Теплостабільні мутанти ферментів біосинтезу крохмалю

1. Полінуклеотид, що кодує мутантну велику субодиницю поліпептиду рослинної ендоспермної АДФ-глюкозопірофосфорилази або біологічно активний фрагмент згаданого мутантного поліпептиду, причому згаданий мутантний поліпептид включає амінокислотні мутації у дво х або більше сайтах амінокислотної послідовності згаданого поліпептиду, та такий, що, коли згаданий мутантний поліпептид експресується з малою субодиницею АДФ-глюкозопірофосфорилази з утворенням мутантного ферменту АДФглюкозопірофосфорилази, то згаданий мутантний фермент або біологічно активний фрагмент згаданого мутантного ферменту демонструє підвищену теплостабільність і/або підвищену ферментну активність у порівнянні з ферментом АДФглюкозопірофосфорилази дикого типу, де згаданий мутантний поліпептид, що кодується згаданим полінуклеотидом, включає першу амінокислотну мутацію, де гістидин в згаданому поліпептиді, що знаходиться у положенні 333 амінокислотної послідовності великої субодиниці дикого типу АДФглюкозопірофосфорилази кукурудзи, замінений амінокислотою, що забезпечує згадане збільшення теплостабільності і/або підвищення ферментної активності згаданого мутантного ферменту, і де 2 (19) 1 3 84669 теплостабільність і/або підвищену ферментну активність у порівнянні з ферментом АДФглюкозопірофосфорилази дикого типу, де згаданий мутантний поліпептид, що кодується згаданим полінуклеотидом, включає першу амінокислотну мутацію, де аланін в згаданому поліпептиді, що знаходиться у положенні 177 амінокислотної послідовності великої субодиниці дикого типу АДФглюкозопірофосфорилази кукурудзи, замінений амінокислотою, що забезпечує згадане збільшення теплостабільності і/або підвищення ферментної активності згаданого мутантного ферменту, і де згаданий мутантний поліпептид, що кодується згаданим полінуклеотидом, включає другу амінокислотну мутацію, де аланін в згаданому поліпептиді, що знаходиться у положенні 396 амінокислотної послідовності великої субодиниці дикого типу АДФ-глюкозопірофосфорилази кукурудзи, замінений амінокислотою, що забезпечує згадане збільшення теплостабільності і/або підвищення ферментної активності згаданого мутантного ферменту. 9. Полінуклеотид за п.8, де амінокислота, що замінює аланін у положенні 177, являє собою пролін. 10. Полінуклеотид за п.8, де амінокислота, що замінює аланін у положенні 177, являє собою валін. 11. Полінуклеотид за будь-яким з пунктів 8-10, де амінокислота, що замінює аланін у положенні 396, являє собою валін. 12. Полінуклеотид, що кодує мутантну велику субодиницю поліпептиду рослинної ендоспермної АДФ-глюкозопірофосфорилази або біологічно активний фрагмент згаданого мутантного поліпептиду, причому згаданий мутантний поліпептид включає амінокислотні мутації у дво х або більше сайтах амінокислотної послідовності згаданого поліпептиду, та такий, що, коли згаданий мутантний поліпептид експресується з малою субодиницею АДФ-глюкозопірофосфорилази з утворенням мутантного ферменту АДФглюкозопірофосфорилази, то згаданий мутантний фермент або біологічно активний фрагмент згаданого мутантного ферменту демонструє підвищену теплостабільність і/або підвищену ферментну активність у порівнянні з ферментом АДФглюкозопірофосфорилази дикого типу, де згаданий мутантний поліпептид, що кодується згаданим полінуклеотидом, включає першу амінокислотну мутацію, де гістидин в згаданому поліпептиді, що знаходиться у положенні 333 амінокислотної послідовності великої субодиниці дикого типу АДФглюкозопірофосфорилази кукурудзи, замінений амінокислотою, що забезпечує згадане збільшення теплостабільності і/або підвищення ферментної активності згаданого мутантного ферменту, і де згаданий мутантний поліпептид, що кодується згаданим полінуклеотидом, включає другу амінокислотну мутацію, де аланін в згаданому поліпептиді, що знаходиться у положенні 396 амінокислотної послідовності великої субодиниці дикого типу АДФ-глюкозопірофосфорилази кукурудзи, замінений амінокислотою, що забезпечує згадане збільшення теплостабільності і/або підвищення ферментної активності згаданого мутантного ферменту. 13. Полінуклеотид за п.12, де амінокислота, що замінює гістидин у положенні 333, вибрана з групи, 4 яка складається з тирозину, фенілаланіну, метіоніну, гліцину, серину, треоніну, цистеїну, аспарагіну та глутаміну. 14. Полінуклеотид за п.12, де амінокислота, що замінює гістидин у положенні 333, являє собою тирозин. 15. Полінуклеотид за п.12, де амінокислота, що замінює гістидин у положенні 333, являє собою фенілаланін. 16. Полінуклеотид за п.12, де амінокислота, що замінює гістидин у положенні 333, являє собою метіонін. 17. Полінуклеотид за будь-яким з пунктів 12-16, де амінокислота, що замінює аланін у положенні 396, являє собою валін. 18. Полінуклеотид, що кодує мутантну велику субодиницю поліпептиду рослинної ендоспермної АДФ-глюкозопірофосфорилази або біологічно активний фрагмент згаданого мутантного поліпептиду, причому згаданий мутантний поліпептид включає амінокислотні мутації у дво х або більше сайтах амінокислотної послідовності згаданого поліпептиду, та такий, що, коли згаданий мутантний поліпептид експресується з малою субодиницею АДФ-глюкозопірофосфорилази з утворенням мутантного ферменту АДФглюкозопірофосфорилази, то згаданий мутантний фермент або біологічно активний фрагмент згаданого мутантного ферменту демонструє підвищену теплостабільність і/або підвищену ферментну активність у порівнянні з ферментом АДФглюкозопірофосфорилази дикого типу, де згаданий мутантний поліпептид, що кодується згаданим полінуклеотидом, включає першу амінокислотну мутацію, де гістидин в згаданому поліпептиді, що знаходиться у положенні 333 амінокислотної послідовності великої субодиниці дикого типу АДФглюкозопірофосфорилази кукурудзи, замінений амінокислотою, що забезпечує згадане збільшення теплостабільності і/або підвищення ферментної активності згаданого мутантного ферменту, і де згаданий мутантний поліпептид, що кодується згаданим полінуклеотидом, включає другу амінокислотну мутацію, де аланін в згаданому поліпептиді, що знаходиться у положенні 177 амінокислотної послідовності великої субодиниці дикого типу АДФ-глюкозопірофосфорилази кукурудзи, замінений амінокислотою, що забезпечує згадане збільшення теплостабільності і/або підвищення ферментної активності згаданого мутантного ферменту, і де згаданий мутантний поліпептид, що кодується згаданим полінуклеотидом, включає третю амінокислотну мутацію, де аланін в згаданому поліпептиді, що знаходиться у положенні 396 амінокислотної послідовності великої субодиниці дикого типу АДФ-глюкозопірофосфорилази кукурудзи, замінений амінокислотою, що забезпечує згадане збільшення теплостабільності і/або підвищення ферментної активності згаданого мутантного ферменту. 19. Полінуклеотид за п.18, де амінокислота, що замінює гістидин у положенні 333, вибрана з групи, яка складається з тирозину, фенілаланіну, метіоніну, гліцину, серину, треоніну, цистеїну, аспарагіну та глутаміну. 5 84669 20. Полінуклеотид за п.18, де амінокислота, що замінює гістидин у положенні 333, являє собою тирозин. 21. Полінуклеотид за п.18, де амінокислота, що замінює гістидин у положенні 333, являє собою фенілаланін. 22. Полінуклеотид за п.18, де амінокислота, що замінює гістидин у положенні 333, являє собою метіонін. 23. Полінуклеотид за будь-яким з пунктів 18-22, де амінокислота, що замінює аланін у положенні 177, являє собою пролін. 24. Полінуклеотид за будь-яким з пунктів 18-22, де амінокислота, що замінює аланін у положенні 177, являє собою валін. 25. Полінуклеотид за будь-яким з пунктів 18-22, де амінокислота, що замінює аланін у положенні 396, являє собою валін. 26. Полінуклеотид за будь-яким з попередніх пунктів, де згаданий мутантний білок також включає амінокислотну мутацію, що забезпечує підвищену вагу насіння у рослини, що експресує згаданий полінуклеотид. 27. Полінуклеотид за п.26, де згаданий полінуклеотид включає мутацію Rev6. 28. Полінуклеотид за п.26 або п.27, де згаданий полінуклеотид кодує велику субодиницю ферменту AGP, в якому принаймні один залишок серину вбудований між амінокислотами, що відповідають номерам 494 та 495 амінокислотної послідовності поліпептиду дикого типу великої субодиниці АДФглюкозопірофосфорилази кукурудзи нативної субодиниці ферменту AGP. 29. Полінуклеотид за п.28, де згаданий полінуклеотид кодує велику субодиницю ферменту AGP, в якому принаймні одна пара амінокислот тирозин:серин вбудована між амінокислотами, що відповідають номерам 494 та 495 амінокислотної послідовності поліпептиду дикого типу великої субодиниці АДФ-глюкозопірофосфорилази кукурудзи нативної субодиниці ферменту AGP. 30. Полінуклеотид за п.26 або п.27, де згаданий полінуклеотид кодує велику субодиницю ферменту AGP, в якому принаймні одна пара амінокислот серин:тирозин вбудована між амінокислотами, що відповідають номерам 495 та 496 амінокислотної послідовності поліпептиду дикого типу великої субодиниці АДФ-глюкозопірофосфорилази кукурудзи нативної субодиниці ферменту AGP. 31. Полінуклеотид за будь-яким з пунктів 1-30, де згаданою рослиною є злак. 32. Полінуклеотид за п.31, де згаданим злаком є рис. 33. Полінуклеотид за п.31, де згаданим злаком є пшениця. 34. Полінуклеотид за п.31, де згаданим злаком є ячмінь. 35. Полінуклеотид за п.31, де згаданим злаком є овес. 36. Полінуклеотид за п.31, де згаданим злаком є сорго. 37. Полінуклеотид за п.31, де згаданим злаком є кукурудза. 38. Полінуклеотид за п.31, де згаданим злаком є просо. 6 39. Спосіб підвищення резистентності рослини до умов теплового стресу, де спосіб включає вбудовування полінуклеотиду згідно з будь-яким з попередніх пунктів у згадану рослину та експресію білка, що кодується згаданим полінуклеотидом. 40. Спосіб за п.39, в якому вказана рослина являє собою однодольну рослину. 41. Спосіб за п.40, в якому вказана однодольна рослина вибрана з групи, яка складається з рису, пшениці, ячменю, вівса, сорго, кукурудзи, лілії і проса. 42. Спосіб за п.39, в якому вказана рослина являє собою Zea mays. 43. Спосіб за п.39, в якому вказана рослина являє собою дводольну рослину. 44. Спосіб за п.43, в якому вказана дводольна рослина вибрана з групи, яка складається з гороху, люцерни, турецького гороху, цикорію, конюшини, кормової капусти, сочевиці, трави для газонів, сої, тютюн у, картоплі, топінамбура, редиски, качанної капусти, рапсу, яблуні і салату-латука. 45. Спосіб підвищення ферментної активності АДФ-глюкозопірофосфорилази рослини, де спосіб включає вбудовування полінуклеотиду згідно з будь-яким з пунктів 1-38 у згадану рослину та експресію білка, що кодується згаданим полінуклеотидом. 46. Спосіб за п.45, в якому вказана рослина являє собою однодольну рослину. 47. Спосіб за п.46, в якому вказана однодольна рослина вибрана з групи, яка складається з рису, пшениці, ячменю, вівса, сорго, кукурудзи, лілії і проса. 48. Спосіб за п.45, в якому вказана рослина являє собою Zea mays. 49. Спосіб за п.45, в якому вказана рослина являє собою дводольну рослину. 50. Спосіб за п.49, в якому вказана дводольна рослина вибрана з групи, яка складається з гороху, люцерни, турецького гороху, цикорію, конюшини, кормової капусти, сочевиці, трави для газонів, сої, тютюн у, картоплі, топінамбура, редиски, качанної капусти, рапсу, яблуні і салату-латука. 51. Рослинна клітина, що включає полінуклеотид за будь-яким з пунктів 1-38. 52. Рослинна клітина за п.51, де згадана рослинна клітина є клітиною однодольної рослини. 53. Рослинна клітина за п.52, причому згадана клітина однодольної рослини вибрана з групи, яка складається з клітин рису, пшениці, ячменю, вівса, сорго, кукурудзи, лілії і проса. 54. Рослинна клітина за п.51, де згадана рослинна клітина є клітиною Zea mays. 55. Рослинна клітина за п.51, де згадана рослинна клітина є клітиною дводольної рослини. 56. Рослинна клітина за п.55, де згадану клітину дводольної рослини вибрано з групи, яка складається з клітини гороху, люцерни, турецького гороху, цикорію, конюшини, кормової капусти, сочевиці, трави для газонів, сої, тютюну, картоплі, топінамбура, редиски, качанної капусти, рапсу, яблуні, салату-латука. 57. Мутант великої субодиниці поліпептиду рослинної ендоспермної АДФглюкозопірофосфорилази або біологічно активного 7 84669 8 фрагменту згаданого поліпептиду, що кодується полінуклеотидом згідно з будь-яким з пунктів 1-38. 58. АДФ-глюкозопірофосфорилаза рослини, що включає мутант великої субодиниці за п.57. 59. Рослина або рослинна тканина, що включає або трансформована полінуклеотидом згідно з будь-яким з пунктів 1-38. 60. Рослина або рослинна тканина за п.59, де згадана рослина або рослинна тканина є однодольною. 61. Рослина або рослинна тканина за п.60, де згадана однодольна рослина або рослинна тканина вибрана з групи, яка складається з рису, пшениці, ячменю, вівса, сорго, кукур удзи, лілії і проса. 62. Рослина або рослинна тканина за п.59, де згадана рослина або рослинна тканина являє собою Zea mays. 63. Рослина або рослинна тканина за п.59, де згадана рослина або рослинна тканина є дводольною. 64. Рослина або рослинна тканина за п.63, де згадана дводольна рослина або рослинна тканина вибрана з групи, яка складається з гороху, люцерни, турецького гороху, цикорію, конюшини, кормової капусти, сочевиці, трави для газонів, сої, тютюну, картоплі, топінамбура, редиски, качанної капусти, рапсу, яблуні, салату-латука. Даний винахід було зроблено за підтримки уряду в межах гранту державного наукового фонду під номером 9316887. Пункти формули даної заявки базуються на пріоритеті попередньої заявки США, що має порядковий номер 60/275,768 та подана 14 березня 2001 року. Природа життя рослин, що характеризується нездатністю до пересування, породжує постійний вплив факторів навколишнього середовища, що спричинює позитивні та негативні впливи на їх ріст та розвиток. Одна з основних перешкод, з якими зіштовхується сільське господарство, полягає у шкідливому впливі умов навколишнього середовища. Одним з важливих факторів, які спричинюють значні втрати врожаю, є тепловий стрес. Температурний стрес у значній мірі зменшує врожай багатьох зернових культур, таких, як кукурудза, пшениця та ячмінь. Втрати врожаю з причини теплового . стресу коливаються в межах від 7 до 35% для важливих злакових культур, що поширені в усьому світі. За допомогою ряду досліджень було ідентифіковано можливі фізіологічні наслідки теплового стресу. Ранні роботи Hunter та ін. (Hunter, R.B., Tollenaar, M. та Breuer, C M. [1977] Can.J.PIant Sci. 57:1127-1133) при використанні умов ростових камер показали, що температура зменшує тривалість періоду виповнення зерна у кукурудзи. Подібні результати, в яких тривалість періоду виповнення зерна була несприятливим чином змінена при впливі підвищених температур, були ідентифіковані Tollenaar та Bruulsema (Tollenaar, M. та Bruulsema, T.W. [1988] Can.J.PIant Sci. 68: 935940). Badu-Apraku та ін. (Badu-Apraku, В., Hunter, R.B. та Tollenaar, M. [1983] Cam.J.PIant.Sci. 63: 357-363) визначали значне зменшення врожаю кукурудзи при температурному режимі день/ніч 35/15°С у порівнянні з тими, що вирощувалися при температурному режимі 25/15°С. Знижений з причини підвищених температур врожай також підтверджується як історичними, так і кліматологічними дослідженнями (Thompson, L.M. [1986] Agron.J. 78: 649-653; Thompson, L.M. [1975] Science 188: 535-541; Chang, J. [1981] Agricul.Metero, 24: 253-262; та Conroy, J.P., Seneweera, S., Basra, A.S., Rogers, G., та NissenWooller, B. [1994] Aust.J.PIant Physiol. 21: 741-758). Той факт, що фізіологічні процеси розвитку насіння піддаються шкідливому впливові теплового стресу, є очевидним з досліджень, що використовують систему in vitro культури зародків (Jones, R.J., Gengenbach, B.G., та Cardwell, V.B. [1981] Crop Science 24: 761-766; Jones, R.J., Ouattar, S., та Crookston, P.K. [1984] Crop Science 24: 133-137; та Cheikh, N. Та Jones, R.J. [995] Physiol.Plant. 95: 59-66). Зародки кукурудзи, які культивують при температурі 35°С, яка є вищою за оптимальну, демонструють значне зменшення ваги. Робота з пшеницею дала змогу ідентифікувати втрату активності розчинної синтази крохмалю (SSS) як ознаку відповіді ендосперму пшениці на тепловий стрес (Hawker, J.S. та Jenner, C.F. [1993] Aust.J.PIant Phisiol. 20: 197-209; Denyer, K., H ylton, СМ., та Smith А.М. [1994] AustJ.PIantPhysiol. 21: 783-789; Jenner, C.F. [1994] Aust.J.PIant Phisiol. 21; 791-806). Додаткові дослідження з SSS ендосперму пшениці показали, що вона є теплолабільною (Reijven, A.H.G.C. [1986] Plant Physiol. 81: 448-453; Keeling, P.L., Bacon, P.J., Holt, D.C. [1993} Planta 191: 342-348; Jenner, C.F., Denyer, К., та Guerin, J. [1995] AustJ.PIant Phisiol. 22: 703-709). Роль SSS та АДФ глюкозо-1-фосфатаденілілтрансферази (AGP) в умовах теплового стресу у кук урудзи є менш зрозумілою. AGP каталізує перетворення АТФ та а-глюкозо-1-фосфату в АДФ-глюкозу та пірофосфат. АДФ-глюкоза використовується як донор глікозилу при біосинтезі крохмалю рослинами та у біосинтезі глікогену у бактерій. Важливість АДФ глюкозо-1-фосфатаденілілтрансферази як ключового ферменту у регуляції біосинтезу крохмалю було відзначено у дослідженні мутантів кукур узи (Zea Mays), що мають дефіцит крохмалю в ендоспермі (Tsai, C.Y., та Nelson, Jr., О.Е. [1966] Science 151: 341-343; Dickinson, D.B., J. Preiss [1969] Plant Physiol. 44:1058-1062). Ou-Lee та Setter (Ou-Lee, Т. та Setter, T.L. [1985] Plant Physiol. 79: 852-855) перевіряли впливи температури на апікальні або верхівкові ділянки качанів кукурудзи. При підвищених температурах активність AGP більш низькою в апікальних зернинах при порівнянні з базальними зернинами під час інтенсивного запасання крохмалю. На противагу цьому, у зернинах, що розвивалися при нормальних температурах, активність AGP була одна 9 84669 ковою в апікальних та базальних зернинах під час цього періоду. Проте активність синтази крохмалю під час цього періоду диференційно не зачіпалась в апікальних та базальних зернинах. Крім того, апікальні зернини, які піддавали тепловій обробці, демонстрували підвищення активності синтази крохмалю понад контролем. Цього не спостерігали для активності AGP. Singletary та ін. (Singletary, G.W., Banisadr, R., та Keeling, P.L. [1993] Plant Physiol. 102: 6 (додатк..); Singletary, G.W., Banisadra, R., Keeling, P.L [1994] Aust.J.PIant Physiol. 21: 829-841) при використанні системи культури in vitro кількісно оцінювали вплив різних температур під час періоду виповнення зерна. Вага насіння незмінно зменшувалася при підвищенні температури від 22 до 36°С. Значення AGP у втратах врожаю також підтримується роботою Duke та Doehlert (Duke, E.R. та Doehlert, D.C. [1996] Environ. Exp. Botan y. 36:199-208). Робота Keeling та ін. (1994, вище) кількісно оцінює активність SSS у кукурудзі та пшениці при використанні аналізу Q10 та показує, що SSS є важливою контрольною точкою у потоці вуглецю у крохмаль. Біохімічні дослідження in vitro з AGP та SSS ясно свідчать, що обидва ферменти є теплолабільними. AGP ендосперму кукурудзи на 96% втрачає свою активність при прогріванні при 57°С протягом 5 хвилин (Hannah, L.C., Tuschall, D.M. та Mans, R.J. [1980] Genetics 95: 961-970). Це знаходиться у протиріччі з AGP картоплі, яка є повністю стабільною при температурі 70°С (Sowokinos, J.R. та Preiss, J. [1982] Plant Physiol. 69: 1459-1466; Okita, T.W., Nakata, P.A., Anderson, J.M., Sowokinos, J., Morell, J., та Preiss, J. [1990] Plant Physiol. 93: 785-90). Дослідження з теплової інактивації SSS показали, що вона також є лабільною при високих температурах, а кінетичні дослідження визначили, що значення Кm для амілопектину зростає експоненціально, якщо температура підвищується від 25 до 45°С (JennerTa ін., 1995, вище). Біохімічні та генетичні дослідження ідентифікували AGP як ключовий фермент у біосинтезі крохмалю у вищи х рослинах та у синтезі глікогену в E.coli (Preiss, J. та Romeo, Т. [1994] Progress in Nuc.Acid Res. And Мої Biol. 47: 299-329; Preiss, J. та Sivak, M. [1996] "Starch synthesis in sinks and sources", In "Photoassimilate distribution in plants and crops: source-sink relationships. Zamski, E., ред. Marcil Dekker Inc. pp. 139-168). AGP каталізує те, що розглядається як початковий етап на шляху біосинтезу крохмалю, при цьому продукт реакції є активованим донором глюкозилу, АДФ глюкозою. Вона використовується синтазою крохмалю для подовження полісахаридного полімера (розглядається у Hannah, L. Curtis [1996] "Starch synthesis in the maize endosperm", In: "Ad vances in cellular and Molecular Biology of Plants, VoU.B.A. Larkins та I.K.Vasil (ред.) Cellular and Molecular Biology of Plant Seed Development. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands). Попереднє дослідження AGP картоплі показали, що експресія в E.coli дає фермент з алостеричними та кінетичними властивостями, що дуже 10 подібні до ферменту, виділеного з непошкоджених бульб (Iglesias, A., Barry, G.F., Me yer, C, Bloksberg, L, Nakata, P., Greene, Т., Laughlin, M.J., Okita, T.W., Kishore, G.M., та Preiss, J. [1993] J.Biol Chem. 268: 1081-86; Ballicora, M.A., Laughlin, M.J., Fu, Y., Okita, T.W., Barry, G.F. та Preiss, J. [1995] Plant Physiol. 109: 245-251). Green та ін. (Greene, T.W., Chantler, S.E., Kahn, M.L, Barry, G.F., Preiss, J., та Okita, T.W. [1996] Proc.Natl.Acad.Sci. 93: 1509-1513; Greene, T.W., Woodbury, R.L, та Okita, T.W. [1996] Plant Physiol. (112: 1315-1320) показали корисність систем бактеріальної експресії в своїх стр уктурнофункціональних дослідженнях з AGP картоплі. Були ідентифіковані множинні мутації, важливі у картуванні алостеричних сайтів та сайтів зв'язування субстрату (Okita, T.W., Greene, T.W. Laughlin, M.J., Salamone, P., Woodbury, R., Choi, S., Ito, H., Ka vakli, H., та Stephens, K. [1996J "Engineering Crops for Industrial End Uses, Shewry, P.R., Napier, J.A., та Davis, P., ред. Portland Press Ltd., London). Ферменти AGP були ізольовані як з бактерій, так і з рослин. Бактеріальна AGP представляє собою гомотетрамер, у той час, як рослинна AGP з фотосинтетичних та нефотосинтетичних тканин є гетеротетрамером, що складається з двох різних субодиниць. Рослинний фермент кодується двома різними генами, причому одна субодиниця є більшою за іншу. Ця ознака спостерігається у ряді рослин. Субодиниці AGP листя шпинату мають молекулярну вагу 54 кДа та 51 кДа, як було визначено за допомогою SDS-поліакриламідного гелю. Обидві субодиниці є імунореактивними з антитілом проти очищеної AGP з листя шпинату (Copeland, L, J.Preiss (1981) Plant Physiol. 68: 9961001; Morell, M., M. Bloon, V. Knowles, J. Preiss [1988] J.Bio.Chem. 263: 633). Імунологічний аналіз при використанні антисироватки, приготовленої проти великої та малої субодиниць листя шпінату, показав, що AGP бульб картоплі також кодується двома генами (Okita та ін., 1990, вище). Також були ізольовані та секвеновані клони кДНК двох субодиниць бульб картоплі (масою 50 та 51 кДа) (Muller-Rober, B.T., J. Kossmann, L.C.Hannah, L Willmitzer, U. Sounewald [1990] Mol.Gen.Genet. 224: 136-146; Nakata, PA, T.W. Greene, J.M. Anderson, B.J. Smith-White, T.W.Okita, J.Preiss [1991] Plant Mol.Biol. 17: 1089-1093). Велика субодиниця AGP бульб картоплі є теплостабільною (Nakata та ін. [1991], вище). Як було постульовано Hannah та Nelson (Hannah, L.C., О.Е. Nelson (1975) Plant Physiol. 55: 297-302; Hannah, L.C. та Nelson, Jr., O.E. [1976] Biochem. Genet. 14:547-560), обидва гени Shrunken-2 (Sh2) (Bhave, M.R., S.Lawrence, C.Barton, L.C.Hannah [1990] Plant Cell 2: 581-588) та Brittle-2 (Bt2) (Bae, J.M., M.Giroux, LC.Hannah [1990] Maydica 35: 317-322) є структурними генами АДФ глюкозо-1-фосфат-аденілілтрансферази ендосперму кукурудзи. Sh2 та Bt2 кодують велику субодиницю та маленьку субодиницю ферменту, відповідно. З результатів секвенування кДНК було передбачено молекулярну вагу білків Sh2 та Bt2, яка складає 57,179 Да (Shaw, J.R., L.C.Hannah [1992] Plant Physiol. 98: 1214-1216) та 52,224 Да, 11 84669 відповідно. Ендосперм представляє собою сайт основного відкладання крохмалю під час розвитку зернин у кукурудзі. Sh2 та bt2 мутанти ендосперму кукурудзи мають значно знижені рівні крохмалю, що відповідають недостатнім рівням активності AGP. Мутації у будь-якому гені були показані як такі, що зменшують активність AGP приблизно на 95% (Tsai та Nelson, 1966, вище; Dickinson та Preiss, 1969, вище). Крім того, спостерігали, що ферментативні активності збільшуються згідно з кількістю функціональних алелів Sh2 та Bt дикого типу, у той час, як мутантні ферменти мають змінені кінетичні властивості. AGP представляє собою складову, що лімітує швидкість у процесі біосинтезу крохмалю у рослин. Stark та ін. поміщали мутантну форму AGP E.coli у бульби картоплі та одержували 35%-не збільшення вмісту крохмалю (Stark та ін. [1992] Science 258:287). Клонування та характеристика генів, які кодують субодиниці ферменту AGP, були проведені для різних рослин. Такі приклади включають кДНК Sh2 (Bhave та ін., 1990, вище), геномну ДНК Sh2 (Shaw та Hannah, 1992, вище) та кДНК Bt2 (Bae та ін., 1990, вище) з кукурудзи; кДНК маленької субодиниці (Anderson, J.M., J.Hnilo, R.Larson, T.W. Okita, M. Morell, J. Preiss [1989] J. Biol. Chem. 264: 12238-12242) та геномну ДНК (Anderson, J.M., R.Larson, D.Landencia, W.T.Kim, D.Morrow, T.W.Okita, J.Preiss [1991] Gene 97: 199-205), що виділена з рису; а також кДНК маленької та великої субодиниць з листя шпінату (МогеІІ та ін., 1988, вище) та бульб картоплі (Muller-Rober та ін., 1990, вище; ; Nakata, Р.А., Green, T.W., Anderson, J.W., Smith-White, B.J., Okita, T.W., та Preiss, J. [1991] Plant Mol.Biol. 17: 1089-1093). Крім того, були ізольовані клони кДНК з ендосперму пшениці та тканини листя (Olive, M.R., R.J. Ellis, W.W.Schuch [1989] Plant Physiol.Mol.Biol. 12: 525-538), а також з листя Arabidopsis thaliana (Lin, Т., Caspar, Т., Sommerville, C.R., та Preiss, J. [1988] Plant Physiol. 88: 1175-1181). Послідовності AGP ячменя були також описані в Ainsworth та ін. (Ainsworth.C, Hosein, F., Tarvis, M., Weir, F., Burrell, M., Devos, K.M., Gale, M.D. [1995]Planta). AGP функціонує як алостеричний фермент в усі х тканинах та організмах, досліджених на сьогоднішній день. Вперше було показано, що алостеричні властивості AGP є важливими в Е.соїі. Був ізольований мутант Е.соїі, що понадекспресує глікоген, та була картована мутація для структурного гена AGP, що був позначений як glyC. Мутант Е.соїі, відомий як glyC-16 був показаний як такий, що є більш чутливим до активатора, фруктозо-1,6біфосфату, та менш чутливим до інгібітора, cAMP (Preiss, J. [1984] Ann. Rev. Microbiol. 419-458). Незважаючи на те, що рослинні усі AGP є алостеричними, вони реагують з іншими ефекторними молекулами, ніж бактеріальні AGP. У рослинах 3фосфогліцеринова кислота (3-PGA) функціонує як активатор, у той час фосфат (РО4) служить інгібітором (Dickinson та Preiss, 1969, вище). Використовуючи систему мутагенезу in vivo, створену за допомогою Ас-опосередкованого надлишку Ds елемента, здатного до переміщення, випадково розміщеного поблизу відомого сайту 12 активатора зв'язування, Giroux та ін. (Giroux, M.J., Barry, G., Cobb, G.B., Green, Т., Okita, T.W. та Hannah, L.C. [1996] Proc.Natl. Acad. Sci. 93: 58245829) одержали змогу отримати сайт-специфічні мутанти у функціонально важливій ділянці AGP ендосперму кукурудзи. Один мутант, Rev6, що містить тирозин-серинову вста вку у великій субодиниці AGP обумовлює 11-18%-не збільшення ваги насіння. Крім того, опублікована міжнародна заявка WO 01/64928 показує, що різноманітні характеристики, такі, як кількість насіння, рослинна біомаса, індекс врожаю, тощо, можуть бути підвищені у рослинах, трансформованих за допомогою полінуклеотиду, що кодує велику субодиницю AGP кукурудзи, яка містить Rev6 мутацію. Опубліковані міжнародні патентні (заявки WO 99/58698 та WO 98/22601), а також виданий (патенті США №6,069,300) розкривають мутації у великій субодиниці ферменту AGP кукур удзи, що при експресії забезпечують підвищення теплостабільності у порівнянні з такими, що спостерігаються для дикого типу ферменту AGP. Деякі теплостабільні мутанти розкриті у більше, ніж 300 патентах та публікаціях WO, включаючи мутанти, що позначені, як HS13 (мають заміну Ala на Pro у положенні 177); HS14 (що має заміну Asp на His у положенні 400 та Val на Не у положенні 454); HS16 (що має заміну Arg на Thry положенні 104); HS33 (що має заміну His на Туг у положенні 333); HS39 (що має заміну His на Туг у положенні 333 та заміну Thr на Не у положенні 460); HS47 (що має заміну Arg на Pro у положенні 216 та заміну His на Туг у положенні 333); RTS48-2 (що має заміну Ala на Val у положенні 177) та RTS60-1 (що має заміну Ala на Val у положенні 396). Об'єкт даного винаходу відноситься до матеріалів та способів, що є корисними для підвищення врожаїв рослин, зокрема, зернових культур. В одному втіленні предмет винаходу забезпечує теплостабільні ферменти AGP та нуклеотидні послідовності, що кодують ці ферменти. У бажаному втіленні теплостабільні мутанти за винаходом можуть використовуватися для одержання рослин, які мають вищу толерантність до підвищених температур, що таким чином підвищує врожаї цих рослин. В особливо бажаному втіленні поліпшені рослини представляюють собою зернові культури. Зернові культури, до яких застосовується даний винахід, включають, наприклад, кукурудзу, пшеницю, рис, ячмінь. Фіг.1 показує геномну нуклеотидну послідовність алеля Shrunken-2 дикого типу Zea mays. Інтрони позначені літерами знизу. Основа 1 представляє собою сайт початку транскрипції. Фіг.2 показує порівняння ферментативної активності для дикого типу та різноманітних мутантів великої субодиниці AGP кукур удзи. Усі реакції проводили у повторності. Наведені числа є середнім значенням повторності після віднімання значення фону. Процент відноситься до активності, що залишається після теплової обробки у порівнянні з активністю перед тепловою обробкою. Підписи для фігури є наступними: "sh2"= sh2 білок дикого типу; 13 84669 "sh2hf = білок sh2 дикого типу після теплової обробки; "33" = білок sh2, що містить мутацію HS33 (тобто амінокислотну заміну гістидин-на-тирозин у положенні 333 у великій субодиниці AGP кукурудзи); "33hf = білок sh2, що містить мутацію після теплової обробки; "177" = білок sh2, що містить мутацію rts48-2 (тобто амінокислотну заміну аланінна-валін у положенні 177 у великій субодиниці AGP кукур удзи); "177hf = білок sh2, що містить мутацію rts48-2 (тобто амінокислотну заміну аланін-на-валін у положенні 177 у великій субодиниці AGP кукур удзи), після теплової обробки; "396" = білок sh2, що містить мутацію rts60-1 (тобто амінокислотну заміну аланін-на-валін у положенні 396 у великій субодиниці AGP к укурудзи); "396hf = білок sh2, що містить мутацію rts60-1 (тобто амінокислотну заміну аланін-на-валін у положенні 396 у великій субодиниці AGP кукур удзи), після теплової обробки; "7+6" = білок sh2, що містить комбінацію мутацій "177" та "396"; "7+6hf= білок sh2, що містить комбінацію мутацій "177" та "396", після теплової обробки; "7+3" = білок sh2, що містить комбінацію мутацій "177" та "HS33"; "7+3hf = білок sh2, що містить комбінацію мутацій "177" та "HS33", після теплової обробки; "6+3" = білок sh2, що містить комбінацію мутацій "396" та "HS33"; "6+3hf = білок sh2, що містить комбінацію мутацій "396" та "HS33", після теплової обробки. Фіг.3 показує рестрикційну карту кодуючої ділянки Sh2. Показані рестрикційні ферменти є такими, що використовуються при ізоляції цілої кодуючої ділянки та при створенні подвійних або потрійних мутантів. Мутації позначені за допомогою зірочки (*). SEQ ID NO.1 представляє собою амінокислотну послідовність ділянки, що відповідає амінокислотам від 318 до 350 великої субодиниці AGP кукурудзи, що містить мутацію HS33. SEQ ID NO.2 представляє собою амінокислотну послідовність ділянки, що відповідає амінокислотам від 170 до 189 великої субодиниці AGP кукурудзи, що містить мутацію RTS48-2. SEQ ID NO.3 представляє собою амінокислотну послідовність ділянки, що відповідає амінокислотам від 389 до 406 великої субодиниці AGP кукурудзи, що містить мутацію RTS60-1. SEQ ID NO.4 представляє собою геномну нуклеотидну послідовність алеля дикого типу Shrunken-2 Zea mays. SEQ ID NO.5 представляє собою синтетичний олігонуклеотидний праймер, що може використовуватися у відповідності з об'єктом винаходу. SEQ ID NO.6 представляє собою синтетичний олігонуклеотидний праймер, що може використовуватися у відповідності з об'єктом винаходу. SEQ ID NO.7 представляє собою синтетичний олігонуклеотидний праймер, що може використовуватися у відповідності з об'єктом винаходу. 14 SEQ ID NO.8 представляє собою синтетичний олігонуклеотидний праймер, що може використовуватися у відповідності з об'єктом винаходу. SEQ ID NO.9 представляє собою синтетичний олігонуклеотидний праймер, що може використовуватися у відповідності з об'єктом винаходу. SEQ ID NO.10 представляє собою синтетичний олігонуклеотидний праймер, що може використовуватися у відповідності з об'єктом винаходу. Об'єкт даного винаходу відноситься до нових мутантних молекул полінуклеотидів та до поліпептидів, що кодуються ними, які забезпечують підвищену теплорезистентність та врожай рослин, що вирощуються в умовах теплового стресу, у порівнянні з рослинами, що експресують генотип дикого типу. У специфічних втіленнях полінуклеотидні молекули об'єкта винаходу кодують ферментативні активності АДФ глюкозо-1-фосфатаденілілтрансферази ендосперму кукур удзи (AGP) та розчинної синтази крохмалю (SSS). Мутантні ферменти забезпечують підвищену стабільність до умов теплового стресу під час розвитку насіння та рослин у рослинних та насінних тканинах, що експресують ферменти, у порівнянні з ферментативними активностями дикого типу. Один аспект об'єкту даного винаходу відноситься до полінуклеотидів, які кодують дві або більше амінокислотні заміни у великій субодиниці AGP, у порівнянні з послідовністю дикого типу поліпептиду великої субодиниці AGP, при цьому мутантний білок, що експресується, демонструє підвищену стабільність. Бажано, коли поліпептид, що кодується полінуклеотидами за даним винаходом, при експресії з малою субодиницею демонструє підвищену ферментативну активність у порівнянні з білком дикого типу та переважно на рівні, який є приблизно таким самим або більшим від такого, що демонструється при мутації однієї амінокислоти, яка забезпечує підвищен у теплову стабільність, такою, як, наприклад, HS33. Полінуклеотиди за даним винаходом можуть кодувати дві, три або більше амінокислотних змін послідовності дикого типу. Бажано, коли полінуклеотиди за даним винаходом кодують поліпептид, який має амінокислотну заміну в одному або більше наступних положеннях, що відповідають положенням великої субодиниці AGP кук урудзи: положеннях 177, 333 та 396. В одному втіленні полінуклеотид за даним винаходом кодує мутантну велику субодиницю рослинної AGP, що має подвійну мутацію: амінокислотну заміну гістидину на тирозин та амінокислотну заміну аланіну на валін у послідовності поліпептиду. У наведеному в прикладах втіленні заміна гістидину на тирозин відбувається у положенні амінокислоти, що відповідає номеру залишка 333 у послідовності великої субодиниці AGP кукур удзи. В одному втіленні заміна аланіну на валін відбувається у положенні амінокислоти, що відповідає номеру залишка 177 в послідовності великої субодиниці AGP кукур удзи. В іншому втіленні заміна аланіну на валін відбувається у положенні амінокислоти, що відповідає номеру залишка 396 в послідовності великої субодиниці AGP кукур удзи. 15 84669 В подальшому втіленні полінуклеотид за даним винаходом кодує мутантну велику субодиницю рослинної AGP, що містить дві амінокислотні заміни аланіну на валін у послідовності поліпептиду. У втіленні, що представлене у прикладах, перша заміна аланіну на валін відбувається по амінокислоті, що відповідає залишку в положенні 177, а друга заміна аланіну на валін відбувається по амінокислоті, що відповідає залишку під номером 396 у послідовності великої субодиниці AGP кукурудзи. Ферментативна активність, асоційована з мутантними білками за даним винаходом, які мають дві мутації, представлена на Фіг.2. Інше втілення пов'язане з потрійним мутантом, що включає заміну гістидину на тирозин по амінокислоті, що відповідає залишку під номером 333, заміну аланіну на валін по амінокислоті, що відповідає залишку під номером 177, та заміну аланіну на валін по амінокислоті, що відповідає залишку 396 у послідовності великої субодиниці AGP кукурудзи. Номери амінокислотних залишків, що згадані вище, базуються на загальноприйнятих номерах амінокислот у цьому білку (Shaw та Hannah, 1992, вище). Положення цих замін можуть бути легко ідентифіковані середнім спеціаластом у даній галузі. Таблиця 1 нижче показує подвійні та потрійні амінокислотні заміни мутантів, приклади яких представлені у даній заявці. Таблиця 1 Sh2 мутант поліпептиду HS 7+3 HS6+3 HS 7+6 HS 7+6+3 Амінокислотна заміна Ala на Val у положенні 177 His на Туг у положенні 333 Ala на Val у положенні 396 His на Туг у положенні 333 Ala на Val у положенні 177 Ala на Val у положенні 396 Ala на Val у положенні 177 Ala на Val у положенні 396 His на Туг у положенні 333 та та та та та З причину існування гомології між поліпептидами AGP у різних видів рослин (Smith-White та Preiss [1992] J.MoI.Evol. 34: 449-464), середній спеціаліст у даній галузі може легко визначити положення мутацій в AGP рослин, відмінних від кукурудзи, що відповідає положенню мутацій в AGP кукур удзи, які розкриті у даній заявці. Таким чином, даний винахід охоплює полінуклеотиди, що кодують мутантну AGP рослин, відмінних від кукурудзи, включаючи, але не обмежуючись, пшеницю, ячмінь, овес, рис, які забезпечують підвищену теплостабільність при експресії в рослині. Мутації, які пов'язані з заміною однієї амінокислоти в AGP, що забезпечує теплостабільність, та способи одержання та селекції таких мутацій розкриті у Патенті США № 6,069,300 та опублікованих міжнародних заявках WO 99/58698 та WO 98/22601. Типово, плазміду, що включає полінуклеотид, який кодує SH2 субодиницю AGP кук урудзи, піддавали мутагенезу, вводили в м утантні клітини E.coli glgC, що експресують ВТ2 субодини 16 цю, клітини вирощували при температурі 42°С та піддавали селекції на мутанти, що можуть продукувати глікоген при цій температурі. Були ізольовані декілька мутантів, що називалися теплостабільними мутантами (HS). Готували сирові екстракти цих мутантів та визначали теплостабільність одержаної AGP. Мутанти, що містять одну амінокислотну заміну, зберігали 8-59% своєї активності після інкубації при 60°С протягом 5 хвилин. Крім того, загальна ферментативна активність мутантних AGP ендосперму кукурудзи перед тепловою обробкою підвищувалася приблизно у 2-3 рази у декількох мутантів. Множинна теплостабільність, що притаманна мутаціям, може бути легко поєднана усередині однієї субодиниці. Наприклад, можуть використовуватися різноманітні унікальні рестрикційні сайти, що поділяють кодуючі ділянки Sh2 на три різні фрагменти. Якщо це є прийнятним, комбінації мутацій можуть бути генеровані шляхом субклонування відповідного фрагменту, що містить додаткову мутацію. Якщо дві мутації знаходяться у безпосередній близькості, то для створення таких комбінацій може використовуватися сайтнаправлений мутагенез. Один спосіб сайтспецифічного мутагенезу використовує ПЛР, мутагенний праймер та рестрикційну ендонуклеазу Dnpl. Праймери можуть бути сконструйовані так, щоб містити мутацію на 5'-кінці, та можуть використовуватися для ПЛР ампліфікацію при застосуванні полімерази корегування Vent. Ампліфікована ДНК може бути потім перетравлена за допомогою Dpnl. Батьківську ДНК, ізольовану з E.coli, піддають метилуванню, і таким чином, вона стає чутливою до Dpnl. Перетравлену ДНК піддають фракціонуванню за розмірами шляхом гельелектрофорезу, лігують та клонують в експресійні вектори. Мутації підтверджують аналізом секвенування та трансформують в штам AC70R1-504, що несе маленьку субодиницю дикого типу. Потім можуть аналізуватися комбінаторні мутанти. Об'єкт винаходу також відноситься до мутантних поліпептидів, які кодуються полінуклеотидами за даним винаходом та мають амінокислотні заміни, описані у даній заявці. У бажаному втіленні мутантні поліпептиди мають походження з кукурудзи. Об'єкт винаходу також стосується теплостабільних мутантів AGP за даним винаходом, поєднаних з теплостабільними мутаціями у маленькій субодиниці ферменту. Мутації у маленькій субодиниці AGP, що надають ферменту теплостабільності, також можуть бути легко приготовлені та ідентифіковані при використанні способів, [описаних у Патенті США №6,069,300 та в опублікованих міжнародних заявках WO 99/58698 та WO 98/22601]. Теплостабільні мутанти маленької субодиниці можуть бути коекспресовані з мутантами за даним винаходом для подальшого поліпшення ферменту AGP. Рослини та вторинні рослинні тканини, що містять мутантні полінуклеотиди або трансформовані за допомогою мутантних полінуклеотидів за даним винаходом, та такі, що експресують поліпептиди, які кодуються полінуклеотидами, також охоплю 17 84669 ються даним винаходом. Рослини та рослинні тканини, що експресують мутантні полінуклеотиди, забезпечують тканини, що мають, наприклад, знижену втрату ваги або врожаю, які індуковані тепловим впливом, коли піддаються тепловому стресу під час розвитку. Рослини, що охоплюються даним винаходом, включають однодольні рослини, такі, як рис, пшениця, ячмінь, овес, сорго, кукурудза, лілії, просо, та дводольні рослини, такі, як горох, люцерна, турецький горох, цикорій, конюшина, кормова капуста, сочевиця, трава для газонів, соя, тютюн, картопля, топінамбур, редиска, кочанна капуста, рапс, яблуня, салат-латук. В особливо бажаному втіленні рослини представляють собою злакові. Злаки, до яких застосовують даний винахід, включають, наприклад, кукурудзу, пшеницю, рис, ячмінь, овес, жито та просо. Об'єкт даного винаходу також відноситься до способів одержання та ідентифікації полінуклеотидів та поліпептидів, що охоплюються даним винаходом. В одному втіленні мутації генів, після проведення яких рослини піддають селекції при використанні бактеріальних експресійних систем, можуть використовуватися для ізоляції молекул полінуклеотидів, що кодують субодиниці рослинних AGP, які мають несуть мутації, що можуть пом'якшувати теплоіндуковані втрати при біосинтезі крохмалю в рослинах, індивідуальні амінокислотні заміни можуть бути поєднані в одну субодиницю, як описано в даній заявці. Об'єкт даного винаходу також стосується рослин та рослинних тканин, що містять полінуклеотид за даним винаходом. У бажаному втіленні рослина або рослинна тканина має мутантний ген AGP за винаходом, що вбудований в рослинний геном. У бажаному втіленні рослина є злаковою рослиною. Більш бажано, коли рослина представляє собою Zea mays. Рослини, що мають мутантний ген AGP, можуть вирощуватися з насіння, що включає мутантний ген у своєму геномі. Крім того, способи трансформації рослин геном, такі, як інфікування Agrobacterium tumefaciens, балістичні способи, тощо, добре відомі у даній галузі техніки. З причини виродженості генетичного коду різноманітність різних полінуклеотидних послідовностей може кодувати кожний з варіантних поліпептидів AGP, розкритих в даній заявці. Крім того, середній спеціаліст у даній галузі може легко створити альтернативні полінуклеотидні послідовності, що кодують такий самий або суттєво такий самий поліпептид за даним винаходом. Як такий, що використовується в контексті даної заявки, термін «суттєво такий самий» відноситься до послідовностей, які кодують амінокислотні заміни, делеції, доповнення або вставки, що не змінюють матеріально функціональну активність поліпептиду, який кодується мутантною послідовністю AGP, що описана в даній заявці. Як такі, що використовуються в контексті заявки, терміни "нуклеїнова кислота" та "полінуклеотидна послідовність" відносяться до полімеру дезоксирибонуклеотиду або рибонуклеотиду в одноланцюговій або дволанцюговій формі та, якщо інше не вказано, будуть охоплювати відомі аналоги природних нуклеотидів, що можуть функ 18 ціонувати таким самим чином, що й існуючі в природі нуклеотиди. Полінуклеотидні послідовності включають як послідовність ланцюга ДНК, що транскрибується в РНК, так і послідовність РНК, що транслюється у білок. Полінуклеотидні послідовності включають як послідовності повної довжини, так і коротші послідовності, що мають походження від послідовностей повної довжини. Зрозуміло, що специфічні полінуклеотидні послідовності включають вироджені кодони природної(их) послідовності(ей), що можуть бути введені для забезпечення переважних кодонів в специфічних хазяйських клітинах. Алельні варіації представлених послідовностей також входять в об'єм даного винаходу. Полінуклеотидні послідовності, що входять в об'єм даного винаходу, також включають послідовності, які специфічно гібридизуються з проедставленими послідовностями. Полінуклеотиди включають як смислові, так і антисмислові ланцюги, а також індивідуальні ланцюги або одноланцюгові або дволанцюгові молекули. Заміни амінокислот, відмінні від тих, що специфічно представлені у мутантах, розкритих у даній заявці, також входять до об'єму даного винаходу. Амінокислоти можуть бути розподілені у наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні та кислотні. Консервативні заміни, за допомогою яких мутантний поліпептид AGP, що має амінокислоти одного класу, замінюються іншими амінокислотами того самого класу, також входять в об'єм даного винаходу, при умові, що мутантний поліпептид AGP, який має заміни, ще зберігає підвищену теплостабільність у порівнянні з поліпептидом дикого типу. Таблиця 2 нижче забезпечує приклади амінокислот, що належать до кожного класу. Таблиця 2 Клас амінокиПриклади амінокислот слот Неполярні Ala, Val, Leu, He, Pro, Met, Phe, Trp Незаряджені Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin полярні Кислотні Asp, Glu Основні Lys, Arg, His Наприклад, заміна тирозину у положенні 333 у HS 33, HS 7+3, HS 6+3 та HS 7+6+3 мутантів іншими амінокислотами, такими, як гліцин, серин, треонін, цистеїн, аспарагін та глутамін, входить в об'єм даного винаходу. Заміни або фенілаланіну, або метіоніну у положенні 333 у великій субодиниці AGP також специфічно охоплюються даним винаходом. Таким чином, комбінації фенілаланіну або метіоніну у положенні 333 з валіном у положенні 177, або з валіном у положенні 396, або обидві ці заміни також сецифічно охоплюються даним винаходом. Подібно до цього, заміни валіну у положенні 177 та 396 у RTS 48-2, RTS 60-1, HS 7+3, HS 6+3, HS 7+6 та HS 7+6+3 мутантах іншими амінокислотами, такими, як лейцин, ізолейцин, пролін, метіонін, фенілаланін та триптофан, охоплюються даним винаходом. Амінокислотні заміни у 19 84669 положеннях, відмінних від сайту теплостабільних мутацій, також охоплюються даним винаходом, за умови, що поліпептид зберігає підвищену теплостабільність або надає підвищеної теплостабільності у порівнянні з поліпептидом дикого типу. Поліпептиди та білки, що складають об'єкт даного винаходу, можуть також бути визначені у границях специфічної ідентичності та/або подібності з тими, що представлені у даній заявці. Ідентичність типово буде більше 60%, бажано більше 75%, більш бажано більше 80%, навіть більш бажано 90%, і може бути більшою за 95%. Ідентичність та/або подібність послідовності може бути 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99% у порівнянні з послідовністю, представленою у даній заявці. Як використовується в контексті даної заявки, якщо інше не вказано, то процент ідентичності та/або подібності двох послідовностей може бути визначений при використанні алгоритму Karlin та Altschul (Karlin та Altschul [1990] Ргос. Natl.Acad. Sci. USA 87: 2264-2268), модифікованому, як описано у Karlin та Altschul (Karlin та Altschul [1993] Ргос. Natl. Sci. USA 90: 5873-5877). Такий алгоритм вводиться в NBAST та XBLAST програми Altschul та ін. (Altschul та ін. [1990] J. Мої. ВіоІ. 215: 402-410). Дослідження BLAST може бути проведене за допомогою N BLAST програми, бальна оцінка=100, довжина слова=12, для одержання послідовностей з бажаним процентом ідентичності послідовності. Для одержання вирівнювання з розривами для цілей порівняння, Gapped BLAST може використовуватися так, як описано у Altschul та ін. (Altschul та ін. [1997] Nucl.Acid Res. 25: 3389-3402). При використанні BLAST та Gapped BLAST програм можуть використовуватися значення параметрів по умовчанню відповідних програм (NBLAST та XBL AST). Дивися NCBI/NIH веб-сторінка. Об'єкт даного винаходу також стосується полінуклеотидів, які кодують фрагменти мутантних поліпептидів повної довжини, за умови, що ці фрагменти зберігають суттєво таку саму функціональну активність, що й поліпептид повної довжини. Фрагменти мутантного поліпептиду AGP, що кодуються цими полінуклеотидами, також входять в об'єм даного винаходу. Фрагменти послідовності повної довжини можуть бути приготовлені при використанні стандартних методів, що відомі у даній галузі те хніки. Об'єкт даного винаходу також охоплює такі полінуклеотидні молекули, що кодують ферменти біосинтезу крохмалю, які мають послідовності, що є достатньо гомологічними з послідовностю дикого типу, настільки, щоб дозволити проводити гібридизацію з послідовністю в жорстких умовах та за допомогою стандартних способів (Maniatis, Т. E.F. Fritsch, J.Sambrook [1982] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprihg Harbor, NY). Як такий, що використовується в контексті даної заявки, термін "жорсткі" умови гібридизації відноситься до умов, в яких гібридизацію типово виконують протягом ночі при температурі, що на 20-25°С нижче від температу 20 ри плавлення (Тт) гібридної молекули ДНК, в б х SSPE, 5 х розчині Денхарда, 0,15 SDS, 0,1 мг/мл денатурованої ДНК. Температура плавлення описується наступною формулою (Beltz, G.A., К.А. Jacobs, Т.Н. Eickbush, P.T. Cherbas та F.C. Kafatos [1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman та R.Moldave [ред.] Academic Press, New York 100: 266-285): Tm=81,5°C+16,6Log[Na+]+0,41(%G+C)0,61(%формаміду)-600/довжина дуплекса у парах основ. Промивання типово виконували, як описано нижче: (1) Двічі при кімнатній температурі протягом 15 хвилин в 1´SSPE, 0,1% SDS (промивання низької жорсткості). (2) Один раз при Тm-20°С протягом 15 хвилин в 0,2´SSPE, 0,1% SDS (промивання помірної жорсткості). Молекули полінуклеотидів об'єкту даного винаходу можуть використовуватися при трансформації рослин для експресії мутантного теплостабільного ферменту в цих рослинах. Крім того, полінуклеотиди об'єкту даного винаходу можуть використовува тися для експресії рекомбінантного варіантного ферменту. Вони також можуть використовуватися як зразок для визначення споріднених ферментів. Полінуклеотиди можуть також використовуватися як стандарти розміру ДНК. Молекули полінуклеотидів за даним винаходом також можуть включати ті полінуклеотиди, що кодують ферменти біосинтезу крохмалю, такі, як ферменти AGP, що містять мутації, які можуть забезпечувати підвищену вагу насіння, у доповнення до поліпшеної теплостабільності, у рослинах, що експресують ці мутанти. Поєднання теплостабілізуючої мутації, такої, як наприклад, Sh2HS 7+6 або Sh2-HS 7+3, з мутацією, що підвищує вагу насіння, наприклад, Rev6, у полінуклеотиді, що кодує велику субодиницю AGP кукур удзи, специфічно охоплюється даним винаходом. [Патенти США № 5,589,618 та 5,650,557] розкривають полінуклеотиди (наприклад, Rev6), які кодують мутації у великій субодиниці AGP, що надають підвищеної ваги насінню у рослин, які експресують мутантний поліпептид. Мутації субодиниць AGP, що забезпечують теплостабільність, можуть бути поєднані у відповідності з об'єктом винаходу з нечутливими до фосфату м утаціями кукурудзи, такими, як мутація Rev6, для поліпшення стабільності Rev6, що кодується великою субодиницею. Очікується, що ферментативна активність SSS буде пошкоджуватися при більш високих температурах, ніж та, що спостерігаються для AGP. Таким чином, піддані мутагенезу форми SSS можуть експресуватися в умовах підвищеної температури (42°С) для ізоляції теплостабільних варіантів у відповідності зі способами, описаними в даній заявці. Такі теплостабільні мутантні форми SSS представляють собою подальші аспекти даного винаходу. Об'єкт даного винаходу також стосується способів для підвищення характеристик врожайності рослин в умовах теплового стресу шляхом вве 21 84669 дення полінуклеотиду за даним винаходом, який включає мутацію у ферменті біосинтезу крохмалю, що забезпечує характеристки підвищення врожайності у рослин. Підвищені характеристики врожайності включають, наприклад, збільшену кількість насіння, підвищену вагу насіння, підвищену біомасу рослин та підвищений індекс збирання врожаю. Усі патенти, патентні заявки, попередні заявки, публікації, посилання, які наводяться у даній заявці або які цитуються у даній заявці, введені в дану заявку як посилання у своїй цілісності у тій мірі, в якій вони сумісні з детально розробленими способами, що зазначені в даному описі. Далі наводяться приклади, які ілюструють способи для застосування винаходу. Ці приклади не повинні сприйматися як такі, що обмежують даний винахід. У рамках даної заявки приводяться мас.%, а усі кількісні співвідношення розчинників у суміші є об.%., якщо інше не вказано. Приклад 1 - аналіз АДФ глюкозо-1-фосфатаденілілтрансферази ендосперму кукурудзи, що мас багаточисленні амінокислотні мутації. Експресія АДФ глюкозо-1-фосфатаденілілтрансфераз ендосперму кукурудзи. Аліквоти 100мл бульйону Лурія (75г/мл спектоміцину та 50г/мл канаміцину) інокулювали клітинами AC70R1-504 Е.соїі, що зберігалися в гліцерині, при цьому вказані клітини експресують або АДФ глюкозо-1-фосфат-аденілілтрансферазу ендосперму кукурудзи, або АДФ глюкозо-1-фосфатаденілілтрансферазу бульб картоплі, клітини вирощували протягом ночі при температурі 37°С при струшуванні при 220об./хв. Ці культури використовували для інокуляції 250мл бульйону Луріа (75г/мл спектоміцину та 50г/мл канаміцину). Культури вирощували до OD600=0,55 при температурі 37°С при струшуванні при 220об./хв. Культури індукували за допомогою 0,2мМ ізопропіл-Dтіогалактозиду та 0,02мг/мл налідиксової кислоти протягом 7 годин при кімнатній температурі при струшуванні при 220об./хв. Клітини збирали шляхом центрифугування при 3500об./хв. протягом 10 хвилин при температурі 4°С. Клітинні осади ресуспендували в 800 л екстракційного буфера: 50мМ HEPES, рН 7,5, 5мМ МgСІ2, 5мМ, ЕДТА, 20% сахарози та 30% сульфату амонію. DTT (1мМ), 50г/мл лізоциму, 1г/мл пепстатину, 1г/мл лейпептину, 1г/мл антипаїну, 10г/мл хімостатину, 1мМ фториду фенілметилсульфонілу, та 1мМ бензамідину додавали до екстракційного буфера безпосередньо перед використанням. Лізати піддавали обробці ультразвуком три рази протягом 3 секунд при інкубації на льоду між обробками ультразвуком. Зразки піддавали центрифугуванню протягом 1 хвилини при 13,000об./хв. при температурі 4°С. Видаляли супернатанти та аліквотували для аналізів. Поєднання індивідуальних мутацій Стратегія субклонування була призначена для вивчення ефектів мутацій у поєднанні з HS 33 та одна з одною. Для поєднання зворотних мутацій RTS 48-2 та RTS 60-1, плазміди, що містять кожну реверсійну мутацію (температурно чутливі бать 22 ківські мутації видаляли перед поєднанням мутацій), перетравлювали за допомогою Eco RV та фрагмент розміром 339 п.о. RTS 48-2 замінювали на відповідний фрагмент RTS 60-1 (Фіг.3). Одержану плазміду позначали, як Sh2-HS 7+6. Подібну стратегію використовували для поєднання реверсійної мутації RTS 48-2 з мутацією, ідентифікованою у HS 33. Плазміди, що містять мутації, перетравлювали за допомогою Eco RV, а фрагмент розміром 339 п.о. RTS 48-2 замінювали на відповідний фрагмент HS 33. Одержану плазміду позначали як Sh2-HS 7+3. Для поєднання реверсійної мутації RTS 60-1 з мутацією, іденти фікованою в HS 33, плазміди, що містять мутації, перетравлювали за допомогою Mun I/Kpn І, а фрагмент розміром 390 п.о. RTS 60-1 замінювали відповідним фрагментом HS 33 (Фіг.3). Одержану плазміду позначали як Sh2-HS 6+3. Для того, щоб поєднати реверсійні мутації RTS 60-1 та RTS 48-2 з мутацією, ідентифікованою в HS 33, плазміду Sh2-HS 6+3 та плазміду, що містить реверсійну мутацію RTS 48-2 замінювали на відповідний фрагмент Sh2-HS 6+3. Одержану плазміду позначали як Sh2-HS 7+6+3. Заключне секвенування усіх плазмід проводили при використанні шести праймерів для покриття цілої кодуючої ділянки Sh2 в обох напрямках. Праймери, що використовувалися, були наступними: LHBB1 (5'®3'):5'CGACTC ACTATAGGGAGACC-3'(SEQ ID NO.5); LH27 (5'®3'):5'-CCCTATGAGTAACTG-3'(SEQ ID NO.6); LH9 (5'®3'):5'-ТАТАСТС ААТТАС АТ-3'(SEQ ID NO.7); LHBB2 (3'®5'):5'-GTGCCACCTGACGTCTAAG3' (SEQ ID NO.8); LH2135 (3'®5'):5'-CAGAGCTGAC ACGTG3'(SEQ ID NO.9); LH32 (3'®5'):5'-AAGCTGATCGCC ACTC-3'(SEQ ID NO.10). Теплова обробка АДФ глюкозо-1-фосфатаденілілтрансФерази Дикий тип (sh2) та мутантну форму АДФ глюкозо-1-фосфат-аденілілтрансферази, що містить одну амінокислотну мутацію (HS 33, RTS 48-2, RTS 60-1) мутацію на основі багаточисленних змін амінокислот (HS 7+3, тобто RTS 48-2 плюс HS 33; HS 6+3, тобто RTS 60-1 плюс HS33; та HS 7+6, тобто RTS 48-2 плюс RTS 60-1), аналізували на ферментативну активність перед тепловою обробкою та після теплової обробки. Теплова обробка полягала в інкубації тестового білка при 60°С протягом 5 хвилин. Значення активності, що спостерігали після теплової обробки при 60°С протягом 5 хвилин, представлені у Таблиці 3. Генотипи у наборі даних є наступними Sh2 дикого типу, HS 33, RTS 60-1 (тільки реверсійна мутація), RTS 48-2 (тільки реверсійна мутація), Sh2-HS 7+6, Sh2-HS 6+3, Sh2HS 7+3, та Sh2-HS 7+6+3. 23 84669 Таблиця 3 Значення активності після теплової обробки Фермент Sh2 дикого типу HS33 RTS 60-1 RTS 48-2 Sh2-HS 7+6 Sh2-HS 6+3 Sh2-HS 7+3 Sh-HS 7+6+3 % активності 32 69 61 64 77 69 83 72 SEMa 11 7 13* 6 21* 9 8 11 № 3 7 2 3 2 3 3 3 a - стандартна похибка значення - кількість повторень експерименту * - представляє інтервал, більш точний і, ніж SEM b Активність перед тепловою обробкою для Sh2 дикого типу, HS 33, RTS 60-1, RTS 48-2, Sh2-HS 7+6, Sh2-HS 6+3, Sh2-HS 7+3, та Sh2-HS 7+6+3 представлена у Таблиці 4. HS 33 мав у 2,1 разу підвищену активність, ніж Sh2 дикого типу. їх подвійний мутант мав у 1,9 рази більшу активність. Оскільки поєднання двох мутантів підвищувало активність, подвійний мутант не мав синергічного ефекту. Мутація RTS 60-1 при поєднанні з такою HS 33 мала адитивний ефект, підвищуючи активність у 3,4 рази у порівнянні з Sh2 дикого типу. Мутація RTS 48-2 у поєднанні з такою HS 33 демонструвала трохи менше підвищення, до 2,9 разів. Цікаво, що потрійний мутант продемонстрував трохи більше підвищення, ніж тільки реверсійна мутація у другому сайті, але менше підвищення, ніж подвійний мутант реверсійних похідних у др угому сайті. Таблиця 4 Кратність підвищення активності Фермент Sh2 дикого типу HS33 RTS 60-1 RTS 48-2 Sh2-HS 7+6 Sh2-HS 6+3 Sh2-HS 7+3 Sh-HS 7+6+3 Кратність Інтервал підвищення н/в н/в 2,1 0,2а 1,4 0 1,4 0 1,9 0,2 3,4 0 2,9 0,1 1,8 0,1 № н/в 3 1 1 2 1 2 2 a - стандартна похибка значення - кількість повторень експерименту н/в - не використовується b Аналізи на АДФ глюкозо-1-ФосфатаденілілтрансФеразу Для одержання кількісних даних для мутантів, описаних вище, активність вимірювали за допомогою аналізу синтезу (прямого), що визначає вбу 24 довування [14С]глюкози-1-Р у цукор нуклеотиду АДФ-глюкози. Аналізи проводили на сирових ферментативних екстрактах, приготовлених так, як описано нижче. За допомогою реакції синтезу АДФ-глюкози вимірювали вбудовування [14С]глюкози-1-Р в АДФглюкозу. Реакційна суміш містила 80мМ HEPES, рН 7,5, 1мМ глюкоза-1-Р, 4мМ МдСІ2 , 0,5мг/мл сироваткового альбуміну великої рогатої худоби, 10мМ 3-PGA та 15,000 імпульсів/хвилина [14С] глюкози-1-Р. Реакційний об'єм складав 50мл. Аналізи ініціювали шляхом додання 1,5мМ АТФ. Реакцію проводили при інкубуванні протягом 30 хвилин при температурі 37°С та зупиняли шляхом кип'я тіння протягом 2 хвилин. Невбудовану глюкоза-1-Р видаляли шляхом додання 0,3 одиниць бактеріальної лужної фосфатази (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ) та інкубували протягом 2,5 годин при температурі 37°С. Аліквоту об'ємом 20мл реакційної суміші переносили на DEAE папір, промивали за допомогою дистильованої води три рази, висушували та кількісно оцінювали на рідинному сцинтиляційному лічильнику. Додаткові результати для мутантів, що мають одну мутацію, та подвійних мутантів показані на Фіг.2. Для комбінаційного мутанту Sh2-HS 7+6 (RTS 48-2 плюс RTS 60-1) та комбінаційного мутанту Sh2-HS 6+3 (RTS 60-1 плюс HS 33) представлені значення є середніми значеннями даних, отриманих при трьох розведеннях ферменту (у подвійній повторності), помноженими на їх фактор розведення, мінус фонове значення. Для комбінаційного мутанту Sh2-HS 7+3 (RTS 48-2 плюс HS 33) представлені значення представляють собою середнє значення двох розведень ферменту (у подвійній повторності), помножене на їх фактор розведення, мінус фонове значення. Графічне представлення значень проводили при використанні Microsoft Excel. Приклад 2 - Поєднання теплостабільних мутацій з Rev6 Згідно з об'єктом винаходу теплостабільні мутації можуть поєднуватися з мутаціями, асоційованими зі збільшенням ваги насіння, такими, як наприклад, мутація Rev6. Задачею є підтримання бажаних характеристик нечутливості до фосфату Rev6 при підвищенні їх стабільності. Мутанти, що включають теплостабільні мутації у поєднанні з мутацією Rev6, можуть бути сконструйовані та підтверджені так, як описано у даній заявці. Такі "комбінаційні" мутанти можуть бути трансформовані в AC70R1-504, що несе маленьку субодиницю дикого типу. Підвищена теплостабільність може бути легко ідентифікована шляхом позитивного забарвлювання глікогену у середовищі, що містить знижену концентрацію глюкози. Rev6 не забарвлюється при вирощуванні на цьому середовищі. Спочатку усі мутантні комбінації можуть піддаватися скринінгу ферментативно для підтримання нечутливості до фосфату, але далі аналізу піддаються тільки ті комбінації, що підтримують нечутливість до фосфату. Зрозуміло, що приклади та втілення, описані в даній заявці, наведені тільки для ілюстрації, і що 25 різноманітні модифікації або зміни в цьому світлі будуть легко передбачені спеціалістом у даній 84669 26 галузі і включаються в об'єм даного винаходу та прикладені пункти формули. 27 84669 28 29 84669 30 31 84669 32 33 84669 34 35 84669 36 37 84669 38 39 84669 40 41 84669 42 43 84669 44 45 Комп’ютерна в ерстка Н. Лисенко 84669 Підписне 46 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601