Спосіб культивування m. bovis конверсованих форм за температури 3 °с

Реферат: Спосіб культивування М. bovis конверсованих форм на щільних живильних середовищах. UA 68635 U (12) UA 68635 U UA 68635 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології і може бути використана для підвищення ефективності бактеріологічної діагностики туберкульозу тварин, селекції вакцинних штамів для конструювання препаратів специфічної профілактики хвороби. Питання біологічних властивостей мікобактерій, зокрема бичачого виду, дотепер потребують вивчення, оскільки з'являються все нові й нові повідомлення авторів про особливості деяких з них. Так, в 2004 році повідомлено про М. bovis швидкорослого штаму, а в наступному - про втрату здатності швидко розмножуватися за пасажів через штучне живильне середовище. Також відмічено, що цей, згаданий вище штам М. bovis, на такому середовищі конверсує в некислотостійкі паличкоподібні та ниткоподібні форми з паралельною зміною характеру росту культури: наліт, димка. (Ткаченко О. Швидкоростучі М. bovis у проблемі туберкульозу // Ветеринарна медицина України. - 2004. - № 7. - С. 14-17. Поліморфізм і мінливість М. bovis швидко- та повільнорослих штамів / О.А. Ткаченко, М.В. Білан, В.В.Зажарський та інші // Ветеринарна медицина України. - 2009. - № 3. - С. 30-33. Морфологічні особливості реверсії некислотостійких М. bovis у бактеріальну кислотостійку форму / О.А. Ткаченко, М.В. Білан, Л.О.Ковальова, О.Є. Галатюк, // Ветеринарна медицина України. - 2009. № 6.-С. 28-30). Відмічено, що наступні пасажі мікобактерій змінених форм через штучне живильне середовище з різним рН призводять до появи L-форм, та певний період зберігають здатність, реверсувати у вихідні кислотостійкі палички збудника туберкульозу бичачого виду. (Морфологічні особливості реверсії некислотостійких М. bovis в бактеріальну кислотостійку форму / Ткаченко О.А., Білан М.В., Ковальова Л.О., Галатюк О.Є. // Ветеринарна медицина України. - 2009. - №. 6 - С. 28-30). Між тим авторами акцентовано, що в окремих випадках поява форм мікобактерій, конверсія та реверсія супроводжувалися втратою мікобактеріями вихідної здатності формувати колонії. На такому фоні зміни властивостей мікобактерій бичачого виду, необхідно було з'ясувати, чи не набули багаторазово пасажовані через штучне живильне середовище М. bovis здатність розмножуватися та формувати колонії за значно нижчої, ніж традиційна температури. Відомо, що оптимальна температура для росту М. bovis на штучних живильних середовищах 37-38 °C, хоча вони можуть рости в діапазоні 36-39 °C. За кімнатної (18-22 °С) та підвищеної (45 °С) температури мікобактерії туберкульозу не ростуть. (Туберкулѐз животных и меры борьбы с ним / Ю.Я. Кассич, А.Т. Борзяк, А.Ф. Кочмарский и др.; Под ред. Ю.Я. Кассича. // К.: «Урожай», 1990. - 340 с). Тест з визначення росту культури за різних температур є одним з основних критеріїв в диференціальній діагностиці М. bovis від мікобактерій пташиного виду та деяких атипових. (Туберкулѐз сельскохозяйственных животных / Под ред. В.П. Шишкова, В.П. Урбана - М.: Агропромиздат, 1991. - 255 с). З літературних джерел відомо, що М. kanzasii, M. gordonae і М. scrofulaceum ростуть як за температури 37 °C, так і за кімнатної температури (20-22 °С), проте дещо повільніше. М. avium, M. intracellularae, М. xenopi, М. smegmatis ростуть як за температури 22-37 °C, так і за 45 °C і частіше - за кімнатної температури (18-22 °С). Інший термостабільний сапрофіт - М. phlei може рости навіть за температури 52 °C. Того самого часу швидкорослий мікроорганізм М. fortuitum добре росте лише за температур 22 та 37 °C. За більш високих температур він гине. (Туберкулѐз сельскохозяйственных животных / Под ред. В.П. Шишкова, В.П. Урбана -М.: Агропромиздат, 1991. - 255 с). Вивчення умов культивування М. bovis конверсованих форм на штучному живильному середовищі за температури 3 °С раніше не досліджувались. Задачею корисної моделі є розробка способу культивування М. bovis за температури 3 °С. Поставлена задача досягається тим, що проводять культивування М. bovis за температури 3 °С. Приклад 1 На початку досліду виявляли вплив тривалості культивування на інтенсивність росту культури за температури 3 °С, її залежність від кількості пасажів та інтенсивності росту мікобактерій в термостаті (за 37 °С). Для цього відбирали М. bovis восьми пасажів (у проміжку 168-188 пересівів), які культивувалися в термостаті протягом трьох місяців на середовищі з рН 6,5 (по три пробірки кожної генерації); семи пасажів (168-180) - з рН 6,7;семи (116-123) - з рН 7,1 та переносили для подальшого культивування за 3 °С на термін від 9 до 20 місяців. По закінченні цих термінів так само, як і після культивування за температури 37 °C, проводили облік й характеризували ріст колоній мікобактерій (культур). (Настанова по діагностиці туберкульозу / В.М. Манченко, З.Р. Троценко, М.С. Павленко та ін. - Київ, 1994. - 39 с). 1 UA 68635 U 5 10 У підсумку були одержані дані впливу тривалості культивування М. bovis за температури 3 °С на середовищі з різним рН на інтенсивність росту культури, її залежність від кількості пасажів та інтенсивності росту мікобактерій в термостаті (37 °С) (таблиця 1). У цілому, зі збільшенням кількості пересівів (37 °С) на досліджуваних середовищах підвищується вірогідність формування окремо видимих колоній (3 °С). Аналіз результатів дослідження інтенсивності росту культури засвідчив: на середовищі з рН 6,5 до культивування за температури 3 °С макроскопічно сформованих колоній мікобактерій не відмічено; то після різнотривалого перебування за таких температурних умов колонії переважно формувалися мікобактеріями з більшою кількістю пасажів. Подібну закономірність росту колоній виявлено й на середовищі з рН 6,7. Мікобактерії останніх генерацій за температури 3 °С стимулювали утворення колоній більш, як у два рази, а 175 генерація мікобактерій за відсутності росту за температури 37 °C стимулювала утворення значної кількості колоній за температури 3 °С. Таблиця 1 Вплив тривалості культивування на інтенсивність росту культури за температури 3 °С та її залежність від кількості пасажів та інтенсивності росту мікобактерій в термостаті (37 °С) Характер культури та рH Пасаж кількість колоній (37 середовища °С) 168 Ріст відсутній 170 Ріст відсутній 173 Наліт 177 Наліт 6,5 178 Наліт 179 Ріст відсутній 183 Наліт 188 Наліт 168 4 дрібні колонії 170 4 дрібні колонії 173 4 колонії 6,7 175 Ріст відсутній 176 8 колоній 178 4 колонії 180 Наліт Тривалість культивування за 3 °C, місяці 19 18 13 11 11 11 10 9 20 20 13 13 13 13 10 116 20 117 Наліт 20 118 5 дрібних колоній 20 119 5 дрібних колоній 18 120 122 123 7,1 Наліт Наліт Ледь помітний наліт Наліт 18 13 13 Характер та кількість колоній (3°С) Наліт по лінії посіву, 2 сірі колонії Наліт-плями біло-жовті Суцільний білий наліт Інтенсивний наліт кольору середовища Інтенсивний наліт, 3 колонії жовтого відтінку Інтенсивний біло-жовтий наліт, 2 біло-жовті колонії 1 велика біла колонія, наліт 2 дрібні колонії, наліт Суцільний наліт, багато біло-зелених колоній 3 великі біло-жовті колонії, 10 дрібних колоній Багато жовто-коричневих колоній (більше 20) 14 колоній із зеленим відтінком Багато сіро-жовтих колоній 5 жовто-білих колоній Наліт та 2 дрібні колонії зеленого кольору Суцільний наліт та шорсткі білі колонії (1 велика, 5 дрібних) Багато дрібних білих гладеньких колоній, 1 велика шорстка помаранчева та 1 велика гладенька помаранчево-жовта Суцільний білий наліт, 1 велика біла шорстка колонія, 10 дрібних колоній Суцільний білий наліт, 1 велика біла шорстка колонія, 10 дрібних колоній Суцільний біло-зелений наліт, 1 колонія зелено-біла Суцільний білий наліт, 1 велика біла шорстка колонія Наліт 15 20 25 30 На середовищі з рН 7,1 до перенесення дослідних зразків в умови 3 °С формувалися поодинокі колонії в 118 та 119 генераціях, тобто із семи у двох, у той час як культивування за температури 3 °С призвело до формування колоній на середовищах шести пробірок (генерація 116, 117, 118, 119, 120, 122), у тому числі збільшилася кількість колоній 118 та 119 пасажів. В останній генерації (123-й) ріст колоній був відсутній. Аналізуючи залежність росту колоній на середовищі в умовах температури 3 °С від тривалості цих умов, виявлено зворотну залежність частоти формування колоній. Зі зменшенням тривалості перебування досліджуваних проб в умовах низької плюсової температури збільшується частота появи колоній. Це може бути зумовлено більш глибокими, хоча й не з'ясованими, напевно, адаптивними змінами біологічних властивостей мікобактерій, з найбільшою кількістю генерацій, за яких у конверсованих в некислотостійкі форми мікобактерій підвищується здатність (за окремим винятком, причому у віддалені строки) формувати колоній. Отже, ці дослідження засвідчили, що інтенсивність розмноження М. bovis в умовах температури 3 °С більшою мірою залежать від генерації збудника (активації його адаптивних функцій за цього), тобто від кількості пасажів через живильне середовище, ніж від тривалості культивування за традиційної й низької плюсової температури. Таке явище характерне для 2 UA 68635 U 5 10 15 20 25 30 35 40 мікобактерій, культивованих на середовищі з рН 6,5 та 6,7. На такому ж, тільки з рН 7,1 середовищі, така сама закономірність нечітко простежується, що може бути зумовлено іншими змінами біологічних властивостей мікобактерій під впливом такого вмісту в середовищі кислотно-лужних грам-еквівалентів. Перед усім це може стосуватися морфологічних ознак й тинкторіальних властивостей багаторазово пасажованих мікобактерій. Обґрунтованими виявилися дослідження культуральних властивостей, зокрема колоній, які сформувалися в термостаті за температур 37 (пасаж 168-188, рН 6,5; 168-180, рН 6,7; 116-123 рН 7,1) та 3 °С в обох дослідах наприкінці культивування. Приклад 2 Вивчають культуральні властивості М. bovis, які формували колонії за температури 3 °С (наприкінці досліду) на середовищі з рН 6,5, 6,7, 7,1: кількість, форму, величину, поверхню колоній, пігментоутворення, прозорість, емульгованість у фізіологічному розчині. (Настанова по діагностиці туберкульозу / В.М. Манченко, З.Р. Троценко, М.С. Павленко та ін. - Київ, 1994.-39 с). Характеристика культуральних властивостей М. bovis першої (після термостату) та другої (пересів культури культивованої в термостаті, яка сформувалася за 3 °С) генерацій в умовах культивування на середовищі з рН 6,5 за 3 °С наведена в табл. 2. Встановлено, що інтенсивність росту культури двох аналізованих генерацій практично не відрізняється, за винятком 170 пасажу другої генерації, де вона виявлялася пишною. Проте за характером росту культури відрізнялися суттєво. Якщо в першій генерації ріст культури мікобактерій характеризувався нальотом та окремими колоніями, то в другій практично окремими колоніями. Кількість сформованих колоній домінувала в другій генерації мікобактерій, а їх величина практично виявилася подібною, що вірогідно зумовлено тривалістю культивування, яка була, як мінімум, в три рази меншою, ніж за першої генерації. Форма колоній виявилася іншою тільки у 183 пересіві другої генерації. Поверхня колоній першої та другої генерацій була гладенькою. Консистенція в першій генерації крихка та щільна й крихка - в другій. Чітке пігментоутворення зареєстровано тільки в окремих колоній першої (178) та другої (170, 177) генерацій, але за прозорістю відмінностей не відмічено - всі вони були матовими. Емульгованість колоній у фізіологічному розчині виявлялася слабкою. Характеристика культуральних властивостей мікобактерій першої та другої генерацій на середовищі з рН 6,7 (за 3 °С) наведена у табл. 3. Бачимо, що інтенсивність росту колоній мікобактерій першої генерації була вищою, ніж другої. Подібна закономірність зберігається і для характеру росту, де в першій генерації (майже в половині пасажів) колонії розташовуються скупченнями, а в другій - тільки окремо. Це свідчить про вплив терміну культивування: перша генерація культивувалася в декілька разів триваліше, ніж друга (13 і більше місяців та 3 місяці відповідно). Така ж тенденція відзначена й за кількістю та величиною колоній, яких було більше в першій генерації. Зауважимо, що за формою, поверхнею та консистенцією колонії першої та другої генерацій мікобактерій практично не відрізняються, за винятком форми (неправильна) - у 175 пасажі та консистенції (волога) - у 168 пасажі першої генерації. Найбільш вираженим було пігментоутворення у колоній 173 пасажу першої генерації (жовтокоричневий колір). Усі сформовані колонії пасажів першої та другої генерацій мали матову прозорість та задовільну емульгованість. 45 3 UA 68635 U Таблиця 2 Характеристика культуральних властивостей (колоній) M.bovis першої та другої генерацій, культивованних на середовищі з рН 6,5 за температури 3 °С ГеПа- несаж рація 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 168 170 173 177 178 179 183 188 Показник характеристики культуральних властивостей (колоній) M.bovis Інтенсив-ність характер Кон-сисПігментокількість Величина форма Поросту росту тенція утворення (колір) верПрозоОкНе- хня НеСірість Сл Поре- По- ЧиСе- Ве- Пра- пра (глаЩі- пігПиш- НаДрібКриро- Жов(маа- мімі ко- оди- слре- ли- ви- ви- дель- менна літ ні хка жо- тий това) бка рна ло- нокі ені дні кі ль-на ль- ньна товтий нії на ка) вані + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ЕмульгуваНість (слабка) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Таблиця 3 Характеристика культуральних властивостей (колоній) M.bovis першої та другої генерацій, культивованих на середовищі з рН 6,7 за температури 3 °С Показник характеристики культуральних властивостей (колоній) M.bovis характер КільВелиКонсисПігментоформа росту кість чина тенція утворення (колір) ПовеГеПаОкНе- рхЖонеСкПНе- СіБісареПо- Чи- Дпр- ня Квтора- Сл- По- ПиупСе- Ве- раВопіг- роЗелож На- мі од сл- ріа- (гла- риСукоСір- Білція аб- мір- шчере- ли- виломе- жолежоліт коино- ен- бви- де- хха ричий ий ка на на ндні кі льга н-то- втний втлокі ні ні ль- нь- ка неня на ва-ні ий ий нії на ка) вий Інтенсивність росту 168 170 173 175 176 178 180 5 10 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Білозелений + + Прозорість (матова) + + + + + + + + + + + + + + Емульгуваність (задовільна) + + + + + + + + + + + + + + Характеристика культуральних властивостей М bovis першої генерації (пересів культури, яка формувалася за 3 °С після культивування в термостаті) та другої (пересів культури першої генерації) на середовищі з рН 7,1 за температури 3 °С наведена в табл. 4. Оскільки колонії мікобактерій першої генерації 117 пасажу мали відмінні культуральні характеристики, а саме: (а) помаранчеві колонії з гладенькою; (б) шорсткою поверхнею та (в) білі гладенькі колонії, було вирішено дослідити їх кожну окремо, тому М. bovis другої генерації представлені 117(а), 117(б), та 117(в) пасажами. 4 UA 68635 U 5 10 15 Аналізуючи дані табл.4 встановили, що інтенсивність росту культури двох генерацій мала суттєві відмінності. Так, М bovis першої генерації росли помірно, а другої - слабко, за винятком 117 (а, б, в) пасажу, де відмічено пишну інтенсивність росту. Мікобактерії цих варіантів першої генерації утворювали наліт та окремі колонії, тоді як, в другій - лише окремі колонії та їх скупчення. Відмічено поодинокі колонії в першій (крім 118 пасажу) та в другій генераціях, за виключенням 117 пасажу, де їх кількість була численною. Величина колоній мікобактерій першої генерації була дрібною та великою за всіх пересівів, (крім 120, де відмічено наявність лише дрібних, та лише великих - 122). У другій генерації спостерігалися в основному дрібні колонії і тільки в 117 (а, б, в) та 118 пасажах середні й великі, які в подальшому формували суцільний ріст. Форма колоній мікобактерій першої та другої генерацій була правильною, крім 117 пасажу першої генерації, де вона була змішаною: правильна й неправильна. Поверхня колоній 116-119 пасажів першої генерації характеризувалась як гладенька та шорстка, 120 - гладенька та 122 - шорстка, у всіх інших пересівах гладенька. Консистенція колоній була крихкою та сухою. Таблиця 4 Характеристика культуральних властивостей (колоній) M.bovis першої та другої генерацій, культивованих на середовищі з рН 7,1 за температури 3 °С інтенсивність росту ГенеОкрареПоція СлаПи- На- мі мібка шна літ корна лонії Пасаж 116 117 117а 117б 117в 118 119 120 122 123 Показник характеристики культуральних властивостей (колоній) M.bovis Консисвеличина форма Поверхня пігментоутворення (колір) тенція характер росту кількість 1 2 1 2 2 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ПрозНеСі- ПоБі- орЧиГлаСіСеПра- праШоро- мало- ість сл- ДріВедеКри- Суро- Біреви- вирстжо- разе- (маен- бні ли-кі ньхка ха бі- лий дні ль-на лька вт- нчеле- тоні ка лий на ий вий ний ва) Скупчення Поодинокі + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Емульгуваність (задовільна) + + + + + + + + + + + + + + + + Примітка: величина колоній: дрібні - величиною на межі видимості; середні - до 1 мм в діаметрі; великі - більше 1 мм. 20 25 30 Пігментоутворення притаманне для всіх колоній. У першій генерації переважаючим був білий колір, крім 116-117 пасажів, відмічений ще й помаранчевий, та 119 - біло-зелений, а в другій - сіро-білий в усіх пасажах та сіро-жовтий в 117а, б, в. Колонії матові, задовільно емульгуються. Приклад 3 Вивчали морфологічні ознаки та тинкторіальні властивості М. bovis, які культивовані за температури 3 °С. Готували мазки шляхом нанесення на скельце зависі мікобактерій бактеріологічною петлею. Висушені та фіксовані мазки фарбували за Ціль-Нільсеном. (Настанова по діагностиці туберкульозу / В.М. Манченко, З.Р. Троценко, М.С. Павленко та ін. Київ, 1994. - 39 с). Дані морфологічних ознак та тинкторіальних властивостей М. bovis першої та другої генерацій, культивованих на середовищі з рН 6,5 за температури 3 °С узагальнені в табл. 5. Встановлено, що мікобактерії досліджуваних пересівів першої генерації утримують фарбу фуксину (кислотостійкі), хоча в окремих випадках серед них зустрічаються й некислотостійкі форми (170 і 183). Тільки в одному пересіві з цієї генерації (178) колонії формували некислотостійкі варіанти (форми) мікроорганізму. В той же час в другій генерації колонії 5 UA 68635 U 5 10 15 формували в значній кількості (у 3 з 8 пересівів) тільки некислотостійкі форми, ще в двох некислотостійкі та кислотостійкі. Таке явище можна пояснити тривалістю культивування мікобактерій, оскільки друга генерація за часом менше культивувалася в декілька разів. Це могло вплинути на тинкторіальні властивості досліджуваних мікроорганізмів. Підкреслимо, що одна культура (пересів 168, друга генерація) формувалася кислотостійкими елементарними тільцями. Їх кількість в полі зору мікроскопа виявилася не досить значною (скупчень не виявлено). У 188 пересіві першої генерації такі морфологічні форми (кислотостійкі тільця) вміщувалися поряд з паличкоподібними варіантами мікобактерій. Усі мікроорганізми досліджуваних пересівів, як першої, так і другої генерацій, мали форму прямих паличок із заокругленими кінцями, за винятком 170 пересіву, де вміщувалися й нитчасті форми. Крім цього, 170 пересів другої генерації поряд з кислотостійкими паличками містив й некислотостійкі овали з різною оптичною щільністю поверхні. За довжиною мікроорганізмів суттєвої різниці не виявлено: домінували короткі мікобактерії. Це стосується й товщини, в переважній більшості тонкі, іноді виявлялися як тонкі, так і товсті форми мікроорганізмів переважно першої генерації (у 3 з 8 пересівів). Щодо зернистості, то в двох культурах першої генерації (173 та 179) мікобактерії були зернисті, у той час як другої - тільки в одній (173 пересів). У табл. 6 наведено дані морфологічних ознак та тинкторіальних властивостей М. bovis першої та другої генерацій, культивованих на середовищі з рН 6,7 за температури 3 °С. 20 Таблиця 5 Характеристика морфологічних ознак та тинкторіальних властивостей M.bovis першої та другої генерації в умовах культивування на середовищі з рН 6,5 за температури 3 °С Тинкторіальні властиво сті Морфологічні ознаки довжина товщина форма КінНеРозташування ЕлеменПа- Генеці Кокитарні саж рація КислотоКо- коВи- Ни- (за- Зернисло- Дотільця То- То- ПряСкустійкі ро- погн- тч- ок- стість Поод- (кислотото-сті- вгі нкі всті мі пчеткі дібуті ас-ті ругинокі йкі стійкі) ння ле-ні) ні 1 + + + + + + 168 2 + 1 + + + + + + + + + + 170 2 + + + + + + + + 1 + + + + + + + + 173 2 + + + + + + + + + + 1 + + + + + + 177 2 + + + + + + + 1 + + + + + + + + 178 2 + + + + + + + + + 1 + + + + + + + 179 2 + + + + + + + 1 + + + + + + + + 183 2 + + + + + + + + 1 + + + + + + + 188 2 + + + + + + + + 25 30 35 овали (L-форми, не кислотостійкі) + + Аналіз результатів дослідження показав, що мікроорганізми всіх культур першої та другої генерацій володіють вираженою кислотостійкістю і мають паличкоподібну форму. Мікобактерії першої генерації виявилися довшими від традиційних на фоні коротких кокоподібних форм. Збудники другої генерації в більшості мали короткі форми, і тільки культура 175-176 пересівів формувалася як довгими, так і короткими мікобактеріями. Того ж часу, мікобактерії усіх пересівів були тонкими, за формою досліджувані збудники виявилися прямими і вигнутими, із заокругленими кінцями. Зазначимо, що всі форми мали виражену зернистість, тобто вміщували ту чи іншу кількість зерен (іноді до 12). Одночасно характерним є скупчене розміщення мікобактерій у першій генерації. Для другої генерації показовим є більш поодиноке розміщення мікроорганізмів у полі зору мікроскопа, хоча й зустрічаються скупчення мікобактерій. Крім цього, тільки в одній культурі із семи пасажів другої генерації (173) зареєстровані лише кислотостійкі елементарні тільця, хоча ці утворення виявлялися в різних кількостях у культурах (колоніях) інших пересівів другої генерації. У першій генерації таких утворень не виявлено в культурах жодного із пересівів. 6 UA 68635 U Таблиця 6 Характеристика морфологічних ознак та тинкторіальних властивостей M.bovis першої та другої генерації в умовах культивування на середовищі з рН 6,7 за температури 3 °С Тинкторіальні Морфологічні ознаки властивості Недовжина товщина форма кінПа- Генерозташування кисці саж рація КислоЗерниКолото- До- Коротовиг- (затостійкі стість Скуп- Поодикопо- тонкі прямі сті- вгі ткі всті нуті ок-ругдібні чення нокі йкі лені) 1 + + + + + + + + + 168 2 + + + + + + + + + + 1 + + + + + + + + + + 170 2 + + + + + + + + + 1 + + + + + + + + + 173 2 + 1 + + + + + + + + + 175 2 + + + + + + + + + + 1 + + + + + + + + + 176 2 + + + + + + + + + + 1 + + + + + + + + + 178 2 + + + + + + + + 1 + + + + + + + + 180 2 + + + + + + + + 5 10 15 20 25 елементарні тільця (кислотостійкі) + + + + + + + Овали (L-форми, не кислотостійкі) Характеристика результатів морфологічних ознак та тинкторіальних властивостей М. bovis першої та другої генерації, культивованих на середовищі з рН 7,1 за температури 3 °С, наведена в табл. 7. У ході аналізу встановлено, що мікобактерії першої генерації утримують фарбу фуксину (кислотостійкі) і лише в одному, 117 пересіві, виявлена мішана культура (кислотостійкі та некислотостійкі). У другій генерації тільки в чотирьох пересівах із семи, колонії формувалися кислотостійкими формами, в інших 117а і 119 мішаними, а 117б і в - тільки некислотостійкими. Майже всі колонії, які стимульовані мікроорганізмами у формі паличок, вміщували кислотостійкі елементарні тільця (пасажі 120 і 122 першої генерації та 117 (а, б, в), 118 і 119 відповідно другої). Винятком виявилася культура 118 пасажу другої генерації, яка формувалася некислотостійкими овалами (L-форми) з різною оптичною щільністю поверхні та, як правило поодиноких кислотостійких елементарних тілець. За довжиною мікобактерії суттєво не відрізнялися проте дещо домінували коротки форми. У 117 пересіві першої генерації відмічалася наявність поміж інших і кокоподібних форм, а в другій генерації цього ж пересіву - довгих й коротких паличок та кокоподібних форм (117б). Протилежне явище відмічено в культурі 119 пасажу, де в першій генерації були довгі й короткі палички, а в другій - кокоподібні. Стосовно товщини мікроорганізмів, то в першій генерації це товсті й тонкі, а в другій переважно тонкі. Культури першої генерації 116-118 пасажів формувалися мікобактеріями прямої та вигнутої форм, а всі інші пересіви мікроорганізмами прямої форми. Проте всі вони мали заокруглені кінці. Щодо зернистості, то в M.bovis першої генерації вона була присутня, крім 117 пасажу, тоді як мікобактерії другої генерації її зберегли тільки в 116 та 123 пасажах. Характерна спільна властивість для мікобактерій обох генерацій - скупчене розташування. 7 UA 68635 U Таблиця 7 Характеристика морфологічних ознак та тинкторіальних властивостейM.bovis першої та другої генерації в умовах культивування на середовищі з рН 7,1 за температури 3 °С Тинкторіальні властивості Морфологічні ознаки Довжина Пасаж 116 117 117а 117б 117в 118 119 120 122 123 5 10 15 20 25 30 Генера-ція Кислотостійкі НеКислотостійкі 1 2 1 2 2 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 + + + + + + + + + + + + + + + Довгі Кор.откі + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Товщина КокоТопонкі дібні + + + Тов.сті Прямі Вигнуті + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Зернистість Форма Кінці (заокруглені) + + + + + + + + + + + + + + Виражена Відсутня + + + + + + + + + + + + + + + РозТашування (скупчення) + + + + + + + + + + + + + + + ЕлеМенТарні тільця (кислотостійкі) + + + + + + + Овали (LФорми, не кислотостійкі) + Отже, багаторазові пасажі М. bovis одного швидкорослого штаму на середовищі з різним рН сприяли дисоціації з появою різних варіантів мікобактерій, що принципово відрізняються за морфологічними ознаками, тинкторіальними, культуральними й іншими властивостями. Явищу дисоціації передували, напевно, й зміни хімічного складу клітинної стінки, оскільки досить легко змінюються тинкторіальні властивості (кислотостійкість). Усі ці фактори не могли не вплинути на метаболізм мікобактерій. Це, безумовно змінило характер розмноження мікроорганізмів. Скудний в часі, а іноді взагалі відсутній ріст мікобактерій в останніх досліджуваних пасажах, за 37 °C, сприяв зміні метаболізму, стимулюючи, генетично потенційну здатність до обмінних процесів мікробної клітини за низьких плюсових температур. З метою виявлення можливого впливу кількості пасажів на швидкість формування колоній на середовищі з різним рН проведено паралельне дослідження описаних вище культур, за температури культивування 3 та 37 °C. Для цього використано культури мікобактерій, які одержані на середовищі за температури 3 °С. Приклад 4 3 Попередньо готували завись М. bovis: 1 мг культури на 1 см фізіологічного розчину з колоній кожного пасажу, які утворилися на середовищі за температури 3 °С та висівали на живильне середовище трьох пробірок з відповідним рН 6,5; 6,7; 7,1 та подальшим культивуванням за температур 3 та 37 °C. Вплив кількості пасажів на інтенсивність розмноження М. bovis на середовищі з рН 6,5; 6,7; 7,1 за температур 3 та 37 °C наведено в табл. 8, 9, 10. Встановлено, що на живильному середовищі з рН 6,5 за низької плюсової температури початок росту колоній відмічається здебільшого на 10 добу, у той час як за 37 °C - тільки на 45 добу (170 пасаж). Мікобактерії усіх інших пасажів (за 37°С) почали формувати колонії в більш віддалені терміни (на 52 та 59 добу). Особливістю культивування мікобактерій за таких температур на середовищі з рН 6,5 є низька інтенсивність розмноження збудника, що супроводжується формуванням поодиноких колоній (2-5). Водночас за умов низької плюсової температури в деяких пасажах (170) спостерігається значна інтенсивність розмноження з великою кількістю утворених колоній (хоча й у віддалені терміни: на 66 добу). Отже, ці дослідження підтвердили здатність мікобактерій 8 UA 68635 U 5 розмножуватися, накопичуватися на штучному живильному середовищі за температури, яка вважається непридатною для метаболізму цих мікроорганізмів. За температури 3 °С відбувається в 4-5 разів швидше розмноження та відповідно формування колоній, ніж за температури 37 °C. Це може бути зумовлено зміною біохімічного складу в процесі багаторазових пасажів через штучне живильне середовище. Очевидним стало те, що інтенсивність розмноження мікобактерій, а й відповідно швидкість та кількість сформованих колоній визначаються кількістю генерацій (пасажів) М, bovis та їх конверсованих форм. Таблиця 8 Вплив кількості пасажів на інтенсивність розмноження М. bovis на живильному середовищі з рН 6,5 за температури 3 та 37 °С Пасаж 168 170 173 177 178 179 183 188 t°C 3 37 3 37 3 37 3 37 3 37 3 37 3 37 3 37 10 2 5 3 2 2 2 Примітка: Доба культивування, кількість колоній 17 24 31 38 45 52 59 66 3 4 4 4 4 4 5 5 1 1 1 6 6 6 6 6 6 6 20 2 2 3 4 2 2 3 3 3 3 3 3 2 2 2 5 5 5 5 5 5 5 1 1 2 3 4 4 4 4 4 4 4 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 2 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 - кількість колоній на початку росту культури 73 5 1 20 5 3 2 5 3 4 1 2 1 3 3 2 1 80 5 1 20 5 4 2 5 3 4 1 2 1 3 3 2 1 10 15 20 Провівши подібні дослідження з мікобактеріями, які культивовані на середовищі з рН 6,7 за двох температурних режимів, ми одержали практично ідентичні результати: поодинокі колонії, які формувалися на 11 добу за умов 3 °С та на 46-60 добу за традиційної температури культивування(табл. 9). В одній культурі (180 пасаж) відмічено найбільшу кількість колоній наприкінці дослідження. На середовищі з рН 7,1 за температури 3 і 37 °C встановлено (табл. 10), що початок росту, тобто, формування колоній за низької плюсової температури відбувся на одинадцяту добу, за винятком 117 пасажу, де ріст відмічено на четверту добу. За традиційної температури культивування (37 °С) колонії з'явились на 25 добу, крім 117 пересіву - на 11 добу. На цей період спостережень, інтенсивність росту мікобактерій була слабкою і характеризувалась появою поодиноких колоній. Таблиця 9 Вплив кількості пасажів на інтенсивність розмноження М. bovis на живильному середовищі з рН 6,7 за температури 3 та 37 °С Пасаж 168 170 173 t°C 3 37 3 37 3 37 11 2 2 2 18 3 2 2 Доба культивування, кількість колоній 25 32 39 46 53 60 67 4 4 4 4 4 4 4 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 9 74 4 3 3 1 2 1 81 4 4 3 1 2 1 UA 68635 U Продовження таблиці 9 1 2 3 175 37 3 176 37 3 178 37 3 180 37 Примітка: 5 10 3 4 5 6 7 8 4 4 5 5 5 5 1 3 4 4 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 55 5 2 - кількість колоній на початку росту культури 9 5 1 5 3 5 2 10 5 1 5 2 3 1 5 2 11 5 2 5 2 3 1 5 3 12 5 2 5 3 3 2 8 3 12 5 2 5 3 3 2 11 4 У подальшому, інтенсивність розмноження мікобактерій за температури 3 °С характеризувалася пишним ростом лише в 117 (а, б, в) пасажі, що вже на 25 добу культивування сприяло значному збільшенню кількості колоній (більше 25). В інших субкультурах виявлявся помірний ріст, який характеризувався поступовим утворенням нових колоній, зазвичай до десяти. Між іншим, за температури 37 °C інтенсивність розмноження мікроорганізмів 117 пасажу характеризувалася помірним ростом та поступовим збільшенням кількості колоній за період спостереження, з максимальною їх кількістю на 60 добу; мікобактерії інших пересівів мали слабкий ріст, за якого формувалося до 5 колоній. Виходячи з даних табл. 9 та 10, можна, як і в першому випадку, стверджувати, що вплив кількості пасажів на інтенсивність розмноження мікобактерій і за низької плюсової температури, і за традиційної не простежується. 15 Таблиця 10 Вплив кількості пасажів на інтенсивність розмноження М. bovis на живильному середовищі з рН 7,1 за температури 3 та 37 °С Пасаж t°C 3 116 37 3 117а 37 3 117б 37 3 117в 37 3 118 37 3 119 37 3 120 37 3 122 37 3 123 37 Примітка: 20 4 3 3 1 Доба культивування, кількість колоній 11 18 25 32 39 46 53 1 1 2 3 4 4 4 1 1 2 2 2 7 9 >25 >25 >25 >25 >25 1 1 2 2 2 2 3 10 >25 >25 >25 >25 >25 >25 1 1 1 2 4 5 5 6 >25 >25 >25 >25 >25 >25 5 5 8 8 10 11 12 2 3 3 5 5 5 5 1 1 2 2 2 3 5 8 8 9 9 9 2 2 2 2 3 1 1 2 2 3 4 4 1 2 2 3 3 1 2 2 24 4 4 5 1 1 2 2 2 1 2 2 2 3 3 5 1 1 2 2 2 »>» - більше - кількість колоній на початку росту культури Отже, за допомогою багаторазових пасажів, морфологічні ознаки та температурних режимів 60 5 2 >25 4 >25 8 >25 14 5 2 10 3 6 3 5 3 5 3 67 5 2 >25 4 >25 10 >25 14 6 2 10 3 7 4 7 3 8 4 різних сенсорних і регуляторних механізмів мікобактерії в умовах перебудовуючи роботу свого генетичного апарату, змінюючи культуральні властивості (відсутній ріст колоній за традиційних культивування у віддалені строки пасажування), зберігають свою 10 UA 68635 U 5 10 життєздатність та набувають властивостей розмножуватися за низьких плюсових температур. Це не вивчена й не описана раніше властивість М.bovis. Такий методичний підхід культивування М. bovis суттєво підвищує ефективність селекції мікроорганізмів, особливо їх дисоційованих та таких форм, які не культивуються (не формують колоній за звичайних температур), що важливо для одержання вакцинних штамів. Тому розроблений спосіб забезпечує достовірно ефективніше культивування М. bovis конверсованих форм за 3 °C, ніж за 37 °C. Під час цього колонії формувалися значно раніше (на 21 добу), інтенсивніше та в більшій кількості. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб культивування М. bovis конверсованих форм на щільних живильних середовищах, який відрізняється тим, що для підвищення адаптивної здатності мікроорганізмів, культивування проводять при температурі 3 °С. 15 Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 11