Біотехнологічний хондроїтин-6-сульфат з низькою молекулярною масою для запобігання остеоартриту

Реферат: Предметом винаходу є низькомолекулярний (1000-5000 Да) хондроїтинсульфат (CS), отриманий шляхом хімічної сульфатації та наступної деполімеризації несульфатованої хондроїтинової основи, отриманої за допомогою біотехнологічних способів. Ця сполука є істотно моносульфатованою, головним чином у 6-положенні, з дуже низьким рівнем сульфатації у 4-положенні та зі співвідношенням моно/дисульфатованих дисахаридів та щільністю заряду, які є подібними відповідним характеристикам природного CS. Зазначений біотехнологічний хондроїтин-6-сульфат (C6S) є корисним у лікуванні та у запобіганні остеоартриту та гострих і хронічних запальних процесів. UA 113005 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід стосується хондроїтинсульфату (CS) з дуже низькою молекулярною масою (10005000 Да), отриманого шляхом хімічної сульфатації та наступної деполімерізації несульфатованової хондроїтинової основи, отриманої з допомогою біотехнологічних способів або отриманого шляхом сульфатації полісахариду біотехнологічного походження, який спочатку відрізнявся низькою молекулярною масою. Також винаходом передбачено застосування цього хондроїтинсульфату у лікуванні та запобіганні остеоартриту та гострих та хронічних запальних процесів. Зокрема винахід стосується хондроїтинсульфату біотехнологічного походження, який є суттєво моносульфатованим, головним чином у положенні 6, є позбавленим або має мало 4сульфатів та є ідентичним до природного хондроїтинсульфату відносно співвідношення моно/дисульфатованих дисахаридів, відсутності три- та полісульфатованих дисахаридів, щільності заряду та виявленої біологічної активності. Згідно за винаходом, хондроїтин 6сульфат (C6S) має меншу молекулярну масу (1000-5000 Да), ніж хондроїтинсульфати, отримані з тканин сухопутних тварин (корів, свиней та птахів), які відрізняються значеннями молекулярної маси у 14000-26000 Да та з тканин морських тварин (костисті риби, акули, кальмари та скати), які мають молекулярну масу > 50 000 Да. Згідно з винаходом, молекулярна маса C6S є навіть нижчою, ніж молекулярна маса відомих типів низькомолекулярних CS. Завдяки цьому, хондроїтин 6-сульфат за винаходом має покращену біодоступність та, відповідно, є більш ефективним. Застосування низькомолекулярного біотехнологічного хондроїтин 6-сульфату (C6S) у лікуванні та запобіганні остеоартриту підтверджено результатами експериментальної перевірки його протизапальної активності у добре відомій тваринній моделі, яку звичайно застосовують для дослідження артриту та пов'язаних з ним симптомів. Описаний тут низькомолекулярний біотехнологічний C6S також демонструє добру стійкість, як було показано шляхом токсологічних досліджень, проведених у відповідності з керівними принципами ОЕСР для фармацевтичних продуктів. На даний час застосування хондроїтинсульфату (CS) рекомендовано EULAR (Європейською Антиревматичною Лігою) у якості симптоматичних ліків повільної дії для лікування остеоартриту (SYSADOA), зокрема остеоартриту колінного суглоба (Jordan KM et al., Ann. Rheum. Dis. 62, 1145, 2003), hip (Jordan KM et al. Ann. Rheum. Dis. 62, 1145, 2003) та рук (Zhang W et al., Ann. Rheum. Dis. 66, 377, 2007) на підставі численних клінічних результатів та різних мета-аналізів клінічних випробувань. Останні клінічні випробування також показали, що CS змінює зовнішньоклітинні структури хрящової тканини людини (Reginster JY, Heraud F, Zegels B, Bruyere O. Mini Rev Med Chem 7, 1051, 2007. Kahan A, Uebelhart D, De Vathaire F, Delmas PD, Reginster JY. Arthritis Rheum 60, 524, 2009). Хондроїтинсульфат (або сам по собі або у поєднанні з іншими інгредієнтами) також широко застосовують у якості нутрицевтика (McAlindon TE et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi N et al., Separation Sc 1, 22, 2009). Хондроїтинсульфат (CS) є природним полісахаридом, який належить до класу глікозаміногліканів (GAG), є присутнім як у хребетних, так і у безхребетних істот, та складається з дисахаридних послідовностей, утворених змінними залишками глюкуронової кислоти (GlcA) та N-ацетил-D-галактозаміну (GalNAc), зв'язаних між собою бета 1-3 зв'язками та сульфітованих у різних положеннях. CS є присутнім у тваринних тканинах та має структурні та фізіологічні функції. Головним чином ця сполука складається з двох типів дисахаридних одиниць, моносульфатованих у 4- або 6-положеннях GalNAc (відповідно, так звані дисахариди A та C), які є присутніми у різних відсоткових кількостях у залежності від їх походження. Також основа CS містить несульфатований дисахарид (звичайно у невеликих кількостях). Дисульфатовані дисахариди, які мають дві сульфатні групи, зв'язані через атом оксигену у різних положеннях, як-то у 2 положенні GlcA та у 6 положенні GalNAc (дисахариду D), у 2 положенні GlcA та у 4 положенні GalNac або у 4 та 6 положеннях GalNAc (дисахариду E), можуть бути представлені у основі CS у змінних відсоткових кількостях в залежності від певних джерел тваринного походження (Volpi N. J. Pharm. Pharmacol. 61, 1271, 2009. Volpi N. J. Pharm. Sci. 96, 3168, 2007. Volpi N. Curr. Pharm. Des. 12, 639, 2006). Також є можливою наявність сульфатації у 3 положенні GlcA, але вона зустрічається у дуже невеликих кількостях, є рідкою у CS сухопутних тварин та з більшою ймовірністю зустрічається у високосульфатованих типах CS морських тварин (Fongmoon D et al. J Biol Chem 282, 36895, 2007). Формула дисахаридної одиниці CS, яка повторюється, є наступною: 1 UA 113005 C2 5 10 15 в якій R2, R4 та R6 - незалежним чином H або SO3 . Негативні заряди карбоксилатних та сульфатних груп у дисахаридній одиниці, яка повторюється, є звичайно нейтралізованими іонами натрію. Значення скорочень, які найбільш часто застосовують для визначення різним чином сульфітованих дисахаридів, наведені нижче: Ди-0S (R2=H; R4=H; R6=H) Ди--6S (C) (R2=H; R4=H; R6=SO3-) Ди--4S (A) (R2=H; R4=SO3-; R6=H) Ди--4,6 ди S (E) (R2=H; R4=SO3-; R6=SO3-) Ди--2,6 ди S (D) (R2=SO3-; R4=H; R6=SO3-) Ди--2,4 ди S (B) (R2=SO3-; R4=SO3-; R6=H) Ди--2,4,6 три S (R2=SO3-; R4=SO3-; R6=SO3-) Зразки CS, які походять від різних тваринних джерел також відрізняються різною молекулярною масою та щільністю заряду. Цей останній параметр безпосередньо корелює з певними сульфатованими групами. У Таблиці 1 наведені головні типи дисахаридів, які знайдені у природних CS, отриманих з хрящів різних видів тварин: Таблиця 1 Параметри Mn (кДа) Mw (кДа) Індекс полідисперсності Ди-0S Ди-6S Ди-4S Ди-2,6 ди S Ди-4,6 ди S Ди-2,4 ди S Щільність заряду Співвідношення 4S/6S CS корови CS свині CS курки CS акули CS ската CS кальмара 12-17 20-26 9-14 14-20 8-13 16-21 25-40 50-70 27-34 50-70 60-80 80-120 1,8-2,2 1,4-1,8 1,6-2,0 1,0-2,0 1,2-2,5 0,8-1,3 6 33 61 ND ND ND 6 14 80 ND ND ND 8 20 72 ND ND ND 3 44 32 18 2 1 3 39 43 13 1 1 13 15 50 0 22 0 0,90-0,96 0,92-0,96 0,90-0,94 1,15-1,25 1,08-1,20 1,00-1,20 1,50-2,00 4,50-7,00 3,00-4,00 0,45-0,90 1,00-1,40 2,50-4,00 20 25 30 Mn - середньочислова молекулярна маса; Mw = середньовагова молекулярна маса; індекс полідисперсності = Mw/Mn; щільністю заряду є число сульфатних груп на дисахаридну одиницю; ND = не ідентифіковано. Різні типи CS, які були отримані від сухопутних тварин, мають схожі параметри молекулярної маси (Mn та Mw) та при цьому вони відрізняються від подібних характеристик CS морських тварин, які мають більшу молекулярну масу. CS сухопутних тварин мають середню молекулярну масу (Mw) у межах 14-26 кДа, тоді як CS морських тварин, як-то кальмарів, хрящових та костистих риб, мають молекулярну масу (Mw), яка перевищує 50 кДа. Зразки CS сухопутних тварин також відрізняються значенням щільності заряду (CD), яке є нижчим, ніж 1.0, тоді як зразки CS морських тварин завжди мають значення CD, які перевищують 1.0. 2 UA 113005 C2 5 Дисульфатовані дисахариди звичайно є присутніми у вигляді слідів у CS сухопутних тварин та CS морських тварин є більш багатими на них. Крім того, у природних CS не спостерігається значних кількостей полісульфатованих дисахаридів (три- та тетра-сульфатів). Природні CS також демонструють відмінності між різними органами та тканинами навіть у представників однакового виду, як наведено у Таблиці 2. Таблиця 2 Параметри Mn (кДа) Mw (кДа) Індекс полідисперсності Ди-0S Ди-6S Ди-4S Ди-2,6 ди S Ди-4,6 ди S Ди-2,4 ди S Щільність заряду Співвідношення 4S/6S 10 15 20 25 30 35 Клубова кишка, нирки, легені та Тромбоцити кістковий мозок людини кролика Плазма крові людини Хрящ корови Аорта корови Кістки осетра 12-17 20-26 ND ND 25-30 35-40 ND ND ND ND ND ~ 15 1,8-2,2 ND 1,05-1,5 ND ND ND 6 33 61 ND ND ND 0 95-100 0-5 0 0 0 7 55 38 0 0 0 ND ~ 100 сліди 0 0 0 0 сліди > 98 0 0 0 40-60 1-5 60-40 0 0 0 0,90-0,96 0,98-1,02 0,90-0,95 0,98-1,02 0,98-1,02 0,40-0,60 1,50-2,00 < 0,1 0,40-0,90 45 10-50 Також у науковій літературі було повідомлено про наявність у різних тканинах та органах ланцюгів полі- або олігосахаридних CS зі 100 % 6-сульфатних або 4-сульфатних дисахаридів (Sampaio L.O. et al. Biol. Chem. 256, 9205, 1981; Okayama E. et al. Blood 72,745, 1988; Ambrosius M. et al. J. Chrom. A 1201, 54, 2008; Volpi N. et al. Clin. Chim. Acta 370, 196, 2006). Хоча всі ці характеристики демонструють явище надмірної гетерогенності природних CS як відносно молекулярної маси, так і відносно щільності заряду; проте також можуть бути виявлені параметри, відповідно до яких CS можуть бути визначеними, як "подібні до природного типу". Хондроїтин 6-сульфат, який має щільність заряду, порівняну з подібною характеристикою CS морських тварин та відрізняється відсутністю аномальних моделей сульфатації є структурно подібним до природного глюкозаміноглюкану. Його перевірена протизапальна активність in vivo надає додаткову підтримку визначенню "подібного до природного типу" хондроїтин сульфату та надає підтримку його застосуванню у лікуванні симптомів, пов'язаних з артритними розладами. Також було здійснено багато спроб розробки біотехнологічного способу отримання CS з застосуванням мікроорганізмів у якості джерела полісахаридного попередника, що має структуру, яка частково є подібною до структури CS та з наступним застосуванням хімічної сульфатації для отримання хондроїтинсульфату, який би був подібним до природного типу. Деякі бактерії виробляють капсулярні полісахариди зі структурою, подібною до структури глікозаміногліканів; наприклад, Pasteurella multocida виробляє полісахарид, ідентичний несульфатованому хондроїтину (De Angelis P.L., Carbohydrate Res., 337 (17), 1547, 2002). Проте, штам Escherichia coli з серотипом O5:K4:H4 виробляє капсулярний полісахарид з хондроїтиновою основою, який несе залишок β-фруктози, зв'язаний у 3-положенні субодиничної послідовності GlcA (полісахарид K4). Приклади отримання біотехнологічного хондроїтинсульфату слід розпочати з випадку отримання капсулярного полісахариду K4 з E. coli O5:K4:H4, повідомленого у патенті EP 1304338, у якому наведено опис процесу, який полягає у отриманні полісахариду K4 у рідких культурах з наступним очищенням та повторним розчиненням цієї сполуки, після чого її піддають кислотному гідролізу для усунення залишків фруктози, зв'язаних з залишками GlcA полімеру. Потім отриманий та позбавлений залишків фруктози полімер, який є ідентичним до несульфатованої основи CS (CH) піддають сульфатації у 4- або 6-положеннях залишку GalNAc з допомогою різних способів хімічного синтезу з отриманням CS з молекулярною масою у межах 6-25 кДа. Однак слід зауважити, що оцінка протизапальної та протиартритної активності 3 UA 113005 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 описаного у EP 1304338 біотехнологічного хондроїтинсульфату здійснена не була та можливе застосування цієї сполуки у лікуванні артриту та/або остеоартриту залишається лише гіпотезою. Це є особливо важливим, оскільки лише 70 % полісахариду, описаного у EP 1304338 безумовно має структуру природнього хондроїтинсульфату та позосталі 30 % головним чином являють собою несульфатований хондроїтин (CH) та, крім того, у цій роботі не розглянуті олігосахариди з молекулярною масою, меншою, ніж 5 кДа. Остання публікація (Bedini E. et al. Angew Chem. Int. Ed Engl. 2011) описує процес сульфатації отриманого полісахариду K4 у 4-положенні та/або у 6-положенні залишку GalNAc того ж самого ланцюга, однак у цій роботі знову не була проведена оцінка такої отриманої біотехнологічним шляхом сполуки щодо її протизапальної та протиартритної активності та можливого застосування у лікуванні та запобіганні артриту та/або остеоартриту та пов'язаних з цим запальних процесів. Ті ж автори припускають, що присутність структурних модифікацій ланцюга у отриманому шляхом синтезу біотехнологічному CS веде до появи аномальної сульфатації гідроксильної групи у C3 послідовності GlcA завдяки низькому захисту цієї групи під час процесу синтезу. Відомо, що ця аномалія викликає серйозні токсичні явища у людей під час внутрішньовенного введення гепарину, при якому цей 3-сульфатований у послідовності GlcA хондроїтинсульфат був присутнім в якості забруднювача. Хоча такі токсичні явища ніколи не спостерігали при пероральному введенні CS, проте залишається ризик їх виникнення через аномальну сульфатацію, що також було зазначено тими ж авторами у інший нещодавній публікації (Bedini E. et al. Chem. J. 2012 [Epub ahead of print]). До того ж, біотехнологічний CS, описаний у роботі Bedini et al. (Angew Chem Int Ed Engl. 2011) має молекулярну масу приблизно 17 кДа, отже потенційно демонструє низьку біодоступність природних продуктів джерела екстракції. З усіх цих причин, зазначена сполука навряд чи може бути застосованою у лікуванні та запобіганні артриту та/або остеоартриту. Можна також навести приклади низькомолекулярних CS, прийнятних для застосування у лікуванні артриту (Cho SY et al. Biol. Pharm. Bull. 27, 47, 2004, Das A. et al. Osteoart. Cartil. 8, 343, 2000), але всі вони є отриманими шляхом деполімерізації CS тваринного походження, а це не виключає наявності вірусів, пріонів та інших інфекційних агентів, які можуть передаватися. Стислий опис фігур. Фіг. 1: Збільшення маси тіла щурів, які страждають від ад'ювантного артриту (AA) під час їх лікування низькомолекулярним біотехнологічним хондроїтин 6-сульфатом (C6S). HC - здорові контрольні тварини; AC - контрольні тварини зі штучно викликаним артритом; T - група, яка була піддана лікуванню з C6S (дні 0-28); PT - група, яка була піддана попередньому лікуванню з C6S (дні 14-28). Значення наведені у грамах (г.). ± SEM (стандартна похибка середньої величини). Фіг. 2: Оцінка набряків задніх кінцівок щурів, які страждають від ад'ювантного артриту (AA) під час їх лікування низькомолекулярним біотехнологічним C6S. Відсоткове збільшення відображено у вигляді вимірювань збільшення об'єму (мл) та обчислення відсотка: [(доба n / доба 0) x 100] – 100. Значення наведені у відсотках (%) ± SEM (стандартна похибка середньої величини). Фіг. 3: Розвиток набряклості протягом досліджень у щурів, які страждають від ад'ювантного артриту (AA) під час їх лікування низькомолекулярним біотехнологічним C6S. Оцінку відсоткового збільшення об'єму проводили у 0, 7, 14, 21 та 28 добу досліджень після отримання стану ад'ювантного артриту. Значення наведені у відсотках (%). Фіг. 4: Оцінка артриту у щурів, які страждають від ад'ювантного артриту (AA) під час їх лікування низькомолекулярним біотехнологічним C6S (Була здійснена наступна оцінка (у балах ± SEM): навколосуглобовий набряк та еритема передніх кінцівок (1-5), навколосуглобовий набряк та еритема задніх кінцівок (1-8), діаметр струпа біля основи хвоста (1-5)). Фіг. 5: Оцінка розвитку артриту у щурів, які страждають від ад'ювантного артриту (AA) під час лікування низькомолекулярним біотехнологічним C6S. Оцінку проводили у 0, 7, 14, 21 та 28 добу досліджень після отримання стану ад'ювантного артриту. Значення наведені у балах. Було виявлено, що низькомолекулярний хондроїтинсульфат (CS) (з молекулярною масою 1000-5000 Да або, переважніше, 2000-4000 Да), отриманий шляхом хімічної сульфатації та наступної деполімерізації несульфатованої та отриманої біотехнологічним шляхом хондроїтинової основи, має протизапальну активність, яку можна порівняти з протизапальною активністю природних CS, покращену біодоступність та сприятливий профіль безпечності. Такий хондроїтинсульфат є суттєво моносульфатованим, головним чином у 6-положенні, а також має дуже невелику сульфатацію у 4-положенні та подібні до природних CS значення співвідношення моно / дисульфатованих дисахаридів та щільності заряду. CS заявленого винаходу має всі характеристики природних CS, як-то природних CS морських тварин. Ця сполука має схожий відносний відсотковий вміст моно- та 4 UA 113005 C2 5 10 дисульфатованих дисахаридів, схожий розподіл дисульфатованих дисахаридів та, внаслідок цього, подібну щільність заряду (CD), пов'язану з низьким співвідношенням 4-сульфатів / 6сульфатів. Отриманий біотехнологічним шляхом хондроїтинсульфат заявленого винаходу також має наступні особливі характеристики: дуже низьку молекулярну масу (1000-5000 Да або, переважніше, 2000-4000 Да); дуже високий відсотковий вміст 6-сульфатованих дисахаридів; майже повну відсутність три-сульфатованих дисахаридів та практичну відсутність сульфатації у 3-положенні залишку GlcA. Зокрема, відомі типи синтетичних CS відрізняються присутністю трисульфатованих дисахаридів та дисахаридів, сульфітованих у 3-положенні GlcA та часто викликають побічні дії при їх терапевтичному застосуванні. У Таблиці 3 наведено фізико-хімічні характеристики біотехнологічного хондроїтин 6сульфату відповідно до винаходу. Таблиця 3 Фізико-хімічні характеристики біотехнологічного CS Молекулярна маса (MWw) 1000-5000 Да Дисахариди: Δ Ди-0S < 15 % Δ Ди-6S ≥ 65 % Δ Ди-4S