Синтетичний транзитний пептид хлоропластів, що походить з brassica, та спосіб його одержання

Реферат: Винахід стосується конструкції нуклеїнової кислоти для локалізації поліпептиду в хлоропласт, де конструкція характеризується нуклеотидною послідовністю, яка кодує синтетичний транзитний пептид хлоропластів (СТР) з послідовністю SEQ ID NO: 6 або SEQ ID NO: 8, зв'язаною безперервно в рамці зчитування з нуклеотидною послідовністю, яка кодує поліпептид, таким чином, що конструкція кодує химерний білок, що містить синтетичний СТР і поліпептид. Винахід також стосується химерного білка, кодованого зазначеною послідовністю, клітини трансгенної рослини, яка містить зазначений химерний білок, трансгенної рослини, частини трансгенної рослини, насіння трансгенної рослини, культури клітин та способу одержання трансгенного рослинного матеріалу. UA 115547 C2 (12) UA 115547 C2 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ДОМАГАННЯ НА ПРІОРИТЕТ За даною заявкою вимагається пріоритет по тимчасовій патентній заявці США із серійним номером № 61/593555, поданій 1 лютого 2012 року, а також по тимчасовій патентній заявці США із серійним номером № 61/625222, поданій 17 квітня 2012 року. ПОЛОЖЕННЯ ВІДПОВІДНО ДО 37 C.F.R. § 1.821(c) або (e) - СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ, НАДАНИЙ ЯК ТЕКСТОВИЙ ФАЙЛ ASCII Відповідно до 37 C.F.R. § 1.821(c) або (e), файл, що містить текстову версію ASCII списку послідовностей, наданий разом з даною заявкою. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід стосується композицій і способів генетичного кодування й експресії поліпептидів, які націлюються в пластиди клітин, що містять пластиди. У визначених варіантах здійснення винахід стосується амінокислотних послідовностей, які націлюють поліпептиди в хлоропласти (наприклад, вищих рослин), і/або молекул нуклеїнових кислот, що їх кодують. У визначених варіантах здійснення винахід стосується химерних поліпептидів, які містять амінокислотну послідовність, що контролює транспорт химерних поліпептидів у пластиди, і/або молекул нуклеїнових кислот, що їх кодують. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Клітини рослин містять різні субклітинні органели, загалом називані "пластидами", які обмежені характерними мембранними системами і виконують спеціалізовані функції в клітині. Конкретні пластиди відповідальні за фотосинтез, а також за синтез і запасання певних хімічних сполук. Усі пластиди походять із пропластид, що присутні в меристематичних областях рослини. Пропластиди можуть розвиватися, наприклад, у: хлоропласти, етіопласти, хромопласти, геронтопласти, лейкопласти, амілопласти, елайопласти і протеїнопласти. Пластиди існують напівавтономно у клітині, вони включають їх власну генетичну систему й апарат синтезу білків, однак вони залежать від тісної взаємодії з ядерно-цитоплазматичною системою в їх розвитку і біосинтетичній активності. У фотосинтезуючих клітинах листів вищих рослин найбільш помітними пластидами є хлоропласти. Найбільш важливою функцією хлоропластів є проведення реакцій фотосинтезу, що запускаються світлом. Однак хлоропласти також здійснюють багато які інші важливі для клітини рослини біосинтетичні процеси. Наприклад, усі жирні кислоти клітини виробляються ферментами в стромі хлоропластів з використанням ATP, NAOPH і вуглеводів, що вільно доступні в них. Більше того, відновлювальна потужність активованих світлом електронів забезпечує відновлення нітриту (NO2 ) в аміак (NH3) у хлоропластах; цей аміак забезпечує рослину азотом, необхідним для синтезу амінокислот і нуклеотидів. Хлоропласт також бере участь у процесах, які мають особливе значення для агрохімічної промисловості. Наприклад, відомо, що багато які гербіцидів діють, блокуючи функції, які виконують хлоропласти. У нещодавніх дослідженнях була ідентифікована конкретна мішень декількох гербіцидів. Наприклад, гербіциди, що походять з триазинів, інгібують фотосинтез шляхом витіснення молекули пластохінону з його ділянки зв'язування в поліпептиді масою 32 кДа фотосистеми II. Цей поліпептид масою 32 кДа кодується в геномі хлоропластів і синтезується апаратом органел. Також були одержані мутантні рослини, що є стійкими до триазинових гербіцидів. Ці рослини містять мутантний поліпептид масою 32 кДа, з якого пластохінон більше не витісняється триазиновими гербіцидами. Сульфонілсечовини інгібують ацетолактатсинтазу в хлоропласті. Ацетолактатсинтаза залучена в синтез ізолейцину і валіну. Гліфосат інгібує функцію 5-енолпірувіл-3-фосфошикіматсинтази (EPSPS), яка являє собою фермент, залучений у синтез ароматичних амінокислот. Усі ці ферменти кодуються ядерним геномом, однак вони переміщаються в хлоропласт, де відбувається фактичний синтез амінокислот. Більшість білків хлоропластів кодуються в ядрі клітини рослини, синтезуються як більш великі білки-попередники у цитозолі і посттрансляційно імпортуються в хлоропласт. Імпорт через зовнішню і внутрішню мембрани оболонки в строму є основним шляхом входження в білки, призначені для надходження в строму, мембрану тилакоїду і просвіт тилакоїду. Локалізація імпортованих білків-попередників у мембрані тилакоїду і просвіті тилакоїду здійснюється чотирма різними механізмами, включаючи два з них, що гомологічні системам транспорту бактеріальних білків. Таким чином, механізми локалізації білка в хлоропластах частково походять із прокаріотичного ендосимбіонта. Cline and Henry (1996), Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12:1-26. Білки-попередники, призначені для експресії в хлоропластах, містять N-кінцеві подовження, відомі як транзитні пептиди хлоропластів (CTP). Транзитний пептид є інструментом для специфічного розпізнавання поверхні хлоропластів і для опосередкування посттрансляційного 1 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переміщення пребілків через оболонку хлоропластів і, таким чином, у різні субкомпартменти в хлоропласті (наприклад, строма, тилакоїд і мембрана тилакоїду). Ці N-кінцеві транзитні пептидні послідовності містять всю інформацію, необхідну для імпорту білка хлоропластів у пластиди; транзитні пептидні послідовності необхідні і достатні для імпорту в пластиду. Гени рослин, що містять, відповідно до повідомлень, природним чином кодовані транзитні пептидні послідовності на їх N-кінці, включають малу хлоропластну субодиницю рибулозо-1,5бісфосфаткарбоксилази (RuBisCo) (de Castro Silva-Filho et al. (1996), Plant Mol. Biol. 30:769-80; Schnell et al. (1991), J. Biol. Chem. 266:3335-42); EPSPS (див., наприклад, Archer et al. (1990), J. Bioenerg. and Biomemb. 22:789-810; і патенти США №№ 6867293, 7045684 і Re. 36449); триптофансинтази (Zhao et al. (1995), J. Biol. Chem. 270:6081-7); пластоціаніну (Lawrence et al. (1997), J. Biol. Chem. 272:20357-63); хоризматсинтази (Schmidt et al. (1993), J. Biol. Chem. 268:27447-57); акумулюючий світлову енергію білок, що зв'язує хлорофіл a/b (LHBP) (Lamppa et al. (1988), J. Biol. Chem. 263:14996-14999); і білок хлоропластів Arabidopsis thaliana (Lee et al. (2008), Plant Cell 20:1603-22). У публікації заявки на патент США № US 2010/0071090 описані визначені націлюючі у хлоропласти пептиди з Chlamydomonas sp. Однак структурні вимоги до інформації, кодованої націлюючими у хлоропласти пептидами, залишаються неясними внаслідок їх високого рівня різноманітності послідовності і відсутності загальних або консенсусних мотивів послідовності, хоча можливо, що вони є окремими підгрупами націлюючих у хлоропласти пептидів з незалежними структурними мотивами. Lee et al. (2008), вище. Крім того, не усі з цих послідовностей придатні для гетерологічної експресії націлених у хлоропласти білків у вищих рослинах. ОПИС ВИНАХОДУ У даному описі розкриті композиції і способи для націлювання поліпептидів у рослині в пластиди. У деяких варіантах здійснення композиція містить молекулу нуклеїнової кислоти, що містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує синтетичний транзитний пептид хлоропластів, що походить з Brassica (наприклад, пептид TraP12 або TraP13), функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес. У конкретних варіантах здійснення такі молекули нуклеїнової кислоти можуть бути корисними для експресії і націлювання поліпептиду, кодованого нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес, в однодольній і дводольній рослинах. Крім того, описані вектори, які містять молекулу нуклеїнової кислоти, що містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує синтетичний транзитний пептид хлоропластів, що походить з Brassica, функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес. У деяких варіантах здійснення, нуклеотидна послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, може являти собою нуклеотидну послідовність, що походить з еталонної нуклеотидної послідовності, одержаної з гена Brassica sp. (наприклад, B. napus, B. rapa, B. juncea і B. carinata), або її функціональний варіант. У деяких варіантах здійснення, нуклеотидна послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, може являти собою химерну нуклеотидну послідовність, що містить неповну кодуючу CTP нуклеотидну послідовність з гена Brassica sp., або її функціональний варіант. У конкретних варіантах здійснення нуклеотидна послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, може містити безперервні нуклеотидні послідовності, одержані з кожного з еталонних CTP Brassica sp., і CTP з відмінного гена Brassica sp., відмінного Brassica sp. або відмінного організму (наприклад, рослина, прокаріотичний організм і нижчий фотосинтезуючий еукаріотичний організм), або функціональні варіанти будь-якого з зазначених вище. У конкретних варіантах здійснення безперервна нуклеотидна послідовність може бути одержана з ортологічної нуклеотидної послідовності еталонного CTP Brassica, що одержана з ортолога еталонного гена Brassica sp. з іншого організму (наприклад, з відмінного геному Brassica sp.). У цих і інших варіантах здійснення, нуклеотидна послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, може являти собою химерну нуклеотидну послідовність, яка містить більше однієї кодуючої CTP нуклеотидної послідовності. У деяких прикладах нуклеотидна послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, може являти собою химерну нуклеотидну послідовність, що містить неповну нуклеотидну послідовність CTP з B. napus, або її функціональні варіанти. У конкретних прикладах нуклеотидна послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, може містити безперервні нуклеотидні послідовності, одержані з B. napus, або їх функціональні варіанти. У наступних прикладах нуклеотидна послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, може містити безперервну нуклеотидну послідовність, одержану з гена Brassica sp., або її функціональний варіант і безперервну нуклеотидну послідовність, одержану з гена Arabidopsis sp., або її функціональний варіант. 2 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення композиція містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить щонайменше один засіб, що походить з Brassica, для націлювання поліпептиду в хлоропласт. Крім того, описані молекули нуклеїнової кислоти, що містять молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить щонайменше один засіб, що походить з Brassica, для націлювання поліпептиду в хлоропласт, функціонально зв'язану з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес. У конкретних варіантах здійснення такі молекули нуклеїнової кислоти можуть бути придатними для експресії і націлювання поліпептиду, кодованого нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес, в однодольній або дводольній рослині. Для цілей даного опису, засіб, що походить з Brassica, для націлювання поліпептиду в хлоропласт належить до конкретних синтетичних нуклеотидних послідовностей. У конкретних варіантах здійснення засіб, що походить з Brassica, для націлювання поліпептиду в хлоропласт вибраний з групи, що складається з нуклеотидних послідовностей, позначуваних в даному описі як TraP12 і TraP13. Також у даному описі розкриті рослинні матеріали (наприклад, але не обмежуючись ними, рослини, тканини рослин і клітини рослин), які містять молекулу нуклеїнової кислоти, що містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес. У деяких варіантах здійснення рослинний матеріал може мати таку молекулу нуклеїнової кислоти, стабільно вбудовану в її геном. У деяких варіантах здійснення, рослинний матеріал може тимчасово експресувати продукт молекули нуклеїнової кислоти, що містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес. Також описані способи експресії нуклеотидної послідовності в клітині, що містить пластиду (наприклад, рослині), у пластиді (наприклад, хлоропласт) клітини, що містить пластиду. У конкретних варіантах здійснення, молекулу нуклеїнової кислоти, що містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес, можна використовувати для трансформації клітини рослини так, щоб у цитоплазмі клітини рослини продукувався злитий поліпептид-попередник, який містить синтетичний CTP, що походить з Brassica, злитий із продуктом експресії нуклеотидної послідовності, що представляє інтерес, у цитоплазмі клітини рослин, а потім злитий поліпептид транспортувався in vivo у хлоропласт клітини рослини. Крім того, описані способи одержання трансгенної рослини, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти, що містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес. Також описані рослинні продукти (наприклад, насіння), одержані з таких трансгенних рослин. Зазначені вище й інші ознаки стануть більш зрозумілими з представленого нижче опису декількох варіантів здійснення, що надані з урахуванням прикладених креслень. КОРОТКИЙОПИС КРЕСЛЕНЬ На фіг. 1 проілюстровані молекули мРНК, що є репрезентативними для конкретних прикладів синтетичної нуклеотидної послідовності, що походить з Brassica, яка кодує CTP (наприклад, TraP12 і TraP13), функціонально зв'язаної з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес. У деяких варіантах здійснення молекула мРНК (така, як представлені молекули мРНК) може транскрибуватися з молекули ДНК, яка містить відкриту рамку зчитування, що включає синтетичну послідовність, що походить з Brassica, яка кодує CTP, функціонально зв'язану з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес. У деяких варіантах здійснення нуклеотидна послідовність, що представляє інтерес, може являти собою послідовність, яка кодує пептид, що представляє інтерес, наприклад, але не обмежуючись ними, продукт маркерного гена або пептид, націлюваний в пластиду. На фіг. 2 представлене вирівнювання передбачених транзитних пептидів хлоропластів білка EPSPS з Brassica napus (SEQ ID NO: 2) і Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 4). Зірочкою зазначено, де послідовності розщеплювалися і рекомбінували з утворенням TraP12 і TraP13. На фіг. 3 проілюстрована карта плазміди pDAB101981. На фіг. 4 проілюстрована карта плазміди pDAB101989. На фіг. 5 проілюстрована карта плазміди pDAB101908. На фіг. 6 представлене мікроскопічне зображення TraP12-YFP, що інфільтрував тканину листів тютюну, який був перенесений у хлоропласти тканини листів тютюну. На фіг. 7 представлене мікроскопічне зображення TraP13-YFP, що інфільтрував тканину листів тютюну, який був перенесений у хлоропласти тканини листів тютюну. На фіг. 8 представлене мікроскопічне зображення ненацілених контролів YFP, які інфільтрували листи тютюну і не включалися в хлоропласти тканини листів тютюну. 3 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На фіг. 9 представлене мікроскопічне зображення TraP12-YFP, трансформованого в протопласти кукурудзи, який був перенесений у хлоропласти протопласта кукурудзи. На фіг. 10 проілюстрована карта плазміди pDAB105528. На фіг. 11 проілюстрована карта плазміди pDAB105529. На фіг. 12 проілюстрована карта плазміди pDAB107686. На фіг. 13 проілюстрована карта плазміди pDAB107687. На фіг. 14 проілюстрована карта плазміди pDAB112711. На фіг. 15 проілюстрована карта плазміди pDAB11479. На фіг. 16 проілюстрована карта плазміди pDAB112712. На фіг. 17 проілюстрована карта плазміди pDAB112710. На фіг. 18 проілюстрована карта плазміди pDAB017540. На фіг. 19 проілюстрована карта плазміди pDAB107617. СПОСІБ(ОБИ) ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ I. Огляд декількох варіантів здійснення Транзитний пептид хлоропластів (CTP) (або транзитний пептид пластид) функціонує під час або після трансляції, направляючи поліпептид, що містить CTP, у пластиду (наприклад, хлоропласт). У деяких варіантах здійснення винаходу або ендогенні білки, або гетерологічні білки хлоропластів можна направляти в хлоропласт шляхом експресії такого білка як більш великого поліпептиду-попередника, що містить CTP. У конкретних варіантах здійснення CTP може походити з нуклеотидної послідовності, одержаної з гена Brassica sp., наприклад, але не обмежуючись цим, шляхом включення щонайменше однієї безперервної послідовності з ортологічного гена, одержаного з іншого організму, або її функціонального варіанта. В ілюстративних варіантах здійснення послідовності нуклеїнової кислоти, кожна з яких кодує CTP, виділяли з послідовностей гена EPSPS, одержаних з Brassica napus (номер доступу в базі даних NCBI № P17688). Кодуючі CTP послідовності нуклеїнових кислот виділяли шляхом аналізу послідовності гена EPSPS за допомогою сервера для прогнозування ChloroР. Emanuelsson et al. (1999), Protein Science, 8:978-84 (доступний на cbs.dtu.dk/services/ChloroP). Передбачені білкові продукти виділених кодуючих CTP послідовностей являють собою транзитні пептиди довжиною приблизно 60-70 амінокислот. Кодуючі CTP послідовності нуклеїнової кислоти виділяли з ортологічних генів EPSPS, одержаних з Arabidopsis thaliana (номер доступу NCBI № NP_182055). У цьому прикладі нативний CTP B. napus використовували як еталонну послідовність для конструювання ілюстративних синтетичних CTP, що походять з Brassica, шляхом злиття послідовно розташованих послідовностей з CTP Arabidopsis у конкретному положенні в CTP B. napus. Цей процес конструювання ілюструє розробку нового синтетичного CTP, відповідно до деяких аспектів, з послідовності нуклеїнової кислоти Brassica і Arabidopsis sp. Ці ілюстративні синтетичні CTP, що походять з Brassica, позначаються в даному описі як TraP12 і TraP13. Ці ілюстративні синтетичні TraP досліджували відносно функції націлювання в пластиду і було виявлено, що вони виявляють націлювання в пластиду, що є щонайменше настільки ж ефективним, як спостерігали для нативних послідовностей Brassica по окремості. У наступному ілюстративному варіанті здійснення послідовності нуклеїнової кислоти, кожна з яких кодує синтетичний пептид TraP за винаходом, синтезували незалежно і функціонально зв'язаними з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує жовтий флуоресцентний білок (YFP), з одержанням синтетичних молекул нуклеїнової кислоти, кожна з яких кодувала химерний злитий поліпептид TraP:YFP. Кожну з таких молекул нуклеїнової кислоти, кожна з яких кодує химерний поліпептид TraP:YFP, вбудовували в бінарний вектор так, щоб кожна кодуюча TraP:YFP послідовність нуклеїнової кислоти була функціонально зв'язана з промотором AtUbi10. В іншому ілюстративному варіанті здійснення бінарні вектори, що містили кожну кодуючу TraP:YFP послідовність нуклеїнової кислоти, функціонально зв'язану з промотором AtUbi10, незалежно тимчасово трансформували в тютюн (Nicotiana benthamiana) за допомогою опосередковуваної Agrobacterium трансформації. Конфокальна мікроскопія й аналіз з використанням вестерн-блотингу підтвердили, що кожен TraP успішно націлював YFP у хлоропласти тютюну. У наступному ілюстративному варіанті здійснення послідовності нуклеїнової кислоти, кожна з яких кодувала синтетичний пептид TraP за винаходом, синтезували незалежно і функціонально зв'язаними з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує агрономічно важливу послідовність гена. Послідовності TraP піддавали злиттю з ознаками стійкості до гербіциду (наприклад, dgt-28 і dgt-14) з одержанням синтетичних молекул нуклеїнової кислоти, кожна з яких кодувала химерний злитий поліпептид TraP:DGT-28 або TraP:DGT-14. Такі молекули 4 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 нуклеїнової кислоти, кожна з яких кодувала химерний поліпептид TraP:DGT-28 або TraP:DGT14, вбудовували в бінарний вектор так, щоб кожна кодуюча TraP:dgt-28 або TraP:dgt-14 послідовність нуклеїнової кислоти була функціонально зв'язаною з промотором і іншими регуляторними елементами генів. Бінарний вектор, що містить кодуючу TraP:dgt-28 або TraP:dgt-14 послідовність нуклеїнової кислоти, використовували для трансформації різних видів рослин. Трансгенні рослини аналізували відносно стійкості до гербіциду в результаті надекспресії і переміщення ферментів DGT-28 або DGT-14 у хлоропласт. У наступному ілюстративному варіанті здійснення послідовності нуклеїнової кислоти, кожна з яких кодує синтетичний пептид TraP за винаходом, синтезували незалежно і функціонально зв'язаними з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує агрономічно важливу послідовність гена. Послідовності TraP піддавали злиттю з ознаками стійкості до комах (наприклад, cry2Aa, vip3ab1, cry1F, cry1Ac і cry1Ca) з одержанням синтетичних молекул нуклеїнової кислоти, кожна з яких кодує химерний злитий поліпептид TraP:Cry2Aa, TraP:Vip3Ab1, TraP:Cry1F, TraP:Cry1Ac або TraP:Cry1Ca. Кожну з таких молекул нуклеїнової кислоти, кожна з яких кодує химерний поліпептид TraP:cry2Aa, TraP:vip3ab1, TraP:cry1F, TraP:cry1Ac або TraP:cry1Ca, вбудовували в бінарний вектор так, щоб кожна послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує TraP:cry2Aa, TraP:vip3ab1, TraP:cry1F, TraP:cry1Ac або TraP:cry1Ca, була функціонально зв'язана з промотором і іншими регуляторними елементами генів. Бінарний вектор, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує TraP:cry2Aa, TraP:vip3ab1, TraP:cry1F, TraP:cry1Ac або TraP:cry1Ca, використовували для трансформації різних видів рослин. Трансгенні рослини піддавали біоаналізу відносно стійкості до комах у результаті експресії і переміщення ферментів Cry2Aa, Vip3Ab1, Cry1F, Cry1Ac або Cry1Ca у хлоропласт. В зв’язку з представленим вище докладним описом ілюстративних прикладів, синтетичні послідовності CTP, що походять з Brassica, за винаходом і нуклеїнові кислоти, що їх кодують, можна використовувати для спрямування будь-якого поліпептиду в пластиду широкого діапазону клітин, що містять пластиди. Наприклад, за допомогою способів, що стали доступними фахівцям у даній галузі з урахуванням даного винаходу, химерний поліпептид, який містить синтетичну послідовність CTP, що походить з Brassica, злиту з N-кінцем будь-якої другої пептидної послідовності, можна вводити в (або експресувати) в клітину-хазяїна, що містить пластиду, для націлювання в пластиду другої пептидної послідовності. Таким чином, у конкретних варіантах здійснення пептид TraP може забезпечити збільшену ефективність імпорту і процесингу пептиду, для якого є бажаною експресія в пластиді, у порівнянні з нативним CTP. II. Скорочення CTP транзитний пептид хлоропластів; Bt bacillus thuringiensis; EPSPS 3-енолпірувілшикімат-5-фосфатсинтетаза; YFP жовтий флуоресцентний білок; Ti індукуючий пухлину (плазміди, що походять з A. tumefaciens); T-ДНК трансферна ДНК. III. Терміни Щоб спростити огляд різних варіантів здійснення винаходу, надані наступні пояснення конкретних термінів. Транзитний пептид хлоропластів. Як використовують у рамках винаходу, термін "транзитний пептид хлоропластів" (CTP) (або "транзитний пептид пластид") може стосуватися амінокислотної послідовності, яка, коли вона присутня на N-кінці поліпептиду, спрямовує імпорт поліпептиду в пластиду клітини, що містить пластиду (наприклад, клітина рослини, така як у цілій рослині або в культурі клітин рослини). CTP звичайно необхідний і достатній для спрямування імпорту білка в пластиду (наприклад, первинна, вторинна або третинна пластида, така як хлоропласт) клітини-хазяїна. Передбачуваний транзитний пептид хлоропластів може бути ідентифікований за допомогою одного з декількох доступних алгоритмів (наприклад, PSORT і ChloroP (доступні на cbs.dtu.dk/services/ChloroP)). ChloroP може особливо добре передбачати CTP. Emanuelsson et al. (1999), Protein Science, 8:978-84. Однак жоден з існуючих алгоритмів не забезпечує передбачення функціональних CTP зі 100% ефективністю. Таким чином, важливо підтвердити, що ідентифікований передбачуваний CTP дійсно функціонує, наприклад, як передбачається в методології in vitro або in vivo. Транзитні пептиди хлоропластів можуть бути розташовані на N-кінці поліпептиду, який імпортується в пластиду. CTP може полегшувати транспорт під час трансляції або після трансляції поліпептиду, що містить CTP, у пластиду. Транзитні пептиди хлоропластів, як правило, містять від приблизно 40 до приблизно 100 амінокислот, і виявлено, що такі CTP 5 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 містять певні загальні характеристики. Наприклад, CTP містять дуже мало, або навіть не містять, негативно заряджених амінокислот (таких як аспарагінова кислота, глутамінова кислота, аспарагін або глутамін); N-кінцеві області CTP позбавлені заряджених амінокислот, гліцину і проліну; центральна область CTP також, імовірно, має високий вміст основних або гідроксильованих амінокислот (таких як серин і треонін); і C-кінцева область CTP, імовірно, збагачена аргініном і може містити амфіпатичну структуру бета-шару. Протеази пластид можуть відщеплювати CTP від частини поліпептиду, що залишилася, яка містить CTP, після імпорту поліпептиду в пластиду. Контакт. Як використовують у рамках винаходу, термін "контакт з" або "захоплення" клітиною, тканиною або організмом (наприклад, клітиною рослини; тканиною рослини і рослиною), відносно молекули нуклеїнової кислоти, включає інтерналізацію молекули нуклеїнової кислоти в організм, наприклад, але не обмежуючись цим: контактування організму з композицією, що містить молекулу нуклеїнової кислоти; і просочування організмів розчином, що містить молекулу нуклеїнової кислоти. Ендогенний. Як використовують у рамках винаходу, термін "ендогенний" стосується речовин (наприклад, молекули нуклеїнової кислоти і поліпептиди), що походять з конкретного організму, тканини або клітини. Наприклад, "ендогенний" поліпептид, експресований у клітині рослини, може належати до поліпептиду, що звичайно експресується в клітинах того ж типу з не модифікованих способами генної інженерії рослин того ж виду. У деяких прикладах ендогенний ген (наприклад, ген EPSPS) з Brassica sp. можна використовувати для одержання еталонної послідовності CTP Brassica. Експресія. Як використовують у рамках винаходу, "експресія" кодуючої послідовності (наприклад, гена або трансгена) стосується процесу, за допомогою якого кодована інформація транскрипційного елемента нуклеїнової кислоти (включаючи, наприклад, геномну ДНК або кДНК) перетворюється у функціональну, нефункціональну або структурну частину клітини, який часто включає синтез білка. На експресію генів можуть впливати зовнішні сигнали, наприклад вплив на клітину, тканину або організм агента, що збільшує або знижує експресію гена. Експресія гена також може регулюватися на будь-якому етапі в каскаді від ДНК до РНК до білка. Регуляція експресії гена відбуватися, наприклад, шляхом контролю, що діє на транскрипцію, трансляцію, транспорт і процесинг РНК, деградацію проміжних молекул, таких як мРНК, або шляхом активації, інактивації, компартменталізації або деградації конкретних молекул білків після їх одержання, або шляхом будь-якої їх комбінації. Експресію гена можна вимірювати на рівні РНК або на рівні білка будь-яким способом, відомим у даній галузі, наприклад, але не обмежуючись цим, нозерн-блотинг, ЗТ-ПЛР, вестерн-блотинг або аналіз(и) активності білка in vitro, in situ і in vivo. Генетичний матеріал. Як використовують у рамках винаходу, термін "генетичний матеріал" включає всі гени і молекули нуклеїнових кислот, такі як ДНК і РНК. Гетерологічний. Як використовують у рамках винаходу, термін "гетерологічний" стосується речовин (наприклад, молекули нуклеїнової кислоти і поліпептиди), що не походять з конкретного організму, тканини або клітини. Наприклад, "гетерологічний" поліпептид, експресований у клітині рослини, може належати до поліпептиду, який звичайно не експресується в клітинах того ж типу з не модифікованих способами генної інженерії рослин того ж виду (наприклад, поліпептид, що експресується в інших клітинах того ж організму або в клітинах іншого організму). Виділений. Як використовують у рамках винаходу, термін "виділений" стосується молекул (наприклад, молекули нуклеїнової кислоти і поліпептиди), що по суті відділені або очищені від інших молекул того ж типу (наприклад, інші молекули нуклеїнової кислоти й інші поліпептиди), з якими молекула звичайно асоційована в клітині організму, у якому молекула зустрічається природним чином. Наприклад, виділена молекула нуклеїнової кислоти може бути по суті відділена або очищена від хромосомної ДНК або позахромосомної ДНК у клітині організму, у якому молекула нуклеїнової кислоти зустрічається природним чином. Таким чином, термін включає рекомбінантні молекули нуклеїнової кислоти і поліпептиди, які біохімічно очищені так, щоб інші молекули нуклеїнової кислоти, поліпептиди і клітинні компоненти були видалені. Також термін включає рекомбінантні молекули нуклеїнової кислоти, хімічно синтезовані молекули нуклеїнової кислоти і рекомбінантно продуковані поліпептиди. Термін "по суті очищений", як використовують у рамках винаходу, стосується молекули, яка відділена від інших молекул, звичайно асоційованих з нею в її нативному стані. По суті очищена молекула може бути переважним видом, присутнім у композиції. По суті очищена молекула може бути, наприклад, щонайменше на 60% вільною, щонайменше на 75% вільною або 6 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше на 90% вільною від інших молекул, крім розчинника, присутнього у природній суміші. Термін "по суті очищений" не стосується молекул, присутніх у їх нативному стані. Молекула нуклеїнової кислоти. Як використовують у рамках винаходу, термін "молекула нуклеїнової кислоти" може стосуватися полімерної форми нуклеотидів, яка може включати як смисловий, так і антисмисловий ланцюги РНК, кДНК, геномної ДНК і їх синтетичні форми і змішані полімери. Нуклеотид може належати до рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду або модифікованої форми будь-якого типу нуклеотиду. "Молекула нуклеїнової кислоти", як використовують у рамках винаходу, є синонімом "нуклеїнової кислоти" і "полінуклеотиду". Молекула нуклеїнової кислоти звичайно має щонайменше 10 основ у довжину, якщо немає інших указань. Термін включає одноланцюжкові і дволанцюжкові форми ДНК. Молекули нуклеїнової кислоти включають димерні (так називані тандемні) форми і продукти транскрипції молекул нуклеїнової кислоти. Молекула нуклеїнової кислоти може включати кожний або обидва нуклотиди, які зустрічаються і не зустрічається в природі, зв'язані разом модифікованими, такими, що зустрічаються і не зустрічаються в природі, нуклеотидними зв'язками. Молекули нуклеїнових кислот можуть бути модифікованими хімічно або біохімічно або можуть містити неприродні або перетворені нуклеотидні основи, як добре зрозуміло фахівцям у даній галузі. Такі модифікації включають, наприклад, мітки, метилування, заміну одного або декількох нуклеотидів, що зустрічаються в природі, аналогом, міжнуклеотидні модифікації (наприклад, незаряджені зв'язки, наприклад метилфосфонати, фосфотриефіри, фосфорамідати, карбамати і т. д.; заряджені зв'язки, наприклад фосфоротіоати, фосфородитіоати і т. д.; виступаючі частини, наприклад пептиди; інтеркалюючі агенти, наприклад акридин, псорален і т. д.; хелатори; алкілатори і модифіковані зв'язки, наприклад альфа-аномерні нуклеїнові кислоти і т. д.). Термін "молекула нуклеїнової кислоти" також включає будь-яку топологічну конформацію, включаючи одноланцюжкову, дволанцюжкову, частково дуплексну, триплексну, шпилькову, кільцеподібну конформації і конформацію висячого замка. Як використовують у рамках винаходу відносно ДНК, терміни "кодуюча послідовність", "структурна нуклеотидна послідовність" або "структурна молекула нуклеїнової кислоти" стосуються нуклеотидної послідовності, яка зрештою транслюється в поліпептид через транскрипцію і мРНК, коли вона знаходиться під контролем відповідних регуляторних послідовностей. Що стосується РНК, термін "кодуюча послідовність" стосується нуклеотидної послідовності, яка транслюється в пептид, поліпептид або білок. Границі кодуючої послідовності визначаються шляхом трансляції ініціюючого кодону на 5'-кінці і стоп-кодону на 3'-кінці. Кодуючі послідовності включають, але не обмежуються ними, геномну ДНК; кДНК; EST і рекомбінантні нуклеотидні послідовності. У деяких варіантах здійснення винахід стосується нуклеотидних послідовностей, які можуть бути виділеними, очищеними або частково очищеними, наприклад, з використанням способів розділення, наприклад, таких як іонообмінна хроматографія; способів виключення по молекулярному розміру або по афінності; способів фракціонування на основі розчинності в різних розчинниках і способів генетичної інженерії, таких як ампліфікація, клонування і субклонування. Ідентичність послідовностей. Термін "ідентичність послідовностей" або "ідентичність", як використовують у рамках винаходу в контексті двох послідовностей нуклеїнових кислот або поліпептидів, може стосуватися залишків у двох послідовностях, що є однаковими при вирівнюванні на максимальну відповідність на протязі зазначеного вікна порівняння. Як використовують у рамках винаходу, термін "відсоток ідентичності послідовностей" може стосуватися величини, визначуваної шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей (наприклад, послідовностей нуклеїнових кислот і амінокислотних послідовностей) на протязі вікна порівняння, де частина послідовності у вікні порівняння може містити вставки або делеції (тобто пропуски) у порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить вставок або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток обчислюють шляхом визначення кількості положень, у яких ідентичний нуклеотидний або амінокислотний залишок зустрічається в обох послідовностях, з одержанням кількості положень, що співпали, ділення кількості положень, що співпали, на загальну кількість положень у вікні порівняння і множення результату на 100 з одержанням відсотка ідентичності послідовностей. Способи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі в даній галузі. Різні програми й алгоритми вирівнювання описані, наприклад, у: Smith and Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988), Gene, 73:237-44; Higgins and 7 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Sharp (1989), CABIOS, 5:151-3; Corpet et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992), Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994), Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999), FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Детальний розгляд способів вирівнювання послідовностей і обчислення гомології може бути знайдений, наприклад, у Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10. TM Basic Local Alignment Search Tool (BLAST ; Altschul et al. (1990)) від National Center for Biotechnology Information (NCBI) доступний з декількох джерел, у тому числі National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), і через Інтернет, для застосування разом з декількома програмами аналізу послідовностей. Опис того, як визначати ідентичність послідовностей з TM використанням цієї програми, доступний через Інтернет у розділі "help" для BLAST . Для порівнянь послідовностей нуклеїнових кислот можна використовувати функцію "Blast 2 TM sequences" програми BLAST (Blastn) з використанням матриці BLOSUM62 за замовчуванням з параметрами за замовчуванням. Послідовності нуклеїнових кислот з великою подібністю з еталонними послідовностями будуть демонструвати збільшення процентної ідентичності при оцінці цим способом. Такий, що специфічно гібридизується/специфічно комплементарний. Як використовують у рамках винаходу, терміни "такий, що специфічно гібридизується," і "специфічно комплементарний" являють собою терміни, що вказують на достатній ступінь комплементарності, щоб між молекулою нуклеїнової кислоти і молекулою нуклеїнової кислотимішенню відбувалося стабільне і специфічне зв'язування. Гібридизація між двома молекулами нуклеїнових кислот залучає формування антипаралельного вирівнювання між послідовностями нуклеїнових кислот двох молекул нуклеїнової кислоти. Потім дві молекули здатні утворювати водневі зв'язки з відповідними основами на протилежному ланцюзі з утворенням дуплексної молекули, яка, якщо вона є достатньо стабільною, піддається виявленню з використанням способів, добре відомих у даній галузі. Молекула нуклеїнової кислоти не повинна бути на 100% комплементарною її послідовності-мішені, щоб бути такою, що специфічно гібридизується. Однак величина комплементарності послідовностей, що повинна існувати для гібридизації, щоб вона була специфічною, залежить від використовуваних умов гібридизації. Умови гібридизації, які забезпечують конкретні ступені жорсткості, варіюють, залежно від типу вибраного способу гібридизації і композиції і довжини послідовностей нуклеїнових кислот, що гібридизуються. Як правило, жорсткість гібридизації визначається температурою + ++ гібридизації й іонною силою (особливо концентрацією Na і/або Mg ) буфера для гібридизації, хоча також на жорсткість впливає кількість разів промивання. Обчислення, що стосуються умов гібридизації, необхідних для досягнення конкретних ступенів жорсткості, відомі середнім фахівцям у даній галузі і розглянуті, наприклад, у Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; і Hames and Higgins (eds.), Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Подальша детальна інструкція і керівництво відносно гібридизації нуклеїнових кислот можуть бути знайдені, наприклад, у Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; і Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995. Як використовують у рамках винаходу, "жорсткі умови" охоплюють умови, при яких гібридизація відбувається, тільки якщо існує менше 20% невідповідностей між молекулою, що гібридизується, і гомологічною послідовністю в молекулі нуклеїнової кислоти-мішені. "Жорсткі умови" включають інші конкретні рівні жорсткості. Таким чином, як використовують у рамках винаходу, умови "помірної жорсткості" являють собою умови, у яких молекули з більше ніж 20% невідповідностей послідовностей не гібридизується; умови "високої жорсткості" являють собою умови, у яких послідовності з більше ніж 10% невідповідностей не гібридизуються; і умови "дуже високої жорсткості" являють собою умови, при яких послідовності з більше ніж 5% невідповідностей не гібридизуються. Нижче представлені типові необмежувальні умови гібридизації. Умови високої жорсткості (виявляють послідовності, що мають щонайменше 90% ідентичність послідовностей): гібридизація в 5× буфері SSC при 65 °C протягом 16 годин; промивання два рази в 2× буфері SSC при кімнатній температурі протягом 15 хвилин кожного разу; і промивання два рази в 0,5× буфері SSC при 65 °C протягом 20 хвилин кожного разу. Умови помірної жорсткості (виявляють послідовності, що мають щонайменше 80% ідентичність послідовностей): гібридизація в 5×-6× буфері SSC при 65-70 °C протягом 16-20 годин; промивання два рази в 2× буфері SSC при кімнатній температурі протягом 5-20 хвилин 8 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кожного разу; і промивання два рази в 1× буфері SSC при 55-70 °C протягом 30 хвилин кожного разу. Нежорсткі контрольні умови (гібридизуються послідовності, що мають щонайменше 50% ідентичність послідовностей): гібридизація в 6× буфері SSC при температурі від кімнатної температури до 55 °C протягом 16-20 годин; промивання щонайменше два рази в 2×-3× буфері SSC при температурі від кімнатної температури до 55 °C протягом 20-30 хвилин кожного разу. Як використовують у рамках винаходу, термін "по суті гомологічний" або "суттєва гомологія" відносно безперервної послідовності нуклеїнової кислоти, стосується безперервних нуклеотидних послідовностей, які гібридизуються в жорстких умовах з еталонною послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, послідовності нуклеїнової кислоти, які по суті гомологічні еталонній послідовності нуклеїнової кислоти, являють собою послідовності нуклеїнової кислоти, які гібридизуються в жорстких умовах (наприклад, умовах помірної жорсткості і т. д., вище) з еталонною послідовністю нуклеїнової кислоти. По суті гомологічні послідовності можуть мати щонайменше 80% ідентичність послідовностей. Наприклад, по суті гомологічні послідовності можуть мати приблизно від 80% до 100% ідентичність послідовностей, як, наприклад, приблизно 81%; приблизно 82%; приблизно 83%; приблизно 84%; приблизно 85%; приблизно 86%; приблизно 87%; приблизно 88%; приблизно 89%; приблизно 90%; приблизно 91%; приблизно 92%; приблизно 93%; приблизно 94% приблизно 95%; приблизно 96%; приблизно 97%; приблизно 98%; приблизно 98,5%; приблизно 99%; приблизно 99,5% і приблизно 100%. Властивість суттєвої гомології є значною мірою пов'язаною зі специфічною гібридизацією. Наприклад, молекула нуклеїнової кислоти є такою, що специфічно гібридизується, коли існує достатній ступінь комплементарності, щоб уникнути неспецифічного зв'язування нуклеїнової кислоти з послідовностями, що не є мішенню, в умовах, де є бажаним специфічне зв'язування, наприклад у жорстких умовах гібридизації. Як використовують у рамках винаходу, термін "ортолог" (або "ортологічний") стосується гена в двох або більше видах, який еволюціонував із загальної нуклеотидної послідовностіпопередника і може зберігати одну і ту ж функцію в двох або більше видах. Як використовують у рамках винаходу, дві послідовності нуклеїнових кислот називають такими, що виявляють "повну комплементарність", коли кожен нуклеотид послідовності, що читається в напрямку від 5' до 3', комплементарний кожному нуклеотиду іншої послідовності, що читається в напрямку від 3' до 5'. Нуклеотидна послідовність, яка комплементарна еталонній нуклеотидній послідовності, має послідовність, ідентичну зворотній комплементарній послідовності для еталонної нуклеотидної послідовності. Ці терміни й описи докладно визначені в даній галузі і добре зрозумілі фахівцям даної галузі. При визначенні процентної ідентичності послідовностей між амінокислотними послідовностями фахівцям у даній галузі добре відомо, що ідентичність амінокислот у даному положенні, забезпечувана вирівнюванням, може відрізнятися без впливу на бажані властивості поліпептидів, що містять вирівняні послідовності. У цих випадках у процентну ідентичність послідовностей можна вносити поправку для урахування подібності між консервативно заміщеними амінокислотами. Ці поправки є добре відомими і широко використовуваними фахівцями в даній галузі. Див., наприклад, Myers and Miller (1988), Computer Applications in Biosciences 4:11-7. Варіанти здійснення винаходу включають функціональні варіанти ілюстративних амінокислотних послідовностей транзитного пептиду пластид і послідовності нуклеїнової кислоти, що їх кодують. Функціональний варіант ілюстративної послідовності транзитного пептиду може являти собою, наприклад, фрагмент ілюстративної амінокислотної послідовності транзитного пептиду (такий як N-кінцевий або C-кінцевий фрагмент) або модифіковану послідовність повнорозмірної ілюстративної амінокислотної послідовності транзитного пептиду, або фрагмент ілюстративної амінокислотної послідовності транзитного пептиду. Ілюстративну амінокислотну послідовність транзитного пептиду можна модифікувати в деяких варіантах здійснення шляхом внесення однієї або декількох консервативних амінокислотних замін. "Консервативна" амінокислотна заміна являє собою заміну, у якій амінокислотний залишок замінений амінокислотним залишком, що має подібний функціональний бічний ланцюг, подібний розмір і/або подібну гідрофобність. Сімейства амінокислот, які можна використовувати для заміни іншої амінокислоти того ж сімейства для внесення консервативної заміни, відомі в даній галузі. Наприклад, ці сімейства амінокислот включають: основні амінокислоти (наприклад, лізин, аргінін і гістидин); кислі амінокислоти (наприклад, аспарагінова кислота і глутамінова кислота); незаряджені (при фізіологічних значеннях pН) полярні амінокислоти (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин і цитозин); неполярні амінокислоти (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін і триптофан); бета-розгалужені 9 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислоти (наприклад, треонін, валін і ізолейцин) і ароматичні амінокислоти (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан і гістидин). Див., наприклад, Sambrook et al. (Eds.), вище; і Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, NY, USA. Функціонально зв'язаний. Перша нуклеотидна послідовність "функціонально зв'язана" з другою нуклеотидною послідовністю, коли перша нуклеотидна послідовність знаходиться у функціональному взаємозв'язку з другою нуклеотидною послідовністю. Наприклад, промотор функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо промотор впливає на транскрипцію або експресію кодуючої послідовності. У випадку рекомбінантної продукції функціонально зв'язані нуклеотидні послідовності, як правило, є сусідніми і, коли необхідно зв'язати дві кодуючі білок області, знаходяться в одній і тій же рамці зчитування. Однак нуклеотидні послідовності не повинні бути сусідніми, щоб бути функціонально зв'язаними. Термін "функціонально зв'язаний", коли його використовують відносно регуляторної послідовності і кодуючої послідовності, означає, що регуляторна послідовність впливає на експресію зв'язаної з нею кодуючої послідовності. "Регуляторні послідовності" або "елементи контролю" стосуються нуклеотидних послідовностей, що впливають на час і рівень/величину транскрипції, процесингу або стабільності РНК або трансляції асоційованої з ними кодуючої послідовності. Регуляторні послідовності можуть включати промотори; лідерні послідовності трансляції; інтрони; енхансери; структури стебло-петля; послідовності, що зв’язують репресор; послідовності термінації; послідовності, що розпізнають поліаденілювання, і т. д. Конкретні регуляторні послідовності можуть бути розташовані вище і/або нижче кодуючої послідовності, функціонально зв'язаної з ними. Також конкретні регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з кодуючою послідовністю, можуть бути розташовані на асоційованому з ними комплементарному ланцюзі дволанцюжкової молекули нуклеїнової кислоти. При використанні відносно двох або більше амінокислотних послідовностей, термін "функціонально зв'язаний" означає, що перша амінокислотна послідовність знаходиться у функціональному взаємозв'язку щонайменше з однією з додаткових амінокислотних послідовностей. Наприклад, транзитний пептид (наприклад, CTP) функціонально зв'язаний з другою амінокислотною послідовністю в поліпептиді, що містить обидві послідовності, якщо транзитний пептид впливає на експресію або транспорт поліпептиду або другої амінокислотної послідовності. Промотор. Як використовують у рамках винаходу, термін "промотор" стосується області ДНК, яка може бути розташована вище від початку транскрипції і яка може бути залучена в розпізнавання і зв'язування РНК-полімерази й інших білків для ініціації транскрипції. Промотор може бути функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю для експресії в клітині або промотор може бути функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що кодує сигнальну послідовність, яка може бути функціонально зв'язана з кодуючою послідовністю, для експресії в клітині. "Промотор рослин" може являти собою промотор, здатний ініціювати транскрипцію в клітинах рослин. Приклади промоторів, що знаходяться під контролем стадії розвитку, включають промотори, які переважно ініціюють транскрипцію у визначених тканинах, таких як листи, корені, насіння, волокна, судини ксилеми, трахеїди або склеренхіма. Такі промотори називають "переважними для тканини". Промотори, що ініціюють транскрипцію тільки у визначених тканинах, називають "тканиноспецифічними". "Специфічний до типу клітин" промотор, як правило, запускає експресію у визначених типах клітин в одному або декількох органах, наприклад у клітинах судин у коренях або листах. "Індуцибельний" промотор може являти собою промотор, який може знаходитися під контролем умов навколишнього середовища. Приклади умов навколишнього середовища, які можуть ініціювати транскрипцію індуцибельними промоторами, включають анаеробні умови і присутність світла. Тканиноспецифічні, переважні для тканин, специфічні до типу клітин і індуцибельні промотори складають клас "неконститутивних" промоторів. "Конститутивний" промотор являє собою промотор, що може бути активним при більшості умов навколишнього середовища. У деяких варіантах здійснення винаходу можна використовувати будь-який індуцибельний промотор. Див. Ward et al. (1993), Plant Mol. Biol. 22:361-366. У випадку індуцибельного промотору швидкість транскрипції зростає у відповідь на індукуючий агент. Ілюстративні індуцибельні промотори включають, але не обмежуються ними: промотори з системи ACEI, що відповідають на мідь; ген In2 з кукурудзи, що відповідає на антидоти бензолсульфонамідних гербіцидів; Tet-репресор з Tn10 і індуцибельний промотор з гена стероїдного гормону, транскрипційна активність якого може бути індукована глюкокортикостероїдним гормоном (Schena et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:0421). Ілюстративні конститутивні промотори включають, але не обмежуються ними: промотори з вірусів рослин, такі як промотор 35S з CaMV; промотори з генів актину рису; промотори 10 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 убіквітину; pEMU; MAS; промотор гістону H3 кукурудзи і промотор ALS, фрагмент XbaI/NcoI з 5'сторони від структурного гена ALS3 Brassica napus (або послідовність, подібна з зазначеним фрагментом XbaI/NcoI) (міжнародна публікація PCT № WO 96/30530). Крім того, у деяких варіантах здійснення можна використовувати будь-який тканиноспецифічний або переважний для тканин промотор. Рослини, трансформовані молекулою нуклеїнової кислоти, що містить кодуючу послідовність, функціонально зв'язану з тканиноспецифічним промотором, можуть продукувати продукт кодуючої послідовності винятково, або переважно, у конкретній тканині. Ілюстративні тканиноспецифічні або переважні для тканин промотори включають, але не обмежуються ними: переважний для коренів промотор, такий як промотор гена фазеоліну; специфічний для листів або індукований світлом промотор, такий як промотор з cab або rubisco; специфічний для пиляка промотор, такий як промотор з LAT52; специфічний для пилка промотор, такий як промотор з Zm13; і переважний для мікроспор промотор, такий як промотор з apg. Трансформація. Як використовують у рамках винаходу, термін "трансформація" або "трансдукція" стосується перенесення однієї або декількох молекул нуклеїнової кислоти (кислот) у клітину. Клітина "трансформована" молекулою нуклеїнової кислоти, трансдукованою у клітину, коли молекула нуклеїнової кислоти стає стабільно реплікованою клітиною, або шляхом включення молекули нуклеїнової кислоти в клітинний геном, або шляхом епісомної реплікації. Як використовують у рамках винаходу, термін "трансформація" охоплює всі способи, за допомогою яких молекула нуклеїнової кислоти може бути введена в таку клітину. Приклади включають, але не обмежуються ними: трансфекцію вірусними векторами; трансформацію плазмідними векторами; електропорацію (Fromm et al. (1986), Nature, 319:791-3); ліпофекцію (Felgner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7); мікроін'єкцію (Mueller et al. (1978), Cell, 15:579-85); опосередковуване Agrobacterium перенесення (Fraley et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4803-7); пряме захоплення ДНК і бомбардування мікроснарядами (Klein et al. (1987), Nature, 327:70). Трансген: екзогенна послідовність нуклеїнової кислоти. У деяких прикладах трансген може являти собою послідовність, що кодує поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica. У конкретних прикладах трансген може кодувати поліпептид, що містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica, і щонайменше додаткову пептидну послідовність (наприклад, пептидна послідовність, що надає стійкість до гербіцидів), для якої є бажаною експресія в пластиді. У цих і інших прикладах трансген може містити регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з кодуючою послідовністю трансгена (наприклад, промотор). Для цілей даного опису термін "трансгенний", коли його використовують для указання на організм (наприклад, рослину), стосується організму, що містить екзогенну послідовність нуклеїнової кислоти. У деяких прикладах організм, що містить екзогенну послідовність нуклеїнової кислоти, може являти собою організм, у який послідовність нуклеїнової кислоти була введена способами молекулярної трансформації. В інших прикладах організм, що містить екзогенну послідовність нуклеїнової кислоти, може являти собою організм, у який послідовність нуклеїнової кислоти була введена, наприклад, шляхом інтрогресії або перехресного запилення в рослині. Транспорт. Як використовують у рамках винаходу, терміни "транспорт(и)", "мішень(і)" і "перенесення" стосуються властивості визначених амінокислотних послідовностей за винаходом, що сприяє переміщенню поліпептиду, який містить амінокислотну послідовність, з ядра клітини-хазяїна в пластиду клітини-хазяїна. У конкретних варіантах здійснення така амінокислотна послідовність (тобто синтетична послідовність CTP, що походить з Brassica) може бути здатна транспортувати приблизно 100%, щонайменше приблизно 95%, щонайменше приблизно 90%, щонайменше приблизно 85%, щонайменше приблизно 80%, щонайменше приблизно 70%, щонайменше приблизно 60% і/або щонайменше приблизно 50% поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність, у пластиди клітини-хазяїна. Вектор: молекула нуклеїнової кислоти, введена в клітину, наприклад, для одержання трансформованої клітини. Вектор може включати послідовності нуклеїнових кислот, що дозволяють йому реплікуватися в клітині-хазяїні, такі як ориджин реплікації. Приклади векторів включають, але не обмежуються ними: плазміду; косміду; бактеріофаг або вірус, що несуть екзогенну ДНК у клітину. Вектор також може включати один або декілька генів, антисмислових молекул і/або генів селективних маркерів і інші генетичні елементи, відомі в даній галузі. Вектор може бути трансдукований, трансформований у клітину або він може інфікувати клітину, тим самим забезпечуючи експресію клітиною молекул нуклеїнових кислот і/або білків, кодованих вектором. Вектор необов'язково включає матеріали, що сприяють досягненню проникнення молекули нуклеїнової кислоти в клітину (наприклад, ліпосоми, білкове покриття і т. д.). 11 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Якщо немає інших указань і не передбачається інше, форма однини позначає "щонайменше один", як використовують у рамках винаходу. Якщо конкретно не зазначене інше, усі технічні і наукові терміни, використовувані в даному описі, мають те ж значення, що звичайно мають на увазі фахівці в галузі, до якої належить даний винахід. Визначення загальних термінів молекулярної біології можуть бути знайдені, наприклад,у Lewin B., Genes V., Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-021829); і Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Усі відсотки наведені по масі і всі співвідношення розчинників у суміші представлені по об’єму, якщо немає інших указань. Всі температури представлені в градусах Цельсія. IV. Молекули нуклеїнової кислоти, що містять синтетичну послідовність, яка кодує CTP, що походить з Brassica У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується молекули нуклеїнової кислоти, що містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес. У конкретних варіантах здійснення нуклеотидна послідовність, що представляє інтерес, може являти собою нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, що представляє інтерес. У конкретних прикладах передбачається одна молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, де послідовність TraP12 або TraP13 є злитою з N-кінцем поліпептиду, що представляє інтерес. Синтетичний CTP, що походить з Brassica, може походити з гена EPSPS Brassica. У конкретних прикладах таких варіантів здійснення ген EPSPS Brassica може містити послідовність нуклеїнової кислоти, зазначену як SEQ ID NO: 1, гомологічну послідовність нуклеїнової кислоти з іншого гена EPSPS або ортолог гена Brassica EPSPS, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, зазначену як SEQ ID NO: 1. У деяких варіантах здійснення синтетичний транзитний пептид хлоропластів, що походить з Brassica, може являти собою химерний CTP, що походить з Brassica. Синтетичний CTP, що походить з Brassica, може походити з еталонної послідовності CTP Brassica шляхом зв'язування першої безперервної амінокислотної послідовності, що міститься в еталонній послідовності CTP Brassica, з другою безперервною амінокислотною послідовністю, що міститься у відмінній послідовності CTP (наприклад, послідовність CTP, одержана з Arabidopsis sp.). У конкретних варіантах здійснення, відмінна послідовність CTP, що містить другу безперервну амінокислотну послідовність, може кодуватися послідовністю гомологічного гена з геному, відмінного від геному Brassica sp., з якого одержана еталонна послідовність (наприклад, відмінний Brassica sp., рослина, відмінна від Brassica sp.; нижчий фотосинтезуючий еукаріотичний організм, наприклад хлорофіт; і прокаріотичний організм, наприклад Cyanobacterium або Agrobacterium). Таким чином, нуклеотидна послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, може походити з еталонної послідовності гена, що кодує CTP Brassica, шляхом злиття нуклеотидної послідовності, що кодує безперервну амінокислотну послідовність еталонної послідовності CTP Brassica, з нуклеотидною послідовністю, що кодує безперервну амінокислотну послідовність з відмінної послідовності CTP, що гомологічна іншій частині еталонної послідовності CTP Brassica. У цих і інших прикладах безперервна амінокислотна послідовність еталонної послідовності CTP Brassica може бути розташована на 5'-кінці або 3'кінці синтетичного CTP, що походить з Brassica. У деяких варіантах здійснення синтетичний химерний CTP, що походить з Brassica, може походити з множини послідовностей CTP Brassica (включаючи еталонну послідовність CTP Brassica) шляхом зв'язування безперервної амінокислотної послідовності, що міститься в одній послідовності CTP Brassica, з безперервною амінокислотною послідовністю, що міститься у відмінній послідовності CTP Brassica. У конкретних варіантах здійснення, множина послідовностей CTP Brassica може кодуватися ортологічними послідовностями генів у різних видах Brassica. У деяких прикладах множина послідовностей CTP Brassica може являти собою конкретно дві послідовності CTP Brassica. Таким чином, нуклеотидна послідовність, яка кодує синтетичний химерний CTP, що походить з Brassica, може походити з двох гомологічних (наприклад, по суті гомологічних) послідовностей гена, що кодують Brassica CTP (наприклад, послідовності ортологічних генів), шляхом злиття нуклеотидної послідовності, що кодує безперервну амінокислотну послідовність однієї з послідовностей CTP Brassica, з нуклеотидною послідовністю, що кодує безперервну амінокислотну послідовність з інших послідовностей CTP Brassica, що гомологічна іншій частині першої послідовності CTP Brassica. Ілюстративними прикладами такого синтетичного химерного CTP, що походить з Brassica, є TraP12 і TraP13. 12 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення синтетичний химерний CTP, що походить з Brassica, може походити з еталонної послідовності CTP Brassica внаслідок зв'язування безперервної амінокислотної послідовності, що міститьсяв еталонній послідовності CTP Brassica, з безперервною амінокислотною послідовністю, що міститься в другій послідовності CTP, одержаній з відмінного організму. У конкретних варіантах здійснення друга послідовність CTP може кодуватися послідовністю ортологічного гена у відмінному організмі. Нуклеотидна послідовність, яка кодує синтетичний химерний CTP, що походить з Brassica, може походити з еталонної послідовності CTP Brassica внаслідок злиття нуклеотидної послідовності, що кодує безперервну амінокислотну послідовність еталонної послідовності CTP Brassica, з нуклеотидною послідовністю, що кодує безперервну амінокислотну послідовність з гомологічної (наприклад, по суті гомологічної) послідовності гена, що кодує CTP (наприклад, послідовність ортологічного гена), з послідовності CTP відмінного організму, що гомологічна іншій частині еталонної послідовності CTP Brassica. TraP12 і TraP13 є ілюстративними прикладами такого синтетичного химерного CTP, що містить послідовності CTP, які походять з Brassica і Arabidopsis thaliana. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що після вибору першої безперервної амінокислотної послідовності в еталонній послідовності CTP Brassica, ідентифікація і вибір безперервної амінокислотної послідовності з іншої частини гомологічної послідовності CTP відповідно до зазначеного вище процесу дериватизації є однозначним і автоматичним. У деяких прикладах перша безперервна амінокислотна послідовність може мати довжину від приблизно 25 до приблизно 41 амінокислот (наприклад, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 і 42 амінокислоти у довжину). У деяких варіантах здійснення перша безперервна амінокислотна послідовність в еталонній послідовності CTP Brassica визначається положенням на 3'-кінці мотиву "SVSL" (SEQ ID NO: 9), що є консервативним у деяких генах EPSPS Brassica. Приклади синтетичних химерних послідовностей CTP, що походять з Brassica, відповідно до зазначеного вище процесу представлені в SEQ ID NO: 6 і 8. Через виродженість генетичного коду, рід нуклеотидних послідовностей, що кодують ці пептиди, безпосередньо передбачається фахівцем у даній галузі. Ці конкретні приклади ілюструють структурні ознаки синтетичних химерних CTP, що походять з Brassica, шляхом включення безперервних послідовностей з гомологічного CTP з одного з декількох ортологів ESPSP гена ESPSP B. napus. Деякі варіанти здійснення включають функціональні варіанти синтетичного транзитного пептиду хлоропластів, що походить з Brassica, і/або нуклеїнові кислоти, що їх кодують. Такі функціональні варіанти включають, наприклад, але не обмежуючись ними: синтетичну послідовність, яка походить з Brassica, що кодує CTP, яка походить з гомолога і/або ортолога послідовностей, що кодують CTP Brassica, зазначених як SEQ ID NO: 1, і/або CTP, кодований нею; нуклеїнову кислоту, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, який містить безперервну амінокислотну послідовність у SEQ ID NO: 2, і/або CTP, кодований нею; укорочену синтетичну послідовність, яка походить з Brassica, що кодує CTP, яка містить безперервну послідовність нуклеїнової кислоти в одній з SEQ ID NO: 5, 7, 11, 12, 13, 15, 17 і 19; укорочену синтетичну послідовність CTP, що походить з Brassica, яка містить безперервну послідовність нуклеїнової кислоти, що по суті гомологічна одній з SEQ ID NO: 5, 7, 11, 12, 13, 15, 17 і 19; укорочений синтетичний CTP, що походить з Brassica, який містить безперервну амінокислотну послідовність в одній з SEQ ID NO: 6 і 8; нуклеїнову кислоту, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, який містить безперервну амінокислотну послідовність в одній з SEQ ID NO: 6 і 8, і/або CTP, кодований нею; нуклеїнову кислоту, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, який містить безперервну амінокислотну послідовність в одній з SEQ ID NO: 6 і 8, що має одну або декілька консервативних амінокислотних замін, і/або CTP, кодований нею; і нуклеїнову кислоту, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, який містить безперервну амінокислотну послідовність в одній з SEQ ID NO: 6 і 8, що має одну або декілька неконсервативних амінокислотних замін, для яких продемонстровано, що вони направляють функціонально зв'язаний пептид у пластиду в клітині, що містить пластиду, і/або CTP, кодований нею. Таким чином, деякі варіанти здійснення винаходу включають молекулу нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує синтетичний химерний CTP, що походить з Brassica, який містить одну або декілька консервативних амінокислотних замін. Така молекула нуклеїнової кислоти може бути придатною, наприклад, для полегшення маніпулювання кодуючою CTP послідовністю за винаходом в способах молекулярної біології. Наприклад, у деяких варіантах здійснення, кодуючу CTP послідовність за винаходом можна вводити в придатний вектор для субклонування послідовності в експресуючий вектор, або кодуючу CTP послідовність за винаходом можна вбудовувати в молекулу нуклеїнової кислоти, що сприяє 13 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 продукції іншої молекули нуклеїнової кислоти, яка містить кодуючу CTP послідовність, функціонально зв'язану з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес. У цих і інших варіантах здійснення може бути видалене одне або декілька положень амінокислот у послідовності синтетичного химерного CTP, що походить з Brassica. Наприклад, послідовність синтетичного химерного CTP, що походить з Brassica, може бути модифікована так, щоб амінокислота(и) у положеннях 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 була видалена. Вирівнювання гомологічних послідовностей CTP можна використовувати для одержання указань на те, які амінокислоти можна видаляти без впливу на функцію синтетичного CTP. У конкретних прикладах синтетичний транзитний пептид хлоропластів, що походить з Brassica, має довжину менше 80 амінокислот. Наприклад, синтетичний CTP, що походить з Brassica, може мати довжину 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60 або менше амінокислот. У визначених прикладах синтетичний CTP, що походить з Brassica, може мати довжину приблизно 65, приблизно 68, приблизно 72 або приблизно 74 амінокислот. У цих і наступних прикладах синтетичний CTP, що походить з Brassica, може містити амінокислотну послідовність, зазначену в одній з SEQ ID NO: 6 і 8, або функціональний варіант будь-якої з зазначених вище. Таким чином, синтетичний CTP, що походить з Brassica, може містити амінокислотну послідовність, яка містить одну з SEQ ID NO: 6 і 8, або її функціональний варіант, де довжина синтетичного CTP, що походить з Brassica, складає менше 80 амінокислот. У визначених прикладах синтетичний CTP, що походить з Brassica, може містити амінокислотну послідовність, яка, наприклад, щонайменше на 80%, щонайменше на 85%, щонайменше на 90%, щонайменше на 92%, щонайменше на 94%, щонайменше на 95%, щонайменше на 96%, щонайменше на 97%, щонайменше на 98%, щонайменше на 99% або на 100% ідентична одній з SEQ ID NO: 6 і 8. Усі нуклеотидні послідовності, які кодують конкретний синтетичний CTP, що походить з Brassica, наприклад пептид TraP12 SEQ ID NO: 6, пептид TraP13 SEQ ID NO: 8, або функціональні варіанти будь-якого з зазначених вище, включаючи будь-які конкретні делеції і/або консервативні амінокислотні заміни, будуть відомі фахівцям у даній галузі з урахуванням даного опису. Виродженість генетичного коду забезпечує кінцеву кількість кодуючих послідовностей для конкретної амінокислотної послідовності. Вибір конкретної послідовності, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, здійснюється за розсудом практикуючого фахівця. У різних застосуваннях можуть бути бажаними різні кодуючі послідовності. Наприклад, для збільшення експресії синтетичного CTP, що походить з Brassica, у конкретному хазяїні можна вибирати кодуючу послідовність, що відображає переважне використання кодонів хазяїном. Як приклад, синтетичний CTP, що походить з Brassica, може кодуватися нуклеотидною послідовністю, зазначеною як одна з SEQ ID NO: 5, 7, 11, 12, 13, 15, 17 і 19. У молекулах нуклеїнової кислоти, передбачуваних в деяких варіантах здійснення винаходу, останній кодон нуклеотидної послідовності, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, і перший кодон нуклеотидної послідовності, що представляє інтерес, можуть бути розділені будь-якою кількістю нуклеотидних триплетів, наприклад, без кодування інтрона або "зупинки". У деяких прикладах послідовність, що кодує перші амінокислоти зрілого білка, звичайно асоційована з транзитним пептидом хлоропластів у природному поліпептиді-попереднику, може бути присутньою між останнім кодоном нуклеотидної послідовності, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, і першим кодоном нуклеотидної послідовності, що представляє інтерес. Послідовність, що розділяє нуклеотидну послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, і перший кодон нуклеотидної послідовності, що представляє інтерес, може складатися, наприклад, з будь-якої послідовності, так щоб було малоймовірно, що кодована амінокислотна послідовність змінить трансляцію химерного поліпептиду і його переміщення в пластиду. У цих і наступних варіантах здійснення останній кодон нуклеотидної послідовності, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, може бути злитий у рамці зчитування з першим кодоном нуклеотидної послідовності, що представляє інтерес, безпосередньо сусідньої з ним або відділеної від нього не більше ніж на коротку пептидну послідовність, таку як пептидна послідовність, кодована синтетичним нуклеотидним лінкером (наприклад, нуклеотидний лінкер, який можна використовувати для забезпечення злиття). У деяких варіантах здійснення може бути бажаною модифікація нуклеотидів нуклеотидної послідовності, що представляє інтерес, і/або послідовності, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, злитої з нею в одній кодуючій послідовності, наприклад, для підвищення експресії кодуючої послідовності у конкретному хазяїні. Генетичний код є надмірним при наявності 64 можливих кодонів, однак більшість організмів переважно використовують підгрупу цих кодонів. Кодони, які використовуються найбільш часто видом, називаються оптимальними 14 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кодонами, і не використовувані кодони дуже часто класифікують як рідкі кодони або маловикористовувані кодони. Zhang et al. (1991), Gene, 105:61-72. Кодони можна заміняти так, щоб це відображало переважне використання кодонів у конкретному хазяїні в процесі, іноді позначуваному як "оптимізація кодонів". Оптимізовані кодуючі послідовності, що містять кодони, переважні для конкретного прокаріотичного або еукаріотичного хазяїна, можна одержувати, наприклад, для підвищення швидкості трансляції або для одержання рекомбінантних РНКтранскриптів, що мають бажані властивості (наприклад, більш тривалий час напівжиття в порівнянні з транскриптами, одержаними з неоптимізованої послідовності). Будь-який поліпептид може бути націлений у пластиду клітини, що містить пластиду, шляхом включення послідовності синтетичного CTP, що походить з Brassica. Наприклад, у деяких варіантах здійснення поліпептид може бути зв'язаний з послідовністю синтетичного CTP, що походить з Brassica, так, щоб направляти поліпептид у пластиду в клітині, де експресується зв'язана молекула поліпептид-CTP. У конкретних варіантах здійснення поліпептид, націлений у пластиду шляхом включення послідовності синтетичного CTP, що походить з Brassica, може являти собою, наприклад, поліпептид, що звичайно експресується в пластиді клітини, де поліпептид експресується нативним чином. Наприклад, але не обмежуючись цим, поліпептид, націлений у пластиду шляхом включення послідовності синтетичного CTP, що походить з Brassica, може являти собою поліпептид, залучений у стійкість до гербіциду, стійкість до вірусу, стійкість до бактеріального патогену, стійкість до комах, стійкість до круглих черв’яків або стійкість до грибів. Див., наприклад, патенти США №№ 5569823; 5304730; 5495071; 6329504 і 6337431. Поліпептид, націлений у пластиду шляхом включення послідовності синтетичного CTP, що походить з Brassica, альтернативно може являти собою, наприклад, але не обмежуючись цим, поліпептид, залучений в активність росту і врожайність рослини (включаючи поліпептиди, залучені в стійкість до екстремальних температур, умов ґрунту, рівнів освітленості, рівнів води і хімічного середовища), або поліпептид, який можна використовувати як маркер для ідентифікації рослини, яка має ознаку, що представляє інтерес (наприклад, продукт гена селективного маркера, поліпептид, залучений у забарвлення і т. д.). Необмежувальні приклади поліпептидів, залучених у стікість до гербіцидів, що можуть бути зв'язані з пептидною послідовністю синтетичного CTP, що походить з Brassica, у деяких варіантах здійснення винаходу включають: ацетолактатсинтазу (ALS), мутантну ALS і попередників ALS (див., наприклад, патент США № 5013659); EPSPS (див., наприклад, патенти США №№ 4971908 і 6225114), таку як EPSPS CP4 або EPSPS класу III; ферменти, які модифікують фізіологічний процес, що відбувається в пластиді, включаючи фотосинтез і синтез жирних кислот, амінокислот, олій, аротиноїдів, терпеноїдів, крохмалю і т. д. Інші необмежувальні приклади поліпептидів, які можуть бути зв'язані з синтетичним пептидом CTP, що походить з Brassica, у конкретних варіантах здійснення включають: зеаксантинепоксидазу, холінмонооксигеназу, ферохелатазу, десатуразу омега-3 жирних кислот, глутамінсинтетазу, ферменти, що модифікують крохмаль, поліпептиди, залучені в синтез незамінних амінокислот, провітамін A, гормони, білки Bt-токсину і т. д. Нуклеотидні послідовності, що кодують згадані вище пептиди, відомі в даній галузі, і такі нуклеотидні послідовності можуть бути функціонально зв'язані з нуклеотидною послідовністю, яка кодує синтетичний пептид CTP, що походить з Brassica, для експресії у вигляді поліпептиду, який містить поліпептид, що представляє інтерес, зв'язаний з синтетичним пептидом CTP, що походить з Brassica. Більше того, додаткові нуклеотидні послідовності, що кодують будь-який зі згаданих вище пептидів, можуть бути ідентифіковані фахівцями в даній галузі (наприклад, шляхом клонування генів з високою гомологією з іншими генами, що кодують конкретний поліпептид). Після ідентифікації такої нуклеотидної послідовності, конструювання нуклеотидної послідовності, що містить послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, функціонально зв'язану з ідентифікованою нуклеотидною послідовністю, або послідовність, що кодує еквівалентний поліпептид, є неважким процесом. V. Експресія поліпептидів, які містять синтетичний транзитний пептид хлоропластів, що походить з Brassica У деяких варіантах здійснення щонайменше одну молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica, або його функціональний еквівалент, можна вводити в клітину, тканину або організм для експресії в ньому поліпептиду. У конкретних варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти може містити нуклеотидну послідовність, що представляє інтерес, функціонально зв'язану з нуклеотидною послідовністю, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica. Наприклад, молекула нуклеїнової кислоти може містити кодуючу послідовність, що кодує поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що 15 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 походить з Brassica, і щонайменше додаткову пептидну послідовність, кодовану нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес. У деяких варіантах здійснення молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом можна вводити в клітину-хазяїна, що містить пластиду, тканину або організм (наприклад, клітина рослини, тканина рослини і рослина), так, щоб з молекули нуклеїнової кислоти в хазяйській клітині, що містить пластиду, тканині або організмі міг експресуватися поліпептид, де експресований поліпептид містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica, і щонайменше додаткову пептидну послідовність, кодовану нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес. У визначених прикладах синтетичний CTP, що походить з Brassica, такого експресованого поліпептиду може полегшувати націлювання частини поліпептиду, що містить щонайменше додаткову пептидну послідовність, у пластиду клітини-хазяїна, тканини або організму. У деяких варіантах здійснення молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом можна вводити в клітину, що містить пластиду, за допомогою однієї з будь-яких методик, відомих фахівцям у даній галузі. У конкретних варіантах здійснення клітину-хазяїна, тканину або організм можна вводити в контакт з молекулою нуклеїнової кислоти за винаходом для введення молекули нуклеїнової кислоти в клітину, тканину або організм. У конкретних варіантах здійснення клітину можна трансформувати молекулою нуклеїнової кислоти за винаходом так, щоб у клітину була введена молекула нуклеїнової кислоти і молекула нуклеїнової кислоти стабільно вбудовувалася в геном клітини. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти, що містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica, функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес, можна використовувати для трансформації клітини, наприклад клітини, що містить пластиду (наприклад, клітини рослини). Для ініціації або посилення експресії молекула нуклеїнової кислоти може містити одну або декілька регуляторних послідовностей, що можуть бути функціонально зв'язані з нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica. Молекула нуклеїнової кислоти може являти собою, наприклад, векторну систему, що включає, наприклад, лінійну або замкнуту кільцеву плазміду. У конкретних варіантах здійснення вектор може являти собою експресуючий вектор. Послідовності нуклеїнової кислоти за винаходом можна вбудовувати, наприклад, у вектор так, щоб послідовність нуклеїнової кислоти була функціонально зв'язана з однією або декількома регуляторними послідовностями. Для цієї мети доступна множина векторів, і вибір конкретного вектора може залежати, наприклад, від розміру нуклеїнової кислоти, що підлягає вбудовуванню у вектор, і конкретної клітини-хазяїна, яку трансформують вектором. Вектор, як правило, містить різні компоненти, тип яких залежить від функції вектора (наприклад, ампліфікація ДНК і експресія ДНК) і конкретної клітини-хазяїна (клітин-хазяїнів), з якою вектор сумісний. Деякі варіанти здійснення можуть включати вектор для трансформації рослин, що містить нуклеотидну послідовність, яка містить щонайменше одну з описаних вище регуляторних послідовностей, функціонально зв'язаних з однією або декількома нуклеотидними послідовністями, що кодують поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica. Одну або декілька нуклеотидних послідовностей можна експресувати під контролем регуляторної послідовності(ей), у клітині рослини, тканині або організмі, з одержанням поліпептиду, який містить синтетичний CTP, що походить з Brassica, який націлює щонайменше частину поліпептиду в пластиди клітини рослини, тканини або організму. У деяких варіантах здійснення регуляторна послідовність, функціонально зв'язана з нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica, може являти собою промоторну послідовність, що функціонує в клітині-хазяїні, такій як бактеріальна клітина, де молекула нуклеїнової кислоти повинна ампліфікуватися, або клітина рослини, де молекула нуклеїнової кислоти повинна експресуватися. Промотори, придатні для застосування в молекулах нуклеїнових кислот за винаходом, включають промотори, що є індуцибельними, вірусними, синтетичними або конститутивними, усі з який добре відомі в даній галузі. Необмежувальні приклади промоторів, що можуть бути придатними у варіантах здійснення винаходу, надані в: патентах США №№ 6437217 (промотор RS81 кукурудзи); 5641876 (промотор актину рису); 6426446 (промотор RS324 кукурудзи); 6429362 (промотор PR-1 кукурудзи); 6232526 (промотор A3 кукурудзи); 6177611 (конститутивні промотори кукурудзи); 5322938, 5352605, 5359142 і 5530196 (промотор 35S); 6433252 (промотор L3 олеосину кукурудзи); 6429357 (промотор актину 2 рису і інтрон актину 2 рису); 6294714 (індуковані світлом промотори); 6140078 (індуковані сіллю промотори); 6252138 (індуковані патогеном промотори); 6175060 (індуковані дефіцитом фосфору промотори); 6388170 16 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (двонаправлені промотори); 6635806 (промотор гамма-коїксину); і патентній заявці США із серійним номером 09/757089 (промотор альдолази хлоропластів кукурудзи). Додаткові ілюстративні промотори включають промотор нопалінсинтази (NOS) (Ebert et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84(16):5745-9) і промотор октопінсинтази (OCS) (який міститься в індукуючих пухлину плазмідах Agrobacterium tumefaciens); промотори колімовірусів, такі як промотор 19S вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV) (Lawton et al. (1987), Plant Mol. Biol. 9:315-24); промотор 35S CaMV (Odell et al. (1985), Nature, 313:810-2); промотор 35S вірусу мозаїки ранника (Walker et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84(19):6624-8); промотор сахарозосинтази (Yang and Russell (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4144-8); промотор комплексу генів R (Chandler et al. (1989), Plant Cell, 1:1175-83); промотор гена білка, що зв'язує хлорофіл a/b; CaMV35S (патенти США №№ 5322938, 5352605, 5359142 і 5530196); FMV35S (патенти США №№ 6051753 і 5378619); промотор PC1SV (патент США № 5850019); промотор SCP1 (патент США № 6677503); і промотори AGRtunos (номер доступу GenBank № V00087; Depicker et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983), Nature, 304:184-7). У конкретних варіантах здійснення молекули нуклеїнової кислоти за винаходом можуть містити тканиноспецифічний промотор. Тканиноспецифічний промотор являє собою нуклеотидну послідовність, що забезпечує більш високий рівень транскрипції функціонально зв'язаної нуклеотидної послідовності в тканині, для якої промотор є специфічним, відносно інших тканин в організмі. Приклади тканиноспецифічних промоторів включають, але не обмежуються ними: специфічні для тапетуму промотори; специфічні для пиляка промотори; специфічні для пилка промотори (див., наприклад, патент США № 7141424, і міжнародну публікацію PCT № WO 99/042587); специфічні для насінного зачатка промотори; (див., наприклад, патентну заявку США № 2001/047525 A1); специфічні для плодів промотори (див., наприклад, патенти США №№ 4943674 і 5753475); і специфічні для насіння промотори (див., наприклад, патенти США №№ 5420034 і 5608152). У деяких варіантах здійснення в композиції або способі за винаходом можна використовувати специфічний для стадії розвитку промотор (наприклад, промотор, активний на більш пізній стадії розвитку). Додаткові регуляторні послідовності, які у деяких варіантах здійснення можуть бути функціонально зв'язані з молекулою нуклеїнової кислоти, включають 5'-UTR, розташовані між промоторною послідовністю і кодуючою послідовністю, що функціонують як лідерні послідовності трансляції. Лідерна послідовність трансляції присутня в повністю процесованій мРНК, і вона може впливати на процесинг первинного транскрипту і/або стабільність РНК. Приклади лідерних послідовностей трансляції включають лідерні послідовності білка теплового шоку кукурудзи і петунії (патент США № 5362865), лідерні послідовності білка оболонки вірусу рослин, лідерні послідовності рибулозо-1,5-біфосфаткарбоксилази/оксигенази рослин і інші. Див., наприклад, Turner and Foster (1995), Molecular Biotech. 3(3):225-36. Необмежувальні приклади 5'-UTR являють собою: GmHsp (патент США № 5659122); PhDnaK (патент США № 5362865); AtAntl; TEV (Carrington and Freed (1990), J. Virol. 64:1590-7); і AGRtunos (номер доступу GenBank № V00087; і Bevan et al. (1983), Nature, 304:184-7). Додаткові регуляторні послідовності, які у деяких варіантах здійснення можуть бути функціонально зв'язаними з молекулою нуклеїнової кислоти, також включають 3'нетрансльовані послідовності, 3'-області термінації транскрипції або області поліаденілювання. Вони являють собою генетичні елементи, розташовані нижче нуклеотидної послідовності, і включають полінуклеотиди, що забезпечують сигнал поліаденілювання і/або інші регуляторні сигнали, здатні впливати на транскрипцію або процесинг мРНК. Сигнали поліаденілювання функціонують у рослинах, забезпечуючи приєднання поліаденілатних нуклеотидів до 3'-кінця мРНК-попередника. Послідовність поліаденілювання може походити з різних генів рослин або з генів T-ДНК. Необмежувальним прикладом 3'-області термінації транскрипції є 3'-область нопалінсинтази (nos 3'; Fraley et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4803-7). Приклад застосування різних 3'-нетрансльованих областей наданий у Ingelbrecht et al. (1989), Plant Cell, 1:671-80. Необмежувальні приклади сигналів поліаденілювання включають сигнал поліаденілювання з гена Pisum sativum RbcS2 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984), EMBO J. 3:1671-9) і AGRtu.nos (номер доступу в GenBank № E01312). Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти або вектор за даним винаходом може містити селективний маркер, який надає фенотип, що піддається селекції, трансформованій клітині, такій як клітина рослини. Селективні маркери також можна використовувати для селекції рослин або клітин рослин, що містять рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом. Маркер може кодувати стійкість до біоциду, стійкість до антибіотика (наприклад, канаміцину, генетицину (G418), блеоміцину, гігроміцину і т. д.) або стійкість до гербіциду (наприклад, гліфосат і т. д.). Приклади селективних маркерів включають, але не обмежуються ними: ген neo, 17 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 який кодує стійкість до канаміцину і його селекція може бути здійснена з використанням канаміцину, G418 і т. д.; ген bar, що кодує стійкість до біалафосу; мутантний ген синтази EPSP, що кодує стійкість до гліфосату; ген нітрилази, що надає стійкість до бромоксинілу; мутантний ген ацетолактатсинтази (ALS), що надає стійкість до імідазолінону або сульфонілсечовини; і ген DHFR стійкості до метотрексату. Доступна множина селективних маркерів, що надають стійкість до ампіциліну, блеоміцину, хлорамфеніколу, гентаміцину, гігроміцину, канаміцину, лінкоміцину, метотрексату, фосфінотрицину, пуроміцину, спектиноміцину, рифампіцину, стрептоміцину і тетрацикліну, і т. п. Приклади таких селективних маркерів проілюстровані, наприклад, у патентах США №№ 5550318; 5633435; 5780708 і 6118047. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти або вектор за даним винаходом так само або альтернативно може включати маркери для скринінгу. Маркери для скринінгу можна використовувати для того, щоб здійснювати моніторинг експресії. Ілюстративні маркери для скринінгу включають ген β-глюкуронідази або ген uidA (GUS), що кодує фермент, для якого відомі різні хромогенні субстрати (Jefferson et al. (1987), Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); ген Rлокусу, що кодує продукт, який регулює продукцію антоціанінових пігментів (червоний колір) у тканинах рослин (Dellaporta et al. (1988), "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac", 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); ген β-лактамази (Sutcliffe et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:373741); ген, що кодує фермент, для якого відомі різні хромогенні субстрати (наприклад, PADAC, хромогенний цефалоспорин); ген люциферази (Ow et al. (1986), Science, 234:856-9); ген xylE, який кодує катехолдіоксигеназу, що може конвертувати хромогенні катехоли (Zukowski et al. (1983), Gene, 46(2-3):247-55); ген амілази (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); ген тирозинази, що кодує фермент, здатний окисляти тирозин у DOPA і допахінон, який, у свою чергу, конденсується в меланін (Katz et al. (1983), J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); і ген αгалактозидази. Придатні способи для трансформації клітин-хазяїнів включають будь-який спосіб, за допомогою якого ДНК можна вбудовувати в клітину, наприклад, і не обмежуючись цим, трансформацію протопластів (див., наприклад, патент США № 5508184), захоплення ДНК, опосередковуване зневоднюванням/інгібуванням (див., наприклад, Potrykus et al. (1985), Mol. Gen. Genet. 199:183-8), електропорацію (див., наприклад, патент США 5384253), струшування з волокнами з карбіду кремнію (див., наприклад, патенти США №№ 5302523 і 5464765), опосередковувану Agrobacterium трансформацію (див., наприклад, патенти США №№ 5563055; 5591616; 5693512; 5824877; 5981840 і 6384301) і прискорення покритих ДНК частинок (див., наприклад, патенти США №№ 5015580; 5550318; 5538880; 6160208; 6399861 і 6403865), і т. д. З використанням способів, таких як ці, можна стабільно трансформувати клітини практично будьякого виду. У деяких варіантах здійснення трансформуючу ДНК вбудовують у геном клітинихазяїна. У випадку багатоклітинних видів, трансгенні клітини можна регенерувати в трансгенний організм. Будь-який з цих способів можна використовувати для одержання трансгенної рослини, наприклад, що містить одну або декілька послідовностей нуклеїнової кислоти за винаходом в геномі трансгенної рослини. Найбільш широко використовуваний спосіб введення експресуючого вектора в рослини оснований на природній системі трансформації Agrobacterium. A. tumefaciens і A. rhizogenes являють собою патогенні для рослин бактерії ґрунту, що генетично трансформують клітини рослин. Плазміди Ti і Ri з A. tumefaciens і A. rhizogenes, відповідно, містять гени, відповідальні за генетичну трансформацію рослини. Плазміди Ti (індукуючі пухлину) містять великий сегмент, відомий як T-ДНК, що переноситься в трансформовані рослини. Інший сегмент плазміди Ti, область vir, відповідальний за перенесення T-ДНК. Область T-ДНК обмежена кінцевими повторами. У модифікованих бінарних векторах індукуючі пухлину гени видалені, і функції області vir використовуються для перенесення чужорідної ДНК, обмеженої прикордонними послідовностями T-ДНК. T-область також може містити селективний маркер для ефективного відновлення трансгенних рослин і клітин і ділянку множинного клонування для вбудовування послідовностей для перенесення, таких як нуклеїнова кислота, яка кодує синтетичний CTP, що походить з Brassica. Таким чином, у деяких варіантах здійснення вектор для трансформації рослин походить із плазміди Ti A. tumefaciens (див., наприклад, патенти США №№ 4536475, 4693977, 4886937 і 5501967; і патент Європи EP 0 122 791) або плазміди Ri A. rhizogenes. Додаткові вектори для трансформації рослин включають, наприклад, і не обмежуючись ними, вектори, описані HerreraEstrella et al. (1983), Nature, 303:209-13; Bevan et al. (1983), Nature, 304:184-7; Klee et al. (1985), Bio/Technol. 3:637-42; і в патенті Європи EP 0 120 516, і вектори, що походять з будь-якого з вищевказаних. Інші бактерії, такі як Sinorhizobium, Rhizobium і Mesorhizobium, що взаємодіють з 18 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рослинами в природі, можна модифікувати для забезпечення перенесення генів у ряд різноманітних рослин. Ці асоційовані з рослинами симбіотичні бактерії можна робити компетентними для перенесення генів шляхом введення як знешкоджених плазмід Ti, так і придатного бінарного вектора. Після надання екзогенної ДНК реципієнтним клітинам трансформовані клітини, як правило, ідентифікують для подальшого культивування і регенерації рослин. Для підвищення здатності ідентифікувати трансформовані клітини може бути бажаним використання селективного маркерного гена або маркерного гена для скринінгу, як описано вище, з вектором, використовуваним для одержання трансформанта. У випадку, коли використовують селективний маркер, трансформовані клітини ідентифікують у потенційно трансформованій популяції клітин шляхом впливу на клітини селективного засобу або засобів. У випадку, коли використовують маркер для скринінгу, клітини можна піддавати скринінгу на бажану ознаку маркерного гена. Клітини, що виживають після впливу селективного засобу, або клітини, оцінені як позитивні в скринінговому аналізі, можна культивувати в середовищі, яке підтримує регенерацію рослин. У деяких варіантах здійснення будь-яке придатне культуральне середовище для тканини рослини (наприклад, середовище MS і N6) можна модифікувати шляхом включення додаткових речовин, таких як регулятори росту. Тканину можна підтримувати на основному середовищі з регуляторами росту доти, поки не стане доступно достатньо тканини, щоб почати спробу регенерації, або, після повторюваних раундів селекції вручну, доти, поки морфологія тканини не стане придатною для регенерації (наприклад, щонайменше 2 тижні), а потім переносити в середовище, що сприяє утворенню паростка. Культури пересаджують періодично доти, поки не відбудеться достатнє утворення паростка. Після утворення паростків їх переносять у середовище, яке сприяє утворенню коренів. Після утворення достатніх коренів, рослини можна переносити в ґрунт для подальшого росту і дозрівання. Для підтвердження присутності молекули нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес (наприклад, нуклеотидна послідовність, що кодує поліпептид, який містить щонайменше одній синтетичний CTP, що походить з Brassica), у регенеруючій рослині можна проводити множину аналізів. Такі аналізи включають, наприклад: молекулярно-біологічні аналізи, такі як саузернблотинг і нозерн-блотинг, ПЛР і секвенування нуклеїнових кислот; біохімічні аналізи, такі як виявлення присутності білкового продукту, наприклад, за допомогою імунологічних засобів (ELISA і/або вестерн-блотинг) або ферментативної функції; аналізи частин рослин, такі як аналізи листів або коренів; і аналіз фенотипу цілої рослини, що регенерувала. Як приклад, трансгенні об'єкти, що вбудовуються, можна аналізувати шляхом ампліфікації ПЛР з використанням, наприклад, олігонуклеотидних праймерів, специфічних до нуклеотидної послідовності, що представляє інтерес. Мають на увазі, що генотипування ПЛР включає, але не обмежується цим, ампліфікацію з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) геномної ДНК, що походить з виділеної тканини рослини-хазяїна, яка передбачувано містить молекулу нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, вбудовану в геном, з наступним стандартним клонуванням і аналізом послідовності продуктів ампліфікації з використанням ПЛР. Способи генотипування за допомогою ПЛР докладно описані (див., наприклад, Rios G. et al. (2002), Plant J. 32:243-53) і їх можна застосовувати відносно геномної ДНК, що походить з будь-якого виду рослин (наприклад, Z. mays або G. max) або типу тканини, включаючи клітинні культури. Трансгенна рослина, утворена з використанням способів трансформації на основі Agrobacterium, як правило, містить одну рекомбінантну послідовність ДНК, вбудовану в одну хромосому. Одну рекомбінантну послідовність ДНК називають "трансгенним об'єктом" або "об'єктом, що вбудовується". Такі трансгенні рослини є гетерозиготними по вбудованій послідовності ДНК. У деяких варіантах здійснення трансгенну рослину, гомозиготну відносно трансгена, можна одержувати шляхом статевого схрещування (самозапилення) незалежної сегрегантної трансгенної рослини, що містить одну екзогенну послідовність гена, з нею ж, наприклад рослини F0, з одержанням насіння F1. Чверть одержаного насіння F1 буде гомозиготним відносно трансгена. Проростання насіння F 1 приводить до рослин, які можна досліджувати відносно гетерозиготності, як правило, з використанням аналізу SNP або аналізу кінцевої ампліфікації, який дозволяє розрізнити гетерозиготи і гомозиготи (тобто аналіз зиготності). У конкретних варіантах здійснення копії щонайменше одного поліпептиду, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica, продукуються в клітині, що містить пластиду, у яку була введена щонайменше одна молекула нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує щонайменше один поліпептид, який містить щонайменше 19 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 один синтетичний CTP, що походить з Brassica. Кожен поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica, може експресуватися з множини послідовностей нуклеїнової кислоти, введених у різних трансформуючих об'єктах, або з однієї послідовності нуклеїнової кислоти, введеної в одному трансформуючому об'єкті. У деяких варіантах здійснення множина таких поліпептидів експресується під контролем одного промотору. В інших варіантах здійснення множина таких поліпептидів експресується під контролем множини промоторів. Можуть експресуватися одиничні поліпептиди, що містять множину пептидних послідовностей, причому кожна з цих пептидних послідовностей націлена в пластиду. На доповнення до прямої трансформації рослини рекомбінантною молекулою нуклеїнової кислоти, трансгенні рослини можна одержувати шляхом схрещування першої рослини, що має щонайменше один трансгенний об'єкт, з другою рослиною, позбавленою такого об'єкта. Наприклад, рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica, можна вводити в першу лінію рослин, що піддається трансформації, з одержанням трансгенної рослини, яку можна схрещувати з другою лінією рослин для інтрогресії нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, у другу лінію рослин. VI. Рослинні матеріали, що містять поліпептид, який направляється синтетичним транзитним пептидом хлоропластів, що походить з Brassica У деяких варіантах здійснення передбачається рослина, де рослина містить клітину рослини, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica. У конкретних варіантах здійснення таку рослину можна одержувати шляхом трансформації тканини рослини або клітини рослини і регенерації цілої рослини. У наступних варіантах здійснення таку рослину можна одержувати з комерційного джерела або шляхом інтрогресії нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica, у зародкову плазму. Також передбачаються рослинні матеріали, що містять рослинну клітину, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica. Такий рослинний матеріал можна одержувати з рослини, що містить клітину рослини. У наступних варіантах здійснення рослинний матеріал являє собою рослинну клітину, що нездатна регенерувати з утворенням рослини. Трансгенна рослина або рослинний матеріал, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який містить щонайменше один із синтетичних CTP, що походять з Brassica, у деяких варіантах здійснення може виявляти одну з наступних характеристик: експресія поліпептиду в клітині рослини; експресія частини поліпептиду в пластиді клітини рослини; імпорт поліпептиду з цитозолю клітини рослини в пластиду клітини; специфічну для пластиди експресію поліпептиду в клітині рослини і/або локалізацію поліпептиду в клітині рослини. Крім того, така рослина може мати одну або декілька бажаних ознак, відмінних від експресії кодованого поліпептиду. Такі ознаки можуть включати, наприклад: стійкість до комах, інших паразитів, хвороботворних агентів; стійкість до гербіцидів; підвищену стабільність, врожайність або термін зберігання; стійкість до факторів навколишнього середовища; фармацевтичне виробництво; виробництво промислового продукту і поліпшення харчування. Трансгенна рослина за винаходом може являти собою будь-яку рослину, здатну бути трансформованою молекулою нуклеїнової кислоти за винаходом. Таким чином, рослина може бути дводольною або однодольною. Необмежувальні приклади дводольних рослин, придатних у даних способах, включають Arabidopsis, люцерну, біб, броколі, капусту, моркву, цвітну капусту, селеру, китайську капусту, бавовну, огірок, баклажан, салат-латук, диню, горох, перець, арахіс, картоплю, гарбуз звичайний, хрін, рапс, шпинат, сою, гарбуз великоплідний, цукровий буряк, соняшник, тютюн, томат і кавун. Необмежувальні приклади однодольних рослин, придатних у даних способах, включають кукурудзу, Brassica, цибулю, рис, сорго, пшеницю, жито, просо культурне, цукрову тростину, тритикале, просо прутоподібне і траву рулонного газону. Трансгенні рослини за винаходом можна використовувати або культивувати будь-яким чином. Деякі варіанти здійснення також стосуються товарних продуктів, які містять одну або декілька нуклеотидних послідовностей, що кодують поліпептид, який містить щонайменше одного синтетичний CTP, що походить з Brassica, наприклад товарного продукту, виготовленого з рекомбінантної рослини або насіння, що містить одну або декілька таких нуклеотидних послідовностей. Товарні продукти, які містять одну або декілька нуклеотидних послідовностей, що кодують поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica, включають, наприклад, але не обмежуються ними: продукти харчування, борошно, олії 20 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або розмелені або цільні зерна або насіння рослини, яка містить одну або декілька нуклеотидних послідовностей, що кодують поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica. Виявлення однієї або декількох нуклеотидних послідовностей, що кодують поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica, в одному або декількох товарах або товарних продуктах є фактичним доказом того, що товар або товарний продукт був щонайменше частково виготовлений з рослини, яка містить одну або декілька нуклеотидних послідовностей, що кодують поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica. У конкретних варіантах здійснення товарний продукт за винаходом містить кількість, що піддається виявленню, послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica. У деяких варіантах здійснення такі товарні продукти можна виготовляти, наприклад, шляхом одержання трансгенних рослин і виготовлення з них продукту харчування або корму. У деяких варіантах здійснення трансгенна рослина або насіння, що містить трансген, який містить нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який містить щонайменше один синтетичний CTP, що походить з Brassica, також може містити щонайменше один інший трансгенний об'єкт у своєму геномі, включаючи, але не обмежуючись ними: трансгенний об'єкт, з якого транскрибується молекула i-РНК; ген, що кодує інсектицидний білок (наприклад, інсектицидний білок Bacillus thuringiensis); ген стійкості до гербіциду (наприклад, ген, що забезпечує стійкість до гліфосату); і ген, що додає внесок у бажаний генотип у трансгенній рослині (наприклад, збільшений вихід, змінений метаболізм жирних кислот або відновлення цитоплазматичної чоловічої стерильності). VII. Опосередковувана синтетичним транзитним пептидом хлоропластів, що походить з Brassica, локалізація продуктів генів у пластидах Деякі варіанти здійснення даного винаходу стосуються способу експресії і/або локалізації продукту гена в пластиді (наприклад, хлоропласт). У конкретних варіантах здійснення продукт гена може являти собою продукт маркерного гена, наприклад флуоресцентну молекулу. Експресія продукту гена як частини поліпептиду, який також містить синтетичний CTP, що походить з Brassica, може забезпечити систему для оцінки здатностей до локалізації в пластиді конкретної послідовності синтетичного CTP, що походить з Brassica. У деяких варіантах здійснення експресію продукту маркерного гена як частини поліпептиду, який містить синтетичний CTP, що походить з Brassica, використовують для націлювання експресії продукту маркерного гена в пластиду клітини, де поліпептид експресується. У визначених варіантах здійснення такий продукт маркерного гена локалізований у пластиді(ах) клітини хазяїна. Наприклад, продукт маркерного гена може експресуватися на більш високих рівнях у пластиді(ах), ніж у цитозолі або інших органелах клітини-хазяїна; продукт маркерного гена може експресуватися на значно більш високих рівнях у пластиді(ах); продукт маркерного гена може експресуватися по суті тільки в пластиді(ах) або продукт маркерного гена може експресуватися тільки в пластиді(ах), так що експресію в цитозолі або органелах, що не є пластидами, не можна виявити. У деяких варіантах здійснення поліпептид, що містить функціональний варіант синтетичного CTP, що походить з Brassica, де поліпептид функціонально зв'язаний з продуктом маркерного гена, використовують для оцінки характеристик функціонального варіанта пептиду. Наприклад, послідовність синтетичного CTP, що походить з Brassica, можна варіювати, наприклад, шляхом внесення щонайменше однієї консервативної мутації у синтетичний CTP, що походить з Brassica, і одержаний варіант пептиду можна зв'язувати з продуктом маркерного гена. Після експресії в придатній клітині-хазяїні (наприклад, клітині, де діє один або декілька регуляторних елементів в експресуючій конструкції), можна визначати експресію продукту маркерного гена. Шляхом порівняння субклітинної локалізації продукту маркерного гена між еталонною конструкцією синтетичний CTP, що походить з Brassica, - маркер і варіант пептиду - маркера, можна визначати, чи забезпечує варіант пептиду, наприклад, більш високу локалізацію в пластиді або по суті ідентичну локалізацію в пластиді. Такий варіант можна вважати функціональним варіантом. Шляхом ідентифікації функціональних варіантів синтетичного CTP, що походить з Brassica, які забезпечують більш високу локалізацію в пластиді, мутації в таких варіантах можна включати в подальші варіанти синтетичних CTP, що походять з Brassica. Проведення множини раундів цього процесу оцінки, а потім включення ідентифікованих придатних мутацій у послідовність синтетичного CTP, що походить з Brassica, може забезпечити повторюваний процес оптимізації послідовності синтетичного CTP, що походить з Brassica. Такі оптимізовані послідовності синтетичного CTP, що походить з Brassica, і нуклеотидні послідовності, що їх кодують, вважають частиною даного винаходу, незалежно від 21 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 того, чи можуть такі оптимізовані пептидні послідовності синтетичного CTP, що походить з Brassica, бути далі оптимізовані шляхом додаткової мутації. Посилання, розглянуті в даному описі, надані тільки для їх розкриття до дати подачі цієї заявки. Ніщо в даному документі не слід витлумачувати як допущення того, що цей винахід надає право на протиставлення факту створення винаходу з більш раннім пріоритетом. Наступні приклади надані для ілюстрації визначених конкретних ознак і/або аспектів. Ці приклади не слід витлумачувати як обмежуючі обсяг опису конкретних описаних ознак або аспектів. ПРИКЛАДИ Приклад 1. Конструювання і продукування послідовностей химерного транзитного пептиду хлоропластів (TraP) Пластиди являють собою цитоплазматичні органели, що зустрічаються у видах вищих рослин, і вони присутні у всіх тканинах рослин. Хлоропласти являють собою конкретний тип пластид, що зустрічається в зелених фотосинтезуючих тканинах, які відповідальні за важливі фізіологічні функції. Наприклад, однією з таких основних фізіологічних функцій є синтез ароматичних амінокислот, необхідних для рослини. У цьому біосинтетичному каскаді вимагаються кодовані в ядрі ферменти, і вони транспортуються з цитоплазми усередину хлоропласта. Ці кодовані в ядрі ферменти звичайно мають N-кінцевий транзитний пептид, що взаємодіє з мембраною хлоропластів, сприяючи транспорту пептиду в строму хлоропласта. Bruce B. (2000), Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolution. Trends Cell Bio. 10:440-447. При імпорті стромальні пептидази розщеплюють транзитні пептиди, залишаючи зрілий функціональний білок імпортованим у хлоропласт. Richter S., Lamppa G.K. (1999), Stromal processing peptidase binds transit peptides and initiates their ATP-dependent turnover in chloroplasts. Journ. Cell Bio. 147:33-43. Транзитні пептиди хлоропластів являють собою варіабельні послідовності, що значно розрізняються по довжині, композиції й організації. Bruce B. (2000), Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolution. Trends Cell Bio. 10:440-447. Рівень подібності послідовностей транзитних пептидів хлоропластів значно розрізняється серед гомологічних білків з різних видів рослин. Рівень відмінності між транзитними пептидами хлоропластів є несподіваним, враховуючи, що гомологічний білки, одержувані з різних видів рослин, як правило, мають відносно високі рівні подібності послідовностей при порівнянні процесованого зрілого функціонального білка. Нові химерні послідовності транзитних пептидів хлоропластів конструювали, продукували і досліджували в рослинах. Було показано, що нові химерні транзитні пептиди хлоропластів мають ефективні властивості переміщення і процесингу для імпорту агрономічно важливих білків у хлоропласти. Спочатку, нативні послідовності білка 5-енолпірувілшикімат-3фосфатсинтази (EPSPS) з різних видів рослин аналізували за допомогою комп'ютерної програми ChloroP™ для ідентифікації передбачуваних послідовностей транзитного пептиду хлоропластів (Emanuelsson O., Nielsen H., von Heijne G. (1999), Chloro, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites, Protein Science, 8:978984), доступної на http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/. Після ідентифікації нативних транзитних пептидів хлоропластів першу послідовність транзитного пептиду хлоропластів вирівнювали з другою послідовністю транзитного пептиду хлоропластів із другого організму. На фіг. 2 проілюстроване вирівнювання послідовностей транзитних пептидів хлоропластів EPSPS Brassica napus (номер доступу NCBI № P17688) і Arabidopsis thaliana (номер доступу NCBI № NP_182055). З використанням вирівнювання послідовностей транзитного пептиду хлоропластів конструювали нові химерні транзитні пептиди хлоропластів шляхом комбінування першої половини послідовності транзитного пептиду хлоропластів з першого організму з другою половиною послідовності транзитного пептиду хлоропластів із другого організму в приблизному співвідношенні 1:1. Ілюстративними послідовностями знову сконструйованих химерних транзитних пептидів хлоропластів є TraP12 (SEQ ID NO: 6) і TraP13 (SEQ ID NO: 8). Ці нові послідовності транзитних пептидів хлоропластів походять з білків EPSPS Brassica napus (номер доступу NCBI №: P17688) і Arabidopsis thaliana (номер доступу NCBI № NP_182055). Послідовність химерного транзитного пептиду хлоропластів TraP12 (SEQ ID NO: 6) містить Nкінець, що походить з Brassica napus, і C-кінець транзитного пептиду хлоропластів, що походить з Arabidopsis thaliana. Послідовність химерного транзитного пептиду хлоропластів TraP13 (SEQ ID NO: 8) містить N-кінець, що походить з Arabidopsis thaliana, і C-кінець транзитного пептиду хлоропластів, що походить з Brassica napus. Химерні транзитні пептиди хлоропластів досліджували за допомогою множини аналізів, які включали систему для тимчасової експресії в рослинах і трансгенну експресію як стабільного трансформуючого об'єкта, що містить експресуючий ген елемент, злитий з агрономічно важливою трансгенною послідовністю. 22 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 2. Дослідження тимчасової експресії в рослинах послідовностей химерного транзитного пептиду хлоропластів (TraP) Аналіз тимчасової експресії в тютюні Послідовності химерного транзитного пептиду хлоропластів TraP12 і TraP13 спочатку досліджували за допомогою аналізу тимчасової експресії в рослинах. Синтезували полінуклеотидні послідовності, що кодують химерні послідовності транзитних пептидів хлоропластів TraP12 (SEQ ID NO: 5) і TraP13 (SEQ ID NO: 7). Лінкерну послідовність (SEQ ID NO: 10) вбудовували між послідовністю TraP і кодуючою послідовністю yfp. Одержані конструкції містили дві одиниці транскрипції в рослинах (PTU). Перша PTU містила промотор убіквітину 10 Arabidopsis thaliana (промотор AtUbi10; Callis et al. (1990), J. Biol. Chem. 265:12486-12493), злитий ген TraP-жовтий флуоресцентний білок (TraP-YFP; патентна заявка США № 2007/0298412) і 3'-нетрансльовану область ORF 23 Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3'UTR; патент США № 5428147). Друга PTU містила промотор вірусу мозаїчності прожилок маніоки (промотор CsVMV; Verdaguer et al. (1996), Plant Molecular Biology, 31:1129-1139), послідовність фосфінотрицинацетилтрансферази (PAT; Wohlleben et al. (1988), Gene, 70:25-37) і 3'нетрансльовану область ORF1 Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3'UTR; Huang et al. (1990), J. Bacteriol., 172:1814-1822). Конструкція pDAB101981 містить химерний транзитний пептид хлоропластів TraP12 (фіг. 3). Конструкція pDAB101989 містить химерний транзитний пептид хлоропластів TraP13 (фіг. 4). Конструювали контрольну плазміду, 101908, яка не містила послідовності транзитного пептиду хлоропластів вище гена yfp, і її включали в дослідження (фіг. 5). Конструкції підтверджували шляхом розщеплення ферментами рестрикції і секвенування. Нарешті, конструкції трансформували в Agrobacterium tumefaciens і зберігали як вихідні культури в гліцерині. З вихідної культури Agrobacterium у гліцерині, повну петлю замороженої культури інокулювали в 2 мл YPD (100 мкг/мл спектиноміцину) у 14-мл стерильній пробірці. Інокульоване середовище інкубували при 28 °C протягом ночі при струшуванні при 200 об./хв. На наступну добу приблизно 100 мкл культури використовували для інокуляції 25 мл YPD (100 мкг/мл спектиноміцину) у 125-мл стерильній колбі з трьома перегородками, і інкубували протягом ночі при 28 °C при струшуванні при 200 об./хв. На наступну добу культури розбавляли до OD 600 0,5 у стерильному ddH2O (pН 8,0). Розведений штам Agrobacterium змішували з другим штамом Agrobacterium, що містив білок-помічник P19, у співвідношенні 1:1. Культуру використовували для інфільтрації листів тютюну способом Voinnet O., Rivas S., Mestre P. and Baulcombe D. (2003), An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus, The Plant Journal, 33:949-956. Інфільтровані рослини тютюну поміщали в Conviron™, установлений на 16 год. на світлі при 24 °C протягом щонайменше трьох діб до аналізу. Результати мікроскопії Інфільтровані Agrobacterium листи тютюну відділяли від декількох рослин і поміщали в чашку Петрі з водою для запобігання дегідратації. Інфільтровані листи тютюну спостерігали при збудженні синім світлом за допомогою довгохвильових проникних скляних фільтрів, закріплених з використанням Dark Reader Hand Lamp™ (Clare Chemical Research Co.; Dolores, CO) для ідентифікації непошкоджених областей листів, які успішно експресували репортерні білки YFP. Конкретні ідентифіковані області листів вирізали з листа і поміщали у воду для візуалізації за допомогою конфокальної мікроскопії (Leica TCS-SP5 AOBS™; Buffalo Grove, IL). Репортерний білок YFP збуджували за допомогою спектральної лінії випромінювання лазера при 514 нм, з використанням аргонового іонного лазера з множиною ліній. Ширину щілини для детекції коректували з використанням зразка неекспресуючого (темного) контрольного листа для виключення фонової аутофлуоресценції листа. Одночасно одержували дані аутофлуоресценції хлорофілу в другому каналі для прямого порівняння із сигналом флуоресцентного репортерного білка для визначення локалізації хлоропластів. Результати візуалізації за допомогою мікроскопії показали, що флуоресцентний білок YFP, що містить транзитний пептид хлоропластів TraP12 або TraP13, накопичувався в хлоропластах, розташованих у цитоплазмі клітин тютюну, у порівнянні з контрольними флуоресцентними білками YFP, що не переміщалися в хлоропласти цитоплазми клітин тютюну (фіг. 6 і фіг. 7). Ці результати візуалізації за допомогою мікроскопії вказують на те, що переміщення білка YFP у хлоропласт відбувалося завдяки транзитному пептиду хлоропластів TraP12 або TraP13. Як показано на фіг. 6 і фіг. 7, флуоресцентний сигнал YFP розташований в хлоропластах, що також мають червону флуоресценцію внаслідок аутофлуоресценції в умовах візуалізації за допомогою мікроскопії. Для порівняння, на фіг. 8 надане мікроскопічне зображення тканини листів тютюну, інфільтрованої контрольною конструкцією pDAB101908, що не містить транзитний пептид 23 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хлоропластів. Хлоропласти на цьому зображенні мають тільки червону флуоресценцію внаслідок аутофлуоресценції в умовах візуалізації за допомогою мікроскопії, і вони позбавлені якого-небудь сигналу флуоресценції YFP, який виявляють інфільтровані TraP клітини тютюну. Крім того, флуоресцентний сигнал YFP у контрольних рослинах тютюну виявляється дифузно по всій цитоплазмі клітин рослини тютюну. Результати вестерн-блотингу Зразки інфільтрованих рослин тютюну аналізували за допомогою вестерн-блотингу. Одержані за допомогою діркопробивача фрагменти листів збирали і піддавали помелу в кульовому млині. Приблизно 100-200 мг матеріалу листів змішували з 2 BB (Daisy; Rogers, AR) і 500 мл PBST протягом 3 хвилин у кульовому млині Kleco™. Потім зразки центрифугували в центрифузі при 14000×g при 4 °C. Супернатант видаляли й або прямо аналізували за допомогою вестерн-блотингу, або піддавали імунопреципітації. Імунопреципітацію проводили з використанням набору Pierce Direct IP kit™ (Thermo Scientific; Rockford, IL), відповідно до протоколу виготовлювача. Приблизно 50 мкг антитіла проти YFP зв'язували зі смолою. Зразки інкубували зі смолою протягом ночі при 4 °C. Далі зразки промивали і елюювали на наступний ранок і підготовляли для аналізу шляхом комбінування рівних об’ємів 2× буфера для зразка з 8M, а потім кип'ятіння зразків протягом 5 хвилин. Прокип'ячені зразки розділяли на 4-12% гелі SDS-Bis Tris у буфері MOPS протягом 40 хвилин. Потім гель піддавали блотингу з використанням Invitrogen iBlot™ (Life Technologies; Carlsbad, CA), відповідно до протоколу виготовлювача. Піддану блотингу мембрану блокували протягом 10 хвилин з використанням 5% знежиреного сухого молока в розчині PBS-Tween. Мембрану обробляли первинним антитілом (моноклональне антитіло кролика проти GFP), використаним у розведенні 1:1000, у 5% знежиреному сухому молоці в розчині PBS-Tween протягом 1 години. Далі, мембрану промивали три рази протягом п'яти хвилин за допомогою PBS-Tween для видалення первинного антитіла, що не зв'язалося. Мембрану обробляли вторинним моноклональним антитілом кози проти антитіл кролика (Life Technologies), використаним у розведенні 1:1000, протягом 60 хвилин. Мембрану промивали, як описано вище, і виявляли шляхом додавання субстрату Themo BCIP/NBT. Колориметричному субстрату дозволяли проявитися протягом 5-10 хвилин, потім блоти обполіскували водою, а потім висушували. Результати вестерн-блотингу показали, що білок YFP експресувався в інфільтрованих клітинах тютюну. Інфільтровані як pDAB101981, так і pDAB101989 тканини листів тютюну експресували білок YFP, на що вказувала присутність смуги білка, що реагувала з антитілами проти YFP і була еквівалентна за розміром смузі білка YFP, одержаній для тканини листів рослин тютюну, інфільтрованих контрольною конструкцією YFP. Більше того, ці результати показали, що химерні транзитні пептиди хлоропластів TraP процесувалися і відщеплювалися від білка YFP. Конструкції TraP12-YFP і TraP13-YFP відповідають смузі білка до процесингу, молекулярна маса якого перевищує молекулярну масу контрольного білка YFP. Присутність смуг на вестерн-блоті, які еквівалентні за розміром контрольному YFP, указує на те, що послідовності транзитних пептидів хлоропластів TraP12 і TraP13 процесувалися, що знижувало розмір YFP до молекулярної маси, яка еквівалентна контрольному YFP. Аналіз тимчасової експресії в протопластах кукурудзи Послідовність химерного транзитного пептиду хлоропластів TraP12 (SEQ ID NO: 5) і лінкерну послідовність (SEQ ID NO: 10) клонували вище гена жовтого флуоресцентного білка і включали в конструкцію для дослідження за допомогою аналізу тимчасової експресії в протопластах рослин кукурудзи. Одержана конструкція містила одну одиницю транскрипції рослин (PTU). Перша PTU містила промотор убіквітину 1 Zea mays (промотор ZmUbi1; Christensen A., Sharrock R. and Quail P. (1992), Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689), злитий ген TraP-жовтий флуоресцентний білок (TraP12-YFP; заявка на патент США № 2007/0298412) і 3'нетрансльовану область пероксидази 5 Zea mays (ZmPer5 3'UTR; патент США № 6384207). Конструкцію підтверджували за допомогою розщеплення ферментами рестрикції і секвенування. Насіння Zea mays var. B104 піддавали поверхневій стерилізації шляхом енергійного струшування в 50% Clorox (3% гіпохлорит натрію), що містив 2-3 краплі Tween-20, протягом приблизно 20 хвилин. Насіння ретельно обполіскували стерильною дистильованою водою. Стерильне насіння висівали на середовище ½ MS у лотках Phytatray або боксах подібного типу і дозволяли йому рости в темряві (28 °C) протягом 12-20 діб. Аналіз тимчасової експресії в протопластах кукурудзи використовували для одержання і трансфекції протопластів кукурудзи з листів кукурудзи B104. Цей аналіз протопластів кукурудзи є модифікацією системи, описаної 24 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Yoo S.-D., Cho Y.-H. and Sheen J. (2007), Arabidopsis Mesophyll Protoplasts: A Versitile Cell System for Transient Gene Expression Analysis, Nature Protocols, 2:1565-1572. Розчини приготовляли, як описано Yoo et al. (2007), за винятком того, що концентрацію маніту, використану для наступних експериментів, заміняли на 0,6M. 5 Трансфекцію 100-500 мкл протопластів (1-5×10 ) завершували шляхом додавання протопластів у 2-мл мікроцентрифужну пробірку, що містила приблизно 40 мкл плазмідної ДНК (pDAB106597), при кімнатній температурі. Об’єм ДНК переважно підтримували на рівні приблизно 10% від об’єму протопластів. Протопласти і ДНК випадковим чином зрідка перемішували під час періоду інкубації протягом 5 хвилин. До протопластів і ДНК повільно додавали рівний об’єм розчину PEG, по 2 краплі за раз при перемішуванні між додаваннями крапель розчину PEG. Пробіркам дозволяли інкубуватися протягом приблизно 10 хвилин при періодичному обережному перемішуванні. Далі додавали 1 мл розчину W5+ і перемішували, перевертаючи пробірку декілька разів. Пробірку(и) центрифугували протягом 5 хвилин при 75×g при температурі 4 °C. Нарешті, супернатант видаляли й осад ресуспендували в 1 мл розчину WI і протопласти поміщали на невелику чашку Петрі (35×10 мм) або в багатоямкові планшети з 6 комірками і інкубували протягом ночі в темряві при кімнатній температурі. Флуоресценцію YFP візуалізували за допомогою мікроскопії після інкубації протягом 12 годин. Умови мікроскопії, описані раніше, використовували для візуалізації. Результати мікроскопічної візуалізації показали, що флуоресцентний білок YFP, який містить химерний транзитний пептид хлоропластів TraP12, накопичувався в хлоропластах, розташованих у цитоплазмі клітин тютюну, у порівнянні з контрольними флуоресцентними білками YFP, які не переміщалися в хлоропласти цитоплазми клітин тютюну (фіг. 9). Ці результати мікроскопічної візуалізації вказують на те, що переміщення білка YFP у хлоропласт було результатом химерного транзитного пептиду хлоропластів TraP12. Приклад 3. Послідовності химерного транзитного пептиду хлоропластів (TraP) для експресії агрономічно важливих трансгенів у Arabidopsis Одна мутація амінокислоти (G96A) у ферменті 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтазі (EPSP-синтаза) Escherichia coli може приводити до нечутливості до гліфосату (Padgette et al. (1991); Eschenburg et al. (2002); Priestman et al. (2005); Haghani et al. (2008)). Хоча ця мутація надає стійкість до гліфосату, також відомо, що вона несприятливо впливає на зв'язування EPSP-синтази з її природним субстратом фосфоенолпіруватом (PEP). Зміна в результаті цього ефективності зв'язування субстрату може привести до того, що мутантний фермент буде непридатним для забезпечення стійкості рослин до гліфосату. Базу даних Genbank NCBI піддавали скринінгу in silico відносно білкових і полінуклеотидних послідовностей EPSP-синтази, які природним чином містять аланін у положенні у ферменті EPSP-синтазі, аналогічному положенню мутації G96A, що була внесена у версію ферменту з E. coli (Padgette et al. (1991); Eschenburg et al. (2002); Priestman et al. (2005); Haghani et al. (2008)). Одним ферментом, який був ідентифікований як такий, що містить природний аланін у цьому положенні, був DGT-28 (GENBANK ACC NO: ZP_06917240.1) з Streptomyces sviceus ATCC29083. Додаткове вивчення даних in silico виявило три інших унікальних ферменти Streptomyces з більш високою гомологією з DGT-28; DGT-31 (GENBANK ACC NO: YP_004922608.1); DGT-32 (GENBANK ACC NO: ZP_04696613) і DGT-33 (GENBANK ACC NO: NC_010572). Кожний з цих ферментів містить природний аланін у положенні у ферменті EPSPсинтазі, аналогічному положенню мутації G96A, що була внесена у версію ферменту з E. coli. Фіг. 1. Оскільки білки EPSP-синтази з різних організмів мають різну довжину, нумерація мутації для версії ферменту EPSP-синтази з E.coli не обов'язково відповідає нумерації мутації для ферментів EPSP-синтаз з інших організмів. Ці ідентифіковані ферменти EPSP-синтази раніше не були охарактеризовані відносно стійкості до гліфосату або афінності до субстрату PEP. Більше того, ці ферменти EPSP-синтази являють собою новий клас ферментів EPSP-синтаз і вони не містять ніяких мотивів послідовності, які використовувалися для охарактеризації раніше описаного класу I (послідовності, що походять з рослин, додатково описані в патенті США № RE39247), II (послідовності, що походять з бактерій, додатково описані в патенті США № RE39247) і III (послідовності, що походять з бактерій, додатково описані в міжнародній патентній заявці WO 2006/110586) ферментів EPSP-синтаз. Нові ферменти DGT-14, DGT-28, DGT-31, DGT-32 і DGT-33 охарактеризовували відносно стійкості до гліфосату й афінності до субстрату PEP шляхом порівняння з ферментами EPSPсинтазами класу I. Наступні ферменти класу I; DGT-1 з Glycine max, DGT-3 з Brassica napus (GENBANK ACC NO: P17688) і DGT-7 з Triticum aestivum (GENBANK ACC NO: EU977181), були узяті для порівняння. Ферменти EPSP-синтази класу I і їх мутантні варіанти синтезували й 25 UA 115547 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 оцінювали. Мутація, внесена у ферменти EPSP-синтази рослин, складалася з мутації гліцину на аланін, внесеної у фермент EPSP-синтазу в положенні, подібному з положенням мутації G96A з версії ферменту з E. coli. Крім того, мутації треоніну на ізолейцин і проліну на серин вносили в ці ферменти EPSP-синтази класу I в аналогічних положеннях з положеннями амінокислоти 97 (T на I) і амінокислоти 101 (P на S) у EPSP-синтазі E. coli, як описано в Funke et al. (2009). DGT-14 Трансгенні рослини T1 Arabidopsis, що містили химерні транзитні пептиди хлоропластів TraP12 і TraP13, злиті з трансгеном dgt-14, одержували, як описано в заявці на патент США № 11/975658. На трансгенні рослини розпиляли різні дози гліфосату. Ряд різних концентрацій гліфосату, включаючи підвищені дози, використовували в цьому дослідженні для визначення відносних рівнів стійкості (105, 420, 1680 або 3360 г.е.к./га (g ae/ha)). Типовою 1× використовуваною в польових умовах дозою гліфосату є 1120 г.е.к./га. Рослини T1 Arabidopsis, які використовували в цьому дослідженні, варіювали тільки по кількості копій трансгена dgt-14. Рослини T1 Arabidopsis з низькою кількістю копій dgt-14 ідентифікували з використанням аналізів молекулярного підтвердження, описаних вище, і піддавали самозапиленню і використовували для одержання рослин T2. У таблиці 1 представлена стійкість трансгенних рослин dgt-14 у порівнянні з контрольними рослинами, що містять ген стійкості до гербіциду гліфосату dgt-1 (як описано в патенті США, виданому під номером № 12558351). Спочатку проводили селекцію трансформантів T 1 Arabidopsis відносно вихідного нетрансформованого насіння з використанням схеми селекції з глюфосинатом. Для кожної конструкції T1 аналізували три плоских лотки або 30000 насінин. Відібрані рослини T 1 піддавали молекулярній охарактеризації, а потім рослини пересаджували в індивідуальні горщики і на них розпиляли різні дози комерційного гліфосату, як описано раніше. Відповідь на дозу цих рослин представлена у значеннях % видимого пошкодження через 2 тижні після обробки (WAT). Дані, представлені в таблиці, демонструють індивідуальні рослини, що виявляють невелике пошкодження або відсутність пошкодження (40%). Для кожної конструкції, використаної для трансформації Arabidopsis, представлені арифметичне середнє значення і стандартне відхилення. Діапазон індивідуальної відповіді також зазначений в останньому стовпці для кожної дози і трансформації. Нетрансформовані Arabidopsis дикого типу (cv. Columbia) служили як чутливий до гліфосату контроль. Рівень відповіді рослин варіював у рослинах T 1 Arabidopsis. Це варіювання може бути пов'язане з тим фактом, що кожна рослина відповідає незалежному трансформуючому об'єкту і, таким чином, кількість копій гена, що представляє інтерес, варіює від рослини до рослини. Середнє пошкодження в загальній популяції залежно від дози представлено в таблиці 1, щоб продемонструвати стійкість кожної з конструкцій dgt-14, зв'язаних з транзитним пептидом хлоропластів TraP12 v2 або TraP13 v2, відносно dgt-1 і нетрансформованих контролів дикого типу для різних доз гліфосату. Трансгенні об'єкти містили dgt-14, зв'язаний з TraP12 v2 (SEQ ID NO: 11), що міститься в конструкції pDAB105528 (фіг. 10), і TraP13 v2 (SEQ ID NO: 12), що міститься в конструкції pDAB105529 (фіг. 11). Дані селекції з гліфосатом для рослин T 1 продемонстрували, що, коли dgt-14 був зв'язаний з цими транзитними пептидами хлоропластів, забезпечувалася надійна стійкість до високих рівнів гліфосату. Для порівняння, нетрансформовані контролі (або дикий тип) не продемонстрували стійкості до обробки високими концентраціями гліфосату, коли їх обробляли подібними дозами гліфосату. Крім того, існували приклади, коли трансгенні об'єкти, для яких було показано, що вони містять три або більше копій dgt-14, були більш чутливими до підвищених доз гліфосату. Ці приклади продемонстровані за допомогою діапазону процентного видимого пошкодження, представленого в таблиці 6. Імовірно, що присутність високих кількостей копій трансгенів у рослинах Arabidopsis приводить до пригнічення трансгена або інших епігенетичних ефектів, що приводили до чутливості до гліфосату, незважаючи на присутність трансгена dgt-14. 26 UA 115547 C2 Таблиця 1 Відповідь T1 Arabidopsis, трансформованих dgt-14, на діапазон доз гліфосату, внесених після сходів, у порівнянні з сегрегуючою популяцією dgt-1 (T2) і нетрансформованим контролем. Видимий % пошкоджень через 2 тижні після внесення TraP12 v2:dgt-14 (pDAB105528) Діапазон % пошкодження (№ реплік) Аналіз % пошкодження Середнє значення 0,0 Стандартне відхилення 0,0 Діапазон (%) 0 Доза, що вноситься 40% 0 г.е.к./га гліфосату 105 г.е.к./га гліфосату 420 г.е.к./га гліфосату 1680 г.е.к./га гліфосату 3360 г.е.к./га гліфосату 5 0 0 5 0 0 6,0 6,5 0-15 4 1 0 11,0 5,5 5-20 3 1 1 20,4 14,3 10-45 2 3 0 19,0 4,2 15-25 TraP13 v2:dgt-14 (pDAB105529) Діапазон % пошкодження (№ реплік) Аналіз % пошкодження Середнє значення 0,0 Стандартне відхилення 0,0 Діапазон (%) 0 Доза, що вноситься 40% 0 г.е.к./га гліфосату 105 г.е.к./га гліфосату 420 г.е.к./га гліфосату 1680 г.е.к./га гліфосату 3360 г.е.к./га гліфосату 4 0 0 2 0 2 34,5 32,4 5-65 2 1 1 21,3 27,2 0-60 3 0 1 27,0 35,6 5-80 3 1 0 32,8 31,5 15-80 dgt-1 (pDAB3759) Діапазон % пошкодження (№ реплік) Аналіз % пошкодження Середнє значення 0,0 Стандартне відхилення 0,0 Діапазон (%) 0 Доза, що вноситься 40% 0 г.е.к./га гліфосату 105 г.е.к./га гліфосату 420 г.е.к./га гліфосату 1680 г.е.к./га гліфосату 3360 г.е.к./га гліфосату 4 0 0 0 3 1 40,0 14,1 30-60 0 4 0 30,0 0,0 30 0 3 1 55,0 30,0 40-100 0 0 4 57,5 8,7 45-65 Нетрансформований контроль Діапазон % пошкодження (№ реплік) Аналіз % пошкодження Середнє значення 0,0 Стандартне відхилення 0,0 Діапазон (%) 0 Доза, що вноситься 40% 0 г.е.к./га гліфосату 105 г.е.к./га гліфосату 420 г.е.к./га гліфосату 4 0 0 0 0 4 100,0 0,0 100 0 0 4 100,0 0,0 100 27 UA 115547 C2 Таблиця 1 Відповідь T1 Arabidopsis, трансформованих dgt-14, на діапазон доз гліфосату, внесених після сходів, у порівнянні з сегрегуючою популяцією dgt-1 (T2) і нетрансформованим контролем. Видимий % пошкоджень через 2 тижні після внесення 1680 г.е.к./га гліфосату 3360 г.е.к./га гліфосату 5 10 15 20 25 30 35 0 0 4 100,0 0,0 100 0 0 4 100,0 0,0 100 Вибрані рослини T1 Arabidopsis, для яких було ідентифіковано, що вони містять низькі кількості копій трансгенних уставок (1-3 копії), піддавали самозапиленню з одержанням другого покоління для додаткової оцінки стійкості до гліфосату. Друге покоління рослин Arabidopsis (T 2), що містили 1-3 копії трансгена dgt-14, злитого з химерними транзитними пептидами хлоропластів TraP12 і TraP13, далі охарактеризовували відносно стійкості до гліфосату і стійкості до глюфосинату (стійкість до глюфосинату показала, що експресуюча касета PAT була інтактною і не піддавалася перебудовам під час самозапилення рослин T 1). У поколінні T2 гемізиготні і гомозиготні рослини були доступні для дослідження кожного трансгенного об'єкта і, таким чином, були включені для кожної дослідженої дози гліфосату. Гемізиготні рослини містять два різних алелі в локусі в порівнянні з гомозиготними рослинами, що містять ті ж два алелі в локусі. Кількість копій і рівні плоїдності рослин T 2 підтверджували з використанням протоколів молекулярного аналізу, описаного вище. Аналогічно, гліфосат вносили з використанням способів і доз, описаних раніше. Відповідь рослин на дозу представлена у значеннях % видимого пошкодження через 2 тижні після обробки (WAT). Дані представляли як гістограму для індивідуальних рослин, що виявляють невелике пошкодження або відсутність пошкодження (40%). Арифметичне середнє значення і стандартне відхилення представлені для кожної конструкції, використаної для трансформації Arabidopsis. Діапазон індивідуальної відповіді також зазначений в останньому стовпці для кожної дози і трансформації. Нетрансформовані Arabidopsis дикого типу (cv. Columbia) служили як чутливий до гліфосату контроль. Крім того, рослини, що містять ген стійкості до гербіциду гліфосату dgt-1 (як описано в патенті США, поданому під номером № 12558351), були включені як позитивний контроль. У поколінні T2 трансгенні об'єкти dgt-14 як з однією копією, так і з низьким числом копій (дві або три копії), охарактеризовували відносно стійкості до гліфосату. Середнє пошкодження в загальній популяції на дозу представлене в таблиці 2, щоб продемонструвати стійкість, забезпечувану кожною з конструкцій dgt-14, зв'язаних із транзитним пептидом хлоропластів, проти dgt-1 і нетрансформованих контролів дикого типу для різних доз гліфосату. Трансгенні об'єкти покоління T2 містили dgt-14, зв'язаний з TraP12 v2 (pDAB105528) і TraP13 v2 (pDAB105529). Обидва з цих трансгенних об'єктів були високостійкими до гліфосату. Результати показали, що діапазон пошкоджень для рослин T 2 Arabidopsis складав менше ніж 20% для всіх досліджених концентрацій гліфосату. Для порівняння, нетрансформовані контролі (або дикий тип) не забезпечили стійкість до обробки високими концентраціями гліфосату, коли їх піддавали обробці подібними дозами гліфосату. Загалом, результати показали, що рослини, які містять і експресують білки DGT-14, злиті з химерними транзитними пептидами TraP12 і TraP13, забезпечували комерційний рівень стійкості до гліфосату на рівнях, які аж до 3 разів перевищують дозу на полі (1120 г.е.к./га). Таблиця 2 Відповідь T2 Arabidopsis, трансформованих dgt-14, на діапазон доз гліфосату, внесених після сходів, у порівнянні з сегрегуючою популяцією dgt-1 (T2) і нетрансформованим контролем. Видиме % пошкодження через 2 тижні після внесення. Данні відповідають вибраній лінії з однією копією з кожної конструкції, яка сегрегувала як один локус в скринінгу успадковуваності TraP12 v2:dgt-14 (pDAB105528) Діапазон % пошкодження (№ реплік) Аналіз % пошкодження Доза, що вноситься 40% 0 г.е.к./га гліфосату 4 0 0 28 Середнє значення 0,0 Стандартне відхилення 0,0 Діапазон (%) 0