Спосіб атенуації m. bovis швидкорослих штамів

Спосіб атенуації M.bovis швидкорослих штамів шляхом пасажування їх через середовища, які містять речовини, що послаблюють вірулентність збудника (ектерицид, жовч), який відрізняється тим, що як фактор, що знижує вірулентність, використовують кисле рН середовище, яке дорівнює 6,5. (19) (21) u200805083 (22) 21.04.2008 (24) 25.06.2010 (46) 25.06.2010, Бюл.№ 12, 2010 р. (72) ТКАЧЕНКО ОЛЕКСІЙ АНДРІЙОВИЧ, БІЛАН МАРИНА ВОЛОДИМИРІВНА, ЗАЖАРСЬКИЙ ВОЛОДИМИР ВОЛОДИМИРОВИЧ, КУЛІШЕНКО ОЛЕГ МИКОЛАЙОВИЧ, ГЛЕБЕНЮК ВОЛОДИМИР ВОЛОДИМИРОВИЧ, КОВАЛЬОВА ЛІЛІЯ ОЛЕКСІЇВНА 3 Вивчали форму, структуру та строки формування колоній, морфологічні, тинкторіальні властивості мікобактерій (Настанова по діагностиці туберкульозу / В.М. Манченко, З.Р. Троценко, М.С. Павленко та ін. - Київ, 1994. - 39с.). Сенсибілізуючі властивості, ступінь вірулентності М.bovis першої та наступних генерацій кожного пасажованого штаму визначають, заражаючи традиційним методом, двох морських свинок, вагою 250-300г, зависсю мікобактерій накопиченої культури (1мг/см3 фізіологічного розчину). Сенсибілізуючу здатність та вірулентність оцінюють за традиційними у ветеринарній медицині методами, а ступінь патолого-анатомічних змін у внутрішніх органах лабораторних тварин - за схемою М.С. Триус (Ященко Т.Н., Мечева И.С. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулѐзе. М.: Медицина, 1973. - 260с.). Досліджувані М.bovis, на яєчному середовищі для культивування мікобактерій з двома значеннями рН, формували на 2 добу випуклі, гладенькі, блискучі, кольору слонової кістки, сухуватомаслянистої консистенції, відокремлені одна від одної колонії. Мікроскопія мазків, виготовлених з культур мікобактерій, засвідчила наявність червоних паличок, довжиною 1-3, шириною 0,3-0,5мкм з помірно вираженою грануляцією (в одній мікобактерії інколи знаходилася гранула), що є характерним для мікобактерій бичачого виду. За біохімічними властивостями, визначений швидкорослий епізоотичний штам М.bovis, характеризувався наступним: мікобактерії утворювали корд-фактор, не редукували нітрати, не володіли каталазною активністю, не росли за температури 22 та 45°С, формували колонії на середовищі зі саліцилатом натрію в концентрації 0,5мг/см3 (при мікроскопічних дослідженнях виявлені змінені червоні палички - на фоні нормальної морфології збудника спостерігалися зігнуті, деформовані, в дватри рази довші, ніж у мазках, які були виготовлені з колоній, зареєстрованих на середовищі без саліцилату натрію). За ступенем вірулентності М.bovis досліджуваного штаму віднесені до середнього, оскільки морські свинки, реагували на введений туберкулін на 20 і 30 добу та гинули від генералізованої форми туберкульозу на 34-40 добу після інокуляції зависі мікобактерій. Вивченням ліпідного складу у вихідного штаму М.bovis (методика Фолча в модифікації БлайяДайєра) встановили, що кількість загальних ліпідів на наважку становить 8,05% (Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. - М.: Мир, 1975. - 322с.). Після розділення загальних ліпідів на фракції методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) встановили, що більшу частину останніх складають фосфоліпіди (27,97%) та триацилгліцероли (18,32%). Вміст вільних жирних кислот та ефірів стеринів становить 14,47%, диацилгліцеролів 12,54%, стеринів - 12,23%. Газорідинним хроматографічним аналізом (ГРХ) фракції вільних жирних кислот виявили велику кількість насичених жирних кислот (72,61%), 50641 4 що зумовлено суттєвим вмістом довголанцюгових кислот (С21:0-С27:0 - 35,56%). Поряд з цим виявлена велика кількість пальмітинової кислоти (19,62%). Серед ненасичених жирних кислот відзначимо переважання олеїнової кислоти (23,87%), що становить 87,14% від їх загальної суми. Приклад 2 Вивчення впливу пасажів через штучне живильне середовище з різним рН на культуральні властивості колоній та морфологію збудника засвідчило (табл.1), що М.bovis епізоотичного швидкорослого штаму в другій та наступних генераціях проявляють різну інтенсивність розмноження. Таблиця 1 Швидкість росту колоній М.bovis на щільному середовищі за багаточисельних пересівів Пасаж мікобактерій 1-12 13-24 25-36 37-48 49-60 61-72 73-84 85-91 97-108 109-120 121-132 133-144 145-156 157-168 Строки появи колоній, день рН середовища 7,1 6,5 2,0 2,0 7,0 3,5 11,0 2,5 7,2 2,7 6,5 2,9 10,2 2,3 12,0 3,0 13,0 2,3 14,2 2,7 12,5 6,5 7,7 11,2 13,1 10,1 Як засвідчили дослідження, мікобактерії протягом досліду на середовищі з рН 7,1 знизили строки формування колоній з 19 пасажу, що визначило їх в наступному як повільнорослі; на середовищі з рН 6,5 - це явище виявлено тільки на 115 пересіві. Саме тому на останніх середовищах одержано 168 генерацій швидкорослого штаму, а на середовищі з рН 7,1 тільки 120. Культуральні властивості М.bovis зі збільшенням кількості пасажів через живильні середовища динамічно суттєво змінювалися в залежності від вмісту у середовищі кислотних грам-еквівалентів. Насамперед, це стосується форми, структури колоній й інтенсивності адаптації мікобактерій, щодо того чи іншого штучного живильного середовища. За досить тривалий період спостереження форми колоній змінювалися від дрібних, сухуватих, поодиноких, до більш великих і вологих з суцільним ростом за тривалого культивування, до незначного суцільного росту. При цьому М.bovis, пасажовані через живильне середовище з рН 7,1-7,2, втратили швидкість розмноження на 13-24 пересіві, в той час як на середовищі з рН 6,5 - на 109-120. Але, в цілому (табл.2), на 14 день від початку формування колоній на середовищі з рН 6,5 відмічався суцільний ріст практично до 114 пасажу, на середовищі з рН 7,1 тільки на 21-28 день спостереження 5 50641 до 61-66 пасажу, що свідчить про більш негативний вплив такого вмісту кислотних грам 6 еквівалентів на адаптивну здатність М.bovis щодо живильного середовища. Таблиця 2 Вплив середовища на інтенсивність росту колоній мікобактерій за багаточисельних пересівів 1-3 денної культури Пасаж 1 7-й 2 1-6 3,75 7-12 4,75 12-18 4,25 19-24 0,25 5,5 5,75 5,5 5,25 25-30 10,25 31-36 12,75 37-42 125 , 19,25 43-48 175 , 49-54 5,75 55-60 8,0 61-66 9,0 16,5 12,5 10,5 67-72 310 , 73-78 10,5 79-84 12,5 85-90 25,0 91-96 45,0 97-102 610 , 103-108 Кількість колоній в пробірці (на день) 14-й 21-й 3 4 c.p. 5,25 c.p. c.p. 6,75 8,5 127-132 133-138 c.p. 5,25 14,0 43,0 c.p. 46,5 6,25 c.p. 6,25 2,25 4,5 4,75 7,25 4,75 c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. 9,75 c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. 8,75 8,0 6,5 c.p. c.p. c.p. 13,5 7,0 14,75 10,5 13,7 c.p. c.p. c.p. c.p. 12,75 c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. 1,25 20,5 c.p. c.p. 6,25 c.p. c.p. 12,25 4,5 c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. 83,0 c.p. 63,25 c.p. c.p. 4,25 53,0 c.p. c.p. c.p. . c.p. c.p. 26,25 10 , 121-126 52,25 0,5 25,5 115-120 c.p. c.p. 19,75 109-114 c.p. c.p. c.p. 18,25 5,25 28-й 5 c.p. c.p. c.p. c.p. 6,25 9,75 c.p. c.p. c.p. c.p. c.p. 8,0 3,75 13,5 c.p. 12,5 24 c.p. 6,5 16,5 c.p. 7 50641 8 Продовження таблиці 2 1 2 3 4 5 139-144 5,5 c.p. c.p. 145-150 2,75 c.p. c.p. 151-156 2,0 c.p. c.p. 157-162 14,75 c.p. c.p. 163-168 c.p. c.p. c.p. Примітки: 1 - чисельник - кількість колоній на яєчному середовищі з рН 7,1; знаменник - кількість колоній на яєчному середовищі з рН 6,5; 2 - с.р. - суцільний ріст культури. Водночас, морфологія та тинкторіальні властивості мікобактерій в залежності від середовища змінювалися зі збільшенням кількості пересівів за винятком таких, які культивувалися на середовищі з рН 7,1, де згадані властивості практично не змінилися. На середовищі з рН 6,5, розпочинаючи з 90-ої генерації, в полі зору мікроскопа відмічалися товсті й тонкі, зернисті, короткі й довгі сегментовані палички червоного кольору. Зі 120-130 пасажу з'явилися надзвичайно довгі (15-20мкм - у 6-10 разів довші за традиційні) палички на фоні вихідних форм збудника. В останніх генераціях, розпочинаючи зі 145, на середовищі з рН 6,5 починали з'являтися й поодинокі ниткоподібні кислотостійкі сегментовані, з великою кількістю зерен, форми мікобактерій з менш інтенсивніше зафарбованою оболонкою, ніж в умовах перших пересівів, що може свідчити про зміну біохімічного складу клітинної оболонки. 168 генерація М.bovis на середовищі з рН 6,5 стимулювала інтенсивний ріст горбкуватих колоній. Мікроскопія засвідчила кислотостійкі, різних розмірів, в тому числі й поодинокі ниткоподібні сегментовані форми збудника. Встановлено відмінність у біохімічних властивостях пасажованих M.bovis (табл.3). Таблиця 3 Біохімічні властивості пасажованих М.bovis Властивість Активність № пасажу 2 59 100 164 Редукція нітратів 7,1 * 6,5 Реакція Акумуляція Толерантність Кордгідролізу заліза до 5% NaCl фактор каталазна пероксидазна ТВИН-80 7,1 + + ++ * 6,5 + ++ ++ ++ 7,1 + * 6,5 + + + рН середовища 7,1 6,5 7,1 6,5 + + + * + * 7,1 * 6,5 7,1 6,5 + + + + + ± * ± ріст на середовищі зі саліцилатом натрію 7,1 * 6,5 + + + Примітки: результат "+" - позитивний; "-" - негативний; "±" - сумнівний; "*" - пасажування не проводилось. Для оцінки каталазної активності: "++" - помірне виділення пухирців у першу хвилину; "+" - поодинокі пухирці у першу хвилину. M.bovis швидкорослого штаму при пасажуванні (59 та 100 разів) через штучне живильне середовище з рН 7,1 не редукували нітрати, не акумулювали залізо, не росли на середовищі з додаванням саліцилату натрію (0,5мг/см3), не росли на середовищі з додаванням 5% NaCl, прояв ляли слабку та середню каталазну активність, формували корд-фактор. На 100-му пересіві проявляли перокисидазну активність. При пересівах М.bovis через середовище з рН 6,5 встановлено, що мікобактерії володіли середньою каталазною і слабкою пероксидазною актив 9 50641 ністю до 164-го пасажу, гідролізували ТВИН-80, росли на середовищі з додаванням саліцилату натрію і не редукували нітрати, не акумулювали залізо, не росли на середовищі з додаванням 5% NaCl. Інтенсивність корд-фактору на цьому середовищі суттєво знизилася, починаючи із 100-го пересіву субкультури мікобактерій. 10 З метою вивчення впливу тривалого пасажування на ліпідний склад М.bovis використали культуру, пасажовану 2, 80, 130 та 150 разів і накопичену на середовищі для культивування мікобактерій з рН 6,5. За результатами дослідження ліпідного складу встановлено зниження їх кількості у 1,3-2,2 раза зі збільшенням кількості пасажів (табл.4). Таблиця 4 Вміст загальних ліпідів у М.bovis, (% на наважку) Пасаж Показник 2-й 130-й 150-й 8,05±0,20 Вміст загальних ліпідів 80-й 6,40±0,83 3,90±0,55** 3,66±0,42*** **Р≤0,01; ***Р≤0,001. Після розділення загальних ліпідів на фракції методом ТШХ встановили збільшення вмісту діа цилгліцеролів, стеринів та вільних жирних кислот в динаміці пасажів (табл.5). Таблиця 5 Фракційний склад ліпідів у пасажованих М.bovis (% від суми) Пасаж Фракція загальних ліпідів 2-й 27,97±0,26 12,54±0,27 12,23±0,20 14,47±0,23 18,32±0,16 14,47±0,24 100 Фосфоліпіди Діацилгліцероли Стерини Вільні жирні кислоти Триацилгліцероли Ефіри стеринів ліпідів 80-й 24,34±0,85* 19,05±0,37*** 16,93±0,78** 16,40±0,46* 12,17±0,59*** 11,11±0,67** 100 130-й 20,72±0,85** 20,36±0,86*** 18,93±0,74*** 16,07±0,36* 12,50±0,49*** 11,42±0,80* 100 150-й 23,41±0,45*** 16,71±0,43** 16,00±0,70** 16,00±0,14** 15,61±0,32** 12,27±0,50* 100 *Р≤0,05; **Р≤0,01; ***Р≤0,001. Пасажування мікобактерій призвело до зниження фракцій фосфоліпідів, триацилгліцеролів та ефірів стеринів. ГРХ-аналізом фракції вільних жирних кислот (табл.6) виявлено велику кількість насичених жирних кислот, особливо на 80-му пересіві (за рахунок пальмітинової та стеаринової кислот). В цілому, багаторазове пасажування призвело до збільшення кількості пальмітинової (С16:0) та стеаринової (С18:0) кислот (Р≤0,001). Але зі збільшенням кількості пасажів, відмічається поступове зниження нонадеканової (С19:0) та арахінової (С20:0) кислот. Таблиця 6 Вміст вільних жирних кислот у зразках, % від суми Вільна жирна кислота Код 1 2 Лауринова С12:0 Тридеканова С13:0 Миристинова С14:0 Пентадеканова С15:0 Пальмітолеїнова С16:1 Пальмітинова С16:0 Маргаринова С17:0 Олеїнова С18:1 Стеаринова С18:0 Лінолева+ліноленова С18:2+С18:3 Пасаж 2-й 3 0,04±0,02 0,10±0,02 0,27±0,04 0,22±0,02 0,55±0,07 19,62±0,53 0,81±0,07 23,87±0,60 7,42±0,11 2,97±0,16 80-й 4 0,05±0,03 0,22±0,05 0,22±0,08 0,17±0,08 0,26±0,10 30,35±0,95*** 0,70±0,19 23,37±0,70 25,72±1,79*** 1,86±0,68 130-й 5 0,10±0,06 0,15±0,08 0,51±0,30 0,33±0,23 1,63±0,21* 26,43±1,01** 3,05±0,4** 44,72±1,55*** 10,57±0,64** 3,86±0,02** 150-й 6 сліди сліди сліди 0,08±0,05** 28,97±0,91*** 0,91±0,07 27,16±0,55* 13,58±0,52*** 8,96±0,57* 11 50641 12 Продовження таблиці 6 1 Нонадеканова Арахінова Генейкозанова Бегенева Трикозанова Тетракозанова Пентакозанова Гексакозанова Гептакозанова ненасичених насичених коротколанцюгових довголанцюгових 2 С19:0 С20:0 С21:0 С22:0 С23:0 С24:0 С25:0 С26:0 С27:0 3 3,34±0,06 5,23±0,14 6,74±0,23 5,78±0,18 5,89±0,35 5,57±0,19 7,43±0,26 2,53±0,30 1,62±0,19 27,39±0,44 72,61±0,50 64,44±0,61 35,56±0,47 4 1,60±0,74** 0,63±0,32*** 1,74±0,77** 2,11±0,64** 1,09±0,66** 1,28±0,62** 7,93±1,13 0,70±0,44* сліди 25,49±2,16 74,51±1,50 85,15±0,54 14,85±0,47 5 1,22±0,07*** сліди 2,14±0,03*** 3,17±0,01*** 2,12±0,02*** 50,21±1,80*** 49,79±1,70*** 92,57±0,53 7,43±0,40 6 1,13±0,36** сліди 3,39±0,38** 10,17±0,54** сліди сліди 5,65±0,65 36,20±0,70*** 63,80±0,75*** 80,79±0,50 19,21±0,32 * Р 0,05; ** Р 0,01; ***р 0,001. Примітки: 1. СА:0 - насичена жирна кислота (А - кількість атомів вуглецю); 2. СА:Н - ненасичена жирна кислота (Н - кількість подвійних зв'язків); 3. Сліди - наявність кислоти менше 0,01%. Пасажування призвело до збільшення суми ненасичених жирних кислот у досліджуваної культури М.bovis. Серед ненасичених жирних кислот відмічається переважання олеїнової кислоти (С18:1) у всіх зразках, особливо на 130-му пасажі, де виявлено також максимальну кількість пальмітолеїнової (С16:1) кислоти та 150-му, де спостерігається найбільше лінолевої та ліноленової кислот (С18;2+С18:3). Багаторазове пасажування суттєво впливало на співвідношення коротколанцюгових (С12-С20) та довголанцюгових кислот (С21-С27). Сумарна кількість довголанцюгових кислот зі збільшенням пасажів зменшувалася (в 2,4, 4,8 та 1,9 раза відповідно). На 150-му пасажі, подібно 130-му, на фоні поступового зниження не відмічено таких кислот як С26, С27, а С23 та С24 виявлялися у вигляді слідів, хоча останніх не встановлено на 130-му пасажі взагалі. У 1,8 рази збільшилась кількість бегенової кислоти на 150-му пасажі, у 3,5 раза зменшилась кількість пентакозанової кислоти на 130-му пасажі. Отже, у динаміці пасажів дослідженнями встановлено зниження кількості загальних ліпідів, фракцій фосфоліпідів, триацилгліцеролів та ефірів стеринів, суми насичених та довголанцюгових жирних кислот. Приклад 3 На відміну від вихідного штаму, пасажовані мікобактерії, починаючи від 80-го пасажу почали втрачати вірулентні властивості (табл.7). Вочевидь, як свідчать дані, більш динамічними ці процеси відбувалися на середовищі з рН 6,5, хоча для живлення та розмноження мікобактерій, їх здатності утворювати колонії таке середовище є більш оптимальним. Це свідчить про відсутність зв'язку між швидкістю розмноження мікобактерій та їх вірулентністю. Таблиця 7 Сенсибілізуючі та вірулентні властивості пасажованих мікобактерій Живильне № мор№ середовище, ської пасажу рН свинки 1 2 40 7,1 59 120 3 1 2 3 4 5 6 Алергічне досліСпецифічні ураження Тривалість дження, доба Індекс досліду, ураження лімфатичні діб 20 30 60 селезінка печінка легені вузли 4 5 6 7 8 9 10 11 12 + + + 83 ++ +++ ++ 16 + + 90 ++ ++ ++ 14 + + 59 ++ +++ +++ 18 + + 68 ++ +++ ++ 16 + + + 60 ++ +++ ++ 16 + + 71 ++ +++ ++ 16 13 50641 14 Продовження таблиці 7 1 2 40 80 6,5 130 150 3 7 8 9 10 11 12 13 14 4 + + + 5 + + + + + + + + 6 + + + + + 7 58 47 85 90 90 90 90 90 8 ++ ++ ++ ++ 9 ++ +++ +++ ++ 10 11 +++ +++ ++ ++ 12 18 20 16 14 Примітки: (результат) 1. "+" позитивний; 2. "-"негативний. Для специфічних уражень: 1. "+" - поодинокі вузлики; 2. "++" - декілька вузликів; 3. "+++" - численні, рідко розташовані вузлики. Встановлено, що хоча всі морські свинки і реагували на введення ППД-туберкуліну для ссавців на 30-й день і більшість на 60-й день, проте пасажування мікобактерій через середовище з рН 6,5 до 150 пересіву призвело до втрати ними вірулентності і тварини були забиті на 90-й день дослідження. При розтині морських свинок патологоанатомічних змін, властивих туберкульозу, не ви Комп’ютерна верстка А. Рябко явлено і індекс ураження внутрішніх органів підрахувати не можна. Отже, паралельно зміні форми й структури колоній, морфології, тинкторіальних й біохімічних властивостей (зміни каталазної активності та здатності утворювати корд-фактор), ліпідного складу пасажованих мікобактерій на яєчному середовищі з рН 6,5 змінювалась і їх вірулентність до повного її зникнення. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601