Спосіб культивування мікобактерій, що повільно ростуть, “нанотехнологія культивування мікобактерій”

1. Спосіб культивування мікобактерій, що повільно ростуть, який включає вирощування мікобактерій на живильному середовищі Мордовського або на живильному середовищі Сотона, або на іншому живильному середовищі, який відрізня U 2 (19) 1 3 39507 Йенсена є дорогими. Мікобактерії туберкульозу ростуть на штучних середовищах повільно, і помітний ріст з’являється після 4-10 тижнів інкубації в термостаті. Відомий спосіб культивування мікобактерій на живильному середовищі Гельберга при дослідженні біологічного матеріалу від тварин і посівів культур мікобактерій туберкульозу, що містить, (г/л): яєчну масу 400-500 (6 цілісних курячих яєць), жовтки яєць 90-100 (4 жовтки), молоко 140-160, картопляний відвар 140-160, малахітовий зелений 0,2-0,25 і сольовий розчин 140-160, що складається з калія фосфорнокислого двозаміщеного 0,140,16, натрію лимоннокислого 0,14-0,16, магнію сірчанокислого 0,14-0,16, пептону 0,8-1,0, гліцерину 3,2-4,0 і дистильованої води до 140-160мл [Патент России №2059728. Питательная среда для выделения из биоматериала животных и культивирования микобактерий туберкулеза. МПК C12Q1/04. Опубликовано: 10.05.1996]. Проте, при використанні цього і інших живильних середовищ, що застосовуються в бактеріологічній діагностиці туберкульозу тварин, ріст первинних культур мікобактерій туберкульозу дуже малий і повільний, і тому до появи їх колоній потрібні тривалі терміни інкубації: з посівів біоматеріалу 30-70 днів, при пересіваннях свіжовиділених культур 30-65 днів. Тому спостереження за посівами біоматеріалу проводять протягом 90 днів. Відомий також спосіб культивування мікобактерій "Метод глибинного посіву на кров’яне середовище" [Справочник фтизиатра, под ред. Н.А. Шмелева. - М.: Медицина, 1975. с. 90-91], заснований на використанні середовища Школьникової з додаванням цитратної крові, кінської сироватки, фракції бичачого сироваткового альбуміну. Максимальний ріст мікобактерій туберкульозу на подібному рідкому середовищі відмічається на 15-20 діб. До істотних недоліків цього способу відносяться такі: дуже низька ефективність посіву для мікобактерій туберкульозу і інших видів мікобактерій, виділених з інфікованих тканин і навколишнього середовища, а також те, що здійснення відомого способу вимагає застосування дорогих добавок. Найбільш близьким до пропонованого є спосіб культивування мікобактерій, що повільно ростуть, який включає вирощування мікобактерій на рідкому синтетичному середовищі Сотона, при цьому в середовище Сотона додають катодну фракцію електрохімічної активованої сольової композиції середовища Сотона [Патент России №2106879. Способ культивирования медленнорастущи х микобактерий. МПК А61К39/04, C12N1/20, C12N1/20, C12R1:32. Опубликовано: 20.03.1998]. Недоліками відомого способу є тривалий термін вирощування і обмежений вихід біомаси. У основу корисної моделі поставлена задача підвищення ефективності способу за рахунок збільшення виходу життєздатних мікобактерій, прискорення їх росту і підвищення інтенсивності накопичення бактерійної маси. Це досягається тим, що додатково використовують наночастинки біогенних металів. 4 Запропонований, як і відомий спосіб культивування мікобактерій, що повільно ростуть, включає вирощування мікобактерій на живильному середовищі Мордовського, або на живильному середовищі Сотона, або на іншому живильному середовищі і, відповідно до цієї пропозиції, в живильне середовище додають водний колоїдний розчин наночастинок металів, або наночастинок оксидів металів або наночастинок гідроксидів металів або їх суміш, при цьому метали вибрані з групи, що складається з магнію, міді, цинку. При цьому до 100г живильного середовища додають 10мл колоїдного розчину, який має концентрацію наночастинок, мг/л: наночастинки магнію, його оксиду, гідроксиду 0,5-20 наночастинки міді, її оксиду, гідроксиду 0,03-3 наночастинки цинку, його оксиду, гідроксиду 0,005-0,5 вода решта У запропонованому способі в живильне середовище додають водний колоїдний розчин наночастинок біогенних металів, або наночастинок оксидів біогенних металів або наночастинок гідроксидів біогенних металів або їх суміш, при цьому метали вибрані з групи, що складається з магнію, міді, цинку. Це збільшує ви хід життєздатних мікобактерій, прискорює їх ріст і підви щує інтенсивність накопичення бактерійної маси. Встановлено, що наночастинки сприяють регенерації тканин, стимулюючи метаболічні процеси в біологічних об’єктах. Виявлена інтенсифікація регенераційної активності при загоєнні ран у тварин при застосуванні наночастинок металів [Наночастки металів у лікуванні ран /В.Б. Борисевич, Б.В. Борисевич, О.Ф. Петренко та ін. // Збірник наукових праць міжнародної науково-практичної конференції «Сучасні проблеми ветеринарної медицини». - Кам’янець-подільський. - 2008. - С. 100103]. тобто посилення здатності до розмноження клітин. Цитостимулювальна властивість є характерною особливістю певних металевих наночастинок, яка може бути використана і в бактеріології, зокрема у складі живильних середовищ, особливо у тих випадках, коли мікроорганізми ростуть або погано, або повільно. Наночастинки застосовують у вигляді водного колоїдного розчину. Це дозволяє отримати екологічно чисте нетоксичне живильне середовище. Наночастинки металів набагато менш токсичні в порівнянні з іонною формою металів, отриманою з солей. Водний колоїдний розчин наночастинок отримують шляхом абляції електродів або металевих гранул у воді, наприклад, диспергуванням металевих гранул імпульсами електричного струму у воді [див. патент Україні на корисну модель №23550. Спосіб ерозійно-вибухового диспергування металів. МПК B22F9/14. Опубл. 25.05.2007. Бюл. №7]. До 100г живильного середовища додають 10мл колоїдного розчину, який має концентрацію наночастинок, мг/л: наночастинки магнію, його оксиду, гідроксиду 0,5-20 5 39507 наночастинки міді, її оксиду, гідроксиду 0,03-3 наночастинки цинку, його оксиду, гідроксиду 0,005-0,5 вода решта Компоненти колоїдного розчину узяті в оптимальних співвідношеннях. При вмісті компонентів менше нижніх меж знижується біологічна активність живильного середовища і зменшується швидкість росту мікобактерій. Вміст компонентів вище за верхні межі призводить до перевищення кількості мікроелементів, що також зменшує швидкість росту мікобактерій. Приклад. Висіви бактерій були проведені з використанням музейного штаму M.bovis, а також 6 збудників туберкульозу, виділених з патологічного матеріалу хворих на туберкульоз корів. Готували завісь М.bovis штаму «Шахтар» - 1мг культури на 1мл ізотонічного розчину натрію хлориду з проведенням мікроскопії. Посіви проводили у контролі на живильне середовище Мордовського з рН 6,5 та середовище для культивування мікобактерій ДП «Ветеринарна медицина» м. Харків з рН 7.1, у досліді використовували ті ж самі середовища з уведенням до їх складу колоїдного розчину наночастинок Cu, Zn, Mg. Результати вивчення ростових властивостей мікобактерій на живильних середовищах представлено в Таблиці 1. Таблиця 1 Середовище Музейний штам М. bo vis : а) середовище Мордовського б) середовище Мордовського з наночастинками Ag, Cu, Mg в) середовище «Ветеринарна медицина» (Харків) г) середовще «Ветеринарна медицина» (Харків) з наночастинками Ag. Cu, Zn Польовий ізолят М. bo vis : а) середовище Мордовського б) середовище Мордовського з наночастинками Ag, Cu, Mg в) середовище «Ветеринарна медицина» (Харків) г) середовище «Ветеринарна медицина» (Харків) з наночастинками Ag, Cu, Zn Середня кількість Дні появи колоній в 4-х пробіперших рках на 10-й день колоній від початку росту Морфологічні характеристики колоній 10 3,0±0,28 R,S-форма, опуклі, матові, вологі 7 7,25±0,42*** S-форма, опуклі, матові, вологі 10 4,0±0,29* R,S-форма, опуклі, матові, вологі 7 7,75±0,21*** S-форма, опуклі, матові, вологі 10 2,25±0,49 R,S-форма, опуклі, матові, вологі 7 6,5±0,28*** S-форма, опуклі, матові, вологі 10 2,0±0,27 R,S-форма, опуклі, матові, вологі 7 6,75±0,42 S-форма, опуклі, матові, вологі Примітка: *** Р