Пептид та спосіб його одержання

1 Пептид формули X-Glu-Trp-Y, Де X - Н або Gly, Ala, Leu, lie, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-lle, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, у-аміномасляна кислота, %амінокапронова кислота, Y- Gly, Ala, Leu, lie, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, DAla, D-Leu, D-lle, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, DPhe, D-Trp, у-аміномасляна кислота, % амінокапронова кислота, -ОН, моно- або дизаміщений амід (Сі-Сз) 2 Спосіб одержання пептиду формули X-Glu-Trp-Y, Де X - Н або Gly, Ala, Leu, lie, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-lle, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, у-аміномасляна кислота, %амінокапронова кислота, Y- Gly, Ala, Leu, lie, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, DAla, D-Leu, D-lle, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, DPhe, D-Trp, у-аміномасляна кислота, %амінокапронова кислота, -ОН, моно- або дизаміщений амід (Сі-Сз), який відрізняється тим, що вводять у взаємодію в розчині алкіловий ефір амінокислоти з третбутилоксикарбоніламшокислотою, потім послідовно нарощують пептидний ланцюг методом активованих ефірів і методом змішаних ангідридів, послідовно приєднують третбутилоксикарбоніламшокислоти з попереднім відщепленням на кожній стадії третбутилоксикарбонільної групи шляхом обробки реакційної суміші мурашиною кислотою і з наступною очисткою проміжних продуктів кристалізацією, одержують продукт формули X-Glu-Trp-Y, який очищають обернено-фазовою хроматографією С* q (О Винахід відноситься до медицини, а саме до способів одержання біологічно активних речовин, які мають імунорегулюючі властивості, і може знайти застосування в медицині, ветеринари, а також в експериментальній біохімії В практичній медицині широко ВІДОМІ ЯК регулятори імунних процесів тимусні екстракти, зокрема, тимозин фракція 5 /Goldstein A L Guna A , Latz MM, Hardy H A , White А ,л-ималин/СН, N 659586/ Ці екстракти складаються з комплексу речовин поліпептидної природи і одержання їх із природних джерел обмежено складністю виробництва, малим виходом активних речовин і значною варіабельністю їхніх фізико-хімічних характеристик і біологічних властивостей Крім того, через присутність у природних препаратах тимуса баластних компонентів при їх використанні у хворих ІНОДІ ви никають побічні явища Остання обставина стала стимулом для створення синтетичних пептидів В даний час здійснено синтез ряду пептидів, що мають імунорегуляторні властивості РСТ WO 089/06134, ЕР N 230052, US N 5008246, USN 5013723 Кожний з отриманих синтетичних пептидів з обмеженим комплексом необхідних властивостей має високу активність, низку токсичність, відсутність побічних ефектів, що визначають їхнє можливе застосування в медицині У основу винаходу покладена задача створення нового синтетичного біологічно активного пептиду, що має імунорегулючу властивість, формули X-Glu-Trp-Y, де X - Н або Gly, Ala, Leu, lie, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-lle, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, у - а м і н о м а с л я н а кислота, % ю 51647 аминокапронова кислота, Y - Gly, Ala, Leu, lie, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-lle, D-Val, D- NVal, D-Pro, Dам|номасляна Tyr, D-Phe, D-Trp, у кислота, %амінокапронова кислота, -ОН, моно- або дизаміщений амід (Сі - Сз) Метою винаходу було також створення принципово нового технологічного процесу одержання речовини пептидної природи, що дозволив би при мінімальній КІЛЬКОСТІ і простоті стадій одержувати з високим виходом продукт вищенаведеної формули Сутність нового способу складається в синтезі пептиду в розчині шляхом послідовного нарощування ланцюга з С-кінця молекул, використовуючи стратегію максимального блокування функціональних груп, виходячи з алкілового ефіру амінокислоти за допомогою методу активованих ефірів і методу змішаних ангідридів, використовуючи третбутилоксикарбониламіно-кислоти Для ряду сполук нового пептиду в таблиці 1 приведені значення Rn у системі (хлороформметанол-32% оцтова кислота=60 45 20) і Rf2 у системі (бутанол-піридин-водаоцтовакислота=5 5 4 1) Таблиця 1 Пептид Abu-Glu-Trp-OH Aca-Glu-Trp-OH Ala-Glu-Trp-NH2 Arq-Glu-Trp-OH D-Ala-Glu-Trp-OH D-llc-Glu-Trp-D-Phe D-lle-Glu-Trp-OH D-Leu-Glu-Trp-NH2 D-Leu-Glu-Trp-OH D-Nval-Glu-Trp-OH D-Phe-Glu-Тф-АІа D-Pro-Glu-Trp-OH D-Trp-Glu-Trp-OH D-Tyr-Glu-Trp-OH D-Val-Glu-Trp-NH2 Gly-Glu-Trp-Gly Gly-Glu-Trp-OH H-Glu-Trp-Abu H-Glu-Trp-Aca H-Glu-Trp-Arg H-Glu-Trp-D-Ala H-Glu-Trp-D-lle H-Glu-Trp-D-Leu H-Glu-Trp-D-Nval Пептид H-Glu-Trp-D-Pro H-Glu-Trp-D-Trp H-Glu-Trp-D-Tyr H-Clu-Trp-D-Val H-Glu-Trp-lle H-Glu-Trp-Cly H-Glu-Trp-NH2 H-Glu-Trp-N2H3 H-Glu-Trp-Nval H-Glu-Trp-Trp Rfi 0 40 0 41 0 40 0 26 0 37 0 71 0 39 0 35 0 37 0 38 0 69 0 58 0 47 0 45 0 43 0 44 0 42 0 49 0 51 0 28 0 61 0 63 0 64 0 65 Rfi 0 66 0 63 0 61 0 65 0 64 0 54 0 42 0 32 0 67 0 64 Rf2 0 56 0 57 0 51 0 48 0 55 0 77 0 54 0 56 0 57 0 56 0 76 0 72 0 56 0 57 0 53 0 49 0 56 0 54 0 56 0 40 0 70 0 71 0 72 0 69 Rf2 0 69 0 66 0 66 0 71 0 68 0 58 0 55 0 41 0 71 0 67 H-Glu-Trp-Tyr H-Glu-Trp-УаІ His-Glu-Trp-OH Ile-Glu-Trp-Phe Ile-Glu-Trp-OH Ile-Glu-Trp-Phe Ilc-Glu-Trp-Pro Leu-Glu-Trp-OH Lys-Glu-Trp-OH Lys-Glu-Trp-Tyr NVal-Glu-Trp-OH Phe-Glu-Trp-NH2 Pro-Glu-Trp-Leu Pro-Glu-Trp-OH Trp-Glu-Trp-OH Tyr-Glu-Trp-OH Val-Glu-Trp-Ala Val-Glu-Trp-MH2 Val-Glu-Trp-OH Val-Glu-Trp-Tyr 0 62 0 66 0 31 0 71 0 38 0 72 0 68 0 39 0 30 0 32 0 37 0 53 0 67 0 59 0 48 0 46 0 61 0 38 0 36 0 59 0 66 0 71 0 58 0 78 0 54 0 78 0 81 0 56 0 51 0 50 0 55 0 62 0 75 0 72 0 59 0 58 0 71 0 52 0 51 0 61 Пептид заявленої формули, отриманий в результаті наведеного способу являє собою білий порошок, який розчиняється у воді, малорозчинний у спирті і практично нерозчинний у хлороформі Кращі варіанти здійснення винаходу Винахід ілюструється наступним прикладом Приклад У цьому прикладі описаний спосіб одержання пептиди формули H-lle-Glu-Trp-OH 1 Одержання Boc-lle-OPFP Суміш 46,0г (0,2моля) Вос-ІІе-ОН та 40,5г (0,22моля) пентафторфенолу в ЮОмл етилацетату, охолоджували до -5°С і додавали 45,3г (0,22моля) г\І,г\І-дициклогексилкарбодіміду Реакційну суміш перемішували 3 години при кімнатній температурі, дициклогексилсечовину відфільтровували, розчинники упарювали у вакуумі, залишок кристалізували в суміші етил ацетат-гексан Випавший осад відфільтровували Вихід 71,3г (90%) 2 Одержання Boc-lle-Glu-Trp-OH 19,8г (0,05моль) Boc-lle-OPFP розчиняли в ЮОмл диметилформаміду і при перемішуванні додавали розчин 20г (О.Обмоль) Glu-Trp і 5,0г (О.Обмоль) ІЧаНСОз у воді Розчин перемішували протягом 20 годин при кімнатній температурі, потім упарювали розчинники у вакуумі До залишку додавали 200мл етилацетату і 200мл 2% розчину сірчаної кислоти, перемішували Органічний шар промивали розчином сірчаної кислоти (2 х ЮОмл), насиченим розчином NaCI до рН=7, сушили над безводним сульфатом натрію, розчинник відганяли у вакуумі Залишок кристалізували в системі етилацетат-гексан, осад відфільтровували і сушили у вакуумі Вихід 20,5Г (75%) 3 Одержання H-lle-Glu-Trp-OH 20,5г BOC-lle-Glu-Trp-OH розчиняли в 150мл мурашиної кислоти, перемішували 3,5 години при t=45° і розчинник упарювали у вакуумі До залишку додавали 200мл води та упарювали у вакуумі ще раз Залишок заливали сумішшю ЗООмл ізопропанолу 200мл ефіру і витримували 10 годин Осад фільтрували і сушили у вакуумі 51647 Вихід 15,3г (75%) Очищення пептиду проводили за допомогою обернено-фазової хроматографії в системі ацетонітрил-0,1% розчин трифтороцтової кислоти Вихід 13г (85%) В результаті вивчення фізико-хімічних властивостей пептиду були отримані такі його характеристики Первинна структура - H-lle-Glu-Trp-OH Брутто формула - С24 - Нзо - ЬЦ - О4 Молекулярна вага - 446,5Da 6 ком або сірий порошок Розчинність - розчинний у воді, практично нерозчинний у хлороформі У Ф - спектр в області 250-ЗООмм має максимум 280 ± 2мм, плече 287 ± 2мм Біологічна активність нового пептида вивчалася на морських свинках за допомогою загальноприйнятого тесту Е-розеткоутворення У таблиці 2 приведені порівняльні дані впливу препаратів тимуса і заявленого пептиду на процес Ерозеткоутворення лімфоцитів морських свинок ЗОВНІШНІЙ ВИГЛЯД - білий із жовтуватим ВІДТІН Таблиця 2 КІЛЬКІСТЬ Е-РОК,(%) Фон, интактні тварини Після обробки трипсином тималин тимозин фракція 5 66,5 66,5 36,1 36,1 Ile-Glu-Trp 66,5 36,1 Препарат Після обробки трипсином і препаратом уконцентрацм мг/мл* 10° 10' 10у 10у 10м 10м 10° 7,0 40,1 37,0 35,3 37,4 36,5 34,7 6 0,3 35,4 33,4 39,5 39,1 33,7 35,8 1,4 63,9 64,8 60,2 37,5 40,0 34,3 * Кожна концентрація досліджувалася на п'яти тваринах Достовірним вважається збільшення Е-РОК у порівнянні з контролем на 50%, тобто до 55% і вище Встановлено, що in vitro заявлений пептид активніше відомих препаратів у 103 разів З метою вивчення безпеки пептиді здійснювали вивчення його гострої токсичності Вивчення гострої токсичності здійснювали ВІДПОВІДНО ДО Методичних рекомендацій Фармакологічного комітету РФ «Вимоги до доклінічного вивчення загальнотоксичної дії нових фармакологічних речовин», М, 1985р Результати досліджень показали, що при внутрішньочеревному введенні 1000 кратної дози пептид не спричиняв гострої токсичної дії і при цих дозах виявилося неможливим досягти їх LD50 Промислова придатність Пептид, що володіє біологічною активністю може знайти широке застосування в медицині і ветеринар ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71