Застосування телмісартану для підвищення чутливості до інсуліну

1. Застосування антагоніста рецептора ангіотензину II - телмісартану, або однієї з його солей для одержання лікарського засобу, який призначений для лікування людей, у яких діагностований цукровий діабет типу 2 або існує підозра на предіабетичний стан, для попередження діабету або для лікування метаболічного синдрому та резистентності до інсуліну у пацієнтів з нормальним або підвищеним кров'яним тиском. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що у людей, яких піддають лікуванню, рівень цукру в крові натще перевищує 125мг глюкози на дл плазми. 3. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що у людей, яких піддають лікуванню, рівень цукру в крові натще знаходиться у межах від 110 до 12 мг глюкози на дл плазми. 4. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що у людей, яких піддають лікуванню, рівень цукру в крові, який вимірюють через 2год. після прийому натще 75г глюкози, перевищує 200мг глюкози на дл плазми. 2 (19) 1 3 83854 4 ванні до культурального середовища, яке містить лінію стабільно трансформованих клітин, які експресують злитий білок, який складається з домену фактора транскрипції людського рецептора PPAR γ, який зв'язує ліганди, а також із домену дріжджового GAL4, який зв'язує ДНК, і містять ген люциферази під контролем п'ятикратно повторюваної зв'язувальної ділянки дріжджового Gal4. 14. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що лікарська форма лікарського засобу містить від 20 до 200мг телмісартану. 15. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що телмісартан комбінують із діуретиком. 16. Застосування за п. 15, яке відрізняється тим, що лікарська форма лікарського засобу містить від 10 до 50мг гідрохлортіазиду або хлорталідону. 17. Спосіб лікування людей, у яких діагностований цукровий діабет типу 2 або існує підозра на пред іабетичний стан, для попередження діабету або лікування метаболічного синдрому та резистентності до інсуліну у пацієнтів з нормальним кров'яним тиском, який відрізняється тим, що в організм вводять лікарський засіб, який містить антагоніст рецептора ангіотензину II - телмісартан. 18. Фармацевтична композиція, яка містить телмісартан у комбінації з а) амлодипіном або ніфедипіном, б) еплереноном, в) росиглітазоном, піоглітазоном, репаглінідом або метформіном, г) клопідогрелем, у кожному разі в поєднанні з ацетилсаліциловою кислотою, д) інгібітором DPP4, є) суль фонілсечовиною або ж) інгібітором агрегації тромбоцитів. Даний винахід відноситься до антагоністів рецептора ангіотензину II й, зокрема, до їхнього застосування для лікування людей, у яких діагностовано діабет або існує підозра на предіабетичний стан, для попередження діабету або для лікування метаболічного синдрому та резистентності до інсуліну у пацієнтів з нормальним кров'яним тиском. Цукровий діабет типу 2 є проявом двох патофізіологічних явищ, а саме: зниженої секреції інсуліну бета-клітинами (базофільними інсулоцитами) підшлункової залози та резистентності до інсуліну органів-мішеней, якими є печінка, скелетна мускулатура і жирова тканина. Звичайно має місце комплексний розлад із проявом обох цих складових. Таке захворювання діагностують як гіперглікемію натще, тобто при цьому захворюванні концентрація цукру в крові після голодування протягом 1012год. перевищує граничне значення, яке дорівнює 125мг глюкози на дл плазми. Цілеспрямоване лікування явного діабету типу 2 є можливим з використанням сполук із класу тіазолідиндіонів (глітазонів). Ці сполуки покращують ступінь утилізації інсуліну, який циркулює в системі кровообігу, й таким шляхом приводять до зниження рівня цукру в крові (тому вони одержали назву "сенсибілізатори до інсуліну"). Одночасно із цим через механізми зворотного зв'язку знижується підвищений рівень інсуліну, і тим самим зменшується навантаження на підшлункову залозу. Сенсибілізатори до інсуліну, такі як троглітазон, росиглітазон або піоглітазон, проявляють подібну дію за рахунок зв'язування з певними ядерними рецепторами, які називають PPARg (від англ. "Peroxisomal Proliferator Activated Receptor", рецептор, який активується пероксисомальним проліфератором). Вони діють як регулятори транскрипції цілого ряду генів, які мають важливе значення для глюкозного та ліпідного обміну. Завдяки наявності подібної функції у лігандів рецептора PPARg, таких як простагландини або синтетичні тіазолідиндіони (глітазони), вони можуть сприяти лікуванню діабету типу 2. Один з основних механізмів зниження рівня глюкози лігандами рецептора PPARg полягає в індукції диференціювання адипоцитів. Інтенсифі кація диференціювання адипоцитів та перебудування жирової тканини, що викликаються лігандами рецептора PPARg, призводять до перенаправления, відповідно перерозподілу вільних жирних кислот зі скелетної мускулатури у жирову тканину і за рахунок цього підвищують глюкозний обмін у м'язах. Оскільки до моменту встановлення діагнозу, наприклад, у кожного другого пацієнта, який страждає від діабету тип у 2, є ознаки коронарного серцевого захворювання, зростає тенденція убачати можливі причини діабету в складному порушенні обміну речовин, на наявність якого може вказувати цілий ряд факторів ризику, таких як порушена толерантність до глюкози, підвищений рівень цукру в крові натще, резистентність до інсуліну, підвищений кров'яний тиск, дисліпідемія або ожиріння тулуба. Переважання резистентності до інсуліну найбільш виражене у пацієнтів з гіпертригліцеридемією та низьким рівнем холестерину, який входить до складу ліпопротеїнів високої щільності (ЛВЩ). У цьому випадку говорять про предіабет типу 2, метаболічний синдром, синдром X або синдром резистентності до інсуліну. У першій фазі знижена реакція органів-мішеней на інсулін обумовлює збільшення секреції інсуліну підшлунковою залозою для підтримки рівня цукру у крові в нормальних межах. Після декількох років надлишкового, відповідно зростаючого вироблення інсуліну наступає момент, коли бета-клітини підшлункової залози стають не здатними до подальшого збільшення секреції ними інсуліну. На цьому починається фаза порушеної толерантності до глюкози. У цій фазі організм стає більше не здатний досить швидко реагувати на пікові рівні глюкози. В остаточному підсумку при тривалому збереженні високого рівня цукру у крові натще проявляється діабет. У WO 95/06410 описане застосування антагоністів рецептора ангіотензину II для лікування хронічних запальних захворювань, які включають системні аутоімунні захворювання. При цьому в якості одного з декількох прикладів системних аутоімунних захворювань згадується діабет. Віднесений до 5 83854 аутоімунних захворювань цукровий діабет типу 1 зустрічається переважно у молодих людей у віці до 30-ти років, при цьому при відповідній генетичній схильності під впливом різних факторів розвивається інсуліт з наступним руйнуванням В-клітин, у результаті чого підшлункова залоза стає здатна виробляти інсулін лише в істотно менших кількостях або навіть повністю перестає виробляти його. Цукровий діабет типу 2 не розглядається як аутоімунне захворювання. Антагоністи рецептора ангіотензину II використовуються для лікування артеріальної гіпертонії, а також пов'язаних з нею вторинних уражень кінцевих органів серцево-судинної системи. У спеціальній літературі такі антагоністи звичайно класифікуються як метаболічно нейтральні. Про поліпшення чутливості до інсуліну, яка спостерігалася при моделюванні на тваринах, яким як діючу речовину вводили ірбесартан, повідомлялося в статті Henriksen та ін. [Hypertension 38,2001, сс. 884-890]. В основу даного винаходу було покладене завдання запропонувати лікарські засоби, які були б придатні й для лікування явного діабету типу 2, і для лікування перших симптомів комплексного порушення обміну речовин на предіабетичній стадії й тим самим для попередження цукрового діабету типу 2. Згідно із даним винаходом раптово було встановлено, що деякі антагоністи рецептора ангіотензину II та їхні солі поряд з відомою дією, яка полягає у зниженні кров'яного тиску (гіпотензивна), здатні також підвищувати в клітинній системі ступінь експресії генів, про транскрипцію яких відомо, що вона регулюється рецептором PPARg. Виявлення подібної властивості відкриває нові терапевтичні можливості в лікуванні й попередженні діабету типу 2, метаболічного синдрому та резистентності до інсуліну. Для забезпечення порівнюваних умов цей ефект згідно із даним винаходом можна виявити й кількісно оцінити за допомогою лінії стабільно трансформованих клітин (див. приклад 2). При цьому мова йде про СНОклітини (клітини яєчника китайського хом'ячка), які отримали у результаті трансформації двома генетичними конструкціями. Перша із цих конструкцій кодує ген люциферази з Photinus pyralis [de Wet J.R., Моl. Cell Biol. 7, 1987, с.725] під контролем штучного промотору з п'ятикратним повторенням зв'язувальної ділянки дріжджового Gal4 (див. послідовність у банку генів під номером AF058756). Друга конструкція кодує злитий білок, який складається з домену фактора транскрипції людського рецептора PPARg2, який зв'язує ліганди [див. послідовність у банку генів під номером U79012], і з домену дріжджового GAL4, який зв'язує ДНК [амінокислоти 1-147; Sadowski I., Nucleic Acids Res. 17, 1989, с.7539]. Про тіазолідиндіони, які використовують як антидіабетичні засоби, (наприклад, про росиглітазон) відомо, що вони індукують транскрипцію генів, які регулюються рецептором PPARg, шля хом зв'язування із рецептором PPARg і активування його. Кількісною оцінкою подібної дії в прийнятій згідно із цим винаходом тест-системі може служити інду 6 кована люциферазна активність у лінії трансформованих клітин. При застосуванні антагоністів рецептора ангіотензину II та ж сама індукція люциферазної активності відбувається всупереч очікуванням не в результаті зв'язування діючої речовини з рецептором PPARg. У випадку діючої речовини телмісартану подібна індукція виражена найбільше яскраво. Зв'язування, наприклад, телмісартану з рецептором PPARg не вдалося виявити в жодній з різних тест-систем. Тому передбачається, що підвищення афінності кофакторних білків до рецептора PPARg під впливом антагоністів рецептора ангіотензину II, таких як телмісартан, призводить до поповнення кофакторних білків навіть при відсутності високоафінних штучних лігандів рецептора PPARg. Цим обумовлена наступна, опосередкована такими кофакторами активація транскрипції генів, у регуляції яких бере участь рецептор PPARg. Оскільки тим самим індукція цих генів відповідальна за антидіабетичну дію тіазолідиндіонів, можна виходити з того, що в результаті індукції тих же самих генів антагоністами рецептора ангіотензину II, такими як телмісартан, буде проявлятися порівнянна антидіабетична дія. Відповідно до цього подібні діючі речовини придатні не тільки для лікування підвищеного кров'яного тиску, але й для лікування та попередження цукрового діабету типу 2. Виявлення цієї нової терапевтичної дії у антагоністів рецептора ангіотензину II та їхні х солей означає, що вони можуть використовуватися для одержання лікарського засобу, якій призначений для лікування людей, у яких діагностований цукровий діабет типу 2 або є підозра на предіабетичний стан, для попередження діабету або для лікування метаболічного синдрому і резистентності до інсуліну у пацієнтів з нормальним кров'яним тиском. Подібні лікарські засоби придатні насамперед для лікування та попередження діабету типу 2 і предіабету типу 2. Сюди ж відноситься і лікування та попередження метаболічного синдрому, синдрому X, відповідно синдрому резистентності до інсуліну. При згадуванні в описі даного винаходу людей, яких піддають лікуванню, мова в першу чергу йде про лікування, відповідно запобігання зазначених захворювань у людей, що, однак, не виключає можливості відповідного застосування діючих речовин та їхніх комбінацій й у ветеринарії для лікування ссавців. Цукровий діабет типу 2 проявляється в тому, що рівень цукру в крові натще перевищує 125мг глюкози на дл плазми, при цьому визначення глюкози в крові є стандартним методом аналізу у повсякденній медичній практиці. У хворого діабетом через 2 години після прийому натще 75г глюкози рівень цукру в крові, який визначається завдяки пробі на толерантність до глюкози, перевищує 200мг глюкози на дл плазми. При проведенні проби на толерантність до глюкози досліджуваному після голодування протягом 10-12год. дають прийняти перорально 75г глюкози й відразу ж після прийому глюкози, а також через 1, відповідно 2год. після прийому глюкози визначають рівень цукру в крові. У здорової людини рівень цукру в крові перед прийомом глюкози повинен знаходитися у 7 83854 межах від 60 до 110мг на дл плазми, через годину після прийому глюкози повинен бути нижче 200мг на дл плазми, а після закінчення 2 годин після прийому глюкози повинен бути нижче 140мг на дл плазми. Вміст же цукру в крові після закінчення 2 годин після прийому глюкози на рівні від 140до 200мг свідчить також про порушену толерантність до глюкози. Найбільш показовою ознакою предіабету (предіабетичного стану) є можливість виявлення у пацієнта резистентності до інсуліну. Слід зазначити, що перевищення потреби однієї людини в інсуліні для підтримки його глюкозного гомеостазу в 23 рази в порівнянні з потребою іншої людини в інсуліні може не бути прямою вказівкою на наявність патологічного стану. Найбільш інформативним методом виявлення резистентності до інсуліну є гіперінсулінемічний еуглікемічний "клемп"-тест (гіперінсулінемічне еуглікемічне навантаження). Цим методом визначають відношення концентрації інсуліну в крові до концентрації глюкози в крові при комбінованій тривалій інфузії інсуліну одночасно із глюкозою. Про резистентність до інсуліну можна говорити, коли ступінь поглинання (засвоєння) глюкози знаходиться нижче 25-го процентилю від фонової популяції, яка досліджувалася (відповідно до визначення ВООЗ). Трохи менш складними у порівнянні з дослідженням "клемп"методом є так називані мінімальні моделі, при використанні яких у ході вн утрішньовенної проби на толерантність до глюкози через задані часові інтервали вимірюють концентрації інсуліну й глюкози в крові й на основі отриманих даних оцінюють резистентність до інсуліну. Іншим методом виявлення резистентності до інсуліну є математична модель HOMA (від англ. "Homeostasis Model Assesment", модельна оцінка гомеостазу). У цьому випадку резистентність до інсуліну оцінюють по концентрації глюкози й інсуліну у плазмі натще. Однак цей метод не дозволяє відрізнити печінкову резистентність до інсуліну від периферичної. У повсякденній практиці всі ці методи мало придатні для оцінки резистентності до інсуліну. У повсякденній клінічній практиці для оцінки резистентності до інсуліну звичайно використають інші параметри. Переважно в цих цілях використовувати, наприклад, метод, що заснований на визначенні концентрації тригліцеридів у крові пацієнта, оскільки між підвищеним рівнем тригліцеридів і наявністю резистентності до інсуліну існує значима кореляція. На практиці використовують трохи спрощений підхід, відповідно до якого виходять із того, що про резистентність до інсуліну у людини можна говорити при наявності щонайменше двох наступних ознак: 1) наявність надлишкової ваги або ожиріння, 2) наявність підвищеного кров'яного тиску, 3) наявність дисліпідемії (зміненого загального вмісту ліпідів у крові), 4) наявність щонайменше одного родича першого ступеня з діагностованою порушеною толерантністю до глюкози або діабетом типу 2. Про надлишкову вагу говорять при цьому в тому випадку, коли індекс (або показник) маси тіла 8 (IMT), який розраховується як відношення маси тіла, яка виміряється у кілограмах, до зведеного у квадрат росту в метрах, становить від 25 до 30кг/м 2. При ожирінні IMT перевищує 30кг/м 2. З наведеного вище визначення резистентності до інсуліну з усією очевидністю безпосередньо випливає, що для її лікування засоби, яки знижують кров'яний тиск (гіпотензивні), придатні й показані у тому випадку, коли у пацієнта виявлена, зокрема, така ознака, як підвищений кров'яний тиск. Результат, який досягається згідно із даним винаходом, полягає, таким чином, у тому, що деякі блокатори рецептора ангіотензину II, але насамперед телмісартан, завдяки наявності в них властивості активувати рецептор PPARg є кращими гіпотензивними засобами, які можуть використовуватися для лікування резистентності до інсуліну й у тому випадку, коли у пацієнта виявлено не підвищений, а нормальний кров'яний тиск. Так, зокрема, лікування хворих діабетом типу 2 телмісартаном може використовуватися одночасно для лікування або для підтримуючої терапії дисліпідемії. Застосування телмісартану у звичайних дозуваннях дозволяє при цьому істотно знизити вміст у плазмі холестерину, що входить до складу ліпопротеїнів високої щільності (ЛВЩ), загального холестерину та/або тригліцеридів. Оскільки резистентність до інсуліну розглядається як стан, який викликає поступове підвищення кров'яного тиску, її лікування телмісартаном незважаючи на нормальні показники кров'яного тиску у пацієнта можна вважати профілактикою гіпертензії. Аналогічним чином є всі підстави підозрювати у людини предіабетичний стан можна й при наявності умов, які вказують на наявність метаболічного синдрому, основною ознакою якого є резистентність до інсуліну. Відповідно до директив ATP IHINCEP [Executive Summary of the Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) в Journal of the American Medical Association 285, 2001, cc.2486-2497] про метаболічний синдром у пацієнта говорять при наявності щонайменше трьох наступних ознак: 1) наявність ожиріння нижньої частини тулуба, коли у чоловіків об'єм (окружність) талії перевищує 40 дюймів або 102см, а у жінок перевищує 35 дюймів або 94см, 2) наявність підвищеного рівня тригліцеридів у крові, яке становить більше 150мг/дл, 3) наявність у чоловіків зниженого рівня ЛВЩ, який входить до складу холестерину, що становить менш 40мг/дл, 4) наявність підвищеного кров'яного тиску, коли систолічний тиск перевищує 130, а діастолічний - 85мм рт.ст., 5) наявність підвищеного рівня цукру в крові натще, що становить більше 110мг/дл. З наведеного вище визначення метаболічного синдрому з усією очевидністю безпосередньо випливає, що для його лікування гіпотензивні засоби придатні й показані в тому випадку, коли у пацієнта виявлено, зокрема, підвищений кров'яний тиск. Результат, який досягається згідно із цим винаходом полягає, таким чином, у тому, що деякі блока 9 83854 тори рецептора ангіотензину II, але насамперед телмісартан, завдяки наявності в них властивості активувати рецептор PPARg є кращими гіпотензивними засобами, які можуть використовуватися для лікування резистентності до інсуліну й у тому випадку, коли у пацієнта не виявлений підвищений кров'яний тиск. Оскільки метаболічний синдром також розглядається як стан, що викликає поступове підвищення кров'яного тиску, його лікування телмісартаном незважаючи на нормальні показники кров'яного тиску у пацієнта так само можна вважати профілактикою гіпертензії. Всі підстави підозрювати у пацієнта предіабетичний стан є й у тому випадку, коли рівень цукру в крові натще перевищує максимальне нормальне значення, яке дорівнює 110мг глюкози на дл плазми, але не перевищує релевантного для діабету граничного значення, рівного 125мг глюкози на дл плазми. Іншою ознакою, яка вказує на предіабетичний стан, є порушена толерантність до глюкози, тобто стан, при якому при проведенні проби на толерантність до глюкози її рівень у крові через 2 години після прийому натще 75г глюкози становить від 140 до 200мг на дл плазми. Підстави припускати наявність предіабетичного стану є й у тому випадку, коли концентрація тригліцеридів у крові перевищує 150мг/дл. Подібна підозра підсилюється при низькому рівні в крові ЛВЩ, які входять до складу холестерину. У жінок за низький рівень ЛВЩ, які входять до складу холестерину (ЛВЩ-холестерину) вважається рівень нижче 40мг на дл плазми, а у чоловіків - нижче 50мг на дл плазми. Метод визначення рівня тригліцеридів і ЛВЩ-холестерину в крові також відноситься до стандартних методів аналізу в медицині й описаний, наприклад, у Thomas L. (ред.) в "Labor und Diagnose", з TH-Books Verlagsgesellschaft mb, Frankfurt/Main, 2000. Підозра на наявність предіабетичного стану додатково підсилюється в тому випадку, коли рівень цукру в крові натще одночасно перевищує 110мг глюкози на дл плазми. Якщо рівні зазначених вище речовин, які визначаються, у крові не виходять за граничні значення, то в якості додаткового допоміжного критерію, що дозволяє судити про наявність або відсутність предіабетичного стану, можна використовува ти відношення об'єму (окружності) талії до об'єму (окружності) стегон. Показання до відповідного лікування є в тому випадку, коли у жінок це відношення перевищує 0,8, а у чоловіків перевищує 1. Показання до застосування антагоністів рецептора ангіотензину II для лікування діабету, відповідно передбачуваного предіабетичного стану є насамперед при необхідності лікування й гіпертонії. Про гіпертонію говорять у тому випадку, коли систолічний кров'яний тиск перевищує 140мм рт. ст., а діастолічний кров'яний тиск перевищує 90мм рт. ст. Пацієнтові, що вже страждає явним діабетом, на сьогоднішній день рекомендується знижувати систолічний кров'яний тиск до величини менше 130мм рт. ст., а діастолічний кров'яний тиск до величини менш 80мм рт. ст. Для зниження кров'яного тиску до цих значень іноді показане застосування антагоніста рецептора ангіотензину II у комбінації з діуретиком або антагоністом кальцію. 10 Термін "діуретик" охоплює тіазиди, відповідно їхні аналоги, такі як гідрохлортіазид (HCTZ), клопамід, ксипамід або хлорталідон, антагоністи альдостерону, такі як спіронолактон або еплеренон, а також інші діуретики, які придатні для лікування підвищеного кров'яного тиску, такі як фуросемід і піретанід, і їхні комбінації з амілоридом та тріамтереном. Даний винахід означає, що людям, яким призначене лікування підвищеного кров'яного тиску, застосування антагоністів рецептора ангіотензину II, таких як телмісартан, завжди показане у тих випадках, коли потрібно попередити розвиток діабету, відповідно потрібне лікування явного діабету. Причину підвищеного кров'яного тиску, яку можна ідентифікувати (вторинної гіпертензії), який може бути обумовлений, наприклад, захворюванням нирок, вдається встановити тільки у 10 відсотках всіх випадків його прояву. Зазвичай вторинну гіпертензію вдається усунути за рахунок лікування відповідного захворювання, яким вона обумовлена, і тим самим за рахунок усунення її причини. Однак майже в 90 відсотках всіх випадків появу підвищеного кров'яного тиску мова йде про первинну гіпертензію, точна причина виникнення якої невідома й безпосереднє лікування від якої тим самим неможливо. Негативні наслідки підвищеного кров'яного тиску можна зменшити за рахунок зміни способу життя й правильного лікування. Імовірну причину підвищеного кров'яного тиску швидше за все варто вбачати у взаємозв'язку окремих факторів ризику, відповідно у спільній їхній появі. За спостереженнями підвищений кров'яний тиск все частіше зустрічається при порушеннях жирового обміну й обміну цукру. Подібні порушення часто залишаються непоміченими на початковій стадії їхнього розвитку, однак їх можна виявити за підвищеним рівнем тригліцеридів і глюкози в крові, а також за зниженим рівнем ЛВЩ-холестерину в крові. Ці порушення на трохи більш пізній стадії їхнього прогресування можна додатково розпізнати по ожирінню, яке повільно прогресує. Подібні порушення можна пояснити тим, що зростає резистентність до інсуліну. Зі зменшенням ефективності інсуліну зростає ступінь порушення жирового обміну й обміну цукру. У поєднанні всі ці порушення в остаточному підсумку збільшують імовірність розвитку цукрового діабету й передчасного виникнення серцевого або судинного захворювання або передчасної смерті від нього. По оцінці приблизно у третини дорослого населення, що проживає в тих районах Землі, у яких спостерігається надлишок продовольства, підвищений кров'яний тиск зустрічається при порушеннях жирового обміну й обміну цукру, причому це число буде тільки зростати. У зв'язку з ви щевикладеним існує потреба в лікарських засобах, які дозволяли б сповільнити або навіть повністю зупинити прогресування зазначених вище метаболічних порушень на як можна більш ранній стадії й застосування яких одночасно із цим не тягло б за собою шкідливих для здоров'я наслідків, яки проявляються в підвищенні кров'яного тиску. 11 83854 Відповідно до цього в даному винаході пропонується також лікарський засіб, який може використовуватися не тільки для лікування гіпертонії, але й для лікування явного діабету типу 2, відповідно перших ознак комплексного порушення обміну речовин, характерного для предіабетичного стану. Тим самим даним винаходом передбачене також попередження діабету у пацієнтів, яким призначене відповідне лікування із приводу підвищеного кров'яного тиску. Тому призначення прийнятного антагоніста рецептора ангіотензину II, такого як телмісартан, для контролю кров'яного тиску відразу ж з появою одної з вищевказаних ознак предіабетичного стану дозволяє сповільнити виникнення явного діабету типу 2 або навіть перешкодити його виникненню. Під придатними для застосування в передбачених даним винаходом цілях антагоністами рецептора ангіотензину II маються на увазі сполуки, зв'язування яких з доменом рецептора PPARg, який зв'язує ліганди, може бути виключено проведенням дослідів in vitro (див. приклад 1), але які в клітинах, тобто при їхньому додаванні до культурального середовища, яке містить лінію клітин з репортерним геном, які стабільно трансформовані послідовністю, яка кодує рецептор PPARg, активують експресію також стабільно трансфектованого гена люциферази (див. приклад 3). Таким чином, прийнятні антагоністи рецептора ангіотензину II не зв'язуються in vitro з доменом людського рецептора PPARg, який зв'язує ліганди, однак приводять до індукції люциферазної активності при додаванні до культурального середовища, що містить лінію клітин з репортерним геном, які стабільно трансформовані послідовністю, яка кодує рецептор PPARg, які а) експресують злитий білок, який складається з домену фактора транскрипції людського рецептора PPARg, який зв'язує ліганди, а також із домену дріжджового GAL4, який зв'язує ДНК, та б) містять ген люциферази під контролем зв'язувальної ділянки дріжджового Gal4, яка п'ятикратно повторюється. Одержання такої лінії клітин, які стабільно трансформовані послідовністю, яка кодує рецептор PPARg, і які містять репортерний ген, описано в прикладі 2. Зв'язування in vitro з доменом людського рецептора PPARg2, який зв'язує ліганди, відсутнє у тому випадку, коли його неможливо виявити при аналізі методом AlphaScreen [Ullmann E.F. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1994, сс. 5426-5430]. Замість аналізу методом AlphaScreen можна також використати SPA-аналіз [Mukherjee R. і ін., J. Steroid Biochem. Моl. Віоl. 81, 2002, сс. 217-225] або ЯМР-дослідження [Johnson B.A. і ін., J. Моl. Віоl. 298, 2000, сс. 187-194]. Звичайно жодним із цих методів не вдається виявити зв'язування з рецептором. Докладний перелік антагоністів рецептора ангіотензину II можна знайти на сс. 7-18 публікації WO 95/26188. Антагоністи рецептора ангіотензину II описані, зокрема, у ЕР-А-253310, ЕР-А-323841, ЕР-А-324377, ЕР-А-420237, ЕР-А-443983, ЕР-А459136, ЕР-А-475206, ЕР-А-502314, ЕР-А-504888, 12 ЕР-А-514198, WO 91/14679, WO 93/20816, US 4355040 й US 4880804. До антагоністів рецептора ангіотензину II, які часто згадують, відносяться сполуки із класу сартанів, такі як кандесартан, епросартан, ірбесартан, лосартан, олмесартан, тазосартан, телмісартан або валсартан. Як найбільш кращі для застосування в передбачених винаходом цілях зарекомендували себе ірбесартан, лосартан і телмісартан. Найкращі ж результати досягаються при застосуванні телмісартану та його солей. Готові лікарські форми містять таку діючу речовину в кількостях, еквівалентних, наприклад, 20-200мг, переважно 20, 40, 80, 120, 160 або 200мг, цієї діючої речовини у формі вільної кислоти. При комбінуванні цієї діючої речовини з HCTZ або хлорталідоном вміст такого діуретика в лікарській формі повинний становити, наприклад, від 10 до 50мг, переважно 50,25 або 12,5мг. Винайдена згідно із даним винаходом краща дія окремих антагоністів рецептора ангіотензину II найбільш виражена у такої діючої речовини, як телмісартан. При доцільності або необхідності комбінованого застосування блокатора рецептора ангіотензину II й однієї або декількох інших терапевтичних діючих речовин у якості блокатора рецептора ангіотензину II переважно використовувати телмісартан, оскільки він є єдиною діючою речовиною, яка поєднує в собі гіпотензивну дію з метаболічною дією, наприклад, антидіабетичною дією, що сприяє також попередженню діабету. Із цієї причини вищеописані комбінації діючих речовин, однією із яких є телмісартан, а іншою інгібітор ГМГ-КоА-редуктази, такий як сімвастатин або аторвастатин, дозволяють досягти прогресу в терапевтичному лікуванні серцево-судинних, серцево-легеневих, легеневих або ниркових захворювань, але також у терапії дисліпідемії, остеопорозу або хвороби Альцгеймера. Сказане рівною мірою відноситься й до застосування комбінацій діючих речовин, однією із яких є телмісартан, а іншою або росиглітазон, або піоглітазон, або репаглінід, або метформін, або інгібітор DPP4, у терапії діабету. Телмісартан варто віднести до кращих інгібіторів системи ренін-ангіотензин (CPA) і при лікуванні підвищеного кров'яного тиску інгібіторами CPA в комбінації з антагоністом кальцію, таким як амлодипін або ніфедипін, або антагоністом альдостерону, таким як спіронолактон або еплеренон. Застосування телмісартану в комбінації з антагоністом альдостерону, таким як еплеренон, дозволяє домогтися значного прогресу й у лікуванні, відповідно попередженні серцевої слабості або інфаркту міокарда. Телмісартан переважно використовувати також у сполученні з інгібіторами агрегації тромбоцитів, такими як клопідрогрель або дипіридамол, які у всякому разі додатково комбінують із ацетилсаліциловою кислотою (ACK), насамперед для профілактики апоплексичного удару, ризик виникнення якого поряд з підвищеним кров'яним тиском збільшують також порушення жирового обміну (дисліпідемії) і цукровий діабет. У цих цілях дипіридамол можна використовувати в дозі від 50 до 750мг, переважно від 100 до 500мг, насамперед від 200 до 450мг. ACK можна використовува ти в 13 83854 дозі від 10 до 200мг, переважно від 25 до 100мг, насамперед від 30 до 75мг. Ще одним об'єктом даного винаходу є відповідно до цього фармацевтичні композиції, які містять телмісартан або одну з його солей у комбінації з - амлодипіном або ніфедипіном, - еплереноном або спіронолактоном, - симвастатином або аторвастатином, - росиглітазоном, піоглітазоном, репаглінідом або метформіном, - дипіридамолом або клопідрогрелем, у кожному разі в поєднанні з ацетилсаліциловою кислотою, - сульфонілсечовиною, - антагоністом альдостерону, - інгібітором ГМГ-КоА-редуктази, - інгібітором DPP4 або - інгібітором агрегації тромбоцитів, а також спосіб одержання таких композицій. Такі комбінації діючих речовин, звичайно разом з одним або декількома допоміжними речовинами, які використовують в те хнології приготування лікарських засобів, такими як маніт, сорбіт, ксиліт, сахароза, карбонат кальцію, фосфат кальцію, лактоза, натрієва сіль кроскармелози (натрієва сіль карбоксиметилцелюлози, зшитої), кросповідон, натрійкрохмальгліколят, гідроксипропілцелюлоза (з низьким ступенем заміщення), кукурудзяний крохмаль, полівінілпіролідон, сополімери вінілпіролідону з іншими похідними вінілу (коповідони), гідроксипропилцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза, мікрокристалічна целюлоза, крохмаль, стеарат магнію, стеарілфумарат натрію, тальк, карбоксиметилцелюлоза, ацетофталат целюлози, полівінілацетат, вода, вода/етанол, вода/гліцерин, вода/сорбіт, вода/поліетиленгліколь, пропіленгліколь, цетилстеариловий спирт або речовини, які вміщують жири, наприклад, стверділий жир, або їхніми відповідними сумішами переробляють у звичайні галенові форми, такі як таблетки, драже, капсули, порошки, суспензії або супозиторії. Таблетки виготовляють, наприклад, шляхом змішування діючої речовини або діючих речовин з однією або декількома допоміжними речовинами з наступним пресуванням отриманої суміші. Таблетки можуть також складатися з декількох шарів. Як приклад допоміжних речовин, які використовують при виготовленні таблеток, можна назвати інертні розріджувачі, такі як маніт, сорбіт, ксиліт, сахароза, карбонат кальцію, фосфат кальцію й лактоза, розпушувачі, такі як натрієва сіль кроскармелози (натрієва сіль карбоксиметилцелюлози, зшитої), кросповідони, натрійкрохмальгліколят, гідроксипропілцелюлоза (з низьким ступенем заміщення) і кукурудзяний крохмаль, зв'язувальні речовини, такі як полівінілпіролідон, сополімери вінілпіролідону з іншими похідними вінілу (коповідони), гідроксипропілцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза, мікрокристалічна целюлоза й крохмаль, змащувальні речовини, такі як стеарат магнію, стеарилфумарат натрію й тальк, засоби для забезпечення пролонгованої дії (депо-ефекту), такі як гідроксипропілметилцелюлоза, карбоксиметилцелюлоза, ацетофталат целюлози й полівінілаце 14 тат, і допущені до застосування у фармацевтиці барвники, такі як кольорові оксиди заліза. Блокада альдостерону дозволяє знизити смертність і захворюваність серед пацієнтів з вираженою серцевою слабістю. Результати досліджень, яки проводилися за участю пацієнтів, яки перенесли інфаркт міокарда, яким було призначене лікування інгібіторами АСЕ, антагоністами рецептора ангіотензину, діуретиком або бета-блокатором із приводу симптоматичної серцевої слабості й недостатності лівих відділів серця (лівошлуночкової недостатності), свідчать про те, що додаткове лікування еплереноном, що є вибірковим блокатором альдостерону, збільшує їхні шанси на виживання й зменшує ймовірність їхньої наступної госпіталізації [NEJM 348, 2003, сс. 1309-1321]. У груп у пацієнтів, яки приймали в дослідженнях, включали також хворих діабетом, у яких незважаючи на недостатність лівих відділів серця була відсутня симптоматична серцева слабість, оскільки саме у пацієнтів цієї категорії великий ризик серцево-судинної події в порівнянні з пацієнтами, що страждають недостатністю лівих відділів серця й симптоматичною серцевою слабістю. Беручи до уваги таке положення речей, можна стверджувати, що з урахуванням виявленої згідно із даним винаходом антидіабетичної дії у телмісартану, який є блокатором рецептора ангіотензину II, його комбінація з еплереноном показана для застосування при доліковуванні інфаркту міокарда насамперед тим пацієнтам, які вже хворі діабетом й у кожному разі страждають на діабетичну протеїнурію або у яких є підозра на предіабетичний стан. Об'єктом даного винаходу відповідно до цього є також лікарські форми, які містять комбінацію з обох діючих речовин, однією з яких є телмісартан, а іншою - еплеренон, наприклад, які містять телмісартан у кількості, яка еквівалентна 40-320мг, переважно 80 або 160мг, і еплеренон у кількості, яка еквівалентна 20-200мг, переважно 25 або 50мг. У кращому варіанті такі лікарські форми являють собою двошарові таблетки. Для лікування подібних пацієнтів, у яких одночасно є ознаки дисліпідемії (наприклад, гіпертригліцеридемії або гіперхолестеринемії), комбінацію цих діючих речовин часто доцільно доповнювати засобом, який знижує рівень ліпідів у крові, таким як симвастатин або аторвастатин, у звичайному для нього дозуванні, яке становить від 2,5 до 40мг, переважно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 або 40мг. Відповідна лікарська форма, яка містить телмісартан, еплеренон та аторвастатин або симвастатин, може являти собою, наприклад, тришарову таблетку. Діючу речовину еплеренон використовують переважно у мікронізованому вигляді з розміром часток D90 у межах від 25 до 400мкм [див. WO 00/33847]. Метформін являє собою антидіабетичний засіб, який добре зарекомендував себе, основний ефект якого проявляється в зниженні надлишкового вироблення глюкози в печінці хворого діабетом. При терапевтичному контролі за цукровим діабетом першорядне значення має рівень у крові гемоглобіну HbAIc, який представляє собою продукт неферментативного глікозилювання b-ланцюга гемоглобіну. Гемоглобін HbAIc, оскільки його утво 15 83854 рення в істотному ступені залежить від рівня цукру в крові та часу життя еритроцитів, по типу "пам'я ті", яка зберігає інформацію про рівень цукру в крові, відбиває середнє його значення за минулих 4-6 тижнів. Пацієнти, які потерпають від діабету, у яких вміст гемоглобіну HbAIc у крові за рахунок інтенсифікованої терапії діабету довгостроково підтримується на прийнятному рівні (тобто нижче 6,5% від загального гемоглобіну в зразку крові), набагато краще захищені від діабетичної мікроангіопатії. У хворого діабетом метформін при його індивідуальному застосуванні здатний знижувати концентрацію гемоглобіну HbAIc у середньому на величину порядку 1,0-1,5%. Однак подібного зниження концентрації гемоглобіну HbAIc виявляється достатнім не для всіх хворих діабетом для зменшення в них рівня гемоглобіну HbAIc до необхідних значень, що лежать нижче 6,5%, переважно нижче 6%. Тому для посилення дії метформіну необхідно приймати додаткові терапевтичні заходи. При створенні даного винаходу раптово було встановлено, що телмісартан діє як активатор рецептора PPARg. Відповідно до цього телмісартан має потенціал підвищувати чутливість жирової, м'язевої та печінкової тканини до інсуліну й таким шляхом знижувати вміст цукру в крові. Завдяки цій своїй властивості телмісартан найбільш придатний для застосування в комбінації з антидіабетичними засобами, такими як метформін або репаглінід (стимулює вивільнення інсуліну з В-клітин підшлункової залози), оскільки його дія заснована на іншому принципі й тим самим оптимально підсилює механізм дії цих діючи х речовин. Лікарські форми з комбінацією з репаглініду та телмісартану містять, наприклад, репаглінід у кількості, яка еквівалентна 0,25-5мг, переважно 0,25-2мг, найбільше переважно 0,5, 1 або 2мг, і телмісартан у кількості, яка еквівалентна 40-320мг, переважно 80 або 160мг. Комбінацію з телмісартану та метформіну найбільше доцільно призначати хворому діабетом типу 2, який потерпає від ожиріння, оскільки, метформін, з одного боку, на відміну від інших антидіабетичних засобів, які приймають усередину, не призводить до збільшення маси тіла, а телмісартан, з іншого боку, знижує резистентність до інсуліну, що є важливою ознакою й причиною підвищеного рівня цукру в крові у цієї категорії хворих діабетом типу 2. У більшості хворих діабетом типу 2, які страждають від ожиріння, так само як й у 16 людей із предіабетичним станом виявлений підвищений кров'яний тиск, що також відноситься до критеріїв метаболічного синдрому. Для пацієнтів цієї групи телмісартан є кращим гіпотензивним засобом, який завдяки додатково виявленим у нього властивостям сенсибілізатора до інсуліну, які оптимально поєднуються із властивостями такого засобу, як метформін, який добре зарекомендував себе у якості антидіабетичного засобу, може так само використовуватися одночасно з ним для лікування різних проявів таких захворювань, як діабет типу 2, предіабет типу 2 або метаболічний синдром або резистентність до інсуліну. Прийом телмісартану на додаток до метформіну дозволяє домогтися додаткового зниження концентрації гемоглобіну HbAIc на величину порядку 0,25-2%, переважно 0,25-1%, найбільше переважно 0,250,5%. Зниження концентрації гемоглобіну HbAIc на величину менш 0,25% від загального гемоглобіну також вносить ефективний вклад у лікування хворого діабетом типу 2, однак у цей час зниження концентрації гемоглобіну HbAIc на таку величину не піддається надійному вимірюванню. За результатами дослідження UKPDS (United Kingdom Prospective Diabetes Study) було встановлено, що зниження підвищеного кров'яного тиску настільки ж ефективно, як і спрямована на зниження рівня цукру в крові терапія, для зменшення небезпеки виникнення у хворих діабетом типу 2 пізніх ускладнень, таких як нефропатія, невропатія й ретинопатія, а також всіх макроваскулярних ускладнень. Тим самим запропонована комбінація з телмісартану та метформіну вносить значний вклад у зменшення або навіть запобігання ризику виникнення серйозних ускладнень при діабеті. Лікарські форми з комбінацією з метформіну та телмісартану містять, наприклад, метформін у кількості, що еквівалентна 450-900мг, переважно 500 або 850мг, і телмісартан у кількості, яка еквівалентна 40-320мг, переважно 80 або 160мг. Метформін у вигляді його гідрохлориду має гарну розчинність і не створює проблем при його переробці спільно з допоміжними речовинами, такими як з'єднувальні речовини та речовини, що змащують, у лікарські форми. Кращими лікарськими формами є при цьому двошарові таблетки. Нижче наведені приклади таблеток із кращими кількісними співвідношеннями в них між діючими та допоміжними речовинами. Таблиця 1 Таблетки із вмістом телмісартану 80мг Метформіну гідрохлорид (відповідає 500 або 850мг метформіну) Допоміжні речовини (з'єднувальні речовини та речовини, що змащують), не менш Телмісартан у вигляді SD-гранулята (відповідає 80мг телмісартану) Допоміжні речовини з матриці таблетки з телмісартаном (сорбіт та речовина, що змащує) Загальна маса таблетки (не менш) Телмісартан 80/500мг 643мг і/метформін 80/850мг 1094мг 27мг 46мг 135мг 135мг 345мг 345мг 1150мг 1620мг 17 83854 18 Таблиця 2 Таблетки із вмістом телмісартану 160мг Метформіну гідрохлорид (відповідає 500 або 850мг метформіну) Допоміжні речовини (з'єднувальні речовини та речовини, що змащують), не менш Телмісартан у вигляді SD-гранулята (відповідає 160мг телмісартану) Допоміжні речовини з матриці таблетки з телмісартаном (сорбіт і речовина, що змащує) Загальна маса таблетки (не менш) Лікарські форми з комбінацією з репаглініду та телмісартану містять, наприклад, репаглінід у кількості, еквівалентній 0,25-5мг, переважно 0,25-2мг, найбільше переважно 0,5, 1 або 2мг, і телмісартан у кількості, еквівалентній 40-320мг, переважно 80 або 160мг. Приклади Приклад 1: Телмісартан, лосартан та ірбесартан не зв'язуються in vitro з доменом рецептора PPARg, який зв'язує ліганди Білок, який містить домен людського рецептора PPARg, який зв'язує ліганди (ЛСД), одержують у вигляді злитого з GST (глутатіон-8-трансфераза) білка у Е.соlі та очищають шляхом афінної хроматографії. Із цією метою фрагмент ДНК, який кодує амінокислоти 205-505 фактора транскрипції людського PPAR/2 (див. послідовність у банку генів під номером U79012), субклонують з використанням додатково введених сайтів рестрикції BamH I та Xho I в експресуючий вектор pGEX-4T-l (фірма Amersham) і контролюють послідовність фрагмента ДНК. Експресія злитого білка відбувається в рекомендованому для векторів pGEX штамі Е.соіі BL21(DE3) після індукції 0,2-мілімолярним ІПТГ (ізопропіл-b-D-тіогалактопіранозид) протягом 4год. при 25°С. По закінченні індукції бактерії центрифугують і порціями виморожують у забуференому фосфа тому фізіологічному розчині (ЗФР) з рН 7,4. Після руйнування в пристрої "френч-прес" розчинений злитий білок GST-PPARg-ЛСД очищають за допомогою колонки GSTrap (фірма Pharmacia). Елюювання здійснюють шляхом додавання 20мілімолярного відновленого глутатіону. З фракцій, які містять злитий білок GST-PPAR y-ЛСД, видаляють солі за допомогою колонки для видалення солей НіТrар (фірма Pharmacia) і шляхом стандартного аналізу визначають концентрацію білка. Білок, який містить домен людського рецептора RXRa, який зв'язує ліганди (ЛСД), одержують у вигляді білка, злитого з His-міченим білком, у Е.соlі та очищають шляхом афінної хроматографії. Із цією метою фрагмент ДНК, який кодує амінокислоти 220-461 фактора транскрипції людського RXRa [див. послідовність у банку генів під номером NM_002957, nt 729-1457], субклонують з використанням додатково введених сайтів рестрикції Ват І Телмісартаі 160/500мг 643мг і/метформін 160/850мг 1094мг 27мг 46мг 270мг 270мг 690мг 690мг 1630мг 2100мг та Not I у експресуючий вектор рЕТ28с (фірма Novagen) і контролюють послідовність фрагмента ДНК. Експресія злитого білка відбувається в рекомендованому для векторів рЕТ штамі Е.соlі BL21(DE3) після індукції 0,2-мілімолярним ІПТГ протягом 4год. при 25°С. По закінченні експресії бактерії центрифугують і порціями виморожують у ЗФР із рН 7,4. Після руйнування в пристрої "френч-прес" розчинений злитий білок His-RXRaЛСД очищають за допомогою колонки, яка хелатує НіТrар (фірма Pharmacia). Елюювання здійснюють із використанням 500-мілімолярного імідазолу. З фракцій, які містять злитий білок His-RXRa-ЛСД, видаляють солі за допомогою колонки для видалення солей НіТrар (фірма Pharmacia) і шляхом стандартного аналізу визначають концентрацію білка. а) Аналіз методом AlphaScreen Метод AlphaScreen вперше був описаний у [Ullmann E.F. та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1994, сс. 5426-5430]. У даному прикладі вимірювання проводили за методикою, яка описана у Glickman J.F. та ін., J. Biomol. Screen 7, 2002, сс. 310. Буфер для аналізу складався з HEPES (N-2гідроксіетилпіперазин-N¢-2-етансульфонова кислота) з рН 7,4 у концентрації 25мМ, NaCl у концентрації 100мМ, ДТТ (дитіотреїтол) у концентрації 1мМ, 0,1% твіну 20 та 0,1% БСА (бичачий сироватковий альбумін). Злитий білок GST-PPARg-ЛСД у концентрації 3 нМ, біотинильований пептид LXXLL кофактора СВР (відповідає пептиду, описаному на с 218 у Mukherjee R та ін., J. Steroid Biochem. Моl. Віоl. 81, 2002, сс. 217-225, з додатковим Nкінцевим цистеїном) у концентрації 15 нМ і покриті антитілом до GST кульки-акцептори та покриті стрептавідином кульки-донори (фірма Applied Biosystems) у кількості по 10мкг/мл протягом 4год. інкубували при кімнатній температурі в загальному об'ємі 12,5мкл у присутності речовини, яку тестували, в різних концентраціях (у ДМСО). Кінцева концентрація ДМСО при аналізі становила 1 об. %. Як фоновий контроль (NSB) служив 1%-вий розчин ДМСО. Вимірювання проводили у вимірювальному приладі Packard Fusion. 19 Концентрація, M NSB 1,00x10-8 3,00x10-8 1,00x10-7 3,00x10-7 Концентрація, М 1,00x10-6 3,00x10-6 1,00x10-5 5,00x10-5 83854 MM 619 Телмісартан станд. відхил. 21 642 606 644 41 10 56 MM 677 720 847 1111 Телмісартан станд. відхил. 14 35 82 135 На відміну від росиглітазону, відомого з літератури агоніста рецептора PPARg зі зв'язуванням у ЛСД, у присутності телмісартану, лосартану та ірбесартану, що використовуються у зростаючих концентраціях (аж до 50мкМ), не відбувається безпосередня активація ЛСД рецептора PPARg і ніяке пов'язане із цим значне поповнення пептиду LXXLL. б) SPA-аналіз Опис формату проведення SPA-аналізу ("Scintillation Proximity Assay") можна знайти у [Mukherjee R. та ін., J. Steroid Biochem. Моl. Віоl. 81, 2002, сс. 217-225]. Буфер для аналізу, який використовували складався з тріс із рН7,5 у концентрації 20мМ, KCl у концентрації 25 мМ, ДТТ у концентрації 10мМ та 0,2% тритону Х-100. Злитий білок GST-PPARg-ЛСД у концентрації 30нМ, злитий білок His-RXRa-ЛСД у концентрації 30нМ, анКонцентрація, М NSB Bmax 1,00x10-7 3,00x10-7 1,00x10-6 3,00x10-6 1,00x10-5 3,00x10-5 1,00x10-4 20 Телмісартан станд. MM відхил. 217 9 911 15 837 49 802 28 818 27 818 20 703 30 691 222 545 18 На відміну від безпосередніх агоністов рецептора PPARg, які зв'язуються з його ЛСД, навіть у присутності високих надлишкових кількостей телмісартану, лосартану або ірбесартану не відбувається залежне від концентрації витиснення радіоактивного росиглітазону з зв'язувальної "кишені". в) ЯМР-дослідження На відміну від безпосереднього ліганда рецептора PPARg, наприклад, росиглітазону, при вимірюванні 15N-TROSY-спектра домена рецептора PPARg, який зв'язує ліганд, у присутності телмісартану ця речовина, яку тестують, не взаємодіє з амінокислотами зв'язувальної "кишені". Амінокислоти зв'язувальної "кишені" мають у присутності Росиглітазон MM станд. відхил. 573 17 820 18 1720 48 8704 59 27176 1232 Росиглітазон MM станд. відхил. 43233 1083 52691 3771 56366 4303 титіло до GST (1:600, фірма Amersham Pharmacia), 0,25мг покритих протеїном А кульок, які з'єднують антитіла, з полівінілтолуолу для SPA-аналізу, (фірма Amersham Pharmacia) і мічений 3Н-ізотопом росиглітазон у концентрації 30нМ протягом 5год. інкубували при кімнатній температурі в загальному об'ємі 100мкл із різними розведеннями речовин, які тестували. Як фоновий контроль (NSB) замість радіоактивного росиглітазону додавали немічений росиглітазон у концентрації 10мкМ, а як речовину, якій відповідає максимальне значення (Вmах), замість речовини, що тестували, додавали розчинник, який використовувався, наприклад, ДМСО. По закінченні інкубації досліджувані суміші центрифугували протягом 5хв. при 2000об./хв. у центрифузі Hettich Universal 30Rf та аналізували за допомогою приладу Packard TopCount NXT. Ірбесартан станд. MM відхил. 217 9 911 15 913 54 810 49 815 51 779 26 723 37 648 40 510 81 MM 217 911 915 835 901 814 787 784 611 Лосартан станд. відхил. 9 15 43 11 10 53 46 96 17 речовин, які тестують те ж місце розташування, що й під час відсутності ліганда. Приклад 2: Одержання лінії клітин з репортерним геном, які стабільно трансформовані послідовністю, яка кодує рецептор PPARg Фрагмент ДНК, що кодує амінокислоти 205-505 фактора транскрипції людського PPARg2 (відповідає нуклеотидам 703-1605 послідовності в банку генів під номером U79012), вбудовують із використанням додатково введених сайтів рестрикції Ват І та Hind III у сайт вектора pFA-CMV (фірма Stratagene), який представляє собою сайт множинного клонування, і перевіряють послідовність. Отримана плазміда pFA-CMV/hPPARg2-ЛСД кодує N-кінець домена рецептора PPARg, який зв'язує 21 83854 ліганд, у тій же рамці зчитування, що й рамка зчитування домена білка Gal4, який зв'язує ДНК. Ця плазміда додатково кодує резистентність до неоміцину. Клітини лінії CHO-Kl (ATCC CCL-61) спільно трансфектують плазмідами pFA-CMV/hPPARg2ЛСД та pFR-Luc (фірма Stratagene). Плазміда pFRLuc кодує ген люциферази під контролем п'ятикратно повторюваної зв'язувальної ділянки дріжджового Gal4. Трансфекцію здійснюють із використанням ліпофектаміну 2000 відповідно до інструкції виробника. Після трансфекції клітини культивують у середовищі Хема F12, яке доповнена 10% фетальною телячою сироваткою, у присутності G-418 у кількості 0,5мг/мл. Після шестигодинного культивування клітини пасивують і витримують у к ультуральному середовищі протягом наступних 10 днів. Отримані резистентні до неоміцину колонії збирають під мікроскопом, окремо переносять у лунки 96-лункових планшетів і культивують у них. Таким шляхом одержують різні лінії трансформованих клітин із плазмідами, які містяться в них, (наприклад, клон №10,11,13 і т.д.), які (клітини) залишають у к ультуральному середовищі. Клітини отриманих ліній досліджують на предмет можливості індукування гена люциферази агоністом рецептора PPARg, наприклад, росиглітазоном, реакція яких на стимуляцію агоністом рецептора PPARg проявляється у підвищеному люциферазному сигналі. Приклад 3: Телмісартан, лосартан та ірбесартан активують рецептор PPARg у клітинах Клітини лінії CHO-Kl, що є похідними трансформованого клону №11 із приклада 2, висівають в Концентрація, M NSB 1,00x10-8 3,00x10-8 1,00x10-7 3,00x10-7 1,00x10-6 3,00х10-6 1,00x10-5 3,00x10-5 1,00x10-4 Телмісартан станд. MM відхил. 466 188 760 2859 24498 61397 58790 255 455 2290 7853 2055 96-лункові плоскодонні планшети із щільністю 3x104 клітин/200мкл/лунку та культивують протягом ночі в середовищі Хема F12, яке доповнене 10% фетальною телячою сироваткою та G- 418 у кількості 0,5мг/мл. Через 24год. середовище заміняють на аналогічне, але без доданого до нього G418. Речовини, які тестують, розчиняють у прийнятному розчиннику, наприклад, у ДМСО, до концентрації, яка в 100 разів перевищує необхідну, а потім розводять у попередньо розміщеному у культуральний планшет середовищі, зменшуючи концентрацію в 100 разів. Фоновим контролем служить розчинник, який використовують, наприклад, ДМСО, у такій же концентрації. Через 24год. після додавання речовини, яку тестують, супернатанти видаляють, а клітини двічі промивають промивним буфером порціями по 150мкл (який містить трицин у концентрації 25мМ та MgSО4 у концентрації 16,3мМ, рН 7,8). Після промивання до кожної досліджуваної суміші додають по 50мкл промивного буфера з 150мкл буфера для аналізу, який містить люциферазу (що містить трицин у концентрації 25мМ, ЕДТК у концентрації 0,5мМ, NaTPP у концентрації 0,54 М, MgSO4 у концентрації 16,3мМ, АТФ у концентрації 1,2мМ, люциферин у концентрації 0,05мМ, 2-меркаптоетанол у концентрації 56,8мМ та 0,1% тритон Х-100, рН7,8). Люмінесценцію вимірюють за допомогою приладу Packard TopCount NXT після п'ятихвилинної витримки. Люциферазну активність обчислюють шляхом інтегрування відносних світлових одиниць (BCO) по перших десятьох секундах після початку вимірювання. Ірбесартан станд. MM відхил. 466 188 491 657 1028 3292 22133 29600 Отримані результати свідчать про те, що антагоніст рецептора ангіотензину II телмісартан викликає особливо сильну активацію метаболічних шляхів за участю PPARg у лінії клітин з репортерним геном, які трансформовані послідовністю, яка кодує рецептор PPARg. Активація іншими антагоністами рецептора ангіотензину II, такими як лосартан та ірбесартан, відбувається лише при більш високих концентраціях цих речовин, що тестуються і проявляється у меншому ступені. Приклад 4: Експерименти з адипоцитами 3T3L1 і клітинами PC 12W Мишачі преадипоцити 3T3-L1 культивують у DMEM-середовищі (модифіковане відповідно до способу Дульбекко середовище Ігла) з 10% фета 22 70 65 342 556 4202 6936 Лосартан станд. MM відхил. 466 188 874 589 672 709 3271 11322 475 70 88 163 585 1668 Росиглітазон станд. відMM хил. 741 141 2761 178 8256 708 35265 2947 86859 6139 106252 30018 143232 14064 150989 24245 льною телячою сироваткою (ФТС). Клітини PC 12W культивують у D MEM-середовищі з 5% ФТС та 10% кінською сироваткою. В обох випадках кожне середовище містить по 1% пеніциліну/стрептоміцину. Диференціювання адипоцитів індукують через 2-3 дні після злиття клітин шляхом додавання відповідного розчину. Такий розчин містить дексаметазон у концентрації 1мкмолів/л, 3ізобутил-1-метилксантин у концентрації 0,5ммолів/л, інсулін у концентрації 1,67мкмолів/л та 10% ФТС. Для порівняння диференціювання клітин індукують також відповідним розчином, який додатково містить телмісартан. Через 48год. (день 2) середовище заміняють на DMEM-середовище, яке містить 10% ФТС та інсулін у концентрації 23 83854 1,67мкмолів/л, відповідно 10% ФТС, інсулін у концентрації 1,67мкмолів/л та телмісартан. Після цього клітини стимулюють ще протягом наступних 48год. та на завершення аналізують (день 4). Накопичення ліпідів в адипоцитах 3T3-L1 Клітини промивають ЗФР і фіксують 3,7%-вим розчином формальдегіду протягом 2хв. Після фіксації клітини протягом 1год. офарблюють при кімнатній температурі 0,5%-вим матковим розчином барвника Oil Red-О у ізопропанолі, який розведений водою в пропорції 3:2. Після промивання клітини досліджують під оптичним мікроскопом. Телмісартан у концентрації 10мкмолів/л викликає підвищене накопичення ліпідів в адипоцитах, що помітно по більш інтенсивному фарбуванню барвником Oil Red-O. Звідси можна зробити висновок про те, що телмісартан сприяє диференціюванню адипоцитів 3T3-L1. Стимуляція експресії білка аР2 у клітинах 3T3L1 Для виділення PHK, зворотної транскрипції та кількісного аналізу експресії гена використовували систему виявлення послідовностей ABI 7000 для ПЛР у реальному часі [описана у Janke та ін., Diabetes 51, 2002, сс. 1699-707]. Як ендогенний контроль для ПЛР у реальному часі служать гени "домашнього господарства" 18S рРНК і гіпоксантин-гуанін-фосфорібозил-трансферази (hprt). Індукція, яка спостерігається, залежить від концентрації телмісартану, яку використовують. У клітинах 3T3-L1 телмісартан у концентрації 10мкмолів/л стимулює 3,1±0,3-кратну (р