Засіб визначення клітинного імунітету

Изобретение относится к ветеринарии, медицине и биологии, точнее к разделу клеточной иммунологии, и может быть использо вано для характеристики состояния клеточного иммунитета организма в ветеринарных и медицинских лабораториях иммунологического профиля. Цель - повышение точности и сокращение времени исследования. Цель достигается введением в суспензию лейкоцитов за 30-40 мин до окончания культивирования взвеси инактивированных стафилококков из расчета 150-200 млн микробных тел на 1 мл суспензии лейкоцитов с дополнительной оценкой клеточного иммунитета по фагоцитарной активности лейкоцитов и количеству бластов в одном препарате, 2 табл. Изобретение относится к медицине, ветеринарии и биологии, разделу клеточной иммунологии и может быть использовано для определения клеточного иммунитета организма в клинических и научно-исследовательских медицинских и ветеринарных лабораториях. Целью изобретения является повышение точности и сокращение времени определения. Способ осуществляют следующим образом. Отбирают пробу крови объемом 1-2 мл с добавлением 8-Ю ед. гепарина на 1 мл крови. Кровь отстаивают при комнатной температуре 0,5-1,0 ч, отбирают слой лейкоцитов с плазм о й , переносят в центрифужную проб и р к у и ц е н т р и ф у г и р у ю т 10 м и н п р и 800 об/мин. Плазму крови отсасывают, а из осадка лейкоцитов готовят суспензию, содержащую 1,5 хЮ 6 -2,0 х10 6 клеток в 1 мл питательной среды. Суспензию лейкоцитов наносят на обезжиренное стекло в виде капель и помещают во влажную камеру. Лейкоциты инкубируют при 4-8°С в течение 1-2 ч. За 30-40 мин до окончания инкубации в суспензию лейкоцитов вносят взвесь инактивированных стафилококков из расчета 150-200 млн, микробных тел на 1 мл суспензии клеток. По окончании инкубации стекла вынимают из камеры, спо- 1 ласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают по Паппенгейму. Клеточный иммунитет определяют путем микроскопирования 100200 мононуклеарных лейкоцитов и подсчета среди них числа блэстных клеток лимфоидной природы и нелимфоидной (по размерам, соотношению ядра и цитоплазмы, конденсации хроматина ядра) и определения в этих же клетках на тех же препаратах показателей фагоцитарной активности по поглощению ими инактивированных стафилококков. Результаты реакции учитывают в следующих показателях. Относительное содержание трансформированных лимфоцитов д _ВхЮ0% " В +С ' А in С 02 1686364 где А - показатель трансформированных лимфоцитов. %; В - количество трасформированных лимфоцитов; С - количество нетрансформированных лимфоцитов. Относительное содержание трансформированных клеток нелимфоидной природы л ^ Е х 100 % А Е+К ' , 5 10 где Д - показатель трансформированных нелимфоидных клеток, %; Е - количество нелимфоидных трансформированных клеток; К - количество нетрансформированных 15 клеток. Фагоцитарный показатель и - Т х 100 % Н " Т+Р ' где Н - фагоцитарный показатель, %; Т - количество фагоцитирующих мононуклеарных лейкоцитов; Р - количество нефэгоцитирующих мононуклеарных лейкоцитов. Фагоцитарное число Л Ф и М' где Ф - фагоцитарное число; Л - количество поглощенных кокков; М - количество мононуклеарных лейкоцитов, в которых подсчитывали поглощенные кокки. Число трансформированных лимфоцитов у здоровых людей 41 %, трансформированных клеток нелимфоидной природы 22%, фагоцитарный показатель 63%, фагоцитарное число 8 Учет реакции по бластной трансформации клеток и их фагоцитарной активности прост, удобен, доступен лабораторному работнику средней квалификации, Властные клетки легко идентифицируются ввиду их крупных размеров (в 2-4 раза больше лимфоцитов), отчетливого увеличения площади цитоплазмы, преобладания в ядре нежного эухроматина ярко - розового окрашивания. Полученные результаты обрабатывают статистически. Для этого удобен метод Монцевичуте - Эрингене. П р и м е р 1. Определение клеточного иммунитета больных хронической пневмонией. На стационарном лечении находилось 12 больных в возрасте 29-52 лет с диагнозом: хроническая рецидивирующая пневмония, пневмосклероз. Диагноз установлен на основании анамнестических аускультативных, рентгенологических данных и результатах функциональной диагностики. 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 В результате проведенного лечения через 24-31 день состояние у всех больных улучшилось и они в удовлетворительном состоянии были выписаны из стационара, Субъективное улучшение сопровождалось улучшением аускультативной, рентгенологической симптоматики и функциональных проб, При поступлении и перед выпиской у больныхотбирали пробы крови и проводили определение клеточного иммунитета согласно предложенному способу. Для этого у больных отбирали кровь из локтевой вены в объеме 2 мл в обработанные гепарином пробирки, отстаивали 40 мин, переносили взвесь лейкоцитов в центрифужную пробирку и центрифугировали 20 мин при 800 об./мин. Плазму отсасывали, а к лейкоцитам добавляли питательную среду до конечной концентрации 2,0 х Ї 0 6 клеток в 1 мл суспензии. Суспензию клеток наносили в виде капель на предметные стекла, помещали во влажную камеру и инкубировали при 4°С 2 ч. За 40 мин до окончания инкубации в тех же препаратах к каждой капле суспензии клеток добавляли равные по объему капли взвеси инактивировзнных стафилококков {150 млн. микробных тел в 1 мл). По завершении инкубации стекла вынимали из камер, споласкивали дистиллированной водой, подсушивали, фиксировали 10 мин в метаноле и окрашивали по Паппенгейму. После подсчета 100-200 клеток в каждом препарате определяли количество трансформированных лимфоцитов, трансформированных клеток нелимфоидной природы и в этих же клетках - показатели их фагоцитарной активности Результаты исследований представлены в табл.1. Из приведенных в табл. 1 данных следует, что определенный по предлагаемому способу уровень клеточного иммунитета коррелирует с изменением клинического состояния больных Повышение трансформационной и фагоцитарной активности при выписке свидетельствует о нормализации подавленной клеточной иммунологической реактивности больных хронической пневмонией и сопровождается улучшением их общего СОСТОЯНИЙ, аускультативных и рентгенологических данных. Определение клеточного иммунитета согласно предлагаемому способу по трансформационным и фагоцитарным показателям в одном препарате позволяет более точно, статистически достоверноустановитьразличия клеточного иммунитета, в то время как по известному способу выявленные различия статистически недостоверны. Крометого, значительно сокращается продолжительность исследований, так как определение клеточного иммунитета по фагоцитарной активности согласно извест 1686364 ному способу требует 4-5 ч, а по предлагаемому способу - 30-40 мин. П р и м е р 2. Определение клеточного иммунитета, заболеваемости и сохранности поросят различных пород. 5 Определяли клеточный иммунитет у 20дневных поросят пород "ландрас" и "крупная белая" в животноводческом хозяйстве промышленного типа. С этой целью животных каждой породы объединяли в группы 10 (по 30 голов в каждой) и проводили определение клеточного иммунитета согласно предлагаемому способу, а также регистрировали их заболеваемость и сохранность в течение последующих 30 дней наблюдений. 15 Для определения клеточного иммунитета у всех животных отбирали из ушных вен по 5 мл крови с гепарином и готовили взвеси лейкоцитов содержащие 2,0 х 1 О6 клеток в 1 мл. Взвести 'лейкоцитов наносили на от- 20 дельные предметные стекла в виде капель и помещали во влажную камеру. Лейкоциты инкубировали при 4''С в течение 2 ч. За 30 мин до окончания инкубации к каждой капле клеточной суспензии добавляли равные по 25 объему капли взвеси инактивированных стафилококков, содержавшей 200 млн. микробныхтел в 1 мл. По завершении инкубации стекла вынимали из камеры, споласкивали дистиллированной водой, подсушивали, 30 фиксировали 5 мин. в метаноле и окрашивали по Паппенгейму. При микроскопическом исследовании 100 клеток в каждом препарате подсчитывали количество трансформированных лимфоцитов, трансформированных 35 клеток нелимфоидной природы, а также в этих клетках определяли фагоцитарный показатель и фагоцитарное число (см. табл. 2). Заболеваемость и сохранность поросят определяли путем ежедневных клинических 40 наблюдений. Из представленных в табл. 2 данных следует, что уровень клеточного иммунитета, определенный согласно предлагаемому способу, статистически достоверно выше у 45 поросят породы "ландрас". Дальнейшие наблюдения за животными показали, что у этих же поросят на 12 % ниже заболеваемость и на 3,3% выше сохранность. Это указывает на высокую точность определения у них клеточ- 50 ного иммунитета и возможность прогнозирования по этим показателям ущерба от заболеваемости. Расчетный экономический эффект определения клеточного иммунитета по предлагаемому способу составил 55 А - В - С, где А - расчетный экономический эффект; В - стоимость прогнозируемого ущерба (4 головы х 12,0 кг х 2,5 руб.); С - затраты на проведение исследований А = 4 гол. х 12,0 кг х 2,5 руб. - 10 руб. - 10 руб. или 36,6 тыс. руб. в год в хозяйстве 4 на 800 основных свиноматок. Следует отметить, что определение в данном примере клеточного иммунитета только по бластным клеткам (как это предлагает из вестное техническое решение) не обеспечивает получения статистически достоверных данных и не определяет клеточный иммунитете необходимой для прогнозирования заболеваемости и ущерба точностью Таким образом, по сравнению с известным, предложенный способ позволяет в более короткие сроки (2 ч, а по известному способу только определение фагоцитарной активности требует 4-5 ч и с более высокой точностью определить состояние клеточного иммунитета, Его использование позволяет избежать ошибок в оценке клеточного иммунитета у больных с инфекционными и другими заболеваниями, при проведении у них лечебных мероприятий. Предлагаемый способ более точно устанавливает клеточный иммунитет у животных, что позволяет повысить экономический эффект и результативность исследований по отбору животных с высокой устойчивостью к заболеваниям. Способ технологически не сложен, не требует дефицитных или импортных реактивов и оборудования и можетбыть использован в медицинских и ветеринарных лабораториях в качестве экспресс-метода диагностики и прогнозирования заболеваний человека и животных. Формула изобретения Способ определения клеточного иммунитета, включающий выделение лейкоцитов из крови, культивирование их на предметных стеклах и подсчет бластных клеток, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени определения, к суспензии лейкоцитов добавляют взвесь инактивированного стафилококка, при этом вносят его в количестве 150-200 млн микробных тел на 1 мл суспензии за 30-40 мин до окончания культивирования и дополнительно определяют фагоцитарную активность лейкоцитов в том же препарате. 7 1686364 8 Таблицаї Показатели клеточного иммунитета больных хронической пневмонией Наблюдение При поступлении При выписке Лимфоб- Транс- Фагоци- Фагоци- Лимфоб- Транс- Фагоци- Фагоциласты, % формиро- тарный тарное ласты, % формиро- тарный тарное ванные показачисло ванные показачисло не лимф. тель. % не лимф. тель, % клетки, клетки, 1 28 24 54 32 6 40 62 6 37 26 48 6 39 26 59 9 39 • 26 8 44 74 61 29 8 ' 33 23 5 27 60 40 66 8 - 34 26 7 39 25 71 7 46 41 38 25 26 55 6 70 9 37 28 40 28 58 5 66 9 21 21 42 35 49 5 69 10 24 24 38 61 7 39 65 8 24 71 29 57 7 45 23 11 21 54 37 26 64 37 5 9 24 34 26 44 60 76 9 6 34,9±3,38 24,5+2,0 55,2±5,0 6,1 ±0,95 40,8±2,34 25,9±2,8 67,8±4,8 8,6±1,4 2 3 4 5 6 7 8 9 10 і 11 12 р>0,05 р>0,1 р0,1 49,9 ±4,0 р