протеолізу та/або агрегації мав місце, також складають окремий варіант здійснення даного винаходу. Як і всі мутанти FGF21 за цим винаходом, комбінаційні мутанти FGF21 за цим винаходом можуть бути отримані, як тут описано. Спеціалістам в цій галузі знайомі стандартні методи молекулярної біології, і вони можуть використати ці знання, разом з даним описом, щоб отримувати і використовувати комбінаційні мутанти FGF21 за цим винаходом. Стандартні методи можуть бути використані для рекомбінантної ДНК, синтезу олігонуклеотидів, тканинної культури і трансформації (наприклад, електропорація, ліпофекція). Дивись, наприклад, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, який включено в даний опис за посиланням для будь-яких цілей. Ферментативні реакції і методики очистки можуть здійснюватись у відповідності до технічних вимог виробника, як загалом і діється в цій галузі, або як описано тут. Коли специфічні дефініції не наводяться, номенклатура, використовувана у зв'язку з аналітичною хімією, хімією органічного синтезу, медичною і фармацевтичною хімією, а також у зв'язку з лабораторними процедурами і методиками, описаними тут, є добре відомою і широко вживаною в цій галузі. Стандартні методи можуть бути використані для хімічного синтезу, хімічних аналізів, приготування фармацевтичних препаратів, складання рецептури і доставки препаратів, а також для лікування пацієнтів. Комбінаційні мутанти FGF21 за цим винаходом можуть також зрощуватись з іншою субстанцією, яка може надавати додаткових властивостей комбінаційним мутантам FGF21. В одному варіанті здійснення даного винаходу комбінаційний мутант FGF21 може зрощуватись з IgG послідовністю Fc, наприклад SEQ ID №: 13. Таке зрощення може здійснюватись за допомогою відомих методів молекулярної біології та/або запропонованих тут рекомендацій. Корисні властивості таких злитих поліпептидів, а також методи для їх отримання більш докладно будуть обговорюватись далі. 7. Злиті білки FGF21 Як він тут використовується, термін "злитий поліпептид FGF21" чи "злитий білок FGF21" стосується зрощення одного чи більше амінокислотних залишків (таких як гетерологічний білок чи пептид) на N-кінці чи С-кінці будь-якого описаного тут поліпептидного мутанту FGF21. Гетерологічні пептиди і поліпептиди включають, не обмежуючись ними, епітоп для забезпечення виявлення та/або виділення поліпептидного мутанту FGF21; трансмембранний рецепторний білок чи його частину, такий як позаклітинний домен чи трансмембранний і внутрішньоклітинний домен; ліганд чи його частину, яка зв'язується з трансмембранним рецепторним білком; фермент чи його частину, що є каталітично активною; поліпептид чи пептид, який сприяє олігомеризації, такий як домен лейцинова блискавка; поліпептид чи пептид, який підвищує стабільність, такий як імуноглобулінова постійна ділянка; функціональне чи не функціональне антитіло або його важкий чи легкий ланцюг; і поліпептид, який має активність, таку як терапевтична активність, інший ніж поліпептидні мутанти FGF21 за цим винаходом. Даний винахід включає також мутанти FGF21, зрощені з альбуміном сироватки людини (HSA). Злиті білки FGF21 можуть бути отримані шляхом зрощення гетерологічних послідовностей на N-кінці чи С-кінці поліпептидного мутанту FGF21. Як вже зазначалось, гетерологічною послідовністю може бути амінокислотна послідовність чи полімер, що не містить амінокислотної послідовності. Лінкерна чи перехідна молекула може бути одним чи більше амінокислотними залишками (чи –мерами), наприклад 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 чи 9 залишками (чи –мерами), переважно від 10 до 50 амінокислотних залишків (чи –мерів), наприклад 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 чи 50 залишків (чи –мерів), а краще від 15 до 35 амінокислотних залишків (чи –мерів). Лінкерна чи перехідна молекула може бути сконструйованою з сайтом розщеплення для рестрикційної ендонуклеази ДНК чи для протеази, щоб забезпечувати можливість розділення злитих структур. 15 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 а. Зрощення Fc В одному варіанті здійснення даного винаходу поліпептидний мутант FGF21 є зрощеним з одним чи більше доменів ділянки Fc IgG людини. Антитіла містять дві функціонально незалежні частини – варіабельний домен, відомий як "Fab", який зв'язує антиген, і постійний домен, відомий як "Fc", який задіяний в ефекторних функціях, таких як активація комплементу і атака, здійснювана фагоцитарними клітинами. Fc має довгий період напівжиття в сироватці, тоді як Fab – короткий (Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31). При приєднанні до терапевтичного білку домен Fc може забезпечити подовжений період напівжиття чи взяти на себе такі функції, як зв'язування рецептору Fc, зв'язування білку А, фіксація комплементу і, можливо, навіть плацентарний перенос (Capon et al., 1989). Фармакокінетичний аналіз in vivo показав, що FGF21 людини має короткий період напівжиття – біля 1 години у мишей – через швидкий кліренс і розкладання in vivo. Щоб подовжити період напівжиття FGF21, послідовність Fc було зшито з N- чи C-термінальним кінцем поліпептиду FGF21. Зрощення ділянки Fc з FGF21 дикого типу, зокрема зрощення Fc з N-кінцем FGF21 дикого типу, не подовжило період напівжиття, як очікувалось. Однак це привело до дослідження протеолітичного розкладання FGF21 in vivo і ідентифікації мутантів FGF21, які були резистентними до такого розкладання. Такі мутанти є описаними, наприклад, в Прикладах 8 і 11 і демонструють більш тривалий період напівжиття, ніж FGF21 дикого типу. Ці та інші злиті білки FGF21 складають варіант здійснення даного винаходу. У всьому цьому описі Fc-FGF21 стосується злитого білку, в якому послідовність Fc зшита з N-кінцем FGF21. Подібним чином, у всьому описі FGF21-Fc стосується злитого білку, в якому послідовність Fc зшита з С-кінцем FGF21. Результуючий злитий білок FGF21 можна очистити, наприклад за допомогою колонки для афінної хроматографії білку А. Виявилось, що пептиди і білки, зрощені з ділянкою Fc, демонструють суттєво подовжений період напівжиття in vivo у порівнянні з незрощеною структурою. Крім цього, зрощення з ділянкою Fc забезпечує можливість димеризації/мультимеризації такого злитого пептиду. Ділянка Fc може бути ділянкою Fc, що трапляється у природі, або може бути зміненою для поліпшення певних якостей, таких як терапевтичні якості, тривалість циркуляції чи зменшена агрегація. Корисні модифікації білкових терапевтичних агентів шляхом зрощення з доменом "Fc" антитіла докладно аналізуються в міжнародній публікації №: WO 00/024782, яку включено в цей опис за посиланням у всій її повноті. В цьому документі розглядається зв'язування з "основою", такою як поліетилен гліколь (ПЕГ), декстран чи ділянка Fc. b. Лінкери злитих білків При формуванні злитих білків за цим винаходом може використовуватись, хоча і необов'язково, лінкер. Коли лінкер присутній, його хімічна структура може не бути важливою, оскільки він слугує головним чином як прокладка. Лінкер може складатись з амінокислот, з'єднаних разом пептидними зв'язками. В певних варіантах здійснення даного винаходу лінкер містить від 1 до 20 амінокислот, з'єднаних разом пептидними зв'язками, де ці амінокислоти вибираються з тих 20 амінокислот, що трапляються в природі. В різних варіантах здійснення ці від 1 до 20 амінокислот вибираються з гліцину, серину, аланіну, проліну, аспарагіну, глютаміну і лізину. В певних варіантах здійснення лінкер складається з більшості амінокислот, які є стерично не утрудненими (просторово вільними), таких як гліцин і аланін. В певних варіантах здійснення лінкери є полігліцинами (такими як (Gly)4 (SEQ ID №: 29) і (Gly)5 (SEQ ID №: 30)), поліаланінами, комбінаціями гліцину і аланіну (такими як полі(Gly-Ala)) чи комбінаціями гліцину і серину (такими як полі(Gly-Ser)). Інші придатні лінкери включають (Gly) 5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID №: 23), (Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID №: 31), (Gly)3-Lys-(Gly)4 (SEQ ID №: 32), (Gly)3-Asn-Gly-Ser-(Gly)2 (SEQ ID №: 33), (Gly)3-Cys-(Gly)4 (SEQ ID №: 34) і Gly-Pro-Asn-Gly-Gly (SEQ ID №: 35). Хоча було встановлено, що лінкер з 15 амінокислотних залишків працює особливо добре зі злитими білками FGF21, даний винахід охоплює лінкери будь-якої довжини чи складу. Описані тут лінкери є показовими, і лінкери, які є набагато довшими і які включають інші залишки, також припускаються даним винаходом. Не пептидні лінкери також припускаються даним винаходом. Наприклад, можуть використовуватись алкільні лінкери, такі як -NH-(CH2)sC(0)-, де s=2-20. Такі алкільні лінкери можуть далі заміщуватись будь-якою групою, що не є просторово утрудненою, включаючи, але не обмежуючись ними, нижчий алкіл (наприклад, C1C6), нижчий ацил, галоген (наприклад, Cl, Br), CN, NH 2 чи феніл. Показовим не пептидним лінкером є лінкер з поліетилену гліколю, де цей лінкер має молекулярну вагу від 100 до 5000 кД, наприклад від 100 до 500 кД. 60 16 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8. Хімічно модифіковані мутанти FGF21 Хімічно модифіковані форми поліпептидних мутантів FGF21, описаних тут, включаючи описані тут усічені форми FGF21, можуть бути отримані спеціалістом в цій галузі на основі даного опису. Такі хімічно модифіковані мутанти FGF21 є зміненими, так що хімічно модифіковані мутанти FGF21 відрізняються від не модифікованого мутанту FGF21 типом чи місцезнаходженням молекул, природно приєднаних до мутанту FGF21. Хімічно модифіковані мутанти FGF21 можуть включати молекули, утворені делецією однієї чи більше природно приєднаних хімічних груп. В одному варіанті здійснення поліпептидні мутанти FGF21 за цим винаходом можуть бути модифіковані шляхом ковалентного приєднання одного чи більше полімерів. Наприклад, вибраний полімер типово є водорозчинним, так що білок, до якого він приєднується, не випадає в осад у водному середовищі, такому як фізіологічне середовище. До переліку придатних полімерів входять і суміші полімерів. Переважно, для терапевтичного застосування препарату з кінцевого продукту цей полімер буде фармацевтично прийнятним. Нерозчинні у воді полімери, кон'юговані до поліпептидних мутантів FGF21 за цим винаходом, складають один з аспектів цього винаходу. Придатні полімери можуть мати будь-яку молекулярну вагу і можуть бути розгалуженими чи лінійними. Такі полімери типово мають молекулярну вагу між приблизно 2 кДа і приблизно 100 кДа (термін "приблизно" вказує на те, що в препаратах водорозчинного полімеру деякі молекули будуть важити більше, а інші менше встановленої молекулярної ваги). Середня молекулярна вага кожного полімеру переважно становить від приблизно 5 кДа до приблизно 50 кДа, краще від приблизно 12 кДа до приблизно 40 кДа, а ще краще від приблизно 20 кДа до приблизно 35 кДа. Придатні водорозчинні полімери чи їх суміші включають, не обмежуючись ними, N-зв'язані чи О-зв'язані вуглеводні, цукри, фосфати, поліетилен гліколь (ПЕГ) (включаючи ті форми ПЕГ, які використовувались для отримання білків, включаючи моно-(С1-С10), алкокси- чи арилоксиполіетилен гліколь), монометокси-поліетилен гліколь, декстран (такий як декстран з низькою молекулярною вагою, наприклад біля 6 кД), целюлоза чи інші полімери на основі вуглеводнів, полі-(N-вініл пиролідон) поліетилен гліколь, гомополімери пропилен гліколю, сополімери поліпропілен оксид/етилен оксид, поліоксиетильовані поліоли (наприклад, гліцерин) і полівініловий спирт. Даним винаходом охоплюються також мутанти FGF21, ковалентно приєднані до полісіалової кислоти. В певних варіантах здійснення даного винаходу мутант FGF21 є ковалентно чи хімічно модифікованим, щоб ввести один чи більше водорозчинних полімерів, включаючи, але не обмежуючись ними, поліетилен гліколь (ПЕГ), поліоксиетилен гліколь чи поліпропілен гліколь. Дивись, наприклад, патенти США №№ 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; і 4,179,337. В певних варіантах здійснення даного винаходу мутант FGF21 містить один чи більше полімерів, включаючи, але не обмежуючись ними, монометокси-поліетилен гліколь, декстран, целюлоза, інший полімер на основі вуглеводню, полі-(N-вініл пиролідон)-поліетилен гліколь, гомополімери пропилен гліколю, сополімери поліпропілен оксид/етилен оксид, поліоксиетильовані поліоли (наприклад, гліцерин), полівініловий спирт чи суміші таких полімерів. В певних варіантах здійснення даного винаходу мутант FGF21 є ковалентно модифікованим субодиницями ПЕГ. В певних варіантах здійснення один чи більше водорозчинних полімерів зв'язуються в одній чи більше специфічних позицій (наприклад, на N-кінці) мутанту FGF21. В певних варіантах здійснення один чи більше водорозчинних полімерів є приєднаними випадковим чином до одного чи більше бокових ланцюгів мутанту FGF21. В певних варіантах здійснення ПЕГ використовується для поліпшення терапевтичної здатності мутанту FGF21. Певні такі способи аналізуються, наприклад, в патенті США № 6,133,426, який включено в цей опис за посиланням для будь-якої цілі. В варіантах здійснення даного винаходу, де полімером є ПЕГ, група ПЕГ може мати будьяку підхожу молекулярну вагу і може бути лінійним чи розгалуженим. Середня молекулярна вага групи ПЕГ переважно буде в межах від приблизно 2 кДа до приблизно 100 кДа, а краще від приблизно 5 кДа до приблизно 50 кДа, наприклад 10, 20, 30, 40 чи 50 кДа. Групи ПЕГ будуть загалом приєднуватись до мутанту FGF21 шляхом ацилування чи відновного алкілування через реактивну групу на структурі ПЕГ (наприклад, альдегідна, аміно, тіолова чи ефірна група). Пегілювання поліпептиду, включаючи мутанти FGF21 за цим винаходом, може специфічно здійснюватись з використанням будь-якої з реакцій пегілювання, відомих в цій галузі. Такі реакції є описаними, наприклад, в наступних джерелах: Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10; Європейські патенти №№ 0 154 316 і 0 401 384; і патент США № 4,179,337. 17 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наприклад, пегілювання може здійснюватись шляхом реакції ацилування чи реакції алкілування з реактивною молекулою поліетилену гліколю (чи аналогічного реактивного водорозчинного полімеру), як тут описано. Для реакцій ацилування вибраний полімер повинен мати єдину реактивну ефірну групу. Для відновного алкілування вибраний полімер повинен мати єдину реактивну альдегідну групу. Реактивний альдегід є, наприклад, пропіональдегідом поліетилену гліколю, який є стабільним у воді, або його моно С 1-С10 алкокси чи арилокси похідними (дивись, наприклад, патент США № 5,252,714). В певних варіантах здійснення даного винаходу корисна стратегія для приєднання групи ПЕГ до поліпептиду передбачає комбінування, через утворення кон'югатного зв'язку в розчині, пептиду і структури ПЕГ, кожний з яких несе спеціальну функціональність, що є взаємно реактивною по відношенню до іншої. Такі пептиди можна легко отримати за допомогою звичайного твердофазного синтезу. Такі пептиди "попередньо активують" відповідною функціональною групою в специфічному місці. Попередники піддають очистці і повному дослідженню перед реакцією зі структурою ПЕГ. Зшивання пептиду з ПЕГ звичайно відбувається у водній фазі і може легко контролюватись за допомогою аналітичної ВЕРХ з оберненою фазою. Пегільовані пептиди можна легко очистити з використанням препаративної ВЕРХ і дослідити за допомогою аналітичної ВЕРХ, амінокислотного аналізу і лазерної десорбційної мас-спектроскопії. Полісахаридні полімери є ще одним типом водорозчинного полімеру, який може бути використаний для модифікації білку. Відповідно, мутанти FGF21 за цим винаходом, зшиті з полісахаридним полімером, являють собою варіанти здійснення даного винаходу. Декстрани є полісахаридними полімерами, що складаються з індивідуальних субодиниць глюкози, зв'язаних головним чином альфа 1-6 зв'язками. Сам декстран може мати різну молекулярну вагу і є легко доступним з молекулярною вагою від приблизно 1 кД до приблизно 70 кД. Декстран є підхожим водорозчинним полімером для використання в якості основи сам по собі чи в комбінації з іншою основою (наприклад, Fс). Дивись, наприклад, міжнародну публікацію № WO 96/11953. Повідомлялось про використання декстрану, кон'югованого до терапевтичних чи діагностичних імуноглобулінів. Дивись, наприклад, публікацію Європейського патенту № 0 315 456, який включено в цей опис за посиланням. Даний винахід охоплює також використання декстрану з молекулярною вагою від приблизно 1 кД до приблизно 20 кД. Загалом, хімічна модифікація може здійснюватись в будь-яких придатних умовах, використовуваних для реакції білку з активованою молекулою полімеру. Способи отримання хімічно модифікованих поліпептидів будуть загалом включати етапи: (а) реакції поліпептиду з активованою молекулою полімеру (такою як реакційно здатне ефірне чи альдегідне похідне молекули полімеру) в умовах, в яких поліпептид-мутант FGF21 стає приєднаним до однієї чи більше молекул полімеру, і (b) отримання продуктів реакції. Оптимальні умови реакції будуть визначатись на основі відомих параметрів і бажаного результату. Наприклад, чим більшим є відношення молекул полімеру до білку, тим більшим буде відсоток приєднаних молекул полімеру. В одному варіанті здійснення даного винаходу хімічно модифіковані мутанти FGF21 можуть мати єдиний фрагмент молекули полімеру на аміно-кінці (дивись, наприклад, патент США № 5,234,784). В іншому варіанті здійснення даного винаходу поліпептиди-мутанти FGF21 можуть бути хімічно спарованими з біотином. Біотину/поліпептидам-мутантам FGF21 потім дають зв'язатись з авідином, що приводить до утворення чотиривалентних авідин/біотин/ поліпептидів-мутантів FGF21. Поліпептиди-мутанти FGF21 можуть також ковалентно сполучатись з динітрофенолом (ДНФ) чи тринітрофенолом (ТНФ), а отримані кон'югати осаджували анти-ДНФ чи анти-ТНФ IgM з утворенням декамерних кон'югатів з валентністю 10. Загалом, умови, які можуть бути пом'якшені чи модульовані введенням таких хімічно модифікованих мутантів FGF21, включаю ті, що тут описані для поліпептидів-мутантів FGF21. Однак описані тут хімічно модифіковані мутанти FGF21 можуть мати додаткові види активності, посилену чи знижену біологічну активність або інші характеристики, такі як подовжений чи скорочений період напівжиття у порівнянні з не модифікованими мутантами FGF21. 9. Терапевтичні композиції з мутантами FGF21 та їх введення Терапевтичні композиції, що містять мутанти FGF21, входять до об'єму даного винаходу і є специфічно задуманими у світлі ідентифікації кількох мутантних послідовностей FGF21, що демонструють посилені властивості. Такі терапевтичні композиції з мутантами FGF21 можуть містити терапевтично ефективну кількість пептиду-мутанту FGF21 в суміші з фармацевтично чи фізіологічно прийнятою основою, вибраною у відповідності до способу введення. Прийнятні матеріали основи для приготування композиції переважно є нетоксичними для реципієнтів в тих дозах і концентраціях, які використовуються. 18 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Терапевтичні композиції можуть містити матеріали для приготування лікарської форми – для модифікації, підтримання чи збереження, наприклад, рН, осмолярності, в'язкості, прозорості, забарвлення, ізотонічності, запаху, стерильності, стабільності, швидкості розчинення чи вивільнення, всмоктування чи проникання композиції. Придатні матеріали для приготування лікарської форми включають, не обмежуючись ними, амінокислоти (такі як гліцин, глютамін, аспарагін, аргінін чи лізин), антимікробні агенти, антиоксиданти (такі як аскорбінова кислота, натрію сульфіт чи натрію гідросульфіт), буфери (такі як борат, бікарбонат, Tris-HCl, цитрати, фосфати чи інші органічні кислоти), об'ємоутворюючі агенти (такі як манітол чи гліцин), хелатоутворюючі агенти (такі як етилендіамін тетраоцтова кислота (ЕДТК)), комплексоутворюючі агенти (такі як кофеїн, полівінілпиролідон, бета-циклодекстрин чи гідроксипропил-бета-циклодекстрин), наповнювачі, моносахариди, дисахариди та інші вуглеводні (такі як глюкоза, маноза чи декстрини), білки (такі як сироватковий альбумін, желатин чи імуноглобуліни), барвники, ароматизатори і розріджувачі, емульгатори, гідрофільні полімери (такі як полівінілпиролідон), поліпептиди з низькою молекулярною вагою, утворюючі солі проти іони (такі як натрій), консерванти (такі як бензалконію хлорид, бензойна кислота, саліцилова кислота, тимерозал, фен етиловий спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбінова кислота чи перекис водню), розчинники (такі як гліцерин, пропилен гліколь чи поліетилен гліколь), цукроспирти (такі як манітол чи сорбітом), агенти для суспендування, сурфактанти чи зволожуючі агенти (такі як плюроніки; ПЕГ; ефіри сорбіту; полісорбати, такі як полісорбат 20 чи полісорбат 80; тритон; трометамін; лецитин; холестерин чи тілоксапол), агенти для посилення стабільності (такі як сахароза чи сорбіт), агенти для посилення тонічності (такі як галіди лужних металів – переважно хлорид натрію чи калію, або манітол чи сорбіт), носії, розріджувачі, допоміжні речовини та/або фармацевтичні ад'юванти (дивись, наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990) і наступні видання, які включено в цей опис за посиланням для будьякої цілі). Оптимальний фармацевтичний склад буде визначатись спеціалістом в цій галузі в залежності від, наприклад, задуманого шляху введення, форми доставки і бажаної дози (дивись, наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra). Такі композиції можуть впливати на фізичний стан, стабільність, швидкість вивільнення in vivo і швидкість кліренсу in vivo поліпептиду-мутанту FGF21. Первинна основа чи носій у фармацевтичній композиції можуть бути водними чи неводними за природою. Наприклад, придатною основою чи носієм для ін'єкційного препарату може бути вода, фізіологічний сольовий розчин чи штучна спинномозкова рідина, можливо доповнена іншими матеріалами, звичайними в композиціях для парентерального введення. Нейтральний забуферений сольовий розчин чи сольовий розчин, змішаний з сироватковим альбуміном, є іншими показовими носіями. Інші показові фармацевтичні композиції містять буфер Tris з рН біля 7,0-8,5 чи ацетатний буфер з рН біля 4,0-5,5, який може додатково включати сорбіт чи його прийнятний замінник. В одному варіанті здійснення даного винаходу композиції поліпептидумутанту FGF21 можуть готуватись для зберігання шляхом змішування вибраної композиції, що має бажаний ступінь чистоти, з факультативними агентами для приготування лікарської форми (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) у вигляді ліофілізованого коржа чи водного розчину. До того ж, продукт на основі поліпептиду-мутанту FGF21 може готуватись як ліофілізат з використанням відповідних допоміжних матеріалів, таких як сахароза. Фармацевтичні композиції поліпептиду-мутанту FGF21 можуть вибиратись для парентеральної доставки. Як варіант, такі композиції можуть вибиратись для інгаляції чи для доставки через травний тракт, такої як оральне введення. Приготування таких фармацевтично прийнятних композицій знаходиться в межах компетенції спеціаліста в цій галузі. Компоненти препарату є присутніми в концентраціях, що є прийнятними для даного місця введення. Наприклад, для підтримання композиції при фізіологічному рН чи при трохи нижчому рН, типово в межах від приблизно 5 до приблизно 8, використовуються буфери. Коли передбачається парентеральне введення, терапевтичні композиції для використання за цим винаходом можуть бути у вигляді вільного від пірогенів, парентерально прийнятного водного розчину, що містить поліпептид-мутант FGF21 у фармацевтично прийнятному носієві. Особливо доцільним носієм для парентеральної ін'єкції є стерильна дистильована вода, в якій поліпептид-мутант FGF21 готується як стерильний ізотонічний розчин з відповідними консервантами. Інше приготування може передбачати використання для бажаної молекули агента, такого як ін'єкційні мікросфери, частки, що піддаються біологічному розкладанню, полімерні сполуки (такі як полімолочна кислота чи полігліколева кислота), гранули чи ліпосоми, які забезпечують контрольоване чи уповільнене вивільнення продукту, який може тоді 19 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 доставлятись шляхом ін'єкції для уповільненого всмоктування. Може використовуватись також гіалуронова кислота, що забезпечує подовжене перебування препарату в циркуляції. Інші придатні засоби для введення бажаної молекули включають пристрої для доставки препаратів, що імплантуються в організм. В одному варіанті здійснення фармацевтична композиція може бути призначеною для інгаляції. Наприклад, поліпептид-мутант FGF21 може мати вигляд сухого порошку для інгаляції. Можуть готуватись також розчини для інгаляції поліпептиду-мутанту FGF21 з газомвитискувачем для доставки у вигляді аерозолю. В ще іншому варіанті здійснення розчини можуть розпилюватись. В міжнародній публікації № WO 94/20069 описане легеневе введення хімічно модифікованих білків. Передбачається також, що певні препарати можуть вводитись орально. В одному варіанті здійснення даного винаходу поліпептиди-мутанти FGF21, які вводяться у такий спосіб, можуть готуватись з тими носіями, які звичайно використовуються у твердих лікарських формах, таких як таблетки і капсули, чи без таких носіїв. Наприклад, можна розробити капсулу, яка буде вивільняти активну частину препарату в тому місці шлунково-кишкового тракту, де її біодоступність є максимальною, а досистемне розкладання мінімальним. Можуть включатись додаткові агенти, які сприяють всмоктуванню поліпептиду-мутанту FGF21. Розріджувачі, смакові добавки, віск з низькою температурою плавлення, рослинні олії, лубриканти, агенти для суспендування, агенти для дезінтеграції і зв'язувальні речовини також можуть використовуватись. Інша фармацевтична композиція може включати ефективну кількість поліпептидів-мутантів FGF21 в суміші з нетоксичними допоміжними матеріалами, які використовуються при виготовленні таблеток. Розчинення таблеток у стерильній воді чи іншому відповідному розчиннику дає розчини в дозованій лікарській формі. Придатні допоміжні матеріали включають, не обмежуючись ними, інертні розріджувачі, такі як кальцію карбонат, натрію карбонат чи бікарбонат, лактоза чи кальцію фосфат; агенти для зв'язування, такі як крохмаль, желатин чи гуміарабік, і лубриканти, такі як магнію стеарат, стеаринова кислота чи тальк. Додаткові фармацевтичні композиції поліпептиду-мутанту FGF21 мають бути очевидними для спеціалістів в цій галузі, включаючи препарати, які забезпечують уповільнену чи контрольовану доставку. Методи для отримання широкого кола засобів для уповільненої чи контрольованої доставки, такі як ліпосоми, мікрочастки, що піддаються біологічному розкладанню, пористі гранули чи депо-ін'єкції, так відомі спеціалістам в цій галузі (дивись, наприклад, міжнародну публікацію № WO 93/15722, яка описує контрольоване вивільнення пористих полімерних мікрочасток для доставки фармацевтичних композицій, і Wischke & Schwendeman, 2008, Int. J. Pharm. 364: 298-327, та Freiberg & Zhu, 2004, Int. J. Pharm. 282: 1-18, які аналізують отримання і використання мікросфер/мікрочасток). Додаткові приклади препаратів уповільненого вивільнення включають напівпроникні полімерні матриці у вигляді формованих виробів, наприклад плівок чи мікрокапсул. Матриці для уповільненого вивільнення можуть включати поліефіри, гідрогелі, полілактиди (патент США № 3,773,919 і Європейський патент № 0 058 481), сополімери L-глютамінової кислоти і гамма етилL-глютамату (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56), полі(2-гідроксиетил-метакрилат) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 і Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), етилен вінілацетат (Langer et al., supra) чи полі-D(-)-3-гідроксимасляна кислота (Європейський патент № 0 133 988). Композиції для уповільненого вивільнення можуть включати також ліпосоми, отримані будь-яким з кількох методів, відомих в цій галузі. Дивись, наприклад, Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 0 82: 3688-92; і Європейські патенти №№ 0 036 676, 0 088 046 і 0 143 949. Фармацевтична композиція поліпептиду-мутанту FGF21, призначена для введення in vivo, типово має бути стерильною. Це досягається фільтрацією через стерильні фільтрувальні мембрани. Коли така композиція є ліофілізованою, стерилізацію цим способом можна здійснювати до ліофілізації чи після розчинення. До того ж, композиції для парентерального введення загалом поміщають в контейнери, що мають стерильний порт доступу, наприклад пакет для внутрішньовенного розчину чи флакон з пробкою, яка проколюється голкою для підшкірної ін'єкції. Після приготування фармацевтична композиція може зберігатись у стерильних флаконах як розчин, суспензія, гель, емульсія, тверда речовина або як зневоднений чи ліофілізований порошок. Такі препарати можуть зберігатись у формі, готовій для використання, або у формі (наприклад, ліофілізованій), яка вимагає розчинення перед введенням. В конкретному варіанті здійснення даний винахід пропонує набори для забезпечення дозованої лікарської форми. Кожний такий набір містить перший контейнер для висушеного 20 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білку і другий контейнер для водного середовища. В об'єм цього винаходу входять також набори, які містять одно- і багатокамерні попередньо наповнені шприци (наприклад, шприци для рідини і ліошприци). Ефективна кількість фармацевтичної композиції поліпептиду-мутанту FGF21, використовуваної з терапевтичною метою, буде залежати, наприклад, від терапевтичного контексту і цілей. Спеціалісту в цій галузі буде зрозумілим, що відповідні рівні дози для лікування будуть коливатись в залежності, зокрема, від молекули, що доставляється, показання, для якого застосовується поліпептид-мутант FGF21, шляху введення, а також розміру (вага тіла, площа поверхні тіла чи розмір органів) і стану (вік і загальний стан здоров'я) пацієнта. Відповідно, клініцист може титрувати дозу і модифікувати шлях введення для забезпечення оптимального терапевтичного ефекту. Типова доза може бути в межах від приблизно 0,1 мкг/кг до приблизно 100 мг/кг чи більше в залежності від вищезгаданих чинників. В інших варіантах здійснення доза може бути в межах від приблизно 0,1 мкг/кг до приблизно 100 мг/кг; чи від 1 мкг/кг до приблизно 100 мг/кг; чи від 5 мкг/кг, 10 мкг/кг, 15 мкг/кг, 20 мкг/кг, 25 мкг/кг, 30 мкг/кг, 35 мкг/кг, 40 мкг/кг, 45 мкг/кг, 50 мкг/кг, 55 мкг/кг, 60 мкг/кг, 65 мкг/кг, 70 мкг/кг, 75 мкг/кг до приблизно 100 мг/кг. В щеінших варіантах здійснення доза може становити 50 мкг/кг, 100 мкг/кг, 150 мкг/кг, 200 мкг/кг, 250 мкг/кг, 300 мкг/кг, 350 мкг/кг, 400 мкг/кг, 450 мкг/кг, 500 мкг/кг, 550 мкг/кг, 600 мкг/кг, 650 мкг/кг, 700 мкг/кг, 750 мкг/кг, 800 мкг/кг, 850 мкг/кг, 900 мкг/кг, 950 мкг/кг, 100 мкг/кг, 200 мкг/кг, 300 мкг/кг, 400 мкг/кг, 500 мкг/кг, 600 мкг/кг, 700 мкг/кг, 800 мкг/кг, 900 мкг/кг, 1000 мкг/кг, 2000 мкг/кг, 3000 мкг/кг, 4000 мкг/кг, 5000 мкг/кг, 6000 мкг/кг, 7000 мкг/кг, 8000 мкг/кг, 9000 мкг/кг чи 10 мг/кг. Частота введення буде залежати від фармакокінетичних параметрів поліпептиду-мутанту FGF21 в препараті, що використовується. Типово, клініцист буде вводити композицію до досягнення дози, яка забезпечує бажаний ефект. Відповідно, композиція може вводитись одноразово, двічі або більше разів (які не обов'язково мають містити ту саму кількість бажаної молекули) за якийсь час або як безперервне вливання через імплантований пристрій чи катетер. Подальше уточнення дози рутинно робиться спеціалістами в цій галузі і входить до кола завдань, які звичайно виконуються ними. Правильність встановлення дози може оцінюватись через використання відповідних даних доза-реакція. Шлях введення фармацевтичної композиції знаходиться у відповідності з відомими методами; наприклад, він може бути оральним; ін'єкційним – внутрішньовенним, інтраперитонеальним, інтрацеребральним (інтрапаренхімальним), інтрацеребровентрикулярним, внутрішньом'язовим, внутрішньоочним, інтраартеріальним, інтрапортальним шляхом або композиція вводиться всередину вражених тканин; може здійснюватись за допомогою систем пролонгованого вивільнення (які також можуть бути ін'єкційними) або пристроїв, що імплантуються. Коли бажано, такі композиції можуть вводитись як болюсна ін'єкція, безперервне вливання чи за допомогою пристроїв, що імплантуються. Альтернативно чи додатково, композиція може вводитись місцево шляхом імплантації мембрани, губки чи іншого підхожого матеріалу, на якому було абсорбовано чи інкапсульовано бажану молекулу. Коли використовується пристрій, що імплантується, він може імплантуватись в будь-яку придатну тканину чи орган, і доставка бажаної молекули може здійснюватись через дифузію, регульований в часі болюс чи постійне введення. 10. Терапевтичні застосування поліпептидів-мутантів FGF21 Поліпептиди-мутанти FGF21 можуть використовуватись для лікування, діагностики, пом'якшення чи попередження низки хвороб, розладів чи станів, включаючи, але не обмежуючись ними, метаболічні розлади. В одному варіанті здійснення метаболічним розладом, що лікується, є діабет, наприклад діабет 2 типу. В іншому варіанті здійснення метаболічним розладом, що лікується, є ожиріння. Інші варіанти здійснення включають такі метаболічні стани чи розлади, як дизліпідемія; гіпертонія; гепатостеатоз, такий як неалкогольний стеатогепатит (NASH); серцево-судинна хвороба, така як атеросклероз; і старіння. На практиці, розлад чи стан, такий як діабет чи ожиріння, можуть лікуватись введенням поліпептиду-мутанту FGF21, як описано тут, пацієнту, який того потребує, в кількості терапевтично ефективної дози. Введення може здійснюватись, як описано тут, шляхом внутрішньовенної ін'єкції, інтраперитонеальної ін'єкції, внутрішньом'язової ін'єкції чи орально у вигляді таблетки чи рідкого препарату. В більшості ситуацій бажана доза може бути визначена клініцистом, як описано тут, і вона може представляти собою терапевтично ефективну дозу поліпептиду-мутанту FGF21. Для спеціалістів в цій галузі буде зрозумілим, що терапевтично ефективна доза поліпептиду-мутанту FGF21 буде залежати, inter alia, від графіку введення, стандартної дози введеного антигену, від того чи вводиться молекула нуклеїнової кислоти або 21 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліпептиду в комбінації з іншими терапевтичними агентами, від імунного статусу і здоров'я реципієнта. Термін "терапевтично ефективна доза", як він тут використовується, означає ту кількість поліпептиду-мутанту FGF21, яка викликає біологічну чи медичну реакцію в тканинній системі, тварині чи людині, на яку розраховує дослідник, лікар чи інший клініцист і яка включає пом'якшення симптомів хвороби чи розладу, що лікується. 11. Антитіла Антитіла чи фрагменти антитіла, які специфічно зв'язуються з поліпептидами-мутантами FGF21 за даним винаходом, але специфічно не зв'язуються з поліпептидами FGF21 дикого типу, пропонуються у даному винаході і входять в його об'єм. Антитіла можуть бути поліклональними, включаючи моноспецифічні поліклональні; моноклональними (MAbs); рекомбінантними; химерними; гуманізованими, такими як пересаджені з ділянки, що визначає комплементарність (CDR); людськими; одноланцюговими; та/або біспецифічними; а також фрагментами, варіантами чи їх хімічно модифікованими молекулами. Фрагменти антитіла включають ті частини антитіла, які специфічно зв'язуються з епітопом на поліпептиді-мутанті FGF21. Приклади таких фрагментів включають фрагменти Fab і F(ab'), які утворюються при ферментативному розщепленні антитіл повної довжини. Інші фрагменти, здатні зв'язуватись, включають ті, що створюються методами рекомбінантної ДНК, такими як експресія рекомбінантних плазмід, які містять послідовності нуклеїнових кислот, кодуючі варіабельні ділянки антитіла. Поліклональні антитіла, спрямовані проти поліпептиду-мутанту FGF21, загалом продукуються у тварин (наприклад, кролів чи мишей) після певної кількості підшкірних чи інтраперитонеальних ін'єкцій поліпептиду-мутанту FGF21 і ад'юванту. Може бути корисним кон'югувати поліпептид-мутант FGF21 до булку-носія, що є імуногенним для виду, який імунізується, такого як гемоцианін лімфи равлика, сироватка, альбумін, бичачий тироглобулін чи інгібітор трипсину соєвих бобів. Крім того, для посилення імунної відповіді використовуються агенти для агрегації, такі як галун. Після імунізації у тварин пускають кров, і аналізують сироватку на титр антитіла проти мутанту FGF21. Моноклональні антитіла, спрямовані на поліпептиди-мутанти FGF21, можуть бути отримані за допомогою будь-якого методу, який забезпечує вироблення молекул антитіла стабільними клітинними лініями в культурі. Приклади придатних методів для отримання моноклональних антитіл включають гібридомні методи (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). Цей винахід також пропонує гібридомні клітинні лінії, які продукують моноклональні антитіла, що реагують з поліпептидами-мутантами FGF21. Моноклональні антитіла за цим винаходом можуть бути модифіковані для використання в якості терапевтичних агентів. В одному варіанті здійснення таке моноклональне антитіло є "химерним" антитілом, в якому частина важкого (Н) та/або легкого (L) ланцюга є ідентичною чи гомологічною відповідній послідовності в антитілах, що отримані від конкретного виду чи належать до конкретного класу чи підкласу антитіл, тоді як решта ланцюга є ідентичною чи гомологічною відповідній послідовності в антитілах, що отримані від іншого виду чи належать до іншого класу чи підкласу антитіл. Включеними є також фрагменти таких антитіл, які демонструють бажану біологічну активність. Дивись, наприклад, патент США № 4,816,567; Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-55. В іншому варіанті здійснення моноклональне антитіло за цим винаходом є "гуманізованим" антитілом. Методи для гуманізації нелюдських антитіл є відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, патенти США №№ 5,585,089 і 5,693,762. Загалом, гуманізоване антитіло має один чи більше амінокислотних залишків, введених в нього з джерела, що не є людиною. Гуманізація може здійснюватись, наприклад, з використанням методів, описаних в спеціальній літературі (дивись, наприклад, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-25; Riechmann et al., 1998, Nature 332: 323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-36), шляхом заміщення щонайменше частини ділянки, що визначає комплементарність, гризуна на відповідні ділянки людського антитіла. Даний винахід охоплює також людські антитіла, які зв'язують поліпептиди-мутанти FGF21 за цим винаходом. Використовуючи трансгенних тварин (наприклад, мишей), які здатні продукувати спектр людських антитіл за відсутності ендогенної продукції імуноглобуліну, такі антитіла виробляються шляхом імунізації антигеном мутантного FGF21 (тобто таким, що має щонайменше 6 стичних амінокислот), факультативно кон'югованим до носія. Дивись, наприклад, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 2551-55; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255-58; Bruggermann et al., 1993, Year in Immuno. 7: 33. Згідно з одним методом, таких трансгенних тварин отримують, виводячи з ладу ендогенні локуси, кодуючі в них важкий і легкий імуноглобулінові ланцюги, і вводячи локуси, кодуючі білки важкого і легкого ланцюгів людини, в 22 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 їх геном. Частково модифіковані тварини, тобто тварини, що мають менше ніж повний комплемент модифікацій, потім схрещують, щоб отримати тварину, яка має всі бажані модифікації імунної системи. При введенні імуногену ці трансгенні тварини продукують антитіла з людськими (а не, наприклад, мишачими) амінокислотними послідовностями, включаючи варіабельні ділянки, що є імуноспеціфічними для цих антигенів. Дивись, наприклад, міжнародні публікації №№ WO 96/33735 and WO 94/02602. Додаткові методи описані в патенті США № 5,545,807, міжнародних публікаціях №№ WO 91/10741 і WO 90/04036, і в Європейському патенті № 0 546 073. Людські антитіла можуть отримуватись також шляхом експресії рекомбінантної ДНК в клітинах-хазяях або шляхом експресії в гібридомних клітинах, як тут описано. В альтернативному варіанті здійснення людські антитіла можуть отримуватись також з фагових дисплейних бібліотек (дивись, наприклад, Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581). Ці процеси імітують імунний відбір через дисплей спектрів антитіл на поверхні філаментозного бактеріофагу і наступний відбір фагів за їх зв'язуванням з антигеном вибору. Одна така методика розглядається в міжнародній публікації № WO 99/10494, яка описує виділення високо афінних і функціональних агоністичних антитіл до MPL- і msk-рецепторів з використанням такого підходу. Химерні, з пересадженою CDR і гуманізовані антитіла типово отримують рекомбінантними методами. Нуклеїнові кислоти, кодуючі ці антитіла, вводяться в клітини-хазяї і експресуються з використанням матеріалів і методик, описаних тут. В одному варіанті здійснення такі антитіла продукуються в клітинах-хазяях ссавців, таких як клітини СНО. Моноклональні (наприклад, людські) антитіла можуть отримуватись шляхом експресії рекомбінантної ДНК в клітинах-хазяях чи шляхом експресії в гібридомних клітинах, як тут описано. Антитіла проти мутанту FGF21 за цим винаходом можуть використовуватись у будь-якому відомому методі аналізу, такому як аналіз конкурентного зв'язування, прямий і непрямий сандвіч-аналізи та імунопреципітація (дивись, наприклад, довідник Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987), який включено в цей опис за посиланням у всій його повноті), для виявлення і кількісної оцінки поліпептидів-мутантів FGF21. Ці антитіла будуть зв'язувати поліпептиди-мутанти FGF21 з афінністю, яка відповідає методу аналізу, який використовується. Для діагностичних застосувань, в певних варіантах здійснення, антитіла проти мутанту FGF21 можуть мітитись речовиною, що легко виявляється. Така речовина може бути будь-якою речовиною, здатною продукувати, прямо чи опосередковано, сигнал, що легко виявляється. 3 14 32 35 125 99 111 67 Наприклад, нею може бути радіоізотоп, такий як Н, С, Р, S, I, Tc, In чи Ga; флуоресцентна чи хемілюмінесцентна сполука, така як флуоресцеїн ізотіоціанат, родамін чи люциферин; або фермент, такий як лужна фосфатаза, β-галактозидаза чи пероксидаза хрону (Bayer et al., 1990, Meth. Enz. 184: 138-63). Аналізи конкурентного зв'язування базуються на здатності міченого стандарту (наприклад, поліпептиду-мутанту FGF21 чи його імунологічно реакційно здатної частини) конкурувати з тестовим зразком, що аналізується (наприклад, поліпептидом-мутантом FGF21), за зв'язування з обмеженою кількістю антитіла проти мутанту FGF21. Кількість поліпептиду-мутанту FGF21 в тестовому зразку є зворотно пропорційною кількості стандарту, що зв'язалась з цими антитілами. Для забезпечення визначення кількості стандарту, яка стає зв'язаною, антитіла типово переводять в нерозчинну форму до конкуренції чи після неї, так що стандарт і речовина, що визначається, які зв'язуються з антитілами, можуть бути зручно відділені від тієї частини стандарту і речовини, що визначається, яка залишилась незв'язаною. Сандвіч-аналізи типово передбачають використання двох антитіл, кожне з яких здатне зв'язуватись з різними імуногенними частинами, чи епітопом, білку, що визначається та/або кількісно оцінюється. В сандвіч-аналізі тестовий зразок, що аналізується, типово зв'язується першим антитілом, яке іммобілізоване на твердій підкладці, після чого з тестовим зразком зв'язується друге антитіло, завдяки чому утворюється нерозчинний комплекс з трьох частин. Дивись, наприклад, патент США № 4,376,110. Друге антитіло може саме бути міченим речовиною, що легко виявляється, (прямі сандвіч-аналізи) чи може визначатись за допомогою анти-імуноглобулінового антитіла, яке мітиться речовиною, що легко виявляється (непрямі сандвіч-аналізи). Наприклад, одним типом сандвіч-аналізу є імуноферментний твердофазний аналіз (ELISA), у випадку якого речовиною, що легко виявляється, є фермент. Антитіла проти мутанту FGF21 за цим винаходом використовуються також для отримання зображення in vivo. Антитіло, мічене речовиною, що легко виявляється, може вводитись у тварину, переважно в кровоток, після чого аналізують присутність і місцезнаходження такого міченого антитіла у хазяїна. Антитіло може мітитись будь-якою речовиною, яка виявляється в 23 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 тварині за допомогою ядерного магнітного резонансу, радіології чи інших засобів виявлення, відомих в цій галузі. Антитіла проти мутанту FGF21 за цим винаходом можуть використовуватись як терапевтичні агенти. Ці терапевтичні агенти є загалом агоністами чи антагоністами в тому, що вони посилюють або знижують, відповідно, щонайменше одну біологічну активність поліпептиду-мутанту FGF21. В одному варіанті здійснення антагоністичні антитіла за цим винаходом є антитілами чи їх фрагментами для зв'язування, які здатні специфічно зв'язуватись з поліпептидом-мутантом FGF21 і які здатні пригнічувати чи усувати функціональну активність поліпептиду-мутанту FGF21 in vivo чи in vitro. В певних варіантах здійснення антагоністичне антитіло буде пригнічувати функціональну активність поліпептиду-мутанту FGF21 щонайменше приблизно на 50 %, а переважно щонайменше приблизно на 80 %. В іншому варіанті здійснення антитіло проти мутанту FGF21 здатне перешкоджати взаємодії між поліпептидом-мутантом FGF21 і рецептором FGF, тим самим пригнічуючи чи усуваючи активність поліпептиду-мутанту FGF21 in vivo чи in vitro. Агоністичні і антагоністичні антитіла проти мутанту FGF21 ідентифікуються за допомогою скринінгових досліджень, які є добре відомими в цій галузі. Даний винахід стосується також набору, який містить антитіла проти мутанту FGF21 та інші реактиви, призначені для визначення рівня поліпептиду-мутанту FGF21 в біологічних зразках. Такі реактиви можуть включати мітку, що легко виявляється, блокуючу сироватку, зразки позитивного і негативного контролю та реактиви для здійснення відповідних аналізів. Приклади Наведені далі Приклади є ілюстративними і відображають конкретні варіанти здійснення цього винаходу і його різні застосування. Вони слугують тільки для пояснювальних цілей і не повинні сприйматись як такі, що якимось чином обмежують об'єм даного винаходу. Приклад 1 Приготування конструкцій експресії FGF21 Послідовність нуклеїнових кислот, кодуючу зрілий поліпептид FGF21, було отримано за допомогою ампліфікації полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням праймерів, які мають нуклеотидні послідовності, що відповідають кінцям 5' і 3' зрілої послідовності FGF21. Таблиця 2 Праймери ПЛР для приготування конструкції FGF21 Праймер Послідовність Смисловий 5'-AGGAGGAATAACATATGCATCCAATTCCAGATTCTTCTCC-3' Антисмисловий 5' -TAGTGAGCTCGAATTCTTAGGAAGCGTAGCTGG-3' SEQ ID №: 5 6 30 35 40 45 50 Праймери, використовувані для приготування конструкції експресії FGF21, включали сайти рестрикційної ендонуклеази для цілеспрямованого клонування даної послідовності в придатний вектор експресії (наприклад, pET30 (Novagen/EMD Biosciences; San Diego, CA) або pAMG33 (Amgen; Thousand Oaks, CA)). Вектор експресії pAMG33 містить низькокопійне джерело R-100 реплікації, модифікований промотор lac і ген резистентності до канаміцину. Вектор експресії рЕТ30 містить похідне від pBR322 джерело реплікації, індуцибельний промотор Т7 і ген резистентності до канаміцину. Хоча у випадку pAMG33 експресія була більшою, рЕТ30 виявився більш надійним вектором клонування. Отже, більшість конструкцій, описаних в цій заявці, були спочатку отримані в системі рЕТ30, а потім піддані скринінгу на ефективність. Відібрані послідовності були потім перенесені в систему pAMG33 для подальшої ампліфікації. Послідовність FGF21 було ампліфіковано в реакційній суміші, яка містила 40,65 мкл dH20, 5 мкл реакційного буферу PfuUltra II Reaction Buffer (10x), 1,25 мкл dNTP Mix (40 мМ - 4 × 10 мМ), 0,1 мкл матриці Template (100 нг/мл), 1 мкл Праймер1 (10 мкМ), 1 мкл Праймер2 (10 μΜ), і 1 мкл полімерази ДНК PfuUltra II fusion HS (Stratagene; La Jolla, CA). Реакції ампліфікації здійснювались шляхом нагрівання впродовж 2 хвилин при 95 °C, після чого йшли десять циклів при 95 °C по 20 секунд, 60 °C впродовж 20 секунд (з додатковим зниженням на 1 °C на цикл), і 72 °C впродовж 15 секунд/тисячу пар нуклеотидів бажаного продукту; потім 20 циклів при 94 °C впродовж 20 секунд, 55 °C впродовж 20 секунд, і 72 °C впродовж 15 секунд/тисячу пар нуклеотидів бажаного продукту; потім 72 °C впродовж 3 хвилин. Продукти ампліфікації розщеплювались рестрикційними ендонуклеазами NdeI, DpnI і EcoRI; вводились у відповідний вектор; а потім трансформувались в компетентні клітини. 24 UA 102395 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Приклад 2 Очистка білків FGF21, що походять від бактерій В наступних Прикладах різні білки FGF21, включаючи поліпептид FGF21 дикого типу, усічені поліпептиди FGF21, мутанти FGF21 і злиті білки FGF21, отримувались в бактеріальній системі експресії. Після експресії, яка описується далі, білки FGF21 піддавались очистці, як описано в цьому Прикладі, коли не зазначається інше. Щоб очистити поліпептид FGF21 дикого типу, усічені поліпептиди FGF21 і мутанти FGF21 від бактеріальних включень, двічі промиті тільця включень (DWIB) солюбілізували в буфері для надання розчинності, який містить гуанідин гідрохлорид і DTT (дитіотреїтол) в буфері Tris, при рН 8,5, потім перемішували впродовж однієї години при кімнатній температурі і додавали цю суміш до буферу для перезгортання, який містить сечовину, аргінін, цистеїн і цистаміну гідрохлорид, при рН 9,5, а потім перемішували впродовж 24 годин при 5 °C (дивись, наприклад, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph et al., 1997, "Folding proteins" Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press) 57-99; та Ishibashi et al., 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6). Після солюбілізації і перезгортання суміш фільтрували через 0,45-мкм фільтр. Отриманий матеріал потім концентрували приблизно 10-кратно з використанням відсічної касети Pall Omega молекулярної ваги 10 кД при трансмембранному тиску (ТМР) 20 psi (137,9 кПа) і двічі фільтрували 3 об'ємами колонки 20 мМ Tris, pH 8,0 при трансмембранному тиску 20 psi (137,9 кПа). Освітлений зразок потім піддавали аніонообмінній хроматографії (AEX) з використанням смоли Q Sepharose HP. Лінійний градієнт солі від 0 до 250 мМ NaCl в 20 мМ Tris запускали при pH 8,0 при 5 °C. Пікові фракції аналізували за допомогою SDS-PAGE (електрофорез в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію) і об'єднували. Об'єднаний елюат АЕХ потім піддавали хроматографії з гідрофобною взаємодією (НІС) з використанням смоли Phenyl Sepharose HP. Білок вимили з використанням понижуючого лінійного градієнту від 0,7 М до 0 М амонію сульфату при рН 8,0 і температурі оточуючого середовища. Пікові фракції аналізували за допомогою SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) і об'єднували. Матеріал після хроматографії з гідрофобною взаємодією (НІС) концентрували з використанням 2 відсічної касети Pall Omega 0,2 м молекулярної ваги 10 кД при трансмембранному тиску (ТМР) 20 psi (137,9 кПа). Концентрат фільтрували, використовуючи 5 об'ємів колонки 10 мМ KPO4, 5 % сорбіт, pH 8,0 при трансмембранному тиску (ТМР) 20 psi (137,9 кПа), а отриманий концентрат розвели до 5 мг/мл. Насамкінець, розчин профільтрували через мембрану Pall mini-Kleenpac 0,2 мкМ Posidyne. Щоб очистити злиті білки FGF21 і злиті мутантні білки FGF21 від бактеріальних включень, двічі промиті тільця включень (DWIB) солюбілізували в буфері для надання розчинності, який містить гуанідин гідрохлорид і DTT (дитіотреїтол) в буфері Tris, при рН 8,5, потім перемішували впродовж однієї години при кімнатній температурі і додавали цю суміш до буферу для перезгортання, який містить сечовину, аргінін, цистеїн і цистаміну гідрохлорид, при рН 9,5, а потім перемішували впродовж 24 годин при 5 °C (дивись, наприклад, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph et al., 1997, "Folding proteins" Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press) 5799; та Ishibashi et al., 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6). Після солюбілізації і перезгортання суміш піддавали діалізу проти 5 об'ємів 20 мМ Tris, pH 8,0 з використанням 10-кД діалізної трубки. Величину рН діалізованого матеріалу відрегулювали до 5,0 за допомогою 50 % оцтової кислоти, після чого освітлили центрифугуванням впродовж 30 хвилин при 4К. Освітлений зразок потім піддавали аніонообмінній хроматографії (AEX) з використанням смоли Q Sepharose HP. Лінійний градієнт солі від 0 до 250 мМ NaCl в 20 мМ Tris запускали при pH 8,0 при 5 °C. Пікові фракції аналізували за допомогою SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) і об'єднували. Об'єднаний елюат АЕХ потім піддавали хроматографії з гідрофобною взаємодією (НІС) з використанням смоли Phenyl Sepharose HP. Білок вимили з використанням понижуючого лінійного градієнту від 0,7 М до 0 М амонію сульфату при рН 8,0 і температурі оточуючого середовища. Пікові фракції аналізували за допомогою SDS-PAGE і об'єднали. Після етапу НІС матеріал піддавали діалізу 60 об'ємами 10 мМ Tris, 2,2 % сахарози, 3,3 % сорбіту, pH 8,5. Діалізований матеріал концентрували до 5 мг/мл з використанням пристрою TM Jumbosep . Насамкінець, розчин профільтрували через мембрану Pall mini-Kleenpac 0,2 мкМ Posidyne 60 25 UA 102395 C2 5 Приклад 3 Приготування і експресія усічених білків FGF21 Конструкції, кодуючі усічені білки FGF21, наведені в Таблиці 3, були отримані за допомогою ампліфікації ПЛР вектору експресії FGF21 дикого типу, як описано далі (конструкцію вектору експресії FGF21 дикого типу описано в Прикладі 1). Таблиця 3 Усічення FGF21 Амінокислотні залишки 1-180 1-179 1-178 1-177 1-176 1-175 1-174 1-173 1-172 1-171 1-169 1-168 1-167 1-166 1-165 1-164 1-160 1-156 1-152 1-149 1-113 2-181 3-181 4-181 5-181 6-181 7-181 8-181 9-181 5-174 7-172 9-169 9-149 15-169 15-149 15-113 Кількість усічених залишків* C-термінальні усічення 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14 15 16 17 21 25 29 32 68 N-термінальні усічення 1 2 3 4 5 6 7 8 С- і N-термінальні усічення 11 17 20 40 26 46 82 *Відносно зрілого поліпептиду FGF21 10 Конструкції усічених білків FGF21 були отримані з використанням праймерів з послідовностями, що є гомологічними ділянкам до і після кодону (кодонів), який має бути видалений (приводячи до усічення). Праймери, використовувані в таких реакціях ампліфікації, також давали приблизно 15 нуклеотидів послідовності, що перекривається, для забезпечення рециркуляризації ампліфікованого продукту, а саме повного вектору, який тепер містить бажаний мутант. 26 UA 102395 C2 Показова конструкція усіченого FGF21, кодуюча білок FGF21, який не має гістидинового залишку в позиції 1 зрілої послідовності FGF21 (тобто, є мутантом з усіченням 2-181), було отримано з використанням праймерів, наведених в Таблиці 4. Таблиця 4 Праймери ПЛР для отримання показового усіченого мутанту FGF21 Праймер Послідовність Смисловий 5'-GGAGATATACATATGCCAATTCCAGATTCTTCTCCATTATT-3' Антисмисловий 5'-CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAA-3' SEQ ID №: 7 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Праймери, наведені в Таблиці 4, забезпечують делецію гістидинового залишку, як показано далі, коли верхня послідовність (SEQ ID №: 10) є частиною зрілого поліпептиду FGF21, що містить N-термінальний метіонін, друга послідовність є смисловим праймером (SEQ ID №: 7), третя і четверта послідовності (SEQ ID №№: 11 і 12) є частинами конструкції експресії FGF21, а п'ята послідовність є антисмисловим праймером (SEQ ID №: 9). Конструкції усічених білків FGF21 були отримані фактично з використанням умов ПЛР, описаних в Прикладі 1. Продукти ампліфікації варили з рестрикційною ендонуклеазою DpnI, а потім трансформували в компетентні клітини. Результуючі клони були секвеновані для підтвердження відсутності генерованих полімеразою похибок. Усічені білки FGF21 експресувались шляхом трансформації компетентних клітин BL21 (DE3) чи BL21 Star (Invitrogen; Carlsbad, CA) конструкцією, що кодує конкретний усічений білок FGF21. Трансформанти вирощувались впродовж ночі при обмеженій аерації в середовищі ТВ, доповненому 40 мкг/мл канаміцину. Наступного ранку вмикали аерацію, і після короткого відновлювального періоду трансформанти індукували в 0,4 мМ IPTG (ізопропилтіогалактозиду). Мутанти FGF21 збирались центрифугуванням через 18-20 годин після індукції. Приклад 4 Активність усічених білків FGF21 in vitro Були проведені експерименти для ідентифікації усічених білків FGF21, які зберігають активність FGF21 дикого типу в пробі на ELK-люциферазу in vitro. В Таблиці 5 підсумовано результати, отримані для білків FGF21, що мають усічення на N-кінці, С-кінці і на обох N-кінці і С-кінці. Проби на ELK-люциферазу здійснювались з використанням системи рекомбінантних людських ниркових клітин 293Т, в якій клітини 293Т надекспресують конструкції бета-клото і репортеру люциферази. Ці конструкції також містять послідовності, кодуючі GAL4-ELK1 і 5xUASLuc, репортер люциферази, який запускається промотором, що містить п'ять тандемних копій сайту зв'язування Gal4. Бета-клото – це ко-рецептор, що є необхідним для FGF21 для активації своїх рецепторів FGF та індукції внутрішньоклітинної трансдукції сигналів, яка, в свою чергу, приводить до фосфорилювання Erk і ELK. Активність люциферази регулюється рівнем фосфорильованих Erk/ELK і використовується для того, щоб опосередковано контролювати і кількісно оцінювати активність FGF21. Проби на ELK-люциферазу здійснювались шляхом культивування клітин 293Т в присутності різних концентрацій FGF21 дикого типу чи поліпептидів-мутантів FGF21 впродовж 6 годин і наступного аналізу клітинних лізатів на активність люциферази. На Фіг. 1А-1В показані результати проб на активність люциферази, здійснених на усічених мутантах FGF21 7-181 і 8181 (Фіг. 1A) і усічених мутантах FGF21 1-172, 1-171, 1-169 і 1-164 (Фіг. 1B). Люмінесценція, отримана в пробах на ELK-люциферазу для кожного з усічених мутантів FGF21 3-181, 4-181, 5181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 і 1-149, показана на Фіг.2. 27 UA 102395 C2 Поліпептиди-мутанти FGF21 порівнювались зі стандартом FGF21 дикого типу і мутанти, які демонстрували ефективність щонайменше 50 % від ефективності FGF21 дикого типу, вважались такими, що не втратили активності FGF21 (вони були позначені «+» в Таблиці 5). Таблиця 5 Усічені білки FGF21: аналіз in vitro Амінокислотні залишки 1-180 1-178 1-177 1-176 1-174 1-173 1-172 1-171 1-169 1-167 1-166 1-165 Амінокислотні залишки 2-181 3-181 4-181 5-181 7-181 8-181 9-181 C-термінальні усічення Ефективність 93,2 % 95,0 % 112,0 % 104,8 % 104,6 % 96,1 % 97,5 % 113,0 % 84,9 % 20 % 20 % 10 % N-термінальні усічення Ефективність 112,5 % 130,3 % 117,0 % 119,6 % 74,2 % 24,9 % 12,5 % Активність (+/-) + + + + + + + + + Активність (+/-) + + + + + 5 10 15 20 25 30 Взяті разом, представлені в Таблиці 5 результати засвідчують, що С-термінальні делеції 14 і більше амінокислотних залишків (тобто, С-термінально усічений білок FGF21, що складається з амінокислотних залишків 1-167, і коротші білки) ліквідують активність FGF21. До того ж, Таблиця 5 засвідчує, що N-термінальні делеції 7 і більше амінокислотних залишків (тобто, Nтермінально усічений білок FGF21, що складається з амінокислотних залишків 8-181, і коротші білки) ліквідують активність FGF21. Не дивно, що усічені білки FGF21, що одночасно мають Nтермінальне усічення від 8 до 14 залишків і С-термінальне усічення з 12 чи 32 залишків, демонстрували відсутність активності в пробах на ELK-люциферазу. Узгоджуючись з даними, представленими в Таблиці 5, усічені поліпептиди FGF21 з Nтермінальними усіченнями, меншими ніж 7 амінокислотних залишків, становлять варіанти здійснення цього винаходу. Подібно до цього, усічені поліпептиди FGF21 з С-термінальними усіченнями, меншими ніж 13 амінокислотних залишків, також становлять варіанти здійснення даного винаходу. Приклад 5 Активність усічених білків FGF21 in vivo FGF21 володіє низкою біологічних активностей, включаючи здатність знижувати рівні глюкози, інсуліну, тригліцеридів чи холестерину в крові; зменшувати вагу тіла; чи поліпшувати толерантність до глюкози, енергетичні витрати чи чутливість до інсуліну. Усічені поліпептиди FGF21 додатково аналізувались на активність FGF21 in vivo шляхом введення резистентним до інсуліну мишам ob/ob і визначення здатності конкретного усіченого поліпептиду FGF21 знижувати рівень глюкози у крові. Усічений поліпептид FGF21, що тестується, ін'єктували інтраперитонеально 8-тижневій миші ob/ob (Jackson Laboratory), і через різні інтервали часу після однократного введення, наприклад через 0, 6, 24, 72, 120 і 168 годин, брали зразки крові. Рівні глюкози у крові визначали за допомогою глюкометру OneTouch Glucometer (LifeScan, Inc. Milpitas, CA), а результати виражали як відсоток зміни рівня глюкози у крові відносно вихідного рівня (тобто, в 0 годин). 28