Химера il6ril6 для лікування нейродегенеративних захворювань

1. Застосування химери IL6RIL6 для виробництва лікарського засобу для лікування травматичної дегенерації нервів, демієлінізуючих захворювань ЦНС або ПНС і/або нейродегенеративних захворювань. 2. Застосування за п.1, де демієлінізуючим захворюванням є розсіяний склероз (РС). 3. Застосування за п.1, де нейродегенеративне захворювання вибране з хвороби Альцгеймера, хвороби Паркінсона і аміотрофічного бічного склерозу (БАС). (19) (21) 2002010458 (22) 21.06.2000 (24) 15.09.2006 (86) PCT/IL00/00363, 21.06.2000 (31) 130586 (32) 21.06.1999 (33) IL (46) 05.09.2006, Бюл. №9, 2006р. (72) Ревел Мічел, IL, Чебат Юдіт, IL, Піцці Маріна, IT, Спано П'єрфранко, IT, Бошерт Урсула, CH (73) ЙЄДА РІСЕРЧ ЕНД ДІВЕЛОПМЕНТ КО. ЛТД., IL, АППЛАЙД РЕЗЕЧ СІСТЕМЗ АРС ХОЛДІНГ Н.В., NL 3 76695 4 SC, які експресують МБР і інші білки мієліну тор, що інгібує лейкемію (LIF). стимулюють вижи[Kioussi and Gruss, 1996]. Клітини, мігруючі з нерваність олігодендроцитів оптичного нерва, що кувового гребінця, дають початок не тільки pSC, але льтивуються in vitro з bFGF або PDGF, і збільшутакож сенсорним і симпатичним нейронам, клітиють кількість олігодендроцитів, які експресують нам гладкої мускулатури і клітинам, які досягають МБР, в цих культурах [Mayer et al, 1994]. Однак шкіри і волосяних фолікулів і стають пігментовапри додаванні до гліальних клітин-попередників ними меланоцитами. На долю клітин нервового CNTF і LIF, мабуть, переважно сприяють диферегребінця впливають різні індукуючі фактори: динціюванню астроцитів і індукують експресію марференціювання в гліальні клітини, в нейрони і м'якера GFAP астроцитів, тоді як на олігодендроцити зи активується неурегулінами, такими як гліальний вони надають в основному дію, пов'язану з вижифактор росту (GG.F), ВМР2/4 і TGF-β, відповідно ваність, надаючи при цьому невеликий вплив на [Andersen, 1997]). Диференціювання в меланоцити рівень експресії гена МБР [Kahn and De Vellis, може активуватися факторами росту, такими як 1994, Bonni et al, 1997]. Проте, комбінації CNTF з bFGF або PDGF або SDF [Stocker et al., 1991; нейротрофічним фактором, отриманим з головноAnderson, 1997]. го мозку, BNDF, поліпшують відновлення пошкоЗавершальне диференціювання попередників дженого периферичного сідничного нерва [Ho et al, шванновських клітин і олігодендроцитів в активно 1998]. мієлінізуючі клітини і сама мієлінізація, мабуть, CNTF i LIF є цитокінами, діючими через загазалежать від сигналів, що генеруються при взаєльну рецепторну систему, яка включає в себе ремодії між аксонами нейронів і гліальними клітинацептор LIF (LIFR) і ланцюг gp130, останній також с ми [Lemke and Chao, 1988; Trapp et al., 1988]. Коли частиною рецепторного комплексу інтерлейкіну-6 уривається контакт між аксоном і шванновськими (IL-6) [Ip et al., 1992]. Тому CNTF і LIF є частиною клітинами, як, наприклад, після пошкодження нерIL-6-сімейства цитокінів. У випадку CNTF і LIF сигва, клітини повертаються в немієлінізуючий стан, і нальна трансдукція здійснюється за допомогою експресія генів білків мієліну втрачається [Jessen димеризації LIFR з gp130, тоді як у випадку з IL-6 and Mirsky, 1991]. Щоб зуміти стимулювати мієлінісигнал генерується за допомогою димеризації зацію або ремієлінізацію після нервового захворюдвох ланцюгів gp130 (Murakami et al., 1993). Для вання або травми, надзвичайно важливо ідентифітого, щоб зв'язати gp130,1L-6 утворює комплекс з кувати фактори, які здатні індукувати синтез ланцюгом рецептора IL-6, який існує на певних мієліну. клітинах у вигляді трансмембранного білка gp80, Пошкодження ЦНС, індуковане гострими інсуале розчинна форма якого також може функціонультами, включаючи травму, гіпоксію і ішемію, може вати як агоніст IL-6 коли доставляється із зовнішвпливати як на нейрони, так і на білу речовину. ньої ' "сторони клітини [Taga et al, 1989, Novick et Хоч найбільша увага приділялася процесам, що al, 1992]. При злитті повних кодуючих районів приводять до загибелі нейронів, зростаюча кількДНК, що кодують розчинний рецептор IL-6 (sILкість даних свідчить про те, що пошкодження олі6R) і IL-6, рекомбінантну химеру IL6RIL6 можна годендроцитів, які мієлінізують аксони, також є продукувати в клітинах СНО [Chebath et al., 1997, характерною складовою пошкодження ЦНС. Так, WO99/02552]. Вказана химера IL6RIL6 володіє патологія олігодендроцитів була продемонстровапідвищеною біологічною активністю і зв'язується in на в дуже ранній фазі після ішемії головного мозку vitro з ланцюгом gp130 з набагато більшою ефек(3 години) у пацюків, свідчачи про те, що ці клітини тивністю, ніж суміш IL-6 з sIL-6R (Kollet et al., 1999). навіть більш вразливі до ексцитотоксичних подій, Оглядовий аналіз ефектів IL-6 на клітини чим нейронні клітини [Pantoni et al. 1996]. Одним з центральної і периферичної нервової системи свіпотенційних кандидатів, що опосередковують задчить про те, що цитокін може надавати захисну гибель клітин, є помітне підвищення концентрації дію на нервові клітини, а також бере участь в заглутамату, яке супроводжує багато які гострі пошпальних нейродегенеративних процесах [Gadient кодження ЦНС [Lipton et al. 1994]. Дійсно, виявили, and Often, 1997, Mendel et al, 1998]. CNTF і LIF що навіть крім нейронів олігодендроцити експребули набагато більш активними при дії на гліальні сують функціональні рецептори глутамату, що клітини, ніж IL-6, при стимуляції диференціювання відносяться до підтипу АМРА/каїнату. Крім того, астроцитів, і не спостерігалося дії на клітини, іца олігодендроцити виявляють високу вразливість до продукують білки мієліну [Kahn and De Vellis, застосування глутамату [McDonald et al. 1998]. 1994]. Було виявлено, що IL-6 запобігає індуковаНейрегуліни, такі як GGF, які діють на ембріоній глутаматом загибелі клітин в гіпокампі [Yamada нальні попередники шванновських клітин, також є et al., 1994], а також стріарних нейронів [Toulmond факторами виживання, росту і дозрівання постнаet al., 1992]. Механізм нейропротекції IL-6, направтальних олігодендроцитів і шванновських клітин в леної проти токсичності, що викликається KMDA, пошкоджених нервах, і GGF є одним з мітогенних селективним агоністом рецепторів глутамату факторів, що надаються контактом аксона [Toplico NMDA-підтипу, ще не відомий. Дійсно було виявet al., 1996]. Рекомбінантний hGGF2 може посилюлене, що IL-6 посилює опосередковане NMDA підвати ремієлінізацію при тривалому введенні в мовищення внутрішньоклітинного вмісту кальцію. У делі неуважного склерозу у мишей [Cannela et al., трансгенних мишей, що експресують більш високі 1998] або в роздробленому периферичному нерві рівні як IL-6, так і розчинного IL-6R (sIL-6R), спо[Chen et al, 1998]. Іншим цитокіном, який індукуєтьстерігали прискорену регенерацію нервів після ся в шванновських клітинах контактом аксона, є пошкодження під'язичного нерва, як показане ретциліарний нейротрофічний фактор CNTF [Lee et роградним міченням ядер під'язичного нерва в al., 1995]. Було показано, що CNTF, а також факголовному мозку (Hirota et al, 1996). У вказаній 5 76695 6 роботі при доданні IL-6 і sIL-6R до культур клітин захисту від нейротоксичності, що індукується глугангліїв дорсальних корінців (DRG) показане підтаматом, що забезпечується химерою IL-6 в первищене подовження нейритів нейронів, але не винних культурах нейронів мозочка новонароджеповідомлялося про дію на мієлінізуючі клітини. них пацюків. У світлі представлених вийде даних не було Запропонований молекулярний механізм, по показано, що CNTF/LIF або суміш IL-6 і sIL-6R інякому IL6RIL6 індукує і репресує специфічні факдукують термінальне диференціювання гліальних тори транскрипції, які викликають індукцію дифеклітин в мієлінізуючі клітини. Однак, як підкреслено ренціювання генів МВР в гени мієлінізуючого февище, стимуляція ' Диференціювання мієлінізуюнотипу. чих клітин мала б величезну цілющу дію для паціТаким чином, даний винахід пов'язаний із заєнтів, страждаючих демієлінізуючими або нейростосуванням химери IL6RIL6 для виробництва дегенеративними захворюваннями. лікарського засобу для лікування і/або запобігання Цитування якого-небудь документа в даній роневрологічним захворюванням і розладам. Зокреботі не означає визнання того, що такий документ ма, даний винахід пов'язаний із застосуванням відноситься до попереднього рівня техніки або химери IL6RIL6 для виробництва лікарського заматеріалів, що обговорюються відносно патентособу для лікування травматичної дегенерації нерспроможності якого-небудь пункту формули винава, демієлінізуючих захворювань ЦНС або ПНС ходу даної заявки. Будь-яке твердження відносно і/або нейродегенеративних захворювань. змісту або дати будь-якого документа засноване Більш конкретний винахід пов'язаний із застона інформації, доступній заявникам під час подачі суванням химер IL6RIL6 при лікуванні неуважного заявки на видачу патенту, і не є визнанням корексклерозу (НС), хвороби Альцгеймера, хвороби тності такого твердження. Паркінсона або бічного аміотрофічного склерозу Метою даного винаходу є надання способів лі(БАС, ALS). кування і/або запобігання неврологічним захворюВинахід також пов'язаний з фармацевтичними ванням або розладам. Зокрема, метою даного композиціями, що містять "химеру IL6RIL6, необовинаходу є надання способів стимулювання або в'язково разом з однією або більшою кількістю посилення диференціювання попередників або фармацевтично прийнятних наповнювачів, для диференційованих гліальних клітин в мієлінізуючі лікування і/або запобігання неврологічному захвоклітини. Основою винаходу є застосування рекомрюванню або розладам. Зокрема, фармацевтична бінантного химерного білка IL6RIL6, який володіє композиція являє собою композицію для лікування помітно більш високої афінністю до gp130, чим травматичної дегенерації нервів, демієлінізуючих суміш IL-6 і SIL-6R. захворювань ЦНС або ПНС і/або нейродегенераНаступною метою даного винаходу є надання тивних захворювань. способів стимулювання або посилення мієлінізації Переважним застосуванням фармацевтичних або ремієлінізації пошкоджених волокон, що покакомпозицій згідно з даним винаходом є лікування зано за допомогою індукованої ремієлінізації аксоНС, хвороби Альцгеймера, хвороби Паркінсона нів після аксотомії сідничного нерва in vivo в допоабо БАС. внення до мієлінізуючої дії IL-6-химери на індукцію На Фіг.1 показане збільшення МВР-РНК в кугенів мієліну in vitro. льтурах шванновських клітин, оброблених химеМетою даного винаходу також є застосування рою IL6RIL6 або форсколіном (FSK), або - зліва химери IL6RIL6 для збільшення кількості шванновнеоброблених (НО). ських клітин, що розвиваються в культурах гангліїв На Фіг.2 показана проліферація недиференцідорсальних корінців (DRG). Крім того, метою данойованих клітин "oli-neu", виміряна через 24, 48 і 72 го винаходу є застосування IL6RIL6 для індукції години після обробки різними кількостями химери диференціювання вказаних клітин до того моменIL6R/IL6. ту, коли вони накручуються навколо аксонів і проНа Фіг.3 показано, що IL6RIL6 сильно індукує дукують основний білок мієліну, як показано в спімРНК МБР (А) і знижує синтез мРНК Рах-3 (В) в льних культурах ліній шванновських клітин і клітинах F10.9 з плином часу. НО означає необропервинних DRG. блені клітини. Іншою метою даного винаходу є застосування На Фіг.4 показане порівняння нейропротекції химери IL6RIL6 для індукції транскрипції генів оспід дією одного тільки IL-6 і химерою IL-6 у відноновних білків мієліну (МБР) в системі трансдифшенні нейротоксичності, опосередкованої NMDA, в ференціювання, в якій клітини з фенотипом мелаорганотипових зрізах гіпокампу. ноцитів перетворюються в клітини шванновського На Фіг.5 показано пролонгована нейропротекмієлінізуючого фенотипу, як показано при дії торна дія химери IL-6 проти дії одного тільки IL-6 в IL6RIL6 на меланому мишей. органотипових зрізах гіпокампу. Іншою метою даного винаходу є застосування На Фіг.6 показана дія химери IL6R/IL6 на вихимери IL6RIL6 як агента нейропротекції і для заживаність нейронів, позбавлених NGF, після 24 побігання загибелі нервових клітин в гіпокампі, годин обробки, як виміряно за допомогою МТТрайоні, залученому до кодування пам'яті, і районі, аналізу. який виявляє ранню дегенерацію при хворобі АльЗгідно з винаходом, було виявлено, що додацгеймера і ішемії. вання рекомбінантного білка IL6IL6R до культур Іншою метою даного винаходу t застосування клітин гангліїв дорсальних корінців або клітин мехимери IL6RIL6 як протекторного засобу проти ланоми стимулює диференціювання цих клітин в процесу нейротоксичності, що ініціюється збуджумієлінізуючі клітини. Також було виявлено, що доючими амінокислотами, як показано за допомогою давання рекомбінантного білка IL6IL6R до спіль 7 76695 8 них культур нейронів і шванновських клітин індукує індукція МБР. Згідно з даним винаходом, крім гою, останні до утворення регулярної оболонки навколо експериментально виявлене, що в спільній кульаксонів. Тому винахід стосується застосування турі шванновських клітин з нейронами химера IL-6 химери IL6RIL6 для виробництва лікарського заможе індукувати значне збільшення скріплення собу для того, щоб утворити мієлінізуючі клітини шванновських клітин вздовж немієлінізованих акабо стимулювати, посилити або прискорити утвосонів протягом 5 годин. Шванновські клітини, які рення мієлінізуючих клітин. мітили Fluorogold, довшали, і через декілька днів Химера IL-6, крім того, індукує ремієлінізацію можна було бачити, як їх цитоплазма, що флуориin vivo перерізаних волокон після аксотомії сідничсцує, формувала регулярну оболонку навколо акного нерва у пацюків. Тому винахід, крім того, відсонів. Без химери, або в присутності NGF, шванноситься до застосування химери IL6RIL6 для виновські клітини зв'язуються набагато менше і не робництва лікарського засобу для індукції, утворюють оболонку. посилення або прискорення ремієлінізації, зокреТому винахід, крім того, відноситься до застома, після пошкодження або травми нерва або посування химери IL6RIL6 для виробництва лікарсьшкоджень аксонів. кого засобу для індукції проліферації і/або, дифеДалі, було виявлено, що додавання рекомбіренціювання шванновських клітин, а також нантного білка IL6IL6R до органотипових культур мієлінізації шванновськими клітинами в перифериіндукує пролонговану захисну дію від нейротоксичній нервовій системі. ческих агентів. Тому винахід також відноситься до Згідно з даним винаходом, крім того, було позастосування химери IL6RIL6 для виробництва казано, що химера IL-6 може індукувати ремієлінілікарського засобу для індукції, посилення, пролозацію периферичних нервів in vivo. Після аксотомії нгації або прискорення нейропротекції, зокрема, сідничного нерва у пацюків і накладення проксивід нейротоксичних агентів, і для інгібування, знимального і дистального обрізків химера IL-6 могла ження або сповільнення загибелі нейронів, яка індукувати регенерацію периферичних нервів і може бути, наприклад, наслідком апоптозу. ремієлінізацію перерізаних волокон in vivo. У приДаний винахід стосується застосування «хисутності химери IL-6 виявили 4-кратне збільшення мери IL6RIL6» (яку також називають «IL6RIL6» або кількості і товщини мієлінізованих волокон, і збіхимерою IL-6), яка являє собою рекомбінантний льшення ремієлінізації більш віддалених волокон. глікоиротеїд, отриманий злиттям повної кодуючої Тому винахід крім того відноситься до застосуванпослідовності розчинного IL-6-рецептора δ-Val ня химери ІL6RIL6 для виробництва лікарського природного походження з повною кодуючою посзасобу для індукції ремієлінізації в периферичній лідовністю зрілого IL-6 природного походження, нервовій системі. при цьому, обидві вони походять з клітин людини. Більш того, також було виявлено, згідно з даХимеру IL6RIL6 можна продукувати в будь-яких ним винаходом, що химера IL-6 може індукувати придатних еукаріотичних клітинах, таких як клітини експресію генів, що кодують компоненти білків дріжджів, клітини комах і ним подібні. Химеру пемієліну, таких як гени МВР, PLP і РО в мієлінізуюреважно продукують в клітинах ссавців, найбільш чих клітинах периферичної нервової системи, тапереважно - в отриманих методами генної інженеких як шванновські клітини, і в клітинах центральрії клітинах СНО, [як описано в WO 99/02552]. Неної нервової системи, таких як олігодендроцити. зважаючи на те, що переважний білок, який похоТому винахід, крім того, відноситься до застосудить з клітин людини, фахівцеві в даній області вання химери IL6RJL6 для виробництва лікарськобуде зрозуміло, що подібний злитий білок будьго засобу для індукції мієлінізації і/або ремієлінізаякого іншого походження можна використати згідції олігодендроцитами в центральній нервовій но з винаходом, при умові, що він зберігає описану системі. тут біологічну активність. Згідно з даним винаходом, також було виявБільш конкретно, даний винахід стосується залено, що додавання химери IL6RIL6 до культур стосування химери IL6RJL6, для того, щоб стимулінії клітин меланоми мишей B16/F10.9 індукує лювати диференціювання попередників або диекспресію гена МБР в межах 6-12 годин. Індукуференційованих гліальних клітин в мієлінізуючі ються інші гени, які кодують білки мієліну, такі як клітини. Як показано в даній роботі, процес дифеген СЫРази, тоді як експресія генів, які залучені в ренціювання мієлінізуючих клітин, індукований меланогенез (утворення меланінових пігментів), IL6RIL6, залучає як активацію генів, необхідних таких як ген тирозинази, сильно репресована. Клідля утворення мієлінової оболонки навколо аксотини F10.9, оброблені IL6RIL6, також зазнають нів нейронів, так і репресію гена, необхідного для помітної морфологічної зміни, і придбавають фепідтримки немієлінізуючих фенотипів. нотип, подібний фенотипу шванновських клітин. Згідно з даним винаходом, експериментально Феиотипічні зміни і індукція специфічних генів мієбуло виявлено, що додавання химери IL6RIL6 до ліну підтверджують гіпотезу про те, що IL6RIL6 культур клітин ембріональних гангліїв дорсальних викликає трансдиференціювання клітин з стану корінців (eDRG), виділених з ембріонів мишей на меланоцитів в стан мієлінізуючих клітин. Оскільки 14-15 день вагітності, впливає надзвичайно сильв ембріонові клітини, мігруючі з нервового гребінним чином на розвиток попередників шванновсьця, можуть давати початок або меланоцитам, або ких клітин, присутніх в DRG. Після 2-5 днів в кульмієлінізуючим шванновським клітинам і олігодендтурі має місце помітне збільшення кількості роцитам, передбачається, що IL6RIL6 може вплиембріональних шванновських клітин, помітна зміна вати на долю клітин і стимулювати утворення мієфенотипу цих клітин, які починають утворювати з лінізуючих клітин. Тому винахід також відноситься своїх мембран оболонку навколо аксонів DRG, і до застосування химери TL6RIL6 для виробництва 9 76695 10 лікарського препарату для індукції, стимулювання, Виявлено, що химера 1L-6 захищає нейрони від посилення або прискорення утворення мієлінізуюнейротоксичності, індукованої глутаматом. Тому чих клітин в периферичній і в центральній нервовинахід відноситься до виробництва лікарського вій системі і/або для індукції трансдиференціюзасобу для захисту нервових клітин від загибелі, вання меланоцитів в мієлінізуючі клітини. зокрема, внаслідок дії нейротоксичних агентів, і Крім того, відповідно до даного винаходу, подля лікування і/або запобігання нейродегенератиказано, що IL6RIL6 діє при придушенні гомеобоксвних захворювань, подібних, наприклад, хворобі ного гена Рах-3, гена, який експресується в клітиАльцгеймера, хворобі Паркінсона або БАС. нах ембріонального нервового гребінця перед тим, Крім того, до неврологічних захворювань, які як вони диференціюються в мієлінізуючі шванновможна лікувати химерою IL6RIL6, відносяться інські клітини [Kioussi and Gruss, 1996]. Відомо, що сульти, порушення рухів, епілепсія, біль і тому Рах-3 репресує ген МБР. Тому, мабуть, репресія подібне. Рах-3 є ключовою подією в кінцевому дозріванні Мають на увазі, що визначення «фармацевтимієлінізуючих клітин. Отже, IL6RIL6 діє на ключове чно прийнятний» охоплює будь-який носій, який не перемикання диференціювання (а саме, репресію заважає ефективності біологічної активності актирах-3). вного інгредієнта і який не токсичний для господаРах-3 є транс-активатором фактора транскриря, якому його вводять. Наприклад, для парентепції MITF, пов'язаного з мікрофтальмією, який, в рального введення химера IL6RIL6 може бути свою чергу, індукує і підтримує експресію гена типриготована в дозованій лікарській формі для ін'єрозинази і інших генів, які відповідають за меланокції в таких наповнювачах як фізіологічний розчин, цитний фенотип. Тому виявлення швидкої репресії розчин декстрози, сироватковий альбумін або розРах-3 за допомогою IL6RIL6 може пояснити молечин Рінгера. кулярні події, які стимулюють мієлінізуючу активХимеру IL6RIL6 можна вводити пацієнту, який ність клітин, що походять з нервового гребінця. потребує такого введення, різними шляхами. ШляПісля пошкодження нерва мієлінізовані аксони хи введення включають в себе інтрадермальний, зазнають демієлінізації в ході валеровського перетрансдермальний (наприклад, в композиціях упородження. Під час цього процесу в шванновських вільненого вивільнення), внутрішньом'язовий, внуклітинах меншає експресія гена МВР і інших ротрішньочеревний, внутрішньовенний, підшкірний, динних білків мієліну. Має місце супутній процес пероральний, епідуральний, локальний і інтранастимуляції Рах-3 і GFAP, який означає реверсію зальний шляхи. Можна використовувати будь-який від мієлінізуючих SC до немієлінізуючих і проліфеінший терапевтично ефективний шлях введення, руючих SC [Kioussi and Gruss, 1996]. Згідно з данаприклад, абсорбцію через епітеліальні або енним винаходом, химера IL6RIL6, мабуть, є ефекдотеліальні тканини, або за допомогою генної тетивним цитокіном для повернення в початковий рапії, при якій пацієнту вводять молекулу ДНК, що стан після процесу валеровської дегенерації неркодує химеру IL6RIL6 (наприклад, за допомогою вів за допомогою репресування Рах-3 і індукуванвектора), яка викликає експресію і секрецію хименя SC до відновлення їх мієлінізуючої активності. ри IL6RJL6 in vivo. Крім того, химеру IL6RIL6 можТакі ж міркування можуть бути застосовані до дена вводити разом з іншими компонентами біологімієлінізуючих захворювань головного мозку, оскічно активних агентів, таких як фармацевтично льки, подібно процесам при травмі, нейродегенеприйнятні поверхово-активні речовини, ексципієнрація при цих захворюваннях посилюється ти, носії, розріджувачі і наповнювачі. внаслідок процесу демієлінізації, що здійснюється Для парентерального (наприклад, внутрішньомакрофагами і іншими запальними клітинами. Товенного, підшкірного, внутрішньом'язового) ввему винахід також стосується застосування химери дення химеру IL6RIL6 можна приготувати в компоIL6RIL6 для виробництва лікарського засобу для зиції у вигляді розчину, суспензії, емульсії або лікування пошкодження нервів і/або травматичної ліофілізованого порошку разом з фармацевтично дегенерації нервів і/або пошкодження аксонів. прийнятним парентеральним наповнювачем (наIL6RIL6 можна ін'єкувати мишам, в яких аутоіприклад, водою, фізіологічним розчином, розчимунна демієлінізація була індукована імунізацією ном декстрози) і добавками, які підтримують ізотоМВР, як модельна система хронічного рецидивуюнічність (наприклад, маніт) або хімічну стабільність чого неуважного склерозу [Cannella et al, 1998]. (наприклад, консерванти або буфери). Композицію Здатність IL6RIL6 індукувати гени білків мієліну і стерилізують способами, що традиційно викорисдиференціювання мієлінізуючих гліальних клітин товуються. можна спостерігати in vivo, використовуючи цей «Ефективна кількість» відноситься до кількості фармацевтичний зразок. Тому винахід, крім того, активних інгредієнтів, яка є достатньою, щоб відноситься до застосування химери IL6RIL6 для вплинути на течію і тяжкість описаних вище захвовиробництва лікарського засобу для лікування рювань, приводячи до ослаблення або ремісії таі/або запобігання аутоімунних демієліиізуючих закої патології. Ефективна кількість буде залежати хворювань, зокрема, для лікування і/або запобівід шляху введення і стану пацієнта. гання неуважному склерозу. Доза, введена індивідууму у вигляді однократТакож було показано, що химера IL-6 володіє ної або багаторазових доз, буде варіювати, в занейропротекторною дією, запобігаючи втраті житлежності від багатьох факторів, включаючи фартєздатності нервових клітин, індукованої ексцитомакокінетичні властивості химери IL6RIL6, шлях токсичними агентами в районах, залучених до ковведення, стан і характеристики пацієнтів (стать, дування пам'яті і що виявляють ранню вік, маса тіла, здоров'я, ріст), міра виявлення симдегенерацію при хворобі Альцгеймера і ішемії. птомів, супутнє лікування, частота лікування і ба 11 76695 12 жаний ефект. Можливе коректування і маніпулюрідку мережу, що забарвлюється антитілами до вання встановленими межами доз в рамках комнейрофіламентів. Деякі аксони були довгими і ропетенції фахівців, а також способів in vitro і in vivo здвоєними, але шванновських клітин вздовж аксовизначення ремієлінізації нервів. нів не було видно. Навпаки, в культурах з додаХоч винахід буде описаний в зв'язку з його ванням IL6RIL6 були видні не тільки нервові конкретним варіантом, буде зрозуміло, що він доклітини з аксонами, забарвленими на нейрофілапускає додаткові модифікації. Мається на увазі, що менти, але також і шванновські клітини, що з'явдана заявка охоплює будь-які варіації, застосуванляються у вигляді плоских клітин, які мали довгі ня або переробки винаходу, які загалом слідують біполярні вирости з кінцевими розгалуженнями. Ці принципам винаходу і які включають в себе такі вирости не були забарвлені на білки нейрофілавідступи від даного опису, які узгодяться з відомою ментів. При скануючій ЕМ ці шванновські клітини або звичайною практикою в області, до якої віднобули чітко видні вздовж аксонних паростків з мемситься винахід, і які можуть бути застосовані до бранними збираннями, що починають накручуваосновних елементів, вказаних вище, як викладено тися навколо аксона. нижче в рамках прикладеної формули винаходу. Фарбування анти-МВР виявило позитивно заВсі цитовані тут матеріали, включаючи статті барвлені шванновські клітини в культурах, обробабо анотації в журналах, опубліковані і неопублілених IL6RIL6, зокрема, в рядах клітин, які були ковані заявки на видачу патенту, видані або інозевистроєні одна за іншою. З іншого боку, спостерімні патенти, або будь-які інші матеріали, включені галася невелика специфічна для МБР флуоресцетут у вигляді посилань в повному об'ємі, включаюнція в культурах, оброблених NGF без IL6RIL6. чи всі дані, таблиці, фігури і текст, представлені в Схожі результати спостерігали в культурах дитованих матеріалах. Крім того, повний зміст циDRG з ембріонів пацюків, отриманих на е15 день. тованих публікацій в межах матеріалів, що викориШванновські клітини, отримані з сідничного стовуються при підготовці даної заявки, також нерва миші, також культивували in vitro з IL6RJL6 в включений у вигляді посилань в повному об'ємі. концентрації 1,4мкг/мл, і вимірювали рівень РНКДаний винахід тепер буде описаний більш детранскрипту МБР. Для порівняння такі ж культури тально на основі наступних не обмежувальних обробляли 20мкМ форсколіном, хімічним агентом, прикладів і супроводжуючих малюнків. який штучно збільшує рівні циклічного АМФ в кліПриклади тинах, і, як відомо, індукує МБР [Lemke and Chao, Приклад 1: Вплив IL6RIL6 на мієлінізацію і ре1988]. Результати показали, що IL6RIL6 був так мієлінізацію in vitro само ефективний, як і форсколін в індукції експреУ спинному мозку дорсальний корінець містить сії гена МБР, і більш ефективним в підтримці рівнів по суті чутливі нейрони, які формують синапи в РНК МБР через 3 дні культивування (Фіг.1). гангліях дорсальних корінців (DRG). Під час ембріПри дослідженні клітин гангліїв дорсальних огенезу у мишей (на е14-е15 день), DRG є відповікорінців (DRG) 18-денного ембріона було виявледним джерелом нейронів і ембріональних шванно, що химера IL-6 індукує експресію мРНК МБР і новських клітин, які ще не диференційовані в РО протягом 3 днів, тоді як мРНК Рах-3 в цій же мієлінізуючі SC: Способи отримання експлантатів клітинній системі була сильно інгібована. ДозозаDRG для культур in vitro описані Li (1998). Культилежна крива дії химери IL-6 на експресію генів РО і вування здійснювали на покрівних склах, вміщених МБР свідчить про максимальну дію химери IL-6 в лунки планшетів Costar, в середовищі F12/DMEM при концентрації 500нг/мл. Отже, химера IL-6 ви(Gibco). Покрівні скла покривали або колагеном, ступає як важливий індуктор експресії гена мієліну або полі-D-лізином, по суті, з однаковими резульв нормальних нейрогліальних клітинах. татами. Культивування проводили або в середоДля подальшого дослідження дії химери IL-6 вищі без добавок факторів росту або цитокінів, або створили лінії шванновських клітин, отриманих з в середовищі з добавкою фактора росту нервів сідничного нерва пацюка або з клітин ганглія дор(NGF/ 40нг/мл), або в середовищі з добавкою хисальних корінців (DRG) пацюка. мерних рекомбінантних білків IL6RIL6 (3мкг/мл). Виявили, що лінія шванновських клітин, отриКультури перевіряли щодня за допомогою світломаних з сідничного нерва пацюка, відповідає на вої мікроскопії, використовуючи інвертований мікдію химери IL-6, як було визначено за допомогою роскоп Olympus, з'єднаний з системою візуалізації ОТ-ПЛР і Нозерн-блот-аналізом, 2-3-кратною індуза допомогою відеокамери (система Leica LIDA). кцією гена РО, білковий продукт якого формує Частину покрівних стекол фіксували в формальдеприблизно 50% мієліну периферичних нервів. гіді, і білки МБР мітили першими моноклональними Для того, щоб дослідити активацію транскрипантитілами до основних білків мієліну і кон'юговації компонентів гена мієліну химерою IL-6, ввели ними з флуоресцеїном другими антитілами. Тіла промотор МВР в експресуючий вектор вище за нейронних клітин і аксони фарбували антитілами течією репортерного гена люциферази, і тестувадо білків нейрофіламентів. Деяке покрівні стекла ли в лінії шванновських клітин сідничного нерва перевіряли скануючою електронною мікроскопіпацюка. У цих клітинах спостерігали індукцію транєю (ЕМ). скрипційної активності з промотору МВР аж до 7Через 2-5 днів на експлантатах DRG, що кулькратної індукції у відповідь на химеру IL-6 у відсуттивуються без добавок, показали, що клітини, що ність форсколіну. В додатковому аналізі репортерзросли з експлантата були або полігональними, ного гена виявили, що химера JL-6 викликає в цих або що мають форму овалу. Однак в тому випадклітинах 2,5-кратну індукцію транскрипції з промоку, коли додавали NGF, клітини овальної форми тору гена РО. утворювали довгі паростки-аксони, які формували Приведені вище результати свідчать про те, 13 76695 14 що химера IL-6 надає пряму дію на транскрипцію відомо, індукує диференціювання олігодедроцитів генів мієліну в комітованих шванновських клітинах. [дивися, наприклад, Jung et al. (1995)]. Для того, Була виділена додаткова лінія шванновських щоб дослідити, який вплив на морфологію здійсклітин з ганглія дорсального корінця (DRG) пацюка нює химера IL6R/IL6 додатково до впливу і названа лінією клітин СН. Виявлено, що ця лінія дбцАМФ, клітини oli-neu заздалегідь обробляли клітин володіє низькою швидкістю росту, і її ріст протягом 3 днів дбцДМФ перед додаванням химезалежить від химери IL-6 (140нг/мл). Цікаво, що ри IL6R/IL6 плюс дбцАМФ. У паралелі клітини обСН-клітини мали зірчасту морфологію, подібну робляли химерою IL6R/IL6 без попередньої оброолігодендроцитам. Клітини, мабуть, були функціобки. нальними по відношенню до індукції мієлінізації Зміни морфології оцінювали за допомогою химерою IL-6. Клітини експресували РО І МВР і фазово-контрастної мікроскопії або імуногістохімігинули при вирощуванні в середовищі, що містить чним фарбуванням на маркери олігодендроцитів сироватку, у відсутність химери. СNРазу (діестеразу 2', 3'-циклічних нуклеозид-3'Приклад 2: Інгібування проліферації олігоденфосфатів) і GalC (сіалогангліозиди і сульфатиди) і дроцитів in vitro використовуючи антитіла А2В5, специфічні для Досліджували вплив химери IL-6 на клітини ліпіду мієліну галактоцереброзиду. центральної нервової системи. Встановлено, що Додавання химери IL6R/IL6 явно індукувало диференціювання олігодедроцитів пов'язане з морфологічні зміни в клітинах oli-neu. Тіла клітин інгібуванням їх проліферації, і таким чином,із стизбиралися рядами, і їх паростки ставали більш муляцією утворення оболонки і мієлінізації олігоподовженими. Самі клітини довшали і здавалися дендроцитами. злитими, що свідчило про досягнутий стан дифеТому тестували здатність химери IL6R/IL6 інгіренціювання. бувати проліферацію олігодендроцитів in vitro. У Експресія маркерів олігодендроцитів була поцьому експерименті використали клітинну лінію казана за допомогою імуногістохімії. Клітини були первинних олігодендроцитів миші (олігодендрогліпозитивні відносно специфічних маркерів олігодеальні клітини), іморталізовані за допомогою онкондроцитів - антигену А2В5 і ОМРази, але були гену t-neu (лінія клітин «oli-neu»). Створення і вланегативними відносно маркера астроглії GFAP, стивості лінії клітин oli-neu, а також умови таким чином, свідчачи, що дійсно підтримувався культивування [описані Jung et al. (1995)]. фенотип олігодендроцитів. Вимірювали проліферацію недиференційоваПопередня обробка дбцАМФ і комбінована обних клітин oli-neu через 1, 2 і 3 дні у відповідь на робка химерою IL6R/IL6 і дбцАМФ збільшували різні кількості химери IL6R/IL6 (1мкг/мл, 500нг/мл, кількість олігодедроцитів, утворюючих оболонку, 250нг/мл, 125нг/мл і 0нг/мл (контроль). Кількісно через 3 дні. У порівнянні з подовженими клітинавизначали швидкість зростання за допомогою вими, видимими в присутності однієї химери мірювання метаболічної активності клітин за доIL6R/IL6, морфологічно клітини виглядали навіть помогою флуориметричного/колориметричного більш диференційованими. Можна було спостерііндикатора зростання, Alamar Blue. Вказаний агент гати клітини, що мають вигляд листа, що свідчило містить індикатор окислення-відновлення, який про досягнутий стан диференціювання. виявляє як флуоресценцію, так і зміни свого забаНа закінчення, обробка химерою IL6R/IL6 в рервлення у відповідь на хімічне відновлення ростозультаті приводила до морфологічної зміни олігового середовища внаслідок зростання клітин. дендроцитів in vitro, таким чином, далі підтверАгент, що використовується і аналіз [описані у джуючи її роль як індуктора олігодендрогліального Ahmed, et al. (1994) і в патенті США 5501959]. диференціювання і мієлінізації. Результати показані на Фіг.2. Додавання хиПриклад 4: Вплив химери IL-6 на взаємодію мери IL6R/TL6 в культуральне середовище олігонейронів ι шванновських клітин дендроцитів веде до різко вираженого зниження При культивуванні DRG мишей в присутності росту вже через 48 годин. Через 72 години ріст інгібіторів синтезу ДНК арабінози С (АrаС) і фторскорочувався до 40-50%, в порівнянні з контролем. дезоксіуридину (FudR) нервові клітини можуть Цікаво, що сама висока кількість химери IL6R/IL6 утворювати аксони, в той час як проліферація глі(1мкг) була менш ефективною, ніж більш низькі альних клітин інгібована. Такі культури DRG можна кількості від 500 до 125нг/мл. використовувати як джерело нервових клітин з Експеримент показав, що химера IL6R/IL6 синемієлінізованими аксонами. До цих культур екзольно інгібує проліферацію олігодендроцитів in генно додають шванновські клітини, щоб дослідиvitro, свідчачи про те, що вона стимулює диференти взаємодію між нейронами і шванновськими кліціювання олігодендроцитів. Оскільки олігодендротинами. цити є гліальними клітинами, що продукують мієКлітини ліній шванновських клітин сідничного лінові оболонки в ЦНС, химера IL6R/IL6 може бути нерва пацюка мітили Fluorogold, міткою, яка проагентом, активно стимулюючим ремієлінізацію in никає через бішарову ліпідну мембрану клітин і vivo. зберігається протягом протяжного періоду часу, не Приклад 3: Вплив химери IL6R/IL6 на морфовпливаючи на функцію клітин. Спільне культивулогію олігодендроцитів вання нейронів і вказаних шванновських клітин в Для того, щоб дослідити вплив химери IL6 на присутності химери IL-6 приводить до значного морфологію олігодендроглії, клітини oli-neu (дивизбільшення скріплення шванновських клітин ся приклад 2) культивували протягом 3 днів в привздовж аксонів клітин в межах 5 годин. Клітини сутності 1мкг/мл химери IL6R/IL6. довшають, і через декілька днів можна спостерігаДибутил-цАМФ (дбцАМФ) є агентом, який, як ти, як їх флуоресцуюча цитоплазма утворює регу 15 76695 16 лярну оболонку навколо аксонів. У відсутність хизацію активністю. Вказана активність химери мери або у відсутність NGF шванновські клітини IL6R/IL6 суворо свідчить про сприятливу дію хизв'язуються набагато менше і не утворюють обомери IL6R/IL6 на ремієлінізацію в периферичній і лонку. Дані результати показують, що химера IL-6 центральній нервовій системі. Цей ефект можна впливає дуже швидким чином на взаємодію гліавикористовувати при всіх розладах, заснованих на льних клітин з нейронами, свідчачи про те, що дефектах мієлінізації; демієлінізації або недостатіндукуються або активуються адгезивні молекули. ній мієлінізації нейронів ЦНС або ПНС. Тому хиВказана система дозволяє дослідити різні стадії мера IL6R/IL6 може бути ефективним агентом для процесу мієлінізації, на які впливає химера IL-6. лікування порушень ремієлінізації і/або демієлініПриклад 5: Вплив химери IL6R/IL6 на мієлінізації, подібних, наприклад, неуважному склерозу. зацію в змішаних культурах нейронів і олігодендПриклад 6: Вплив химери IL-6 на регенерацію роцитів периферичних нервів in vivo Для того, щоб далі дослідити активність химеПісля аксотомії сідничного нерва у пацюків і ри IL6R/IL6, що індукує мієлінізацію, готували динакладення проксимального і дистального відрізків соційовані культури з півкуль головного мозку мипериферичні нерви можна індукувати до регенешей Е15 (15 ембріональній день). Підготовка і рації, і перерізані волокна можна індукувати до умови культивування [описані Lubetzki et al. ремієлінізації in vivo [Sahenk et al. 1994]. Досліджу(1993)]. Первинні клітини підтримували в культурі вали вплив химери IL6R/IL6 на ремієлінізацію пепротягом 8 днів перед додаванням 1L6R/IL6 риферичних нервів після аксотомії. Пацюкам (7 (1,5мкг/мл) протягом 11 днів. тварин) вводили химеру IL6R/IL6 внутрішньочереМБР (основний білок мієліну) і специфічний вно через кожні два дні в дозі 100мкг/кг протягом для олігодендроцитів білок PLP (протеоліпідний 12 днів, починаючи з дня операції. Контрольним білок) є маркерами зрілих і/або мієлінізованих олітваринам (9 пацюків) ін'єкували PBS. Через 12 годендроцитів і є головними компонентами мієліну днів частини регенеруючого нерва на 2,5 і 5мм ЦНС. Тому їх можна використати як маркери для нижче за аксотомію аналізували за допомогою оцінки активної мієлінізації, що має місце в культутрансмісійної електронної мікроскопії, і оцінювали рі клітин. кількість позитивних волокон. В умовах культивування на 4 день мієлінізація У присутності химери IL-6 виявили 2,5-кратне не відбувається. Тому мРНК на 4 день використазбільшення кількості мієлінізованих волокон на ли в цьому експерименті як калібрувальний контвідстані 2,5мм нижче за аксотомію, в порівнянні з роль. На 19 день в умовах культивування в кульконтролями, обробленими PBS. Крім того, було турі клітин спостерігається мієлінізація. виявлено, що химера збільшує ремієлінізацію Таким чином, для того, щоб кількісно виміряти більш віддалених волокон, індукуючи 5,2-кратне мРНК МВР і PLP екстрагували мРНК з необроблезбільшення кількості мієлінізованих волокон на них і оброблених лунок на 4 і 19 день. 5мм дистальніше за розріз. Це важливе, оскільки мРНК МВР, PLP і GAPDH, яка служила як РНК ремієлінізація знижується по мірі того, як відстань внутрішнього контролю, вимірювали за допомогою від розрізу збільшується. Вплив CNTF спостерігакількісної ОТ-ПЛР в реальному часі [Medhurst et al. ли на відстані 0,5мм від розрізу, а в присутності (2000)], використовуючи прилад для визначення химери IL-6 виявляється набагато більш віддалепослідовностей РЕ Applied Biosystems Prism, моний вплив, і більш сильний - на відстані 5мм, ніж дель 7700. на відстані 2,5мм. Товщина мієлінізованих волокон Результати підсумовані в таблиці І, приведеній також збільшувалася більш ніж в 2 рази після обнижче. Провели два незалежних експерименти. робки химерою. Загалом химера IL-6, мабуть, інЕкспресія мРНК показана у вигляді кратної ексдукує ремієлінізацію приблизно ] 0% волокон, в пресії контрольної РНК на 4 день. В обох експерипорівнянні з інтактними пацюками без аксотомії. ментах химера IL6R/IL6 чітко посилювала експреПриклад 7: Індукція гена МВР за допомогою сію МВР і PLP в два рази, ще раз підтверджуючи IL6R/1L6 в культурах клітин меланоми B16-F10.9 роль химери IL6R/IL6 як індуктора або підсилюваЕмбріональним джерелом меланоцитів шкіри, ча мієлінізації. які продукують меланінові пігменти, і шванновських клітин є спільні клітини-лопередники, мігруючі з Таблиця нервового гребінця ембріонів мишей е8. Меланоми являють собою злоякісні пухлини, що розвиваЕкспресія МВР і PLP в первинних культурах кортикальються в шкірі з меланоцитів, і тому також походять них клітин з попередників нервового гребінця. Лінія клітин В16 отримана з спонтанної меланоми мишей Контроль Контроль на Химера IL6R/IL6 Balb/c, і клон F10.9 виділяли з В16 за їх фенотина 4 день 19 день на 19 день пом, відповідним високо злоякісним метастазам. Експеримент І Клітини F10.9, як і інші клітини В16, продукують МВР 1 72 181 PLP 1 1265 2157 чорний пігмент еумеланін і багаті на тирозиназу, Експеримент II перший фермент меланогенного шляху [Bertolotto МВР 1 187 2157 et al, 1996]. PLP 1 1884 4198 Клітини F10.9 висівали в 96-лункові мікропланшети при концентрації 30000 клітин/лунка і кульНа закінчення, приклади з 1 по 5 показують, тивували протягом 3 днів в середовищі DMEM з що химера IL6R/IL6 володіє антипроліфератив10% FCS в присутності або у відсутність IL6R/IL6 в ною, такою, що індукує диференціювання і мієлініконцентраціях 0,3-1мкг/мл. Екстрагували сумарну 17 76695 18 клітинну РНК і аналізували за допомогою Нозернпараліч кінцівок; 5) летальність. Головний мозок і блотів із зондами ДНК для МВР. У клітинах F10.9 спинний мозок тварин досліджували за допомогою мРНК МВР були дуже сильно індуковані IL6R/IL6 світлової мікроскопії після фарбування мієліну через 48 годин (Фіг.3А). Дослідження часового стійко блакитним люксолом. Можна встановити ходу показало, що збільшення РНК МВР починавплив IL6RIL6 на пониження клінічної міри хвороби лося через 12 годин після додавання химери і зменшення демієлінізації білої речовини головноIL6RIL6 до культур кпітин. го мозку. Химера IL6RIL6 індукує не тільки експресію геПриклад 9: Нейропротекторна дія химери IL6 на МВР, але також фосфодіестерази циклічного на нейротоксичність по відношенню до нейронів і 2'3' АМФ або СNРази, яка є іншим компонентом олігодендроглії мієліну і маркером диференційованих шванновсьОрганотипові культури надають унікальну ких клітин. Клітини також утворюють подовжені стратегію, за допомогою якої можна дослідити паростки на протилежних полюсах тіла клітини, і багато які аспекти фізіології і патології головного шикуються в культурах в довгі ряди як звичайні мозку. Довготривалі культури зрізів гіпокампу, рашванновські клітини. йону, залученого до кодування пам'яті і району, в Несподівано IL6RIL6 перемикала фенотип кліякому виявляється рання дегенерація при хворобі тин F10.9 з клітин, що продукують меланін, на Альцгеймера і ішемії, є особливо корисними в шванновські клітини, що продукують мієлін. Ферцьому відношенні, внаслідок виразності механізмів ментативна активність тирозинази і продукція месинаптичної пластичності (наприклад, довготриваланіну повністю зникали через 48 годин після долого потенціювання) і реагування на патологічні давання химери IL6RIL6 до клітин. інсульти (наприклад, ексцитотоксичність). MITF є транскрипційним фактором, який актиКультури готували, [як описано раніше Bahr et вує ген тирозинази [Bertolotto et al, 1996]. Обробка al. (Bahr 1995)], з невеликими модифікаціями. Гіпоклітин F10.9 химерою IL6RIL6 сильно репресує кампи вирізали у пацюків Wistar восьмиденного експресію гена MITF. Сам MITF трансактивується віку, і зрізи товщиною 400мкм накладали на порисгомеотичним фактором транскрипції Рах-3 ту і прозору мембрану Міllісеll-СМ (Мillіроrе) і куль(Watanabe et al. 1998), і вимірювання мРНК Рах-3 в тивували в 6 лунках багатолункових планшетів. На клітинах F10.9, оброблених IL6RIL6, показали, що кожну мембрану вміщували чотири зрізи. Середоекспресія Рах-3 знижується, починаючи з 6 годин і вище для культивування складалася з 50% мініаж до 48 годин (Фіг.3В). Відомо, що Рах-3 репресує мально необхідного середовища (+25мМ HEPES, ген МБР (Kioussi and Gruss, 1996). Тому вплив +4мМ NaHCO3, +NaOH pH7,2), 25% сироватки коня химери IL6RIL6 можна приписати впливу на генну і 25% розчину Хенкса, глюкози (6,4г/л), пеніцилірегуляцію гомеобоксного гена Рах-3, який експрену/стрептоміцину (10мл/л), L-глутаміну (2мМ). Кусується під час розвитку ембріональних шванновльтури тримали в 5% СО2-інкубаторі, встановлеських клітин перед мієлінізацією, і повинен бути ному при температурі 37°С, щонайменше, репресований для того, щоб відбувалася мієлініпротягом 3 тижнів до використання. Середовище зація. Крім того, в нервах, що дегенерують і демієміняли кожний тиждень. лінізуються Рах-3 знов експресується в шванновЗрізи гіпокампу піддавали впливу JL6 або хиських клітинах, коли ці клітини перестають мери IL6 при концентраціях в межах від 10пг/мл до продукувати МБР. Тому дуже важливо, що 10мкг/мл протягом 15хв., потім додавали 50мкМ IL6RTL6 може як репресувати Рах-3, так і викликаNMDA ще протягом 30хв. Культури вміщували в ти диференціювання шванновських клітин в клітисвіже середовище з додаванням або без IL6 або ни, що мієлінізують за допомогою індукції генів химери IL6. Для кожної експериментальної точки білків мієліну. використали щонайменше чотири зрізи. Загибель Приклад 8: Ін'єкції IL6RIL6 в моделі хронічного клітин, індуковану NMDA, оцінювали або через 1, рецидивуючого неуважного склерозу у мишей або через 3-7 днів після експериментального пошУ мишей лінії SJL/J розвивається експерименкодження, інкубуючі культури протягом 1 години в тальний аутоімунний енцефаломієліт (ЕАЕ) після свіжому середовищі, що містить йодит пропідію (РІ імунізації 0,4мг бичачого МВР в неповному ад'ю5мкл/мл). Завдяки своїм гідрофобним властивосванті Фройнда, що містить 60мкг Mycobacterium тям РІ входить в зруйновані клітини і зв'язується з tuberculosis H37Ra (Difco). Захворювання можна ядерним хроматином. Оцінювали червону флуопасивно перенести сингенному реципієнту за доресценцію, що випускається, (маркер загибелі кліпомогою внутрішньовенної ін'єкції 30 мільйонів тин), використовуючи інвертований флуоресцентклітин лімфатичного вузла, взятих через 10 днів ний мікроскоп (Zeiss), пов'язаний з камерою після імунізації. Клінічні симптоми паралічу з'явсполученого пристрою інтенсифікації заряду. Кільляються через період часу від тижня до 10 днів. кісну оцінку загальної флуоресценції проводили за Після гострої фази слідують ремісії і рецидиви. допомогою системи аналізу зображення (Image Цим мишам ін'єкують IL6RIL6 внутрішньочеревно Pro Plus). або підшкірно в дозах 1, 3 і 5мкг на мишу (маса Виявлено, що як IL-6, так і химера IL-6 захитіла біля 25г). Ін'єкції вводять 4 рази на тиждень, щають клітини гіпокампу від загибелі, індукованої щонайменше протягом 3 тижнів, починаючи або на NMDA. Виявлено, що через один день в культурі 3, або на 7 день після пасивного перенесення. При IL-6 в концентрації в межах від 0,1 до 10нг/мл заклінічній оцінці тварин слідували і проводили клахищала приблизно 50%-30% нейронів, відповідно, сифікацію за наступними критеріями: 1) втрата тоді як химера IL-6 в концентрації в межах від 0,05 ригідності хвоста; 2) слабкість задніх кінцівок; 3) до 1пг/мл захищала приблизно 40%-75% нейронів. односторонній параліч кінцівок; 4) двосторонній Максимальна захисна дія химери IL-6 (захист 75% 19 76695 20 клітин) спостерігалася при концентрації 0,5пг/мл том. (Фіг.3). Приклад 10: Вплив химери IL6R/IL6 на вижиВиявлено, що захисна дія IL-6 знижується згованість нейронів верхніх шийних гангліїв після видом. Життєздатність нервових клітин знижувалася далення NGF після обробки, і через два дні захисна дія IL-6 збеНейропротекторну дія, що надається химерою рігалася тільки при концентрації 0,1нг/мл IL-6, при IL6R/IL6, також досліджували в системі культивуцьому захисна дія виявлялася тільки на 30% клівання периферичних нейронів. тин на 5 день. У протилежність цьому, химера IL-6 Нейрони верхніх шийних гангліїв (SCG) видів концентрації 0,5пг/мл володіла пролонгованою ляли з верхніх шийних гангліїв пацюків РО-Р3 (дні дією, зберігаючи приблизно 60% клітин на 5 день з 0 по 3 постнатального розвитку). Нейрони ви(Фіг.4). тримували протягом 4 днів в середовищі, утримуПрисутність олігодендроцитів в органотипових ючому 5% сироватки пацюків і NGF. NGF потрібно зрізах визначали імуногістохімічним фарбуванням нейронам для виживання, оскільки позбавлення Gal-C, специфічним маркером олігодендроцитів. NGF приводить до загибелі клітин внаслідок індукЧерез 2-3 тижні in vitro органотипові зрізи піддавації апоптозу. Початкове середовище замінювали ли 30-хвилинному впливу 50мкМ NMDA, який індусередовищем без NGF, що містить нейтралізуючі кує некротичну клітинну загибель клітин, присутніх антитіла до фактора росту. У цій тимчасовій точці в цих культурах. Дійсно, як було визначено за дододавали 0,1 або 1мкг/мл химери IL6R/IL6 в 1% помогою ОТ/ПЛР. після обробки NMDA в цих кульДМСО в кінцевій концентрації. Культури витримутурах припинялася експресія всіх МБР, яка хараквали при 37°С протягом 24 годин. терна для олігодендроцитів. Вплив химери 1L6R/IL6 на виживаність нейроАктивація іонотрофних рецепторів глутамату нів, позбавлених NGF, через 24 години обробки являє собою первинну подію в процесі нейротокоцінювали за допомогою мікроскопії, а також на сичності, ініційованої збуджуючими амінокислотаоснові мітохондріальної активності клітин, яку вими. Первинні культури нейронів мозочка новонамірювали в МТТ-аналізі, детально описаному роджених пацюків (які містять >97% нейронів) Mosmann (1983). Концентрації химери IL6R/IL6, що використали для дослідження ефектів химери IL6 використовуються не виявляли ніякої токсичної дії на індуковану глутаматом нейротоксичність, і поріабо дії на морфологію нейронів SCG, оброблених внювали з ефектами IL-6. NGF. Первинні культури зернистих клітин мозочка Додавання химери IL6R/IL6 в концентрації готували з пацюків Sprague-Dawley 8-денного віку, 100нг/мл і 1мкг/мл спасало до 40% нейронів SCG як описане [Pizzi et al. 1993]. Клітини висівали на від нейронної загибелі, яка була індукована видачашки, покриті полі-L-лізіном і культивували в осленням NGF, як можна бачити за результатами новному середовищі Ігла, що містить 10% інактиМТТ-аналізу (Фіг.6). Таким чином, химера IL6R/IL6вованої теплом фетальної бичачої сироватки, глуволодіє нейропротекторною дією на периферичні тамін (2мМ), гентаміцин (50мкг/мл) і KСl (25мМ), нейрони, свідчачи про активність при нейродегенеративних захворюваннях, подібних, наприклад, при щільності 2,5 105клітин/см2. Цитозинарабінохворобі Альцгеймера, хвороби Паркінсона або зид (10мкМ) додавали до культур через 18 годин БАС (бічному аміотрофічному склерозу). після посіву, щоб не допустити проліферацію нерТепер, після повного опису винаходу, фахіввових клітин. Експерименти проводили після кульцям в даній області буде зрозуміло, що те ж саме тивування нейронів протягом 10 днів. можна виконувати в широких межах еквівалентних Якщо не обумовлено особливо, культури підпараметрів, концентрацій і умов, не відходячи від давали впливу 50мкМ глутамату протягом 15хв. в суті і не виходячи за рамки винаходу і без надміррозчині Лока, не утримуючому Mg++. IL6 або хименого експериментування. ру IL6 додавали за 5хв. до обробки глутаматом. Посилання Потім в чашки повертали кондиціоноване культуAbramsky, 0, and Ovadia, H. (1997) Frontiers in ральне середовище при 37°С в атмосфері 95%Multiple Sclerosis, clinical research and therapy. повітря/5% СО2, і через 18-24 години вимірювали Manin Dunitz publisher, London. життєздатність клітин. Ahmed S.A.. Gogal, R.M, Jr., Walsh, (1994) A Життєздатність клітин оцінювали через 18 гоnew rapid and simple non-radioactive assay to дин за допомогою прижиттєвого фарбування суmonitor and determine the proliferation of мішшю діацетату флуоресцеїну і йодиду пропідію, lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine як описано раніше (Pizzi et al. 1993). Процент нейincorporation, J. of Immunol. Methods 170, 211-224. ронів, що вижили в моношарі підраховували, оціAnderson, D.J. (1997) Cellular and molecular нюючи співвідношення між фарбуванням діацетаbiology of neural crest cell lineage determination. том флуоресцеїну (зелені життєздатні клітини) і Trends Genet. 13, 276-280. фарбуванням діацетатом флуоресцеїну плюс йоBahr, Long-term hippocampal slices: a model дидом пропідію (сумарні клітини) на мікрофотогsystem for investigating synaptic mechanisms and рафіях трьох репрезентативних полів кожного моpathologic processes. J Neurosci Res, 42, 294-305. ношару. Значення брали для трьох аналогічних Bertolono, C., Bille, K., Ortonne, J.P. and Ballotti, чашок. R. (1996) Regulation of tyrosinase gene expression У той час як IL-6 не індукував захисної дії на by cAMP in B16 melanoma involves two CATGTG зернисті клітини мозочка пацюків в межах доз від motifs surrounding the TATA box: implication of the 0,1 до 10нг/мл, химера IL-6 в концентрації 0,1пг/мл microphtalmia gene product. J. Cell.Biol. 134,747і 1пг/мл захищала, відповідно 40-20% нервових 755. клітин від нейротоксичності, індукованої глутама 21 76695 22 Bonni A, Sun Y, Nadal-Vicens M, Bhatt A, Frank CD34+CD38-/low/SCID repopulating cells (SRC) in DA, Rozovsky I, Stahl N, Yancopoulos GD, vitro. Blood, in press. Grcenberg ME (1997) Regulation of gliogenesis in the Kioussi, С and Gruss, P. (1996) Making a central nervous system by the JAK-STAT signaling Schwann. Trends Genet., 12, 84-86. pathway. Science 278, 477-483. Lee, D.A., Zurawel, R.H. and Windebank, AJ, Cannella, В., Hobam, CJ. Gao, Y.L. et al (1998) (1995) Ciliary Neurotrophic factor expression in The neuregulin, glial growth factor 2, diminishes Schwann cells is induced by axonal contact. J. autoimmune demyelination and enhances Neurochem. 65, 564-568. remyelination in a chronic relapsing model for Multiple Lemke, G. and Chao, Μ. (1988), Axons regulate Sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 10100Schwann cell expression of the major myelin and 10105. NGF receptor genes. Development 102, 499. Chebath. J., Fischer, D., Kumar, Α., Oh, J.W, Li. R., (1998) Culture methods for selective Kollet, O., Lapidot, Т.. Fischer, M., Rose-John, S., growth of normal rat and human Schwann cells, Meth, Nagler, Α., Slavin, S. and Revel, M. (1997) Cell. Biol., 57, 167-186. Interleukin-6 receptor- Interleukin-6 fusion proteins Lipton, S, Α., and Rosenberg, Ρ A. (1994). with enhanced Interleukin-6 type pleiotropic activities. Excitatory amino acids as a Final common pathway Eur. Cytokine Netw. 8, 359-365. for neurologic disorders. N Engl J Med, 330, 613-22. Chen, L.E., Liu, K. Seaber, A.V., Katragadda, S., Lubetzki, C, Demerens, C, Anglade, P., Kirk, С and Urbaniak, J.R. (1998) Recombinant Villarroya, H., Frankfurther. A, Lee., V. M.-Y., and human glial growth factor 2 (rhGGF2) improves Zalc, B. (1993) Even in culture, oligodendrocytes functional recovery of crushed peripheral nerve (a myelinate solely axons. PNAS 90, 6820-6824. double-blind study) Neurochem. Int., 33, 341-351. Mayer, M., Bhakoo, K. and Noble, M. (1994) Fraser, S. Ε. and Bronner-Fraser, M. (1991). Ciliary Neurotrophic factor and Leukemia Inhibitory Migrating neural crest cells in the trunk of the avian factor promote the generation, maturation and embryo are multipotent. Development 112, 913-920. survival of oligodendrocytes in vitro. Development, Gadient, R.A. and Otten, U.H. (1997) Interleuin-6 120, 143-153. (IL-6) - A molecule with both beneficial and McDonald, J.W, Althomsons, S.P., Hyrc. K, L., destructive potentials. Prog. Neurobiol., 52, 379-390. Choi. D. W., and Goldberg, Oligodendrocytes from Hartung, H.P., van der Meche, F.G, Pollard, J.D, forebrain are highly vulnerable to AMPA/kainate (1998) Guillain-Barre syndrome, CIDP and other receptor-mediated excitotoxicity. Nat Med, 4, 291-7. chronic immune-mediated neuropathies. Curr. Opin. Medhurst, A.D., Hamson, dbcAMP, Read, S.J., Neurol., 11,497-513. Campbell. C.A., Robbins, M.J. and Pangalos, M.N. Hirota, H., Kiyama, H., Kishimoro, T. and Taga, (2000) The use of TaqMan. RT-PCR assays for T. (1996) Accelerated nerve regeneration in mice by semiquantitative analysis of gene expression in CNS upregulated expression of Inter] eukin (1L) 6 and IL-6 tissues and disease models. J, Neurosci. Methods 15, receptor after trauma, J. Exp. Med., 183, 2627-2634. 9-20. Ho, P.R., Coan, G.M., Cheng, E.T., Niell, C., Mendel, I., Katz, Α., Kozalc, N., Ben-Nun. A. and Tarn, D.M., Shou, H., Sierra, D, and Terris, D.J. Revel, M. (1998) Interleukin-6 functions in (1998) Repair with collagen tubules linked with brainautoimmune encephalomyelitis; a study in genederived neurotrophic factor and ciliary neurotrophic targeted mice. Eur. J. Immunol, 28, 1727-1737. factor in a rat sciatic nerve injury model. Arch. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for Otolaryngol. Head Neck Surg., 124, 761-766. cellular growth and survival: Application to Ip NY, Nye SH, Boulton TG, Davis S, Taga T, Li proliferationand cytotoxicity assays. J. Immunol, Y, Birren SJ, Yasukawa K, Kishimoto T, Anderson DJ, Methods 65, 55-63. et al (1992) CNTF and LIF act on neuronal cells via Murakami, M., Hibi, M., Nakagawa, N., shared signaling pathways that involve the IL-6 signal Nagakawa. Т., Yasukawa, K., Yamanishi, K., Taga, T. transducing receptor component gp130. Cell and Kishimoto, T. (1993) IL-6 induced 69:1121-32. homodimerization of gp130 and associated activation Jessen, K. R. and Mirsky, R. (1991). Schwann of a tyrosine kinase. Science 260, 1808-1810. cell precursors and their development. Glia 4,185Novick, D., Shulman, L.M., Chen, L, and Revel, 194. M. (1992) Enhancement of interleukin-6 cytostatic Jung, М., Kramer, E., Grzenkowsko, M, effect on human breast carcinoma cells by soluble ILBlakemore, W., Aguzzi, Α., Khazaiu, K., Chlichlia, K., 6 receptor from urine and reversion by monoclonal von Blankenfeld, O., Kettenmann, and Trotter, J. antibodies. Cytokine, 4, 6-11. (1995). Lines of Murine Oligodendroglial Precursor Panioni, L., Garcia, J. H., and Gutierrez, J.A. Cells Immortalized by an Activated neu Tyrosine Cerebral white matter is highly vulnerable to Kinase Show Distinct Degrees of Interaction with ischemia. Stroke, 27,1641-6. Axons In Vitro and In Vivo. Eur. J, of Neuroscience 7, Pizzi M., Fallacara, C, Arrighi. V., Memo, M., and 1245-1265. Spano, P.F., (1993) Attenuation of excitatory amino Kahn, M.A. and De Vellis, J, (1994) Regulation of acid toxicity by metabotropic glutamate receptor an oligodendrocyte progenitor cell line by the agonists and aniracetam in primary cultures of interleukin-6 family of cytokines. Glia. 12, 87-98. cerebellar granule cells. J Neurochem, 61,683-9. Kollet, О., Aviram, R., Chebath, J., ben-Hur, H., Pohlau, D., Aktas, O., Epplen, C. Hartung, H.P., Nagler, Α., Shultz, L, Revel, M, and Lapidot, T, (1999) Hoffmann, V. and Przuntek, H. (1998) Promoting The soluble IL-6 recepcor/IL-6 fusion protein remyelination as a future therapeutic principle in enhances maintenance and proliferation of human Multiple Sclerosis. Nervenarzi, 69, 841-850. 23 76695 24 Sahenk, Z., Seharaseyon, J., and Mendell, J.R. cholinergic neurons. Neurosci Lett, 144, 49-52. (1994) CNTF potentiates peripheral nerve Trapp. B, D., Hauer, P, and Lemke, G. (1988), regeneration. Brain Res, 655, 246-50. Axonal regulation of myelin protein mRNA levels in Stocker, K.M, Sherman, L., Ree, S. and Ciment, actively myelinating Schwann cells. J. Neurosci. G. (1991) Basic FGF and TGF-betal influence 8.3515. commitment to melanogenesis in neural crest-derived Trojaborg W (1998) Acute and chronic cells of avian embryos. Development, 111, 635-645. neuropathies: new aspects of Guillain-Barre Taga, Т., Hibin M., Hirata, Y.. Yamasaki, K., syndrome and chronic inflammatory demyelinating Yasukawa, K., Matsuda, Т., Hirano, T. and Kishimoto, poly neuropathy, an overview and an update. T. (1989) Interleukin-6 triggers the association of its Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 107, 303-316. receptor with a possible signal transducer gp130. Watanabe, Α., Takeda, K., Plopis B. and Cell, 58, 573-581. Tachibana, M. (1998) Epistatic relationship between Topliko, P., Murphy. P, and Charnay, P. (1996) Waardenburg syndrome genes MITF and РахЗ, Embryonic development of Schwann cells: Multiple Nature Genet., 18, 283-286. roles for Neuregulins along the pathway, Моl. Cell. Yamada, M., and Hatanaka, H. (1994). Neurosc, 8, 71-75, Interleukin-6 protects cultured rat hippocampal Toulmond, S., Vige, X., Fage, D., and Benavides, neurons against glutamate-induced cell death. Brain J. (1992), Local infusion of interleukin-6 attenuates Res. 643, 173-80. the neurotoxic effects of NMD A on rat striatal 25 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 76695 Підписне 26 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601