Пептид і спосіб його одержання

1 Пептид формули X-A-D-Trp-Y, де A — D - G l u або Ю-Glu, X — обраний з групи, що складається з Н, Gly, Ala, Leu, lie, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-lle, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y аміномасляної кислоти, £, -амінокапронової кисло аміномасляної кислоти, ^-амінокапронової кислоти, -ОН або заміщеного аміду (Сі - Сз) 2 Спосіб одержання пептиду формули X-A-D-Trp-Y, де A — D - G l u або iD-Glu, X — обраний з групи, що складається з Н, Gly, Ala, Leu, lie, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-lle, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y аміномасляної кислоти, ^-амінокапронової кислоти, Y — обраний з групи, що складається з Gly, Ala, Leu, lie, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-lle, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y аміномасляної кислоти, ^-амінокапронової кислоти, -ОН або заміщеного аміду (Сі - Сз), який складається з синтезу пептиду у розчині шляхом розкриття внутрішнього ангідриду третбутилоксикарбонілглутамшової (D або L) кислоти К-сіллю D-Trp-Y, нарощування пептидного ланцюга методом активованих ефірів і методом змішаних ангідридів із попереднім відщепленням третбутилоксикарбонільної групи шляхом обробки мурашиною кислотою і хроматографічним поділом а -1 у-ізомерів ти, Винахід відноситься до медицини, а саме до способів одержання біологічно активних речовин, що мають імунорегулюючі властивості, і може знайти застосування в медицині, ветеринари, а також в експериментальній біохімії Актуальність розробки нових нешкідливих імунорегулюючих пептидів, здатних зупинити прогресуючий ріст таких захворювань, як ЗЛОЯКІСНІ новоутворення, сепсис, хронічні і в'яло протікаючи інфекції, що розвиваються на фоні імунодефіцитних станів, підтверджується великою КІЛЬКІСТЮ досліджень, проведених у цій області Найбільш поширеним способом виявлення нових пептидів є виділення активних пептидних фракцій із сумарних тканинних екстрактів, фракціонування й очищення аж до виділення індивідуальної речовини і її ідентифікації (SU №1600047, SU №1638849, SU №1737798) У практичній медицині широко ВІДОМІ в якості регуляторів імунних процесів тимусні екстракти, зокрема, тимозин фракція 5 /Goldstein A L, Guna A , Latz М М , Hardy H А , White А/, тамалін /СН №659586/ Ці екстракти складаються з комплексу речовин поліпептидної природи й одержання їх із природних джерел обмежено складністю виробництва, малим виходом активних речовин і значною варіабельніс О а> оо 48974 тю їхніх фізико-хімічних характеристик і біологічних властивостей Крім того, через присутність у природних препаратах тимуса баластових компонентів при їхньому використанні у хворих ІНОДІ виникають побічні явища Остання обставина стала стимулом для створення синтетичних пептидних препаратів В даний час здійснений синтез ряду пептидів, що мають імунорегулюючі властивості РСТ WO 089/06134, SU №1541821, SU №1518956, ЕР №230052, ЕР №406931, US №5021551, US №5013723 Кожний з отриманих синтетичних пептидів з обмеженим комплексом необхідних властивостей володіє високою активністю, низкою токсичністю, відсутністю побічних ефектів, що визначають їхнє можливе застосування в медицині В основу винаходу покладено задачу створення нового синтетичного біологічно активного пептиду, що має імунорегулюючу властивість, формули X-A-D-Trp-Y, де A-D-Glu iD-Glu, X - Н або Gly, Ala, Leu, lie, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-lle, D-Val, D-Nvai, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, у-амшомасляна кислота, '%амінокапронова кислота, Y - Gly, Ala, Leu, lie, Val, Nval, Pro, Tyr, Phe Trp, D-Ala, D-Leu, D-lle, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, у-амшомасляна кислота, %амінокапронова кислота, -ОН або заміщений амід (Сі - Сз) Метою винаходу було також створення принципово нового технологічного процесу одержання речовини пептидної природи, що дозволив би при мінімальній КІЛЬКОСТІ і простоті стадій одержувати з високим виходом продукт вищенаведеної формули, що є визначальним при виробництві фармацевтичного препарату Сутність нового способу полягає в синтезі пептидів, що містять глутаміл, у розчині шляхом розкриття внутрішнього ангідриду третбутилоксикарбоніл глутамшової (D або L) кислоти ВІДПОВІДНИМ ПОХІДНИМ D-Trp-Y з наступним хроматографічним поділом а- і у-ізомерів Подальший синтез здійснювали шляхом нарощування пептидного ланцюга за допомогою активованих ефірів третбутилоксикарбоніламінокислот Для ряду аналогів сполук пептиду в таблиці 1 приведені значення Rfi у системі (хлороформметанол- 32% оцтова кислота = 60 45 20) і Rf2 у системі (бутанол-піридин-вода-оцтова кислота = 5 5 4 1) Таблиця 1 Пептид Abu-D-Glu-D-Trp-OH Abu-iD-Glu-D-Trp-OH Aca-D-Glu-D-Trp-OH Aca-iD-Glu-D-Trp-OH Ala-D-Glu-D-Trp-OH Ala-iD-Glu-D-Trp-OH D-Ala-D-Glu-D-Trp-D-Ala D-Ala-D-Glu-D-Trp-OH D-Ala-iD-Glu-D-Trp-D-Ala Rfi Rf2 0 32 0 29 0,31 0 28 0 34 0 32 0 22 0 26 0 25 0 53 0 49 0 52 0 49 0 61 0 55 0 41 0 51 0 50 D-Ala-iD-Glu-D-Trp-OH D-lle-D-Glu-D-Trp-D-Leu D-lle-D-Glu-D-Trp-OH D-lle-iD-Glu-D-Trp-D-Leu D-lle-iD-Glu-D-Trp-OH D-Leu-D-Glu-D-Trp-OH D-Leu-iD-Glu-D-Trp-OH D-NVal-D-Glu-D-Trp-OH D-NVal-iD-Glu-D-Trp-OH D-Phe-D-Glu-D-Trp-Ala D-Phe-iD-Glu-D-Trp-Ala D-Pro-D-Glu-D-Trp-OH D-Pro-iD-Glu-D-Trp-OH D-Trp-D-Glu-D-Trp-OH D-Trp-iD-Glu-D-Trp-OH D-Tyr-D-Glu-D-Trp-D-Tyr D-Tyr-iD-Glu-D-Trp-D-Tyr D-Val-D-Glu-D-Trp-OH D-Val-iD-Glu-D-Trp-OH Gly-D-Glu-D-Trp-NVal Gly-D-Glu-D-Trp-OH Giy-iD-Glu-D-Trp-NVal Gly-iD-Glu-D-Trp-OH H-D-Glu-D-Trp-Abu H-D-Glu-D-Trp-Aca H-D-Glu-D-Trp-D-lle H-D-Glu-D-Trp-D-Pro H-D-Glu-D-Trp-Gly H-D-Glu-D-Trp-lle H-D-Glu-D-Trp-Leu H-D-Glu-D-Trp-Lys H-D-Glu-D-Trp-OH H-D-Glu-D-Trp-Phe H-D-Giu-D-Trp-Pro H-D-Glu-D-Trp-Tyr H-D-Glu-D-Trp-Val H-iD-Glu-D-Trp-Abu H-iD-Giu-D-Trp-Aca H-iD-Glu-D-Trp-D-lle H-iD-Glu-D-Trp-D-Pro H-iD-Glu-D-Trp-Gly H-iD-Glu-D-Trp-lle H-iD-Glu-D-Trp-Leu H-iD-Glu-D-Trp-Lys H-iD-Glu-D-Trp-OH H-iD-Glu-D-Trp-Phe H-iD-Glu-D-Trp-Pro H-iD-Glu-D-Trp-Tyr H-iD-Glu-D-Trp-Val Ile-D-Glu-D-Trp-D-Phe Ile-D-Giu-D-Trp-OH He-iD-Glu-D-Trp-D-Phe Ne-iD-Glu-D-Trp-OH Leu-D-Glu-D-Trp-OH Leu-iD-Glu-D-Trp-OH NVal-D-Glu-D-Trp-OH NVai-iD-Glu-D-Trp-OH Phe-D-Glu-D-Trp-OH Phe-iD-Glu-D-Trp-OH Pro-D-Glu-D-Trp-OH Pro-iD-Glu-D-Trp-OH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 35 36 34 27 36 35 33 32 37 36 38 37 41 40 39 38 34 33 29 30 32 29 33 30 35 37 29 36 36 28 36 39 38 37 38 34 33 34 36 28 34 35 27 30 38 37 35 36 42 38 40 37 35 27 35 34 41 40 43 42 0 51 0 53 0 54 0 53 0 52 0 53 0 52 0 51 0 51 0 56 0 55 0 58 0 58 0 59I 0 59 0 58 0 58 0 51 0 50 0 51 0 541 0 53 0 53 0 52 0 53 0 58 0 61 0 54 0 58 0 59 0 47 0 56 0 61 0 59 0 58 0 61 0 51 0 50 0 55 0 58 0 52 0 57 0 58 0 45 0 52 0 61 0 60 0 58 0 60 0 68 0 56 0 67 I 0 55 0 62 0 57 0 61 0 60 0 63 0 62 0 63 0 62 48974 Продовження таблиці 1 Trp-D-Glu-D-Trp-OH Trp-iD-Glu-D-Trp-OH Tyr-D-Glu-D-Trp-OH Tyr-iD-Glu-D-Trp-OH Val-D-Glu-D-Trp-D-Val Val-D-Glu-D-Trp-OH Val-iD-Glu-D-Trp-D-Val Val-iD-Glu-D-Trp-OH 0 45 0 44 0 42 0 0 0 0 0 41 46 33 44 34 0 0 0 0 0 0 0 0 68 67 64 63 68 50 66 52 Кращі варіанти здійснення винаходу Винахід ілюструється наступним прикладом Приклад H-D-Glu-D-Trp-OH і H-iD-Glu-D-Trp-OH 1 Одержання Boc-D-Glu-OH 14,7 (0,1 молю) H-D-Glu-OH розчиняли 200мм дистильованої води, одномолярним розчином КОН доводили рН до 10,2 і при інтенсивному перемішуванні додавали розчин 33,0г (0,3 молі) ВОСгО в діоксані Стежили за значенням рН на рН-метрі Після закінчення реакції суміш вміщували в ділильну лійку, екстрагували з лужного середовища 3x150 мм етилацетатом, водяну фазу повільно підкислювали 0,2% розчином сірчаної кислоти до рН = 3,0 і екстрагували Boc-D-Glu-OH в органічну фазу (3 х 200мм) Органічний прошарок промивали 3 х 200мм насиченим розчином Na2SO4 до нейтрального середовища, сушили над Na2SO4 Упарювали у вакуумі до маслоподібного стану Вихід 16,7г (68%) 2 Одержання суміші Boc-D-Glu-D-trp-OH і Boc-iD-Glu-D-Trp-OH 16,7г (0,068 моль) Boc-D-Glu-OH розчиняли в 200мл диметалформаміду, охолоджували до 0° і при перемішуванні додавали розчин 20,6г (0,1 моль) ІЧІМ'-дициклогексилкарбодшміду в ЮОмл диметилформаміду Суміш перемішували 4 години при + 4°С і залишали на 8 годин при кімнатній температурі Випавший осад дициклогексилсечовини відфільтровували, осад промивали 2 х 50мм диметилформаміду, фільтрат упарювали у вакуумі до 1/2 об'єму і додавали при охолодженні до + 4°С і інтенсивному перемішуванні 24,3 (0,1 моль) H-DTrp-ОК Розчин лишали поступово нагріватися до кімнатної температури Про закінчення реакції стежили по ТСХ у системі (хлороформ етилацетат метанол 6 3 1) до зникнення плями внутрішнього ангідриду Boc-D-Glu кислоти Залишки дициклогексилсечовини відфільтровували, диметилформамід упарювали у вакуумі До маслоподібного залишку додавали 200мм етилацетату і 200мл 0,2% розчину сірчаної кислоти Органічний прошарок відокремлювали, промивали до нейтрального середовища насиченим розчином Na2SO4, сушили над Na2SO4, етилацетатний розчин упарювали у вакуумі Отриманий маслоподібний осад являв собою суміш Boc-D-Glu-D-Trp-OH і Boc-iD-Glu-D-Trp-OH Загальний вихід масла склав 25,4г (70%) 3 Одержання H-D-Glu-D-Trp-OH і H-iD-Glu-DТгр-ОН 25,4г (0,048 моля) суміші розчиняли в 200мл мурашиної кислоти, перемішували при 40°С протягом 1 години і упарювали у вакуумі до маслоподібного стану Розділення і очищення пептидів здійс нювали за допомогою іонообмінної хроматографії на колонці з Сефадексом в градієнті 0,01 - 0,2М піридинацетатного буферу Вихід 5,7г (35%) H-DGlu-D-Trp-OH і 5,7г (35%) H-iD-Glu-D-Trp-OH В результаті вивчення фізико-хімічних властивостей пептиду були отримані такі його характеристики Первинна струк- - H-D-Glu-D-Trp-OH і H-iDтура Glu-D-Trp-OH - C16H20N3O5 Брутто формула - 334,35 Молекулярна вага ЗОВНІШНІЙ ВИГЛЯД - білий з жовтуватим ВІДТІНКОМ або сірий порошок РОЗЧИННІСТЬ - легко розчинний у воді, помірно в спирті, практично нерозчинний у хлороформі У Ф - спектр у проміжку 250 ЗООнм має максимум 280 ± 2мм, плече 287 ± 2нм Біологічна активність нового пептиду вивчалася на мишах лінії Balb/c Клітини селезінки мишей суспендували в середовищі RPMI 1640 із 2мм глутаміну і 5% шактивованої фатальної сироватки і вносили в плоскодонні планшети в КІЛЬКОСТІ ЮОмкл, ВІДПОВІДНО, 200000 клітин на лунку Досліджуваний препарат вносили на початку культивування У якості мітогену використовували конканавалін А в кінцевій концентрації 2мкг на лунку Планшети шкубували при 37°С і 5% СОг протягом 48 годин Проліферацію клітин оцінювали по включенню ЗН-тимідину, внесеного за 24 години до закінчення культивування в дозі 5мкг/мл, за допомогою сцинтиляційного лічильника і виражали в КІЛЬКОСТІ розпадів у хвилину (СРМ) Отримані результати підсумовані в таблиці 2 Таблиця 2 Проліферація клітин селезінки мишей Препарат СРМІ* Доза препарату (мкг/мл) 1 iD-Glu-D-Trp Cyclosporm A Control 5 10 20 68594 63428 20043 13222 67649 2698 574 569 61467 - середнє з трьох визначень Встановлено, що новий пептид має здатність інгібувати проліферацію клітин селезінки З метою вивчення безпеки пептиду здійснювали вивчення його гострої токсичності Вивчення гострої токсичності здійснювали згідно з Методичними рекомендаціями Фармакологічного комітету РФ "Вимоги до доклінічного вивчення загальнотоксичної дії нових фармакологічних речовин", М , 1985р Результати досліджень показали, що при внутрішньочеревному введенні 1000 кратної дози пептид не спричиняв гострої токсичної дії і при цих дозах виявилося неможливим досягти їх LD50 Промислова придатність 7 48974 Пептид, що має біологічну аісгивність, може знайти широке застосування в медицині і ветери нари ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71