Активне косметичне начало, що складається з екстракту мікроводоростей класу chlorophycees і ферулату аргініну, та його застосування

1. Активне косметичне начало, що складається з ферулату аргініну й екстракту мікроводоростей класу Chlorophycees, збагаченого фітоалексинами. 2. Активне начало за п. 1, яке відрізняється тим, що зазначені мікроводорості класу Chlorophycees належать до роду Scenedesmus. 3. Активне начало за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що масове співвідношення ферулату аргініну: C2 2 (19) 1 3 гормонів, що спричиняє поступове зниження функцій тканин, кліток і органічних функцій. Такі гормони, як гормон росту (HGH), тестостерон, DHEA і мелатонін, виробляються у великих кількостях до 20-літнього віку, вони ж сприяють відновленню кліток. І навпаки, зовнішнє старіння приводить до гістопатологічних змін, таких як надмірне накопичення еластичної речовини у верхній дермі і руйнування колагенових волокон. Одним з механізмів старіння є надмірне утворення вільних радикалів, що націлені на різні компоненти кліток: протеїни, ліпіди, цукри і ДНК. Під впливом деяких зовнішніх факторів вільні радикали вступають у реакцію, оскільки їм постійно потрібні інші молекули, з якими вони можуть з'єднуватися. Вони уражають колагенові волокна, клітинні мембрани і жировий шар шкіри. Вони змінюють генетичну програму кліток і в такий спосіб якість нових кліток шкіри знижується. Організм захищає себе від цих агресивних продуктів за допомогою системи ферментів, які протидіють зазначеним окисним реакціям (антиоксиданти). Але після двадцяти років природні механізми захисту поступово послабляються і шкіра не в змозі самостійно захистити себе. Накопичення ушкоджених білків є одним з факторів клітинного старіння. Таким чином, накопичення ушкоджених білків створює з віком проблему ефективності протеолітичних систем, які повинні видаляти ці білки, зокрема, проблему ефективності протеасомальної системи, задіяної не тільки при видаленні ушкоджених білків, зокрема, окислених білків, але також і в безперервному відновленні внутрішньоклітинних білків. У 1956 р. Харман у роботі "Free radical theory of aging" припустив, що ушкодження різних компонентів кліток, викликані реакційноспосібними похідними кисню, є значним чинником процесу старіння. Клітинне старіння залежить, напевно, від продукування реакційноспосібних похідних кисню, від протиокислювального захисту й ефективності систем, відповідальних за видалення ушкоджених клітинних компонентів. Ушкоджені білки можуть бути або репаровані, або деструктуровані в залежності від виду ушкодження (див. Фігуру 1). Єдиними відомими механізмами репарації є система тіоредоксин (T)-тіоредоксинредуктаза (TR), здатна відновити дисульфідні містки, і пептид метіонінсульфоксидредуктазу, що дозволяє відновити метіонінсульфоксид (продукт окислювання метіоніну). Раніше було показано, що тіоредоксин захищає шкіру від ушкоджень, викликаних УФВопроміненням. При нормальних умовах TR відновлює окислений тіоредоксин у присутності NAPDH. Відновлений тіоредоксин служить донором електронів для тіоредоксин редуктази, яка у цьому випадку відновлює H2O2 у H2O. Отже, TR є сильним антиоксидантом у боротьбі проти ушкоджень, викликаних вільними радикалами. Була доведена присутність TR, інтегрованих у мембрану й у цитозол, у шкірі людини. 95283 4 Було також показано, що у фібробластах шкіри людини, опроміненої УФА, тіоредоксин перешкоджає втраті мембранного потенціалу метохондрію, зниженню вмісту ATP у клітці і втраті життєздатності клітки, які обумовлені опроміненням (Didier і співр. Free Radical Biology and Medecine, Vol.31, n°5, стор.585-598, 2001). Було також показано, що в умовах окисного стресу, викликаного Уф-опроміненням, тіоредоксин перешкоджає ушкодженням у ДНК, індукованим Уф-опроміненням (Didier і співр. Free Radical Biology and Medecine, Vol.30, n°5, стор.537-546, 2001). Отже, тіоредоксин також є значним чинником для збереження цілісності генома. Усунення інших видів ушкоджень здійснюється шляхом, деструкції внутрішньоклітинних білків, яка залежить від протеасоми. Протеосомальна система складається з каталітичного комплексу - 20S-протеасоми, і декількох компонентів регуляції, які впливають на її активність і специфічність. Протеасома локалізується в клітках ссавців, як у цитозолі, так і в ядрі клітки. 208-протеасома складається з 14 різних кодуємих генами субодиниць, або типу , або типу , і зібраних у стопку циліндричної форми, що має з 4 кілець по 7 субодиниць. Існують різні субодиниці протеасом (наприклад, 20S, 19S, 26S і РА28), які функціонують індивідуально або спільно один з одним у залежності від клітинного метаболізму. Так, мова може йти або про субодиниці протеасом, або про самі протеасоми, тип яких залежить від клітинного метаболізму. Цей протеолітичний комплекс, названий протеасомою, розщеплює переважно білки на рівні кінцевої карбокси-групи основних, гідрофобних і кислотних залишків. Ці пептидазні активності обумовлені 3 різними -субодиницями, локалізованими усередині структури. Зв'язування регулятора 19S з 20Sпротеасомою утворює 26S-протеасому, яка здійснює деструкцію убіквітинірованих білків. З віком відбувається накопичення ушкоджених білків, явище, яке, певно, сприяє можливому зниженню ефективності протеосомальної системи. Зокрема, було констатовано, з одного боку, збільшення з віком вмісту карбонільних груп білків у біопсійному матеріалі епідерми, а також у культурі кератиноцитів, і, з іншого боку, констатована модифікація, під дією аддуктів - похідних вуглеводів і ліпідів, білків, що несуть карбонільні групи. Вікове збільшення кількості окислених білків супроводжується зниженням активності протеасоми, обумовленою зниженням кількості протеасом (Petropoulos і співр., J.Gerontol A Biol Sci 2000; 55А: В220-7). Два недавніх дослідження, одне стосувалося постмітотичного старіння скелетно-м'язових кліток пацюків, а інше відносилося до фібробластів людини, де досліджувалася експресія 6000 генів з використанням мікро-чипів, показали зміну експресії менш 1% генів у процесі клітинного старіння, серед яких знаходилися гени протеосомальної системи, експресія яких була зменшена (Lee і співр., Science 1999; 285:1390-3 і Ly і співр., Science 2000; 287:2486-92). 5 Було також констатовано зменшення експресії транскриптів для 3 аналізованих субодиниць протеасоми (X, N3 і С2) у клітках літніх донорів, у той час як чотириста культивованих кліток зберігало рівень експресії й активність протеасоми, близький до рівня молодих донорів (Chondrogrianni і співр., Exp Gerontol 2000; 35:721-8). Сукупність цих результатів ясно свідчить про те, що з віком відбувається зниження активності протеасоми. У механізмі старіння бере участь також інша категорія «модифікованих» білків. Мова йде про білки, названих «глікозилірованими». Глікозилірування являє собою пост-трансляційну модифікацію білків, ініційовану конденсацією відновлювальних цукрів із групами типу «аміно» за допомогою реакції Майарда. Одержувані продукти звичайно називають кінцевими продуктами глікозилірування (PTG). Два основних продукти глікозилірування, карбометиллізин (CML) і пентозидин, накопичуються в процесі старіння і цей процес стає більш інтенсивним при патологіях, таких, наприклад, як діабет. Відома токсичність глікозиліруваних продуктів. Можна назвати як приклад їх руйнуючі ефекти, такі як, порушення ферментативної активності, зшивка білків з утворенням агрегатів, ушкодження поверхні поділу ендотелій-базальна мембрана, зниження здатності до протеолізу, дефект впізнавання молекулярних сигналів і ендоцитозу і модифікація імуногенності. Глікозилірування білків допомагає їх окислюваності і при цьому глікозилірувані білки можуть взаємодіяти з киснем з утворенням окислених вільних радикалів, шкідлива дія яких була зазначена вище. Названі глікозиліровані білки не можна ні зруйнувати, ні виділити їх із клітки, у якій вони накопичені, при цьому вони виявляють стійкість до розкладання протеасомою. Наслідок глікозилірування білків позначається на всьому організмі і грають, зокрема, значну роль у ґенезі деяких захворювань, оскільки провокують клітинне ушкодження, ушкодження тканин і прискорюють їхнє старіння. Отже, існує необхідність у появі активних початків, здатних усунути глікозилірування білків і їхнє накопичення в клітинній системі. У цілому, найбільш серйозний інтерес викликає можливість одержання препаратів для топічного нанесення, які могли б затримувати старіння шкіри, зокрема, завдяки протеасомній активності і зниженню числа глікозиліруваних білків. Заявка на патент FR 2 822 702 описує використання екстракту водоростей Phaeodactylum (мікроводорості) як косметичного агента, що сприяє активності протеасом, для одержання косметичної композиції, призначеної для захисту шкіри від несприятливих ефектів при УФ-опромінюванні або для попередження і/або уповільнення старіння шкіри. Заявка на патент EP 2 822 702 A1 описує косметичну композицію, що перешкоджає утворенню вільних радикалів і має протизапальну дію, що включає водногліколевий екстракт водоростей 95283 6 Chlorella, Scenedesmus Spiruline (ARL) і екстракт зелених кавових зерен. З обліком вищевикладеного заявник розробив активний початок, що є синергетичною комбінацією сполук, що відповідає трьом цілям. Перша ціль відповідає необхідності підсилити активність протеасом для того, щоб сприяти видаленню білків, залежних від протеасоми. Друга ціль відповідає стимулюванню продукування тіоредоксину завдяки синергетичному ефекту. Нарешті, третя ціль відповідає необхідності значно знизити утворення глікозиліруваних білків і, отже, накопичення їх у клітках. Заявник несподівано відкрив новий активний косметичний початок, що складається з ферулату аргініну й екстракту мікроводоростей, які активують протеасому і продукування тіоредоксину й одночасно усуває глікозилірування білків. Нові косметичні препарати для топічного застосування, що включають зазначений активний початок, також складають частину винаходу і можуть бути використані для уповільнення шкірного старіння. Основним об'єктом даного винаходу є активний косметичний початок, що складається з ферулату аргініну й екстракту мікроводоростей. Під терміном «мікроводорості» розуміють мікроскопічні водорості, незалежно, одноклітинні або багатоклітинні, на відміну від «макроводоростей», у яких життєвий цикл включає роздільні стадії. Під терміном «екстракт мікроводоростей» розуміють будь-який клітинний екстракт, що походить з мікроводоростей і придатний для використання в складі косметичного активного початку відповідно до винаходу. Таким екстрактом може бути, наприклад, мембранний або ліпідний внутрішньоклітинний екстракт. Штам мікроводоростей культивують у класичному культуральному середовищі, що містить олігоелементи, такі як, наприклад, марганець, мідь, кремній, бор, сірка, гідролізовані білки, при значенні рН в інтервалі 7-8 і при температурі, сприятливої для культивування, що звичайно має 2530°C. Коли ріст протікає оптимально, тобто коли кількість кліток уже не збільшується в культуральному середовищі, виділяють культуральне середовище і центрифугують. При необхідності, культуральне середовище після центрифугування піддають окисному стресу шляхом додавання перекису водню в кількості 1-5 мол перекису (H2O2) на літр середовища, або озону, ґенеровуваного за допомогою генератора озону, що утворюється в результаті взаємодії повітря з УФ-променями. Отриману в такий спосіб біомасу знову центрифугують і осад рекуперують. Ферулат аргініну являє собою синтезовану молекулу, похідну аргініну. Спосіб його одержання докладно описаний у прикладі 1. Таким чином, заявником несподівано виявлено, що за допомогою такої комбінації сполук можна поліпшити активність протеасоми і сприяти видаленню білків, залежних від неї, і одночасно стимулювати за рахунок синергізму продукування тіоредоксину. Це поліпшення виявляється більш значним у порівнянні з використанням одного екс 7 тракту мікроводоростей. Крім того, активний косметичний початок відповідно до винаходу дозволяє істотно знизити утворення глікозиліруваних білків і, отже, їхнє накопичення в клітках. Більш того, зниження глікозиліруваних білків викликає також збільшення активності протеасоми, що приводить до помітно більш високого видалення ушкоджених білків. Заявник знайшов, що можна домогтися зниження на 50% утворення глікозиліруваних білків при обробці кліток за допомогою 0,005-0,02% ферулату аргініну. Ця кількість є достатньою, щоб інгібувати 50% утворення в клітках глікозиліруваних білків. Справді, ясно, що перевага активного початку полягає саме в асоціації екстракту водоростей і ферулату аргініну, який при контакті зі шкірою дисоціюється на аргінін і ферулову кислоту завдяки дії ферментативних систем шкіри. L-аргінін, основна амінокислота, здійснює регенеруючу дію на клітки шкіри, оскільки усуває глікозилірування білків, однак має недолік, що полягає в тому, що вона нестабільна при контакті, наприклад, з киснем повітря і розпадається на цитотоксичні продукти. Ферулова кислота сама є антиоксидантом, здатним абсорбувати Уфпромені. Таким чином, заявник показав, що комплекс ферулату аргініну (або комплекс ферулова кислота/аргінін) збільшує стабільність аргініну, що утворився, і поліпшує в цьому зв'язку активність самого аргініну. Отже, такий ферулат-аргініновий комплекс приводить до підвищеної біодоступності аргініну в тканинах, зокрема, при безпосередньому нанесенні на шкіру. Посилення активності протеасоми активним початком відповідно до винаходу в порівнянні з активністю, що досягається при використанні тільки екстракту мікроводоростей, виявляють по зниженню вмісту окислених негідролізованих білків, що присутні у клітках, таких як клітки шкіри людини або тварини, наприклад, типу кератиноцитів, фібробластів або меланоцитів. Це зниження знаходиться, як правило, в інтервалі від 10 до 25%. Крім того, присутність ферулату аргініну, асоційованого з екстрактом мікроводоростей, переважно, збагаченим фітоалексинами (див. нижче), приводить до підвищеного продукування тіоредоксину в клітках у порівнянні з використанням одного екстракту мікроводоростей. Так, наприклад, використання ферулату аргініну в зростаючих кількостях, що знаходяться в інтервалі від 0,005 до 0,1% мас. від продукту в якому він міститься, переважно, від 0,005 до 0,05%, зокрема, від 0,005 до 0,02%, причому екстракт мікроводоростей має 0,995-0,90%, переважно, 0,995%-0,95%», зокрема, 0,995-0,98%, показує, що можна досягти збільшення продукування тіоредоксину приблизно на 4-20%, переважно, 4-10%, зокрема, 4-8%, у порівнянні з одним екстрактом мікроводоростей, що міститься в тому же продукті при тих же зазначених вище масових кількостях. Це є безсумнівною перевагою винаходу. Під «продуктом, у якому він міститься» розуміють, наприклад, косметичну композицію, яка буде описана нижче. 95283 8 Відповідно до конкретного варіанта здійснення винаходу екстракт мікроводоростей активного початку відповідно до винаходу, збагачують, наприклад, фітоалексинами, поміщаючи мікроводорості в стресові умови, переважно, в умови окисного стресу, обробляючи H2O2 або озоном, як зазначено вище. Фітоолексини є сполуками, названими «захисними», які синтезуються рослинами, і, зокрема, мікроводоростями, коли вони знаходяться в стресових умовах, переважно, в умовах окисного стресу. Зазначені фітоолексини можуть мати різну природу: антибіотичну, ферментативну, фенольну. У даному випадку, мова йде про ферментативні системи, такі як, наприклад, ферредоксин-NADP+ оксидоредуктаза (FNR), супероксидисмутаза (SOD) і глутатіон-пероксидаза. Відповідно до кращого варіанта здійснення винаходу екстракт мікроводоростей активного початку відповідно до винаходу, походить з мікроводоростей класу Chlorophycees. Це зелені водорості, що ростуть в озерах і ставках, що містять велику кількість хлорофілу. Особливо переважно, використовувати мікроводорості, що відносяться до роду Scenedesmus, які є водоростями, що ростуть у прісній воді, і до роду tetracystis. В активному початку відповідно до винаходу масове відношення ферулат аргініну:екстракт мікроводоростей знаходиться, переважно, в інтервалі від 1:1 до 1:199, переважно, від 1:19 до 1:99, особливо переважно, від 1:30 до 1:50, і ще більш переважно, 1:19. Інший об'єкт винаходу відноситься до застосування in vitro або ex-vivo активного початку відповідно до винаходу для активації протеасом кліток, таких як клітки шкіри людини або тварини, наприклад, типу кератиноцитів, або фібробластів меланоцитів. Ця активація виражена в підвищеному розкладанні окислених білків у присутності активного початку відповідно до винаходу. Додатковий об'єкт винаходу відноситься до застосування in vitro або ex-vivo активного початку відповідно до винаходу для стимуляції продукування тіоредоксину. Інший об'єкт даного винаходу відноситься до застосування активного початку відповідно до винаходу для одержання косметичної композиції для топічного нанесення. Переважно, активний початок знаходиться в кількостях, що знаходяться в інтервалі від 0,1% до 2%, переважно, від 0,5% до 2%, зокрема, від 1% до 2% мас. від загальної маси косметичної композиції. Прикладами таких косметичних композицій для топічного застосування є або розчини дисперсії типу лосьйону, емульсії типу олія у воді (Н/Е) або вода в олії (Е/Н), креми і гелі. Вони можуть бути також спеціальними або композиціями лосьйонами для захисту обличчя, тіла і рук, денними кремами, кремами для захисту від сонячних променів, молочком для зняття макіяжу, кремом проти зморщок і композиціями для ванн. Крім активного початку відповідно до винаходу всі зазначені композиції містять переважно класичні активні компоненти і звичайні допоміжні речовини, використову 9 вані в косметичних композиціях, призначених для шкіри. Можна назвати токофероли лінолеат, пом'якшуючі агенти, отдушки, консерванти, барвники, емульгатори, текстуруючі агенти і, при необхідності, сонячні фільтри. Додатковий об'єкт даного винаходу відноситься до косметичної композиції для топічного застосування, що містить активний початок відповідно до винаходу у фізіологічно прийнятному середовищі, причому ця косметична композиція може відповідати, наприклад, крему, лосьйону, гелю і масці або іншим формам, зазначеним вище, і до застосування такої композиції для боротьби проти шкірного старіння. Прикладом косметичної композиції може служити композиція, що містить 1% активного косметичного початку відповідно до винаходу, 2% гліцерину, 0,80% Carbomer'y, 2,00% сорбітану стеарату, 2,00% полисорбату 60, 8,00% октилдодеканолу, 0,80% Trisamino® і інше має демінералізована вода. Процентні частки виражені в масі стосовно загальної маси композиції. Наступні приклади ілюструють винахід, не обмежуючи його обсягу. Приклад 1: Спосіб одержання ферулату аргініну Ферулат аргініну одержують змішуванням аргініну (HN=C(NH2)-NH-(CH2)3-CH(NH2)-COOH) з феруловою кислотою (= 3-метокси-4гідроксицинамінової кислоти). Ретельно змішують два порошки в порошковому змішувачі (Lödige) зі швидкістю 20 об/хв протягом 48 годин. Приклад 2: Клітинна культура Первинні культури кератиноцитів одержують з біопсійного матеріалу, узятого зі шкіри людини, з наступним ферментативним переварюванням мембран кліток для збереження внутрішньоклітинного середовища в культуральному середовищі KGM (повне культуральне середовище, без сироватки, у якій кінцева концентрація кальцію має 0,05 мМ), доповненому EGF ("Epidermal Growwth Factor"). Клітки були досліджені після різних пасажів (Р2, Р4, Р6 і Р8) і після опромінення УФВпроменями для оцінки впливу активного початку відповідно до винаходу на постарілі клітки. В обсязі даного винаходу термін «пасаж» має класичне значення, прийняте в області клітинних культур. Пасаж P1 означає час, необхідний для того, щоб 95283 10 клітки первинної культури досягли злиття. Після цього здійснюють повторне щеплення культурального середовища P1, яке культивують у середовищі, описаному вище, причому час, необхідний для досягнення злиття кліток має пасаж Р2, і так далі, що дозволяє скласти пасажі Р4, Р6 і Р8. Тести проводили з кератиноцитами донора у віці 15 років, що служив контрольною моделлю для оптимальної протеосомальної активності, і з кератиноцитами донора у віці 62 років, у якого протеосомальна система функціонує менш ефективно, чим у 15-літнього донора. Клітки 15-літнього донора піддалися опроміненню для того, щоб вимірити протеосомальну активність і порівняти ці клітки з клітками 62-літнього донора. Дійсно, відомо, що опромінення УФВ променями викликає руйнування в роботі протеосомальної системи. Ці кератиноцити культивували в середовищі KGM, доповненої EGF, описаної вище, у присутності активного початку, названого як «продукт В», що складається з: - 99,5% екстракту мікроводоростей роду Scenedesmus, що піддався окисному стресу обробкою H2O2 або озоном, як зазначено вище, і - 0,5% ферулату аргініну. Ці кератиноцити культивували також у присутності активного початку, що складався тільки з продукту А, який позначає чистий екстракт мікроводоростей роду Scenedesmus, що піддався окисному стресу, зазначеному вище. Такі ж опити здійснювали під час відсутності продукту А або В (зразок, названий «Контроль»). Були вирощені три культури кератиноцитів у середовищі KGM, доповненого EGF: • При нормальних фізіологічних умовах: культура кліток 15-літнього донора, • При фізіологічних умовах старіння кліток: культура кліток 62-літнього донора, • При умовах фотоіндукованого старіння: культивовані клітки 15-літнього донора, що піддалися 2 Уф-опромінюванню з розрахунку 100-150 мДж/см культурального середовища. Джерелом УФВопромінювання є УФ лампа (Biosun, Viber LourmatFrance), довжина хвилі випромінювача близько 315 нм. Приклад 3: Визначення життєздатності кліток Клітки, отримані в умовах приклада 2, вивчають за допомогою пасажів Р2, Р4, Р6 і Р8. Різні пасажі дозволяють констатувати старіння кліток донора, а також старіння, зв'язане з умовами культивування після різних пасажів кліток. Дійсно, після узяття кліток з епідерми різниця в життєздатності кліток спостерігається із самого початку культивування (зразок «контроль»). Ця різниця різкіше позначається після різних пасажів кліток. Наслідок старіння кліток вивчають шляхом визначення життєздатності кліток, що оцінюється за допомогою тесту на відновлення до блакитного формазану (ММТ). Сіль тетразолію (MTT) має здатність відновлюватися з утворенням блакитних кристалів формазану під дією мітохондріальної сукцинат-дегідрогенази кліток. Цей фермент, що відіграє важливу роль у циклі Кребса, каталізує дегідрогенування сукцинату з утворенням фумарату. 11 Активність цього ферменту, флавопротеїну, сильно зв'язаного з внутрішньою мембраною мітохондрію, виміряється по відновленню МТТ. Абсорбцію (або оптичну щільність) безпосередньо зв'язану з активністю сукцинат-дегідрогеназ, що сама зв'язана з життєздатністю кліток, вимірюють шляхом спектрофотометричного аналізу при 595 нм за допомогою класичного пристрою, такого як спектрофотометр, постачений інформаційною систе 95283 12 мою обробки даних. Чим вище величина абсорбції, тим вище життєздатність кліток. Дослідження проводять при трьох умовах культивування, описаних у прикладі 2. Такі ж опити повторюють з одним продуктом А, який являє собою чистий екстракт мікроводоростей роду Scenedesmus, оброблений в умовах окисного стресу, описаного вище. Результати, отримані в нормальних фізіологічних умовах (донор 15 років) Контроль (%V) 100 100 Життєстійкість під час відсутності продукту А (%) Життєстійкість у присутності 1% продукту А (%) Р2 (%V) 97 95 Р2 (%V) 95 95 Контроль (%V) Життєстійкість під час відсутності продукту В (%) Життєстійкість у присутності 1% продукту В (%) 100 100 Р4 (%V) 93 94 Р4 (%V) 91 94 Р6 (%V) 79 81 Р6 (%V) 79 83 Р8 (%V) 69 74 Р8 (%V) 63 75 Результати, отримані у фізіологічних умовах старіння (донор 62 року) Життєстійкість під час відсутності продукту А (%) Життєстійкість у присутності 1 % продукту А (%) Життєстійкість під час відсутності продукту В (%) Життєстійкість у присутності 1% продукту В (%) Контроль (%V) 100 100 Контроль (%V) 100 100 Р2 (%V) 84 87 Р4 (%V) 66 70 Р2 (%V) 88 93 Р6 (%V) 48 51 Р4 (%V) 69 77 Р6 (%V) 56 71 Результати, отримані в умовах фотоіндукованого старіння (донор 15 років + УФВ 100 мДж/см Контроль (%V) Життєстійкість під час відсутності продукту А (%) Життєстійкість у присутності 1% продукту А (%) Життєстійкість під час відсутності продукту В (%) Життєстійкість у присутності 1% ПРОДУКТУ В (%) %V: % життєздатності % продукту А и В: зміст продукту А або В на 100 м культурального середовища Результати показують, що в процесі різних пасажів життєздатність кліток зменшується, і це явище відбувається швидше в донора 62-х років, чим у донора 15-ти років. Крім того, зниження життєздатності кліток внаслідок опромінення УФВ променями кліток, отриманих від донора 15-ти років, порівняно з фізіологічним зниженням життєздатності в донора 62-х років. Життєздатність кліток, оброблених продуктом В, значно вище життєздатності кліток, оброблених продуктом А, і це спостерігається незалежно від умов старіння: - ні від клітинного старіння, що відбуває в процесі культивування (донор 15 років), - ні від клітинного старіння, що залежить від 100 100 Контроль (%V) 100 100 Р2 (%V) 86 93 Р4 (%V) 78 81 Р8 (%V) 41 47 Р2 (%V) 74 81 2 Р8 (%V) 51 61 КУЛЬТУРИ) Р4 (%V) 62 68 Р6 (%V) 59 66 Р6 (%V) 48 57 Р8 (%V) 33 45 Р8 (%V) 48 54 початкового стану кліток і триваючого в процесі культивування (донор 62 року), - ні від клітинного фотоіндукованого старіння. Приклад 4: Очищення трьох субодиниць протеосоми, відповідно 20S, 26S i PA28 У даному прикладі протеосоми 20S, 26S і РА28 позначають субодиниці. Екстракти кліток, які культивували в середовищі, описаному вище відповідно до приклада 2, при двох фізіологічних умовах, що відповідають фізіологічно нормальним кліткам (донор 15-ти років) і кліткам природно постарілим (донор 62 року), центрифугують при 10000 х g протягом 16 годин при 4 °C. Осад розчиняють у буфері Tris-HCl (25 мМ, рН 7,5), потім переносять на колонку CNBr Sepharose (до якої щеплене моноклональне антитіло, спрямоване проти субодиниці протеасоми людини, що очищається), попередньо урівноважену буфером Tris-нСІ (25 мМ, рН 7,5). Колонку потім 13 95283 промивають тим же буфером, потім субодиницю протеасоми елюють(элюируют) Tris-HCl, що містить 2М NaCl (рН 8) і діалізують протягом 16 годин при 4 °C (або переносять на колонку фільтрування на гелі (PD10 Sephadex)). Зразок субодиниці очищеної протеасоми змішують з денатуруючим буфером (SDS 0,1%), потім інкубують при 100 °C протягом 5 хвилин. Білки, що містяться в елюаті, відокремлюють за допомогою електрофорезу на 12%-ому акриламідному гелі (SDS-PAGE). Міграція здійснюється при кімнатній температурі і при постійній напрузі 80 В протягом 30 хвилин, потім при 120 В протягом 2 годин. Приклад 5: Вимір активності протеасоми шляхом виміру активності трьох субодиниць протеасоми (20S, 26S і РА28) при трьох умовах культивування відповідно до приклада 2. Пептидазні активності протеасоми вимірюють шляхом використання субстрату, утвореного синтетичними пептидами, у яких N-кінці були блоковані, а С-кінці з'єднані ізопептидними зв'язками з флуоресціюючим радикалом: 7-амідо-4метилкумарином (МСА). Ці радикали не є флуоре 14 сціюючими, коли вони з'єднані з пептидами, але стають флуоресціюючими у вільному стані після протеолітичного розщеплення. Суміш, що містить або 50 мкг сирого гомогенату загальних білків, що представляють собою осад приклада 4, або 3 мкг очищеної протеасоми (у Tris-HCl 25 мм, рН 7,5), інкубують при 37 °C з пептидним субстратом у кінцевому об'ємі 200 мкл протягом 30 хвилин. Реакцію зупиняють додаванням 300 мкл кислоти, наприклад, хлористоводневої кислоти, або етанолу. Після додавання 2 мл дистильованої води флуоресценцію вимірюють за допомогою пристрою для зчитування мікро-планшет, що складається в продажі, що працює з довжинами хвиль збудження і передачі 350/440 нм для МСА. Активність протеасоми визначають як різницю між загальною активністю, тобто активністю, обмірюваної на початку досліду, перед додаванням субстрату, і активністю сирого екстракту, що залишилася, тобто після взаємодії субстрату і після очищення. Активність виражена в нг протеасоми/хв/мг загальних білків, що присутні у клітинному екстракті. Результати, отримані в нормальних фізіологічних умовах (донор 15 років, пасаж Р2) Субстрат Субстрат+ 0,1% продукту В Субстрат + 0,5% продукту В Субстрат + 1% продукту В Протеасома 20S (нмоль/хв/мг) 10,5±0,5 9,1±0,4 12,0±1,8 11,8±1,2 Протеасома 26S (нмоль/хв/мг) 74,2±2,5 75,8±5,1 83,2±7,8 87,2±10,2 Комплекс протеасоми РА28 (нмоль/хв/мг) 345,0±25,2 361,2±21,7 362,5±10,2 370,5±24,3 Результати, отримані у фізіологічних умовах старіння (донор 62 Субстрат Субстрат + 0,1% продукту В Субстрат + 0,5% продукту В Субстрат + 1% продукту В Протеасома 20S (нмоль/хв/мг) 7,3±0,7 8,4±0,3 9,6±1,4 12,0±1,1 Протеасома 26S (нмоль/хв/мг) 52,7±4,0 63,0±4,2 69,4±5,6 76,2±2,3 РОКУ) Комплекс протеасоми РА28 (нмоль/хв/мг) 180,2±18,1 198,0±10,5 228,6±13,2 264,2±18,4 2 Результати, отримані в умовах фотоіндукованого старіння (донор 15 років, УФВ 100 мДж/см ) Субстрат Субстрат + 0,1% продукту В Субстрат + 0,5% продукту В Субстрат + 1% продукту В Протеасома 20S (нмоль/хв/мг) 6,2±0,4 8,5±1,1 11,4±1,7 12,1±1,4 Результати показують більш високу активність трьох субодиниць протеасоми при нормальних фізіологічних умовах у порівнянні з умовами фізіологічного і фотоіндукованого старіння. Обробка кліток продуктом В приводить до відновлення активності трьох субодиниць протеасоми в умовах старіння. Відновлена активність досягає в цілому рівня активності, що була обмірювана в умовах відсутності фізіологічного старіння. Результати приведені, зокрема, на Фігурах 2, 3 і 4, що позначають: Фігура 2: результати донора у віці 15 років Протеасома 26S (нмоль/хв/мг) 54,7±7,2 63,7±2,4 70,2±3,5 81,2±8,2 Комплекс протеасоми РА28 (нмоль/хв/мг) 195,7±21,2 227,1±17,4 244,3±13,6 269,3±11,8 Фігура 3: результати донора у віці 62 років Фігура 4: результати донора у віці 15 років + умови фотоіндукованого старіння (УФВ). Три зазначені вище фігури ілюструють значення флуоресценції зразка, отримані в залежності від зібраних фракцій очищення. Приклад 6: Вимір активності протеасоми кількісним аналізом для виявлення кількості окислених негідролізованих білків при трьох умовах культивування відповідно до приклада 2 Виявлення окислених білків здійснюють з використанням набору Oxyblot® (Oxydised Protection Detection Kit, Chemicon International). Цитозольні 15 95283 екстракти кератиноцитів, тобто внутрішньоклітинні екстракти, отримані після ферментативного переварювання, і описані в прикладі 2, у присутності продукту В обробляють 15 хвилин за допомогою 2,4-динітрофенілгідразину, потім розділяють за допомогою електрофорезу на 12%-ому акриламідному гелі (SDS-PAGE) з розрахунку 10 мкг нанесених білків на лунку. Гелі потім переносять на нітроцелюлозну мембрану (Nitrocellulose Hybond). Отримані гідразони імунодетектують за допомогою поліклональних антитіл кролика, спрямованих проти радикала 2,4-динітрофенілу (Sigma, Ref. D 16 9656). Для виявлення убіквітинірованих або модифікованих білків за допомогою аддукта 4гідрокси-2-ноненаля, 20 мкг білків наносять на 12%-ий поліакриламідний гель і виявляють відповідні Вестерн-блоти з використанням поліклональних антитіл, спрямованих проти убіквітину. Виявлення комплексів антиген-антитіло здійснюють із вторинними антитілами кролика, спареними з пероксидазою. Такі ж опити проводили з продуктом А, описаним вище. Результати, отримані в нормальних фізіологічних умовах (донор 15 років) Кількість (одиниця/мм ) Кількість у присутності 1% продук2 ту А (одиниця/мм ) 22±1,1 15±2,0 26±1,4 37±2,8 51±4,1 64±4,0 21±1,4 29±3,2 41±4,2 55±6,0 2 Контроль (P1) Р2 Р4 Р6 Р8 2 Кількість (одиниця/мм ) Контроль (P1) Р2 Р4 Р6 Р8 18±2,0 21±1,5 31±4,2 45±3,4 57±4,0 Кількість у присутності 1% продук2 ту В (одиниця/мм ) 12±0,6 17±1,2 27±1,7 36±2,4 45±3,2 Результати, отримані в умовах фізіологічного старіння (донор 62 року) Кількість (одиниця/мм ) Кількість у присутності 1% продук2 ту А (одиниця/мм ) 100±7,6 90±10,2 131±15,2 183±13,7 251±21,1 375±12,3 113±7,8 151±10,0 205±13,7 321±15,2 Контроль (P1) Р2 Р4 Р6 Р8 2 Кількість (одиниця/мм ) Контроль (P1) Р2 Р4 Р6 Р8 2 90±10,7 123±11,2 170±9,7 233±14,6 349±21,2 Кількість у присутності 1% продук2 ту В (одиниця/мм ) 79±4,2 95±10,2 134±8,4 187±11,1 285±13,2 2 мм : мм культурального середовища Результати показують, що продукт В приводить до чітко вираженого зменшення кількості окислених білків, як у донора 15-ти років, так і в донора 62 років. Ефект яскравіше виражений у випадку, коли опити проводили з продуктом В. Зниження кількості зазначених білків оцінюється приблизно в 12%-15% стосовно випадку, коли використовують тільки один продукт А. Приклад 7: Вимір активності тіоредоксинреду ктази (Тrх) Активність TrxR у клітинних екстрактах кліток, культивованих відповідно до приклада 2, оброблених або не оброблених (Контроль) продуктом В, визначають шляхом виміру концентрації Тrх Біурет-методом (Biuret) після реакції з тіоредоксином (Тrх) і порівнянням з відомою активністю очищеної Тrх. Об'єм, що відповідає 50 мкг білків кожного клі 17 95283 тинного екстракту, інкубують у суміші 80 мМ HEPES, рН 7,5, 0,9 мг/мл NADPH, 6 мМ EDTA, 2 мг/мл інсуліну і 10 мкМ Тrх Е.соlі при 37 °C протягом 20 хвилин у кінцевому об'ємі 120 мкл. Реакцію зупиняють додаванням 500 мкл DTNB (дитіо-биснітробензойна кислота) (0,4 мг/мол) у суміші 6М хлоргідрату гуанідину/Tris-Cl 0,2 M (рН 8,0). Контрольний зразок, що містить ті ж інгредієнти, крім Тrх, інкубують і обробляють таким же способом, як і кожен зразок. Вимірюють поглинання при 412 нм і значення 18 контролю віднімають з відповідного значення абсорбції зразка. Вичерчують стандартну криву з використанням очищеної Тrх, узятої з тимуса теляти, з визначеною специфічною активністю. Значення абсорбції зразків порівнюють зі стандартною кривою й обчислюють активність. Такі ж опити роблять із продуктом А. Активності виражають у нг Тrх/мг загальних білків, що знаходяться в клітинному екстракті. Результати, отримані в нормальних фізіологічних умовах (донор 15 років) Контроль 0,5% продукту А 1% продукту А 2% продукту А Активність (нг Тrх/мг загальних білків) 208,2±5,8 218,3±8,2 228,0±10,1 235,4±9,2 Контроль 0,5% продукту В 1% продукту В 2% продукту В Активність (нг Тrх/мг загальних білків) 208,2±5,8 220,2±8,3 238,0±10,1 251,0±9,8 % +5 +10 +13 % +5 +10 +21 Результати, отримані в нормальних Фізіологічних умовах (донор 15-ти років) у присутності акролеїну інгібітору тіоредоксинредуктази Контроль Акролеїн (25 мкМ) Акролеїн (25мкМ) + 0,5% продукту В Акролеїн (25мкМ) + 1% продукту В Акролеїн (25мкМ) + 2% продукту В Активність (нг Тrх/мг загальних білків) 208,2±5,8 130,8±11,4 139,0±12,5 149,2±10,1 160,4±13,8 Контроль Акролеїн (25 мкМ) Акролеїн (25мкМ) + 0,5% продукту А Акролеїн (25мкМ) + 1% продукту А Акролеїн (25мкМ) + 2% продукту А Активність (нг Trx/мг загальних білків) 208,2±5,8 130,8±11,4 141,0±15,2 145,6±10,0 155,8±13,8 % -37 +6 +14 +23 % -37 +8 +11 +19 Акролеїн (25 мкМ) : концентрація акролеїну в культуральному середовищі. Результати, отримані в умовах Фізіологічного старіння (донор 62 року) Контроль 0,5% продукту А 1% продукту А 2% продукту А Активність (нг Тrх/мг загальних білків) 132,0±8,1 144,8±10,1 160,6±11,0 170,3±13,8 Контроль 0,5% продукту В 1% продукту В 2% продукту В Активність (нг Trx/мг загальних білків) 132,0±8,1 148,8±10,2 159,4±9,3 176,6±11,0 % +9 +21 +28 % +13 +21 +34 19 95283 Виявилося, що присутність продукту В у клітинних екстрактах, описаних вище, збільшує активність тіоредоксинредуктази (Тrх) у порівнянні з контролем, який його не містить. Крім того, активність Trx збільшується пропорційно кількості 20 продукту В, що вводиться. Ця активність у присутності продукту В стає більш високою в порівнянні з тим, коли клітинні екстракти оброблені тільки одним продуктом А. 2 Результати, отримані в умовах Фотоіндукованого старіння (донор 15 років. УФВ 100 мДж/см культури) Контроль УФВ УФВ + 0,5% продукту А УФВ + 1% продукту А УФВ + 2% продукту А Активність (нг Trx/мг загальних білків) 208,2±5,8 246,3±22,3 241,0±12,0 259,0±16,2 270,4±13,7 Контроль УФВ УФВ + 0,5% продукту В УФВ + 1% продукту В УФВ + 2% продукту В Активність (нг Trx/мг загальних білків) 208,2±5,8 246,3±22,3 251,8±11,2 267,2±9,7 278,5±11,4 Усі висновки, викладені вище, використані для даних результатів. Приклад 8: Вимір вмісту тіоредоксину Зміст тіоредоксину в клітинних екстрактах кліток, культивованих відповідно до приклада 2, оброблених або не оброблених (Контроль) продуктом В або тільки продуктом А, визначають за допомогою тесту ELISA. 96-лункові планшети інкубують з 100 мкл на лунку моноклонального антитіла проти Trx, клон 2G11 (5мкг/мл; BD Pharmingen), у карбонатному буфері, рН 9,6, протягом 16 годин при 4 °C Планшети промивають PBS, що містить 0,05% Tween 20 (PBS-T), і блокують додаванням 200 мкл PBS, що містить 3% BSA (PBS-BSA) протягом 1 години. Лунки промивають 4 рази PBS-T і інкубують з 100 мкл зразка або стандартного Trx, розведених серіями в PBS-TB, що містить 1 ММ DTT (Dithiothreitol) протягом 2 годин при 4 °C. Планшети покривають алюмінієвою фольгою. % +18 +16 +24 +30 % +18 +21 +28 +34 Лунки промивають 4 рази PBS-T і потім інкубують з 100 мкл комплексу козячого біотинілірованого імуноглобуліну G (Ig)-анти Trx людини (ІМСО Co), 75 мг/мл, протягом 1 години при кімнатній температурі на підставі, що струшується. Лунки потім промивають 4 рази PBS-T і інкубують з 100 мкл стрептавидину, коньюгованого з лужною фасфатазою (АХ02-0402Х; 1:4000) (Amersham Biosciences), у PBS-BSA-T (0,1% BSA, 0,05% Tween 20) на підставі, що струшується. Планшети промивають 4 рази в PBS-T і інкубують з n-нітрофенілфосфатом (Sigma Chem Co) у диетаноламіні, рН 9,0, що містить MgCl2 0,5 мМ і 0,02% NaN3 протягом 40 хвилин. Абсорбцію вимірюють при 405 нм. Рекомбінантний Trx людини (ІМСО Co) використовували як стандарт в інтервалі 100-0,41 нг/мл. Зміст виражали в нг Trx/мг загальних білків, що присутні у клітинному екстракті. Результати, отримані в нормальних Фізіологічних умовах (донор 15 років) Контроль 0,5% продукту А 1% продукту А 2% продукту А Зміст (нг Trx/мг загальних білків) 87,6±7,6 90,0±4,2 94,0±4,7 98,8±10,2 Контроль 0,5% продукту В 1% продукту В 2% продукту В Зміст (нг Trx/мг загальних білків) 87,6±7,6 88,4±2,7 95,7±7,6 99,8±5,3 % +3 +7 +13 % +1 +9 +14 21 95283 22 Результати, отримані в нормальних фізіологічних умовах (донор 15 років) у присутності N-ацетилцистеїна (NAC) - інгібітору і тіоредоксину Контроль NAC (10 ММ) NAC (10 ММ) + 0,5% продукту А NAC (10 ММ) + 1% продукту А NAC (10 ММ) + 2% продукту А Зміст (нг Trx/мг загальних білків) 87,6±7,6 59,8±8,1 60,2±2,8 61,4±3,3 63,1±6,0 Контроль NAC (10 ММ) NAC (10 ММ) + 0,5% продукту В NAC (10 мМ) + 1% продукту В NAC (10 ММ) + 2% продукту В Зміст (нг Trx/мг загальних білків) 87,6±7,6 59,8±8,1 60,4±5,4 61,0±3,1 65,4±9,2 % -32 +1 +3 +6 % -32 +1 +2 +9 Результати, отримані в умовах фізіологічного старіння (донор 62 року) Контроль 0,5% продукту А 1% продукту А 2% продукту А Зміст (нг Trx/мг загальних білків) 61,6±4,2 65,9±6,0 68,9±2,6 74,5±4,2 Контроль 0,5% продукту В 1% продукту В 2% продукту В Зміст (нг Trx/мг загальних білків) 61,6±4,2 66,9±5,8 70,4±8,3 77,3±10,0 Результати, отримані в умовах Фотоіндукованого старіння (донор 15 РОКІВ. УФВ 100 мДж/см Контроль УФВ УФВ + 0,5% продукту А УФВ + 1% продукту А УФВ + 2% продукту А Зміст (нг Trx/мг загальних білків) 87,6±7,6 93,4±9,4 95,8±9,0 100,7±12,4 109,1±13,3 Контроль УФВ УФВ + 0,5% продукту В УФВ + 1% продукту В УФВ + 2% продукту В Зміст (нг Trx/мг загальних білків) 87,6±7,6 93,4±9,4 94,8±7,7 106,5±10,0 114,1±13,0 У присутності продукту В спостерігається більш значне збільшення вмісту тіоредоксину, чим у присутності одного продукту А. Приклад 9: Вимір ферментативної активності фітоалексинів, продукованих клітками, культивованими в умовах стресу згідно приклада 2. Активність ферредоксина-NADP+ оксидоредуктази (FNR) визначали колориметричним методом, заснованим на відновленні цитохрому с. Відновлення цитохрому с, обмірюване на спектрофотометрі з довжиною хвиль 550 нм, прямо пропорційно активності ферменту. Одиниця FNR відновлює 1 мілімоль цитохрому с у хвилину при рН 7,5 при 25 °C у присутності % +7 +12 +21 % +9 +14 +25 2 КУЛЬТУРИ) % +7 +9 +15 +25 % +7 +8 +22 +30 фередоксину і NADPH. Активність супероксиддисмутази (SOD) оцінюється по її здатності інгібувати потік супероксидних аніонів, генерованих системою ксантинксантиноксидази. Супероксидні радикали, продуковані цією системою, відновлюють нітроблакитною тетразолією (NBT) до стабільного формазану блакитного при 560 нм. Одиниця ферменту SOD відповідає кількості рослинного екстракту, здатного ініціювати інгібування відновлення NBT на 50%. Глутатіонредуктаза регенерує відновлений глутатінон до форми глутатіону, яка стає доступною для клітки. 23 95283 24 Результати: Фітоалексин SOD CuZn SOD глутатіонредуктаза FNR Активність в одиницях/мл продукту, біля: 20 3,5 0,5 2,5 25 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 95283 Підписне 26 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601