Засіб із властивістю формування клітинного імунітету проти mycobacterium tuberculosis h37 rv, спосіб його отримання (варіанти), рекомбінантний штам і засіб для діагностики туберкульозу

1. Рекомбінантний штам 2-9XL Acinetobacter johnsonii VKPM-9312 - продуцент видоспецифічного глікопротеїнового туберкульозного комплексу M. tuberculosis Н37 Rv (ТБ-антигену), депонований у ВКПМ ФГУП ДержНДІгенетика. 2. Спосіб отримання видоспецифічного глікопротеїнового туберкульозного комплексу Mycobacterium tuberculosis H37 Rv (ТБ-антигену), який відрізня 2 (19) 1 3 96488 4 9XL, нейтралізують 0,5 N розчином ТХО до pH 6,0, графії, елюати містять очищений ТБ-антиген з додають сульфат амонію до 30 % насичення, вимолекулярною масою від 55,0 до 75,0 кДа й наявтримують при +4 °С, центрифугують, до надосадоністю вуглеводів від 20 % до 50 %. вої рідини додають сульфат амонію до 100 % на4. Засіб для формування В- і Т-клітинного імунітесичення, витримують при +4 °С, при цьому з ту проти Mycobacterium tuberculosis H37 Rv, що порцією осаду, повторно обробленого розчином містить видоспецифічний глікопротеїновий туберNaOH, проводять нейтралізацію за допомогою кульозний комплекс (ТБ-антиген) Mycobacterium ТХО й осадження сульфатом амонію у вищевказаtuberculosis H37 Rv, що продукується штамом 2ній послідовності, два осади, отримані після 100 9XL Acinetobacter johnsonii, охарактеризованим в насичення сульфатом амонію, розчиняють в PBSп. 1. буфері pH 7,0, діалізують проти великого обсягу 5. Засіб для діагностики туберкульозу, що містить PBS-буфера, сконцентровані розчини, що містять видоспецифічний глікопротеїновий туберкульозТБ-антиген, поєднують і піддають очищенню шляний комплекс (ТБ-антигену) Mycobacterium хом фракціонування гель-фільтрацією на Сефадеtuberculosis H37 Rv, отриманий способом за п. 2. ксі G-200 або за допомогою іонообмінної хромато Винахід стосується галузі біофармакології, препаративної біохімії, медицини й створення засобу на основі туберкульозного комплексу, що продукується мікроорганізмом, і може знайти застосування в лікуванні й діагностиці туберкульозу. Важливою ланкою в рішенні проблеми туберкульозу є створення біологічних вакцин і розробка методів швидкої й некоштовної діагностики. Очевидно, що необхідно ідентифікувати в збуднику туберкульозу такі білки й формовані ними комплекси, які відповідали б найсучаснішим вимогам для досягнення цих цілей. У біологічних вакцин основним критерієм є безпека для людини, поряд з високою ефективністю, у діагностичних препаратів чутливість і специфічність. Головними напрямками рішення поставленої задачі є: а) клонування генів мікобактерій у безпечному реципієнті й вивчення властивостей синтезованих туберкульозних білків, б) виділення з мікобактерій білків й їхніх комплексів з наступною характеристикою властивостей. У літературі описана можливість створення геномної бібліотеки М. tuberculosis H37 Ra і передачі фрагментів хромосомної ДНК збудника туберкульозу в реципіентні бактерії Е. соlі XLl-Blue. Показано, що з певного фрагмента хромосомної ДНК Μ. tuberculosis H37 Ra, що складається з 1535 пар основ і перебуває в складі плазмідного вектора pZx7, є можливим синтез туберкульозного білка із приблизною масою 52,0 кДа. Цей білок локалізується на зовнішній мембрані Е. coli XL 1-Blue, наділяє рекомбінантний штам можливістю проникати усередину еукаріотних клітин HeLa і розмножуватися в них, що характерно для патогенних мікобактерій. Однак, авторами не вказується, що даний білок є індивідуальним (видоспецифічним) і може бути використаний для діагностики збудника туберкульозу. Навпаки, амінокислотна послідовність вивченого білка має гомологію як з патогенними мікроорганізмами (Listeria monocytosis, Shigella, Jersinia pseudotuberculosis), так і з рядом білків людини, наприклад, ?-адаптином (1). З фільтратів культури М. Tuberculosis був виділений й охарактеризований білок МРТ63, що секретується і має молекулярну масу 18,0 кДа. Аналіз нуклеотидної послідовності тр+63 гена показав, що він має відкриту рамку зчитування, що кодує білок з 159 амінокислот і складає 29 амінокислот сигнального пептиду й 130 амінокислот зрілого МРТ63 білка. Рекомбінантний МРТ63 білок із клітин Е. соlі й очищений з культуральних фільтратів М. tuberculosis були нерозрізнені в серологічних реакціях і впливали на гуморальний імунітет морських свинок, інфікованих вірулентним штамом М. tuberculosis. Передбачалося використати цей білок як специфічний реагент для діагностики шкірного тестування при захворюванні туберкульозом, однак дотепер цей білок і комплекс білка із сигнальним пептидом не знайшли широкого застосування (2). Відомо також опис і характеристику 4 головних позаклітинних білків М. tuberculosis, що секретуються, виділених з непатогенних швидко зростаючих мікобактерій, які мають ферментативну активність і присутні також у патогенних штамах. Ці білки передбачається використати для конструювання біологічних вакцин, тому що вони індукують захисний імунітет, однак дотепер вони не одержали визнання (3). Таким чином, до теперішнього часу не створено генно- інженерний мікроорганізм, що міг би синтезувати туберкульозні видоспецифічні білки або їхні комплекси, придатні для використання в діагностичних цілях або бути основою для створення біологічної вакцини. Білки, виділювані з патогенного штаму М. tuberculosis або не патогенних мікобактерій, також дотепер не дозволяють створити на їхній основі високоспецифічні й чутливі діагностичні препарати або сконструювати біологічні вакцини. Задача винаходу полягає в одержанні генноінженерним і мікробіологічним способом рекомбінантного штаму 2-9XL Acinetobacter johnsonii продуцента специфічного туберкульозного комплексу М. tuberculosis H37 Rv, що може бути основою біологічної вакцини проти збудника туберкульозу з можливістю діагностування для виявлення хворих туберкульозом людей із самими різними формами захворювання й у різних стадіях хвороби. Для рішення поставленої задачі запропоновано рекомбінантний штам 2-9XL Acinetobacter johnsonii, отриманий генно- інженерним способом з наступною селекцією мікробіологічним способом, що є продуцентом видоспецифічного глікопротеїнового туберкульозного комплексу (Тб-антигену), який локалізовано на зовнішній мембрані й у капсульній речовині бактерії й при виділенні може 5 96488 6 бути використаний як основа для одержання біоаналізу 16S РНК отримане у ВКПМ ФГУП ГосНДІлогічної вакцини, діагностичних і лікарських засоГенетика. бів. Технічний результат - одержання високоспеАналіз послідовностей 16S рРНК показав, що цифічних і чутливих препаратів. Для рішення досліджуваний штам, заявлений як «9ха» (2-9XL), поставленої задачі запропонована група винахоналежить до виду бактерій Acinetobacter johnsonii, дів, об'єднаних загальним винахідницьким задупричому зі штамом Acinetobacter johnsonii strain 42 мом. гомологія становить 99% . Заявлено винахід, що представляє собою заОсновні властивості штаму 2-9XL сіб із властивістю формувати клітинний імунітет Acinetobacter johnsonii - суперпродуцента рекомбіпроти М. tuberculosis H37 Rv. Засіб містить видоснантного туберкульозного антигену. пецифічний глікопротеїновий туберкульозний комКультурально-морфологічні властивості: При плекс M.tuberculosis H37 Rv (Тб-антиген). світловій мікроскопії (Фігури 1, 2 креслень. СвітлоКрім того, заявлені варіанти способів отрива мікроскопія, бактерій 2-9XL Acinetobacter мання видоспецифічного глікопротеїнового туберjohnsonii. Фарбування по Граму (Набір барвників кульозного комплексу M.tuberculosis H37 Rv (Тбфірми "Serva"). Культура 2-9XL Acinetobacter антиген), а також рекомбінантний штам 2-9XL johnsonii вирощена на туляремийному середовищу Acinetobacter johnsonii VKPM-9312 - продуцент (FT-arap з 1% глюкозою й добавками, рН 6,6) провидоспецифічного глікопротеїнового туберкульозтягом трьох діб при +32°С. А-Ув. 100X3...; Вного комплексу M.tuberculosis Η 37 Rv (Тб100Х9.3Х... (Мікроскоп «Биомед-2», Росія). На антигену) і засіб для діагностики туберкульозу, що представлених малюнках добре видно, що рекоммістить вищевказаний видоспецифічний глікопробінантніе бактерії 2-9XL стійкі до знебарвлення й теїновий туберкульозний комплекс. схильні до агрегації (склеюванню). 2-9XL Acinetobacter johnsonii є генноКапсула бактерій фарбується сафраніном у інженерним штамом, отриманим шляхом передачі червоні кольори) бактерії являють собою нерухомі в бактерії R-форми F. tularensis у складі векторної поліморфні дрібні коковидніе й паличковидні кліплазміди pRT двох фрагментів хромосомної ДНК тини розмірами 0,4-1,0 мкм. При фарбуванні по Μ. tuberculosis H37 Rv і наступної селекції мікробіГраму бактерії стійкі до знебарвлення, що робить ологічним способом. Дотепер при клонуванні генів враження грампозитивного фарбування. Утворюзбудника туберкульозу (ТБ) у складі векторних ють різноманітні по розмірах і формі скупчення плазмід використали бактерії-хазяїв, які могли клітин, що вказує на їхній високий ступінь агрегації синтезувати тільки одиничні білки ТБ. Виділення й (склеювання). Агрегація бактерій пов'язана з утвовивчення генно-інженерних білків ТБ (як і природренням специфічної капсули, що добре профарбоних білків збудника туберкульозу) не привели до вується сафраніном. При втраті рекомбінантного бажаного результату - створення біологічних вактуберкульозного антигену бактерії стають істинно цин, лікарських препаратів, високо специфічних і грамнегативні. Штам 2-9XL аероб росте на просчутливих діагностикумів. Тому у світі тривають тому й багатому середовищах (ауксотроф) при пошуки нових білків мікобактерій, за допомогою +32°С, однак може рости в інтервалі від +28°С до яких можливе рішення поставлених задач. Імовір+37°С. При рості бактерій на простих середовищах но, даний напрямок може бути помилковим, тому культура припиняє синтез рекомбінантного туберщо видоспецифічність збудника туберкульозу фокульозного антигену. Необхідним фактором росту рмується на рівні комплексу з декількох білків (не 2-9XL є цистеїн. Для максимального синтезу спеменш трьох), частина з яких повинна бути глікозицифічної капсули, що містить рекомбінантний тульована, тобто містити полісахаридну частину. беркульозний антиген, переважними є збагачені Показано, що при передачі фрагментів ДНК Μ. середовища з вітамінними й іншими добавками. tuberculosis H37 Rv у складі векторної плазмідьі Як стимулятор росту бактерій і формування pRT у реципієнт R-форму F. tularensis і наступної специфічної капсули можливе додавання в живиселекції трансформанта певним мікробіологічним льне середовище 1% суспензії автоклавірованих способом перенесені фрагменти (фрагмент) вбубактерій 2-9XL й (або) 10% автоклавірованої капдовуються в хромосомну ДНК бактерію-реципієнта сульної речовини. Найбільш зручними для вирой викликають синтез туберкульозного поліпептиду. щування рекомбінантного штаму 2-9XL є живильні Спочатку цей поліпептид формує в бактерії-хазяїні середовища, використовувані для вирощування специфічний рекомбінантний туляремийнотуляремії, чуми, бруцельозу й так далі. Посів культуберкулезний комплекс, зв'язуючись із туляретури на живильні середовища витримують в термийними білками, що мають більш високу молекумостаті від двох до семи діб. При рості бактерій 2лярну масу. Однак, дана конструкція, імовірно, для 9XL з'являється характерний специфічний не драбактерії-хазяїна незручна й при подальшій селекції тівний запах. Штам 2-9XL погано росте на рідких рекомбінантного штаму починається синтез Тбживильних середовищах і швидко втрачає здатбілків більш високої молекулярної маси, які заміність продукувати рекомбінантний туберкульозний щають туляремийні. антиген. За такої серйозної «реконструкції» у бактерії На щільних живильних середовищах бактерії відбуваються не тільки зміни біохімічних і феноти2-9XL утворять колонії сіро-білого кольору з жовпових властивостей рекомбінантного мікроорганітуватим відливом. При титруванні культури до зму (по ряду властивостей він стає схожий на туокремих ізольованих колоній можлива затримка беркульозні мікобактерії), але міняється також і росту до двох доби. У міру росту розміри колоній структура ДНК бактерії. Висновок про видову приможуть досягати діаметра 5-7 мм. Якщо чашки з належність штаму «9ха» (2-9XL) за допомогою посівом витримати 2-3 доби в холодильнику 7 96488 8 (+4°С), колонії матимуть переважно жовто-сіре володіють дуже високою адгезивністю (здатністю фарбування. Колонії опуклі з нерівними краями, склеюватися) (Див. фігури 1, 2 креслень), що не неблискучі, непрозорі, при узятті петлею консистедозволяє перевірити їх агглютинабельність у реанція колоній щільна, легко знімається з поверхні кції аглютинації. живильного агару. При титруванні культури 2-9XL У реакціях імунодифузії (ІДФ) і імуноелектрона щільних живильних середовищах неможливо форезу з експериментальними сироватками, приготувати стандартну суспензію через високу отриманими на ультразвукові дезинтеграти мікоздатність клітин до склеювання (спонтанна аглюбактерій вірулентного штаму туберкульозу М. тинація), тому титр бактерій не відповідає стандаtuberculosis H37 Rv, антигени рекомбінантних бакртному розведенню (Фігури 3, 4, 5 креслень). Кутерій 2-9XL не формують ліній преципітації. Імовільтурально- морфологічні властивості 2-9XL рно, це пов'язане з тим, що антитіла на рекомбінаAcinetobacter johnsonii. Ізольовані колонії рекомбінтний Тб-антиген виникають тільки в процесі нантного штаму 2-9XL Acinetobacter johnsonii, що розвитку інфекції в організмі людини або тварин й виросли на FT-arapi із цистеїном й 1% глюкозою, їхній титр не буває більшим. У випадку вирощурН 6,6 протягом трьох діб при +32°С. Зберігання в вання мікобактерій на живильних середовищах і холодильнику (4°С) протягом п'яти діб. Фігура 3 – наступної інактивації їхнім ацетоном (або іншими звичайний фон; фігури 4, 5 - білий фон. Фігура 5 твердими бактерицидними препаратами) цей анЗбільшений фрагмент чашки Петрі). тиген руйнується, і тому на нього не можна одерСтабільність популяції штаму 2-9XL. жати специфічні антитіла. При послідовних пересіваннях на щільних жиВ імуноферментному аналізі (ІФА) ТБ- антиген вильних середовищах, вирощуванні при різних в ультразвукових дезинтегратах бактерій й в очитемпературних режимах, після зберігання в ліофіщеному виді взаємодіє з антитілами сироваток льно висушеному стані, погіршенні живильних крові хворих туберкульозом людей і не взаємодіє з властивостей середовища для вирощування й антитілами в сироватках крові здорових людей. В інших несприятливих умов, штам 2-9XL стає неімуноблотинзі Тб-антиген не взаємодіє з антитіластабільним і дисоціює в інші форми. Дисоціація ми хворих туберкульозом, тому що не переноситьнайбільш помітна після тривалого вирощування ся на нітроцелюлозну мембрану. ізольованих колоній (Фігури 6-11 креслень). ДисоВідношення до фагів даного виду. Для рекомціація культури 2-9XL Acinetobacter johnsonii по бінантного штаму 2-9XL Acinetobacter johnsonii культурально-морфологічних ознаках. дотепер власні фаги не виявлені. Чашка Петрі з дисоціаційованою культурою 2Генетичні особливості. Штам 2-9XL 9XL . Ріст колоній різної морфології при титруванні Acinetobacter johnsonii у складі хромосомної ДНК культури з ліофільно висушеного стану. FT-arap з містить як мінімум одну вставку фрагмента хромо1% глюкозою, цистеїном, рН 6,6. Час інкубації при сомної ДНК Μ. tuberculosis H37 Rv, але можливі й +32°С 10 доби, зберігання в холодильнику (+4°С). дві вставки. Фігура 6 - Чашка Петрі сфотографована на біПродуктивність. Рекомбінантний штам 2-9XL є лому фоні; фігура 7 - Чашка Петрі сфотографовапродуцентом туберкульозного антигену Тбна на сірому фоні. антигену) глікопротеїнової природи. Білки, що синФігури 8-11 - Збільшені фрагменти чашки Петтезуються із фрагмента хромосомної ДНК Μ. рі з колоніями 2-9XL різної морфології. tuberculosis H37 Rv, формують на зовнішній мемФігура 8 (1) - Велика кругла біла непрозора брані бактерії 2-9XL й у її капсульній речовині виплоска з опуклим центром і рівним краєм блискуча доспецифічний глікопротеїновий комплекс (Фігури колонія, легко зніметься з агару петлею; 12 -14 /креслень). Фігура 8 (2) - Маленька кругла сіро-жовта неПри одержанні ультразвукових дезинтегратів прозора опукла з рівним краєм не блискуча колобактерій (УЗД) цей комплекс розбивається і є принія, легко знімається петлею з агару; сутнім у вигляді декількох білків. При концентруФігура 9 - Середня кругла сіро-жовто-біла неванні УЗД трихлороцтовою кислотою білки Тбпрозора з опуклим добре позначеним центром і антигену збираються в специфічний рекомбінантвираженим валиком по рівному краю не блискуча ний туберкульозний комплекс. При неекспресивколонія, легко знімається петлею з агару; ному виділенні рекомбінантного Тб-антигену з бакФігура 10 - Середня не кругла жовта непрозотерій 2-9XL його молекулярна маса в SDS-PAAG, ра з вираженим опуклим центром нерівною поверщо денатурує, перебуває в інтервалі від 55,0 до хнею й краєм не блискуча колонія, легко знімаєть75,0 кДа (Фігури 12-14 креслень). ся петлею з агару; Фігура 11 - Велика не кругла На представлений глікопротеїновий комплекс жовто-сіра непрозора з вираженим опуклим у лабораторних тварин формується тривалий нацентром нерівною поверхнею й краєм не блискуча пружений В- і Т-клітинний імунітет проти М. колонія, легко знімається петлею з агару). Біохіміtuberculosis H37 Rv. При вивченні антитілопродукчні властивості штаму 2-9XL. Бактерії при рості на ції (формування В-клітинного імунітету) на рекомщільних живильних середовищах розщеплюють бінантний Тв-антиген проводили імунізацію морсьбілки з виділенням специфічного не дратівного ких свинок і кроликів з метою одержання запаху. При рості на багатих живильних середогіперімунних сироваток. Для імунізації використали вищах здатних синтезувати рекомбінантний туберкроликів вагою 2,5-3 кг. 1 мл Тб-антигену в конценкульозний антиген. Оксидазопозитивні й каталазотрації 1 мг, змішаний з рівним обсягом неповного негативні. Біохімічні властивості рекомбінантного адьюванта Фрейнда, уводили підшкірно у відділ штаму 2-9XL Acinetobacter johnsonii до кінця не спини в ділянці лопаток. Імунізацію повторювали вивчені. Імунохімічні властивості. Бактерії 2-9XL три рази з тижневим інтервалом і дворазовим збі 9 96488 10 льшенням дози. По закінченні первинного циклу Таким чином, присутність рекомбінантного Твімунізації через 4 тижні проводили внутрішньом'яантигена в організмі тварин викликає перебудову зове повторне введення препаратів, починаючи з їхньої імунної системи по В-типу. Тривала присут2 мг й, кратно збільшуючи дозу, до 8 мг. Імунізацію ність ТБ-антигену або повторне його введення морських свинок проводили підшкірно у відділ робить перебудову імунної системи стійкою, на що спини в ділянку лопаток Тв-антигеном у дозі 300 вказує зростання титрів специфічних антитіл у мкг/мл з неповним адъювантом Фрейнда. Через сироватках крові тварин. три тижні введення препарату повторювали. АнтиУ хворих туберкульозом людей і бактеріоносіїв тільну відповідь у лабораторних тварин оцінювали специфічний В-клітинний імунітет визначається за через 21 день після останнього введення Твдопомогою ТБ-антигену в імуноферментних тестантигена. Для цього проводили забір крові, одерсистемах (ІФА), нанітроцелюлозних фільтрах (Імужували сироватку й перевіряли наявність специфіноблотинг, Дот-блот) і в інших реакціях з викорисчних Тв-антитіл у реакції дифузійної преципітації й танням клінічних рідин (сироватка крові, мокротинімуноферментним методом. ня, плевральна рідина, спинномозкова рідина й Показано, що виробіток специфічних антитіл інші), що містять специфічні антитіла. відбувається вже після первинного введення преВивчення зразків сироваток крові хворих тубепарату. При подальших ін'єкціях титри антитіл у ркульозом і здоровими людьми на наявність спесироватках зростали. По завершенню циклів імуніцифічних антитіл представлено в Таблиці 1. зації були отримані гіперімунні сироватки з висоТаблиця 1. Визначення наявності антитіл до ким змістом Тв-антитіл. В імуноферментному аназбудника туберкульозу людини в зразках сировалізі з використанням Тв-антигена, узятого для ток крові різних груп людей імуноферментним меімунізації, титри антитіл у морських свинок склали тодом (Метод визначення представлений у Прик1 : 6400, а в кроликів - 1 : 409600 і вище, у реакції ладі 4). дифузійної преципітації титри були 1:8 й 1:16-1 :32 відповідно. 11 Примітка: Зразки сироваток представлені Держ. НДІ стандартизації й контролю медичних і біологічних препаратів ім. Л.А. Тарасевича (ГІСК) і ООО «БИОНОМ». Обстежено 460 чоловік. ОЩ>0,6 - указує на наявність антитіл у сироватках крові до збудника туберкульозу; 0,3>ОЩ