Селективний агоніст рецептора ep4 (варіанти) для лікування стану, пов’язаного з низькою кістковою масою, та фармацевтична композиція

Цей винахід стосується способів і фармацевтичних композицій, що містять простагландинові агоністи, які є корисними для запобігання розрідження кістки, для відновлення або збільшення кісткової маси, а також для підсилення регенерації кістки, включаючи лікування станів, що полягають в зменшенні кісткової маси та/чи дефектів кісток у хребетних тварин, і зокрема, у ссавців, включаючи людину. Цей винахід особливо стосується способів і фармацевтичних композицій, що містять селективні простагландинові агоністи ЕР4 рецептора. Остеопороз - це системне скелетне захворювання, що характеризується зменшенням кісткової маси і пошкодженням кісткової тканини з подальшим збільшенням ламкості кісток і схильності до переломів. В США такий стан спостерігається більше ніж у 25 млн. чол. і є причиною більше 1,3 млн. переломів щороку, включаючи 500 000 переломів хребта, 250 000 переломів тазостегнового суглоба і 240 000 переломів зап'ястя щорічно. Перелом тазостегнового суглоба є найсерйознішим наслідком остеопорозу, 5-20% хворих помирає протягом року і понад 50% залишаються непрацездатними. Найбільший ризик захворювання на остеопороз загрожує людям похилого віку, і, таким чином, передбачається, що проблема значно зросте із старінням населення. Передбачається, що в світі кількість бипадків переломів збільшиться втричі протягом наступних 60 років, і підрахували, що у 2050 році у світі буде 4,5 млн. випадків переломів. Жінки піддаються ризику захворювання на остеопороз частіше ніж чоловіки. У жінок відбувається значна втрата кісткової маси протягом п'яти років після менопаузи. Іншими факторами, що збільшують ризик захворювання, є паління, зловживання алкоголем, сидячий спосіб життя і недостатнє вживання кальцію. Існує два головних тили фармацевтичної терапії для лікування остеопорозу. Перший полягає у застосуванні анти-резорбтивних сполук для зменшення резорбції кісткової тканини. Естроген є прикладом анти-резорбтивного агента. Відомо, що естроген зменшує вірогідність переломів. Крім того, Black, et al. в ЕР 0605193А1 повідомляє, що естроген, особливо при оральному застосуванні, зменшує рівні ЛНГ в плазмі і збільшує рівні корисних ліпопротеїнів ВИСОКОЇ густо ти (ЛВГ). Однак, естроген не відновлює кістки у остеопорозному скелеті до стану кісток молодої людини. Крім того, довготривала терапія естрогеном спричиняє ряд розладів, включаючи зростання ризику раку матки, внутрішньоматкового раку та можливого раку молочної залози. І це є причиною відмови багатьох жінок у такому лікуванні. Через виникнення значних небажаних ефектів, пов'язаних з терапією естрогеном, виникає необхідність розробки альтернативних способів лікування остеопорозу, які б мали бажані ефекти на рівень ЛНГ в сироватці, але не спричиняли небажаних ефектів. Другим типом фармацевтичної терапії для лікування остеопорозу є використання анаболічних агентів для прискорення остеогенезу та збільшення кісткової маси. Такі агенти повинні відновлювати стан кісток в остеопорозному хребті. Деякі простагландинові агоністи розкриті в патентах Великобританії №№ 1478281 і 1479156, а також в патентах США №№ 4175203, 4055596, 4175203, 3987091 і 3991106, які ε користними як, наприклад, ниркові вазодипататори. У патенті США № 4033996 розкриті 8-аза-9-оксо(і діоксо)-тіа-11,12-секопростагландини, які є корисними як ниркові вазодилататори для запобігання утворення тромбів, для зменшення виділення гормонів росту, а також як регулятори імунної реакції. У патенті Франції № 897566 розкриті похідні амінокислот для лікування неврологічних, психічних та серцево-судинних захворювань. J. Org. Слеш. 26; 1961; 1437 розкриває №-ацетил-№бензил-р-амінофенілмеркаптоацетилову кислоту. У патенті США № 4761430 розкриті сполуки арилбензенсульфонаміду як агенти, що зменшують рівень ліпідів. У патенті США № 4443477 розкриті сульфонамідофенілкарбонові кислоти як агенти, що зменшують рівень ліпідів. У патенті США № 3528961 розкриті похідні ε-капролактаму як фарбники. У патенті США № 3780095 розкриті ацильовані анілінкарбонові кислоти як жовчогінні речовини. У патенті США № 4243678 розкриті ацилгідрокарбіламіналканові кислоти, які застосовуються при лікуванні виразки шлунку, як інгібітори жировиділення, а також для боротьби із запаленнями шкіри. У патенті США № 4386031 розкриті М-бензоїл-ш-аніліналканкарбонові кислоти як протиалергійні речовини, інгібітори агрегації тромбоцитів, протизапальні агенти та агенти, що зменшують рівень ліпідів. Повідомлялося, що внаслідок зменшення кісткової маси крім остеопорозу лише в Америці щорічно виявляють майже 20-25 млн. випадків у жінок і у зростаючої кількості чоловіків вертебральних переломів, а також 250000 випадків переломів тазостегнових суглобів. В останньому випадку спостерігається коефіцієнт смертності 12% протягом перших двох років, 30% пацієнтів потребують догляду няньки після перелому. Оскільки це дуже важливо, "очікується, що зростуть економічні та медичні наслідки одужання завдяки повільному або неповному зростанню кісток на місцях переломів, завдяки старінню населення в цілому. Естрогени були показані (Bolander et al., 38th Annual Meeting Orthopedic Research Society, 1992) для удосконалення якості лікування апендикулярних переломів. Таким чином, естрогензаміщувальна терапія повинна бути е фективною як спосіб лікування переломів. Однак, дотримання хворим режиму і схеми лікування естрогеном є відносно недостатніми через його побічні ефекти, включаючи відновлення менструації, мастодинії, підвищений ризик раку матки, підвищений ризик раку молочної залози, а також супутнє використання прогестинів. Крім того чоловіки не погоджуються на лікування естрогеном. Існує необхідність в терапії, яка була б корисною для пацієнтів, які страждають переломами ослаблених кісток і яка б підвищила дотримання хворим режиму і схеми лікування. Продемонстрували, що простагландин Е2 (PGE2) може відновлювати ослаблені кістки у оваріектомізованого (OVX) пацюка, моделі для постклімактеричного остеопорозу. Ке, H.Z., et al., Bone, 23:249255, 1998. Однак, спостерігалися серйозні побічні наслідки, пов'язані з PGE2. Jee, W.S.S. and Ma, Y.F., Bone, 21:297-304,1997. Хоча існує ряд терапій остеопорозу, виникає необхідність і продовжується пошук в даній галузі стосовно альтернативних терапій остеопорозу. Крім того, існує необхідність в терапії зростання кісток на місці перелому. Також, існує необхідність в терапії, яка може покращити відновлення росту в скелетних зонах, де існують дефекти, викликані або спричинені, наприклад, пухлинами в кістках. Крім того, існує необхідність в терапії, яка може покращити відновлення росту кісток в скелетних зонах, де потрібна трансплантація кістки. Цей винахід стосується способів лікування станів, викликаних зменшенням кісткової маси у ссавців, що полягають у призначенні ссавцям селективного антагоніста ЕР4 рецептора, його проліків або фармацевтично прийнятної солі згаданого селективного агоніста ЕР4 рецептора або згаданих проліків. Цей винахід особливо стосується таких способів, коли згаданим станом є остеопороз, крихкість, остеопорозний перелом, дефект кісток, дитяче ідиопатичне розрідження кістки, альвеолярне розрідження кістки, мандибулярне розрідження кістки, перелом кістки, остеотомія, розрідження кістки, пов'язане з періодонтитом, або протезне вростання. У способах цього винаходу, яким віддається перевага, селективний агоніет ЕР4 рецептора призначається систематично,, наприклад, орально, підшкірно, внутрішньом'язово або як аерозоль. В інших способах цього винаходу, яким віддається перевага, агоніст ЕР4 рецептора призначається для місцевого застосування. Способи цього винаходу є особливо корисними, коли згаданим станом є крихкість.. Способи цього винаходу є особливо корисними, коли згаданим станом є остеопороз. Способи цього винаходу є також особливо корисними, коли згаданим станом є перелом кістки або остеопорозний перелом. Селективні агоністи ЕР4, яким віддається перевага, для використання в способах цього винаходу включають сполуки формули І: їх проліки і фармацевтично прийнятні солі згаданих композицій або згаданих проліків, де: Q - це COOR3 , CONHR4 або тетразол-5-іл; А - це простий або цис-подвійний зв'язок; В - це простий або транс-подвійний зв'язок; U – це R2 - це α-тіеніл, феніл, фенокси, однозаміщений феніл і однозаміщений фенокси, згаданими замісниками є хлор, фтор, феніл, метокси, трифторметил або (Сі-Сз)алкіл; R3 - це водень, (Сі-С5)алкіл, феніл або р-біфеніл; R4-4e COR 5 або SO2R5; і R5-це феніл або (С1-С5)алкіл. Групою селективних агоністів ЕР4 рецептора формули І, яким віддається перевага, для використання в способах цього винаходу є сполуки сполуки формули І, в яких Q - це 5-тетразоліл і U – це які утворюють сполуки, що мають формулу IА Сполуками в межах цієї групи, яким віддається особлива перевага, є 5S-(4-(3-хлор-феніл)-ЗR-гідроксибутил)-1-(6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил-піролідин-2-он; 5S-(3R-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил)-1-(6(2Н-тетразол-5-іл)-гексил)-піролідин-2-он; 5R-(3S-гідрокси-4-феніл-бут-1-еніл)-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил)піролідин-2-он; і 5S-(3R-гідрокси-4-феніл-бутил)-1 -[6-(1 Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он. Іншою групою селективних агоністів ЕР4 рецептора формули І, якимвіддається перевага, для використання в способах цього винаходу є сполуки сполуки формули І, в яких Q - це СООН. Сполуками в межах цієї групи, яким віддається особлива перевага, є 7-{2S-[ЗR-гідрокси-4-(3-фенокси-феніл)-бутил]-5-оксопіролідин-1-іл}-гептанова кислота; 7-{2S-(ЗR-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил)-5-оксо-піролідин-1-іл)гептанова кислота; 7-{2S-[4-(3-хлор-феніл)-ЗН-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанова кислота; 7-{2S(ЗR-гідрокси-4-феніл-бутил)-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанова кислота; і 7- [2R-(3S-гідрокси-4-феніл-бут-1 еніл)-5-оксо-піролідин-1-іл]-гептанова кислота. Переважно лікуються жінки після менопаузи і чоловіки віком від 60 років. Також віддається перевага особам, незалежно від віку, у яких спостерігається значне зменшення кісткової маси, тобто в 1,5 рази або більше від рівня кісткової маси молодої людини. У способах цього винаходу, станами, викликаними зменшенням кісткової маси, є такі стани як, наприклад, остеопороз, дитяче ідиопатичне розрідження кістки, альвеолярне розрідження кістки, мандибулярне розрідження кістки, перелом кістки, остеотомія, розрідження кістки, пов'язане з періодонтитом, або протезне вростання. Способи лікування "вторинного остеопорозу" також включаються в межі способів цього винаходу. "Вторинний остеопороз" включає остеопороз, викликаний глюкокортикоїдами, остеопороз, викликаний гіпертиреозом, остеопороз, викликаний іммобілізацією, остеопороз, викликаний гепарином, і остеопороз, викликаний імунодепресією, у хребетних тварин, наприклад, ссавців (включаючи людину). Ці способи полягають у призначенні згаданим хребетним тваринам, наприклад, ссавцям, для лікування "вторинного остеопорозу" кількості селективного простагландинового агоніста ЕР4 рецептора, його проліків або фармацевтично прийнятної солі згаданого селективного простагландинового агоніста ЕР4 рецептора або згаданих проліків. Ще один аспект даного винаходу стосується способів для підсилення приживлюваності кісткового трансплантанта, включаючи вертебральний синостоз, підсилення випрямлення трубчасти х кісток, підсилення зростання кісток внаслідок лицьової реконструкції, верхньощелепної реконструкції та/чи нижньощелепної реконструкції у хребетних, наприклад, у ссавців (включаючи людину), що полягає у призначенні згаданим хребетним, наприклад, ссавцям, які перенесли лицьову реконструкцію, верхньощелепну реконструкцію чи нижньощелепну реконструкцію, кількості селективного простагландинового агоніста ЕР4 рецептора, його проліків або фармацевтично прийнятної солі згаданого селективного простагландинового агоніста ЕР4 рецептора або згаданих проліків для прискорення зростання кістки. Активні селективні простагландинові агоністи ЕР4 рецептора цього винаходу можна призначати для місцевого застосування на місце реконструкції кістки або для системного застосування. Доза, якій віддається перевага, становить 0,001-100 мг/кг/день селективних агоністів ЕР4 рецептора, їх проліків або фармацевтично прийнятної солі згаданої сполуки або проліків. Особливо віддається перевага дозі, що становить 0,01-10 мг/кг/день селективного агоніста ЕР4 рецептора, його проліків або фармацевтично прийнятної солі згаданої сполуки або проліків. Фраза "стан(и), що полягає(ють) у зниженні кісткової маси" стосується стану, коли рівень кісткової маси нижчий норми для такого віку, як визначається в стандартах Всесвітньої Організації Здоров'я "Assessment of Fracture Risk алеї its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994). Report of a World Health Organization Study Group. World Health Organization Technical Series 843". До "стану(ів), що полягає(ють) у зменшенні кісткової маси" належать первинний та вторинний остеопороз, як згадано вище. Також до таких станів належать периодонтальні захворювання, альвеолярне розрідження кісток, розрідження кісток внаслідок остеостомії та дитяче ідіопатичне розрідження кісток. Фраза "стан(и), що полягає(ють) у зменшенні кісткової маси" також включає ускладнення остеопорозу, такі як викривлення хребта, зменшення зросту та протезна хірургія. Фраза "стан(и), що полягають у зменшенні кісткової маси" також стосується хребетних, наприклад, савців, які мають значно вищу за середню вірогідність розвитку вищезгаданих захворювань, включаючи остеопороз (наприклад, жінки після менопаузи та чоловіки, віком за 50 років). Здатність збільшення кісткової маси включає прискорення зростання кістки на місці перелому, відновлювапьну хір ургію за допомогою кісткового трансплантанта, прискорення приживання кісткових трансплантатів, зростання кісток після лицьової реконструкції, верхньощелепної реконструкції чи нижньощелепної реконструкції, вростання протеза, вертебрапьний синостоз або випрямлення трубчатої кістки. Способи цього винаходу також можуть застосовуватися в зв'язку з ортопедичними пристроями, такими як каркаси для з'єднання хребців, апаратні засоби для з'єднання хребців, пристрої для внутрішньої і зовнішньої фіксації кісток, гвинти і штифти. Фахівець в даній галузі зрозуміє, що термін "кісткова маса" насправді стосується кісткової маси на одиницю площі, яка іноді (хоча не завжди вірно) означає густин у мінералів у кістках. Термін "лікування", що вживається тут означає запобіжну (наприклад, профілактичну), паліативну і лікувальну дію. Під "фармацевтично прийнятним" мається на увазі, що носій, зв'язувальна речовина, розріджувач, наповнювач та/чи сіль повинні бути сумісними з іншими інгредієнтами композиції, а також повинні бути нешкідливими для реципієнта. Термін "проліки" стосується сполуки, що є попередником лікарського засобу, який після застосування виділяє цей лікарський засіб in vivo в результаті деяких хімічних або фізіологічних процесів (наприклад, проліки при доведенні до фізіологічного рівня рН або завдяки дії фермента перетворюються на бажану форму лікарського засобу). Типові проліки при розщепленні виділяють бажану сполуку лікарського засобу. Вираз "фармацевтично прийнятна сіль" стосується нетоксичних аніонних солей, що містять аніони, такі як (але не обмежуються до) хлорид, бромід, йодид, сульфат, бісульфат, фосфат, ацетат, малеат, фумарат, оксалат, лактат, тартрат, цитрат, глюконат, метансульфонат і 4-толуол-сульфонат. Вираз також стосується нетоксичних катіонних солей, таких як (але не обмежуючись до) натрій, калій, кальцій, магній, амоній або протонований бензатин (Ν,Ν'-дибензилетилендіамін), холін, етаноламін, діетаноламін, етилендіамін, мегламін (N-метил-глюкамін), бенетамін (N-бензилфенетиламін), піперазин або трометамін (2-аміно-2-гідроксиметил1,3-пропандіол). Способи цього винаходу мають результатом остеогенез завдяки зменшеному числу переломів. Даний винахід є значним внеском в дану галузь завдяки забезпеченню способів, що підвищують остеогенез, і мають результатом запобігання, затримку та/чи регресію остеопорозу та пов'язаних захворювань кісток. Цей винахід також стосується сполук, вибраних з 7-{2S-[ЗR-гідрокси-4-(3-фенокси-феніл)-бутил]-5-оксопіролідин-1-іл}-гептанової кислоти; 5S-(4-(3-хлор-феніл)-ЗR-гідрокси-бутил)-1-(6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексилпіролідин-2-он; 7-{2S-(3R-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил)-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанової кислоти; 7-{2S-[4-(3-xлop-феніл)-ЗR-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти; та 5S-(3R- гідрокси-4-(3трифторметил-феніл)-бутил)-1-(6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил)-піролідин-2-ону. Цей винахід також особливо стосується 7-{2S-[ЗR-гідрокси-4-(3-фенокси-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1іл}-гептанової'кислоти. Цей винахід також особливо стосується 5S-(4-(3-хлор-феніл)-ЗR-гідрокси-бутил)-1-(6-(2Н-тетразол-5-іл)гексил-піролідин-2-ону. Цей винахід також особливо стосується 7-{2S-(ЗR-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил)-5-оксопіролідин-1-іл)-гептанової кислоти. Цей винахід також особливо стосується 7-{2S-[4-(3-хлор-феніл)-ЗR-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}гептанової кислоти. Цей винахід також особливо стосується 5S-(ЗR-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил)-1-(6-(2Нтетразол-5-іл)-гексил)-піролідин-2-ону. Інші риси і переваги стануть зрозумілими з опису та формули, які описують винахід, Будь-який селективний агоніст ЕР4 рецептора може використовуватися як селективний агоніст ЕР4 рецептора даного винаходу. Селективні агоністи ЕР4 - це сполуки, які мають ІС50 по відношенню до рецепторів ЕР1, ΕΡ2 і ЕРЗ, що, принаймні, в 10 разів більше за ІС50 для підвиду ЕР4 рецептора. Наприклад, 7-{2-(3-гідрокси-4-феніл-бутил)-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанова кислота - це селективний PGE2 агоніст ЕР4 рецептора з ІС50 зв'язування ЕР4 рецептора, що дорівнює 16 нМ. У всі х інши х підвидах рецептора ЕР, включаючи підвиди рецепторів ЕР1, ΕΡ2 та ЕРЗ, ІС50 для 7-{2-{3-гідрокси-4-феніл-бутил)-5-оксо-піролідин-1іл)-гептанової кислоти є більше ніж 3200нМ. Сполуки Формули І можна одержати як показано в патенті США №4177346, який включений сюди шляхом посилання. Селективні агоністи ЕР4 рецептора, що використовуються в способах даного винаходу, адаптовані для терапевтичного використання як агенти, що стимулюють остеогенез та збільшення кісткової маси у хребетних, наприклад, у ссавців, включаючи людину. Оскільки остеогенез тісно пов'язаний з розвитком остеопорозу та захворюваннями кісток, агоністи, що використовуються в способах даного винаходу завдякисвоїй дії на кістки, запобігають, зупиняють та/чи регресують остеопороз. Корисність селективних агоністів ЕР4, що використовуються у способах даного винаходу як лікарські засоби при лікуванні станів, що полягають у зменшенні кісткової маси (наприклад, остеопороз) у хребетних, наприклад, ссавців (зокрема у людей, особливо у жінок), демонструється активністю таких агоністів в загальноприйнятих аналізах, включаючи аналіз зв'язування рецептора, дослідження циклічного АМФ, дослідження in vivo та дослідження по зростанню кісток, які описуються нижче. Такі аналізи дозволяють порівняти активність селективних агоністів ЕР4 між собою та з активністю інших відомих сполук і композицій. Результати таких порівнянь є корисними для визначення рівнів дозування для хребетних, наприклад, для ссавців, включаючи людину, для лікування таких захворювань. Дослідження in vivo Активність анаболічних кісткових агентів на підсилення остеогенезу та збільшення кісткової маси можна дослідити на здорових пацюках чоловічої і жіночої статі та на пацюках, позбавлених статеви х гормонів (орхіектомізовані пацюки чоловічої статі та оваріектомізовані пацюки жіночої статі). Під час дослідження можна використовува ти пацюків чоловічої та жіночої статі різного віку (як, наприклад, віком 3 місяці). Пацюкам, здоровим або кастрованим (оваріектомізованим чи орхідектомізованим), вводили підшкірно або вводили через шлунковий зонд різні дози простагландинових агоністів (1, 3, або 10 мг/кг/день) протягом ЗО днів. У кастрованих пацюків лікування починалося наступного дня після операції (для запобігання розрідження кісток) або в момент появи розрідження кісток (для відновлення кісткової маси). Протягом дослідження всі пацюки мали вільний доступ до води та сухого корму (Teklad Rodent Diet #8064, Harlan Teklad, Madison, Wl), що містить 1,46% кальцію, 0,99% фосфору та 4,96 IU/г вітаміну D 3. Усім пацюкам підшкірно вводили по 10мг/кг капьцеїну за дванадцять та два дні перед усипанням. Пацюків усипали. Одержали наступні результати: Вимірювання мінералів у стегні: Під час аутопсії у кожного пацюка вилучали праве стегно і сканували його, застосовуючи подвійний абсорбційний рентгеноспектральний аналіз (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA) оснащену програмним забезпеченням "Regional High Resolution Scan" (Hologic Inc., Waltham, MA). Розмір поля сканування - 5,08 ´ 1,902см, дозвіл -0,0254 ´ 0,0127см і швидкість сканування - 7,25мм/с. Аналізували відскановані зображення стегон і визначали ділянку кістки, вміст мінералів у кістці (ВМС), і густину мінералів у кістці (BMD) усього стегна (WF), метафізи дистального стегна (DFM), тіло стегнової кістки (FS) та проксимальне стегно (PF). Гістоморфометричний аналіз великогомілкової кістки: Під час аутопсії вилучали праву гомілку, звільняли її від мускул і розрізали на три частини. Проксимальну великогомілкову кістку та тіло великогомілкової кістки поміщали в 70% етанол, зневоднювали у висококонцентрованому етанолі, обезжирювали в ацетоні, а потім занурювали в метилметакрилат (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY). Фронтальні секції метафізів проксимальних великогомілкових кісток товщиною 4 і 10мкМ розрізали, використовуючи мікротом Reichert-Jung Polycut S. Секції товщиною 4мкМ фарбували модифікованою фарбою Masson's Trichrome, в той час як секції товщиною 10мкМ залишали нефарбованими. По одній секції товщиною 4 мкМ та 10мкМ з кожного пацюка використовували для гістоморфометріТ губчатої кістки. Поперечні зрізи тіл великогомілкових кісток товщиною ЮмкМ розрізали, використовуючи мікротом Reichert-Jung Polycut S. Ці зрізи використовували для гістоморфометричного аналізу кортикальних кісток. Гістоморфометрія губчатої кістки: Гістоморфометричну систему Bioquant OS/2 (R&M Biometrics, Inc., Nashville, TN) використовували для статичних і динамічних гістоморфометричних вимірювань вторинного спонгіозу проксимальних великогомілкових метафізів між 1,2 та 3,6мм дистально у відношенні до росту пластинно-епіфізіального злиття. Перші 1,2мм тибіальної метафізарної ділянки потрібно пропускали з метою обмеження вимірювання вторинних спонгіозів. Секцію товщиною 4мкМ використовували для визначення індексів стосовно об'єму кістки, структури кістки та резорбції кістки, в той час як секції товщиною 10мкМ використовували для визначення індексів стосовно остеогенезу та обігу мінералів у кістці. І) Вимірювання і обчислення стосовно об'єму і структури губчатоТ кістки: (1) Загальна метафізарна ділянка (TV, мм 2): метафізарно ділянка між 1,2 та 3,6 мм дистально у відношенні до росту пластинно-епіфізіального злиття. (2) Ділянка губчатої кістки (BV, мм 2): загальна ділянка трабекул в межах TV. (3) Периметр губчатої кістки (BS, мм): довжина загального периметру трабекул. (4) Об'єм губчатої кістки (BV/TV, %): BV / TV x 100. (5) Розмір губчатої кістки (ΤΒΝ, #/мм): 1,199 / 2 ´ BS / TV. (6) Товщина губчатої кістки (ТВТ, мкМ): (2000 /1,199) ´ (BV/ BS). (7) Розділення губчатої кістки (TBS, мкМ): (2000 ´ 1.199) ´ (TV - BV). ІІ) Вимірювання і обчислення стосовно резорбції кістки: (1) Розмір остеокласта (OCN, #): загальний розмір остеокласта в межах загальної метафізарної ділянки. (2) Периметр остеокласта (ОСР, мм): довжина периметра губчатої кістки покритої остеокластами. (3) Розмір/мм остеокласта (OCN/мм, #/мм): OCN / BS. (4) Периметр остеокласта в процентному співвідношенні (%ОСР, %): ОСР / BS ´ 100. Ill) Вимірювання і обчислення стосовно остеогенезу і обігу мінералів у кістці (1) Мічений периметр, що містить один кальцеїн (SLS, мм): загальна довжина трабекулярного периметра міченого однією капьцеїновою міткою. (2) Мічений периметр, що містить два кальцеїни (DLS, мм): загальна довжина трабекулярного периметра, міченого двома кальцеїновими мітками. (3) Зсередини мічена ширина (ILW, мкМ): середня відстань між двома кальцеїновими мітками. (4) Периметр мінералізації в процентному співвідношенні (PMS, %): (SLS/2 + DLS) / BS χ 100. (5) Значення мінеральної репозиції (MAR, мкМ/day): ILW Лнтервап мітки. (6) Швидкість остеогенезу/поверхня (BFR/BS, мкМ2/д./мкМ): (SLS/2 + DLS) ´ MAR / BS. (7) Швидкість обігу мінералів у кістці (BTR, %/y): (SLS/2 + DLS)´MAR/BV´100. Гістоморфометрія кортикального шару кістки: Пстоморфометричну систему Bioquant OS/2 (R&M Biometrics, Inc., Nashville, TN) використовували для статичних і динамічних гістоморфометричних вимірювань кортикального шару тіла великогомілкової кістки. Вимірювали загальну ділянку тканини, ділянку мозкової порожнини, періостальний периметр, ендокортикальний периметр, одно-мічений периметр, двойний мічений периметр, і зсередини мічену товщин у на обох періостальній і ендокортиальній поверхнях, і обчислювали ділянку губча тої кістки (ділянка загальної тканини - ділянка мозкової порожнини), ділянку губчатої кістки в процентному співвідношенні (кортикальна ділянка / ділянку загальної тканини ´ 100), ділянку мозку в процентному співвідношенні (ділянка мозкової порожнини / ділянку загальної тканини ´ 100), періостеальний і ендокортікальний процент міченого периметра [(одно-мічений периметр/2+двойний мічений периметр)/загальний периметр ´ 100], значення мінеральної репозиції (зсередини мічена ширина/інтервали), та показник остеогенезу [значення мінеральної репозиції ´ [(одно-мічений периметр/2+двойний мічений периметр/загальний периметр]. Статистичні дані Статистичні дані обчислювали, використовуючи пакети StatView 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA). Аналіз на варіантність (ANOVA), що проводиться за допомогою PLSD Фішера (Stat View, Abacus Concepts Inc., 1918 Bonita Ave, Berkeley, C A 94704-1014) використовували і для порівняння розбіжностей між групами. Визначення підвищення рівня цАМФ у клітинних лініях 293-S, що стабільно понадекспресують рекомбінантні людські ЕР4 рецептори. кДНК, що представляють повні відкриті рамки зчитування для людських ЕР4 рецепторів, одержали за допомогою зворотної ПЛР при використанні олігонуклеотидних праймерів, що базуються на опублікованих послідовностях (1) і РНК від первинних клітин людських легеней (ЕР4), у якості шаблонів. кДНК клонуються в численні області клонування pcDNAS (Invitrogen Corporation, 3985B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA 92121) і використовуються для трансфекції людських клітин 293-S ембріональної нирки шляхом попередньої пресіпітації фосфату кальцію. G418-стійю колонії розмножувалися та тестувалися на специфічне [3H]PGE2 зв'язування. Трансфектанти, що демонструють високі рівні специфічного [3H]PGE2 зв'язування далі характеризувалися шляхом аналізу Скетчарда для визначення Вmax і Kds для PGEs. Лінії, вибрані для пошуку сполуки, мають приблизно 256400 рецепторів на клітину і Kd = 2,9нМ для PGE2 (EP2). Постійне експресування рецептора в парентальних клітинах 293-S є незначним. Клітини залишають в RPMI з додаванням сироватки плода корови (10% кінцевої юлькості) та G418 (700 мкМ/мл кінцевої кількості). Відповіді цАМФ в лініях 293-S/EP4 визначали шляхом відділення клітин з колби з культурою в 1 мл Са++ і Мд++ де фіцитний по PBS буфер за допомогою ретельного подрібнення, додаючи RPMI без вмісту сироватки до кінцевої концентрації 1 ´ 106 кпітин/мл, і додаючи З-ізобутил-1-метилксантин (ІВМХ) до кінцевої концентрації 1мМ. Один міліметр клітинної суспензії негайно аліквотувапи у 2мл мікроцентрифузі з підвішеним ротором та інкубувати протягом 10 хвилин, регенерували при 37°С, 5% СО2, відносній вологості 95%. Сполука, яку потрібно протестувати , додавали до клітин у співвідношенні 1:100, щоб кінцева концентрація ДМСО або етанолу становила 1%. Після додавання сполуки негайно закрили трубки, перемішували, перевертаючи двічі, та інкубували при 37°С хвилин і негайно охолоджували на льоду протягом 5 хвилин. Клітковий осад осідав після центрифугування при 1000 ´ g протягом 5 хвилин, і очищені лізати переміщували у чисті тр убки. Концентрацію цАМФ визначали за допомогою комерційно доступного комплекту для радіоімуноанапізу цАМФ (NEK-033, DuPont/NEN Research Products, 549 Albany St., Boston, MA 02118), після чого розводили очищені лізати у співвідношенні 1:10 в буфері для радіоімуноанапізу цАМФ (що входить до комплекту). Як правило, клітини обробляли 6-8 концентраціями сполуки, яку потрібно тестувати, в логарифмічних розведеннях. Обчислення ЕС 50 здійснювали на калькуляторі з використанням аналізу лінійної регресії на лінійній ділянці кривих реакції на дозу. Посилання: 1. Regan, J.W. Bailey, T.J. Pepperl, D.J. Pierce, K.L Bogardus, A.M. Donello, J.E. Fairbaim, C.E. Kedzie, K.M. Woodward, D.F. and Gil, D.W. 1994 Cloning of a Novel Human Prostaglandin Receptor with Characteristics of the Pharmaclogically Defined EPz Subtype. Мої. Pharmacology 46:213-220. Дслідження щодо зв'язування простагландинових E2 рецепторів Приготування мембрани: Всі операції проводили при 4°С. Трансфектовані клітини, що експресують простагландинові Е2 рецептори типу 1 (ЕР1 , рецептори типу 2 (ЕР2), тип у З (ЕР3) або типу 4 (ЕР4), збирали і суспендували у співвідношенні 2 млн. клітин на мл в буфері А [50 мМ Тріс-НСІ (рН 7.4), 10 мМ МgСІ2, 1мМ EDTA, 1мМ пефаблокового пептида, (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN), 10мкМ фосфорамідонового пептида, (Sigma, St. Louis, MO), 1мкМ пепстатину А пептида, (Sigma, St. Louis, MO), 10мкМ еластатінального пептида, (Sigma, St. Louis, MO), 100мкМ протибольового пептида, (Sigma, St. Louis, MO)]. Клітини руйнували шляхом ультразвукової обробки сонатором Брансона (Model #250, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) двома вибухами по 15 секунд. Нелізовані клітини і залишоквиділяли центрифугуванням при 100´g протягом 10хв. Потім мембрани збирали шляхом центрифугування при 45,000 ´ g протягом хвилин. Мембрани, що осіли, ресуспендували до рівня 3-10 мг протеїну на мл буфера А, концентрацію протеїну визначали методом Бредфорда [Bradford, Μ., AnaJ. Biochem., 72,248 (1976)]. Ресуспендовані мембрани зберігали у замороженому вигляді при -80°С до використання. Дослідження зв'язування: Заморожені мембрани, приготовлені як вказано вище, розморожували і розбавляли до 0,5мг/мл (для пацюкового ЕР2) або 0,3мг/мл (для пацюкового ЕР4) у вищезгаданому буфері А. Заморожені мембрани, приготовлені як вказано вище, розморожували і розбавляли до 0,5мг/мл (для пацюкового ЕР2) або 0,3мг/мл (для пацюкового ЕР4) у вищезгаданому буфері А. Один об'єм мембран з'єднували з 0,05 об'єму тесто ваної сполуки або буферу і одним об'ємом 3нМ3 Н-простагландину Е2 (#TRK 431, Amersham, Arlington Heights, IL) в буфері А. Суміш (205 мкЛ загального об'єму) інкубували протягом 1 години при 25°С. Потім мембрани, регенерували шляхом фільтрування через скловолоконні фільтри типу GF/C (#1205-401, Wallac, Gaithersburg, MD) з використанням збирального пристрою Томтека (Model Mach 11/96, Tomtec, Orange, CT). Мембрани із зв'язаним 3Н-простагландином Е2 відловлюються фільтром, в той час як буфер і незв'язаний 3Н-простагландин Е2 проходять через фільтр у відходи. Потім кожен зразок тричі промивали 3мл 50 мМ Тріс-НСІ (рН 7.4), 10 мМ МgСІ2, 1 мМ EDTA. Фільтри просушували у мікрохвильовий печі. Для визначення кількості зв'язування 3Н-простагландину Е2 з мембранами, просушені фільтри поміщали в пластмасові мішки з рідиною для сцинтиляції і обчислювали на Betaplate зчитувачі LKB 1205 (Wallac, Gaithersburg, MD). ICso визначали з концентрації тестованої сполуки, необхідної для витіснення 50% специфічно зв'язаного 3Н-простагландину Е2. 293S клітини, що експресують пацюкові рецептори ЕР2 і ЕР4 простатандина Е2, генерували способами, відомими фахівцям у даній галузі. Як правило, праймери ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція), що стосуються кінців 5' та 3' опублікованого рецептора повної довжини готували ви щерозкритими способами і використовували в реакціях RT-ПЛР з викристанням загальної РНК з нирки пацюка для обох ЕР2 та ЕР4 рецепторів. Повну кодуючу послідовність ЕР2 рецептора пацюка готували як розкрито в Nemoto et al., Prostaglandins, 1997, 54,713-725. Повну кодуючу послідовність ЕР4 рецептора пацюка готували як розкрито в Sando et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994,200,1329-1333. Такі рецептори повної довжини використовували для приготування 293S клітин, що експресують ЕР2 та ЕР4 рецептори. Повну кодуючу послідовність для ЕРі рецептора готували як розкрито в Funk et al., Journal of Biological Chemistry, 1993, 268,26767-26772. Повну кодуючу послідовність для ЕР2 рецептора готували як розкрито в Regan et al., Molecular Pharmacology, 1994,46,213-220. Повну кодуючу послідовність для ЕРз рецептора готували як розкрито в Regan et al., British Journal of Pharmacology, 1994, 112,377-385. Повну кодуючу послідовність для ЕР4 рецептора готували як розкрито в Bastien, Journal of Biological Chemistry, 1994, 269,11873-11877. Такі рецептори повної довжини використовували для приготування клітин 293S, що експресують ЕР1 ЕР2, ЕР3 та ЕР 4 рецептори. Клітини 293s, що експресують людські ЕР1, ЕР2, ЕР 3 або ЕР4 простагландинові Е2 рецептори, генерували способами, добре відомими фахівцям у даній галузі. Як правило, праймери ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція), що стосуються кінців 5' та 3' опублікованого рецептора повної довжини готували ви щерозкритими способами і використовували в реакціях RT-ПЛР з викристанням загальної РНК з нирки людини (для ЕР1), легень людини (для ЕР2), легень людини (для ЕР3) або лімфоцитів людини (для EP4). Продукти ПЛР клонували за допомогою методу ТА виступаючих кінців у плазміді pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) і ідентичність клонованого рецептора підтверджували розшифровкою послідовності ДНК. 293S клітини (Mayo, Dept. of Biochemistry, Northwestern Univ.) трансфектуються клонованим рецептором у плазміді pcDNA3 шляхом електропорації. Стабільні клітинні лінії, що експресують рецептори, встановлюються наступною селекцією трансфектованих клітин з G418. Лінії клонованих клітин, що експресують максимальну кількість рецепторів, вибирали, дотримуючись аналізу зв'язування 3H-PGE2 з використанням немічених PGE 2 в якості конкурента. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗРОСТАННЯ КІСТКИ ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВІВ НА ЗРОСТАННЯ КІСТКИ ПІСЛЯ СИСТЕМНОГО ПРИЗНАЧЕННЯ Техніка перелому: Пацюків Sprage-Dawley віком 3 місяці анастезували кетаміном. На проксимальній частині правої гомілки або стегна робили розріз довжиною 1см. Нижче наводиться хірургічна техніка стосовно гомілки. Розріз продовжували до кістки і просвердлювали отвір діаметром 1мм на 4мм проксимально до дистальної сторони горбкуватості великогомілкової кістки і на 2мм медіально до переднього виступу. Інтрамедулярний внутрішньокістковий остеосинтез здійснювали стальним нефарбованим штифтом діаметром 0,8мм (максимальне навантаження 36,3 N, максимальна жорсткість 61,8 N/мм, тестували за тих же умов, що й кістки). Кістково-мозковий канал не розсвердлювали. Стандартизований закритий перелом робили на 2 мм вище місця сполучення великогомілкової та малогомілкової кісток шляхом триточкового згинання з використанням спеціальних регульованих щипців з тупими затискачами. Для мінімізації пошкодження м'якої тканини, старалися не змістити перелом. Шкіру зшивали елементарною ниткою найлону. Операцію проводили при стерильних умовах. Рентгенівські знімки всіх преломів робили негайно після внутрішньокісткового остеосинтезу, І вилучали пацюків з переломами поза межами спеціальної діафізарної ділянки або із зміщеними штифтами. Тварин, що залишилися, довільно розділяли на наступні фупи з 10-12 тваринами у кожній підгрупі на період для тестування зростання кістки на місці перелому. Перша група одержувала щоденно гіпераліментацію наповнювача (вода: 100% етанол = 95:5) при 1 мл/пацюк, в той час як інші одержували гіпераліментацію 0,01-100мг/кг/день тестованої сполуки (1 мл/пацюк) на 10, 20, 40 і 80 день. На 10, 20, 40 і 80 день, 10-12 пацюків з кожної групи анезтезувапи. кетаміном і умертвляли шляхом знекровлювання. Великогомілкову і малогомілкову кістки вилучали при розтині і видаляли всю м'яку тканину. Кістки 5-6 пацюків з кожної групи зберігали в 70% етанолі для гістологічного аналізу, а кістки інших 5-6 пацюків з кожної групи зберігали в буферному розчині Рінгера (+4°С, рН 7.4) для рентгенівських знімків та біомеханічних тестувань, що проводилися. Гістологічний аналіз: Способи гістологічного аналізу пошкодженої кістки (перелом) були раніше опубліковані Моускшдом і Беком (The Effects of Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A Histofogical Description. Bone, 14:19-27, 1993). Коротко, місце перелому розпилювали на 8мм до кожного боку лінії перелому, поміщеного некальцінованим в метиметакрилат, і розрізали фронтальні ділянки на мікротомі Reichert-Jung Polycut товщиною 8мкМ. Masson-Trichrome забарвлені середньо-фронтальні ділянки (включаючи великогомілкову кістку та малогомілкову кістку) використовували для відображення реакції клітин і тканини на зростання кістки з та без лікування. Ділянки, забарвлені червоною фарбою Sirius, використовували для відображення характеристики структури кісткової мозолі, а також для диференціації перетинчастої ретикулофіброзної кістки і пластинчатої кістки на місці перелому. Проводили наступні вимірювання: (1) щілина перелому - вимірюється як найкоротша відстань між кінцями кортикального шару кістки та в переломі, (2) довжина і діаметр кісткової мозолі, (3) загальна площа кісткової мозолі в об'ємі кістки, (4) кісткова тканина на ділянку тканини в межах ділянки кісткової мозолі, (5) волокниста з'єднувальна тканина в кістковій мозолі і (6) хрящова ділянка в кістковій мозолі. Біомеханічний аналіз: Способи біомеханічного аналізу були раніше опубліковані Беком і Андреассеном (The Effects of Aging on Fracture Healing in Rats. Calcif Tissue Int 45:292-297,1989). Коротко, рентгенівські знімки всіх переломів робили перед біомеханічним аналізом. Ме ханічні властивості зростання кістки на місці перелому аналізували деструктивною процедурою згинання в трьох або чотирьох точках. Визначали максимальне навантаження, жорсткість, енергію при максимальному навантаженні, зміщення при максимальному навантаженні і максимальне зусилля. ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВІВ НА ЗРОСТАННЯ КІСТКИ ПІСЛЯ МІСЦЕВОГО ПРИЗНАЧЕННЯ Техніка перелому: У дослідженні використовували гончих собак чоловічої та жіночої статі віком біля двох років після анестезії. Поперечні радіальні переломи виконували повільним тривалим згинанням у трьох точках як описав Lenehan et al. (Lenehan, Τ. Μ.; Baliigand, Μ.; Nunamaker, DM; Wood, F.E.: Effects of EHDP on Fracture Healing in Dogs. J Orthop Res 3:499-507; 1985). Провід втягували через місце перелому з метою гарантії повного анатомічного порушення кістки. Після чого наносили простагландинові агоністи на місце перелому шляхом застосування таблеток повільного вивільнення або використання сполук у прийнятному вигляді, як, наприклад, пасто-гелевий розчин або суспензія на 10, 15 або 20 тижнів. Гістологічний аналіз: Способи гістологічного аналізу пошкодженої кістки (перелом) були раніше опубліковані Петером et al. (Peter, СР.; Cook, W.O.; Nunamaker, D.M.; Pro vost, M. Т.; Seedor, J.G.; Rodan, G.A. Effects of alendronate on fracture healing and bone remodeling in dogs. J. Orthop. Res. 14:74-70,1996) і Мо ускілдом і Беком (The Effects of Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A Histologicat Description. Bone, 14:19-27,1993). Коротко, після умертвлення, місце перелому розпилювали на 3см до кожного боку лінії перелому, поміщеного некальцінованим в метиметакрилат, і розрізали фронтальні секції на мікротомі ReichertJung Polycut товщиною 8мкМ фронтальних секцій. Masson-Trichrome забарвлені середньо-фронтальні ділянки (включаючи великогомілкову кістку та малогомілкову кістку) використовували для відображення реакції клітин і тканини на зростання кістки з та без лікування. Ділянки, забарвлені червоною фарбою Sirius, використовували для відображення характеристики структури кісткової мозолі, а також для диференціації перетинчастої ретикулофіброзної кістки і пластинчатої кістки на місці перелому. Проводили наступні вимірювання: (1) щілина перелому - вимірюється як найкоротша відстань між кінцями кортикального шару кістки та ав переломі, (2) довжина і діаметр кісткової мозолі, (3) загальна площа кісткової мозолі в об'мі кістки, (4) кісткова тканина на ділянку тканини в межах ділянки кісткової мозолі, (5) волокниста з'єднувальна тканина в кістковій мозолі і (6) хрящова ділянка в кістковій мозолі. Біомеханічний аналіз: Способи біомеханічного аналізу були раніше опубліковані Беком і Андреассеном (The Effects of Aging on Fracture Healing in Rats. Calcif Tissue Int 45:292-297,1989) і Петером et al. (Peter, C.P.;Cook, W.O.; Nunamaker, D.M.; Pro vost, M. Т.; Seedor, J.G.; Rodan, G.A. Effects of Alendronate On Fracture Healing And Bone Remodeling In Dogs. J. Orthop. Res. 14:74-70,1996). Коротко, рентгенівські знімки всіх переломів робили перед біомеханічним аналізом. Механічні властивості зростання кістки на місці перелому аналізували деструктивною процедурою згинання в трьох або чотирьох точках. Визначали максимальне навантаження, жорсткість, енергію при максимальному навантаженні, зміщення при максимальному навантаженні і максимальне зусилля. Призначали селективні агоністи ЕР4 рецептора згідно способів даного винаходу можна будь-яким способом систематично та/чи місцево (наприклад, на місце перелому кістки, остеотомії або хірургічної ортопедії). Ці способи включають оральний, парентеральний, інтрадуодеальний способи застосування тощо.·Як правило, сполуки даного винаходу застосовують орально, але можливе і парентеральне застосування (наприклад, внутрішньовенне, внутрішньом'язове, трансдермальне, підшкірне, ректальне або інтрамедулярне), наприклад, коли орапьне застосування неприйнятне для пацієнта або коли пацієнт не може ковтнути лікарський засіб. Способи цього винаходу використовуються для лікування і покращення зростання кістки на місці перелому та остеотомій при місцевому застосуванні (наприклад, на місцях переломів кістки остеотомій) селективних агоністів ЕР4 рецептора. Селективні агоністи ЕР4 рецептора цього винаходу застосовуються на місцях перелому кістки або остеотомії, наприклад, або шляхом ін'єкції сполуки в прийнятному розчиннику (наприклад, маслянистий розчинник такий як арахісова олія) на хрящову пухлин у, або у випадках відкритого перелому, шляхом місцевого застосування сполуки у прийнятному наповнювачі, носії або розріджувачі, таких як кістковий віск, демінералізований кістковий порошок, полімерний кістковий цемент, кісткові ущільнювачі, тощо. З іншого боку, локально можна застосовувати шляхом нанесення розчину абу дисперсії сполуки в прийнятному носії або розчиннику на поверхню або їх введенні в твердий або напівтвердий імплантат, що як правило, використовується в хір ургічній ортопедії, як, наприклад, дакронова сітка, гель-піна і кістка Kiel, або протези. У будь-якому випадку кількість і тривалість застосування сполук, звичайно, буде залежати від об'єкта, що лікується, тяжкості хвороби, способу застосування та оцінки лікаря щодо стану хворого. Таким чином, через індивідуальність організму кожного пацієнта, зазначені тут дози є загальними, і лікар повинен титрувати дози лікарського засобу для досягнення бажаного ефекту при лікуванні (наприклад, збільшення кісткової маси), яку, на думку лікаря, є найбільш прийнятним для пацієнта. При виборі способу лікування лікар повинен брати до уваги ряд факторів, таких як початковий рівень кісткової маси, вік хворого, попередні захворювання, а також наявність інших захворювань (наприклад, серцевосудинні захворювання). Як правило, використовують таку кількість селективного агоніста ЕР4 рецептора, що є достатньою для збільшення кісткової маси до рівня, вищого за поріг перелому кістки (це описується в the World Health Organization Study, що вже цитувалося тут). Сполуки селективного агоніста ЕР4 рецептора, що використовуються в способах цього винаходу, як правило, призначаються у ви гляді фармацевтичних композицій, що містять, принаймні, одну сполуку цього винаходу та фармацевтично прийнятний наповнювач або розчинник. Таким чином, селективний агоніст ЕР4 рецептора можна призначати індивідуально прийнятними дозами для орального, інтраназального, парентерального, ректального або трансдермального застосування. Для орального застосування фармацевтичній композиції можна надати вигляду розчину, суспензії, таблеток; пілюль, капсул, порошку тощо. Таблетки, що містять різні наповнювачі, такі як цитрат натрію, карбонат кальцію і фосфат кальцію, виготовляють з додаванням різних дизінтегрантів, таких як крохмаль, переважно картопляний та з тапіоки, і визначені комплексні силікати, разом із зв'язувальними агентами, такими як полівінілпіролідон, сахароза, желатин і акація. Крім того, для приготування таблеток є корисними змащувальні агенти, такі як стеарат магнію, лауриловий сульфат натрію, і тальк. Подібні тверді композиції також застосовуються як наповнювачі у м'яких і твердих желатинових капсулах; матеріали, яким віддається перевага в цьому випадку, є також лактоза або молочний цукор, а також поліетиленгліколі з високою молекулярною масою. Коли для орального застосування необхідні водні суспензії та/чи елексири, композиції цього винаходу можна комбінувати з різними підсолоджувачами, ароматизаторами, фарбниками, емульгуючими агентами та/чи суспендуючими агентами, а також з такими розріджувачами, як вода, етанол, пропіленгліколь, гліцерин та різними їх комбінаціями. З метою парентерального застосування, розчини можна застосовувати в кунжутовоій чи арахісоійї олії або у водному пропіленгліколі, а також у стерильних водних розчинах прийнятних розчинних у воді солей. Такі водні розчини можна буферува ти, за необхідності, і рідкі розчинники потрібно спершу ізотонувати прийнятною сіллю або глюкозою. Такі водні розчини є особливо прийнятними для внутрішньовенних, внутрішньом'язових, підшкірних та інтраперитонеапьних ін'єкцій. В такому випадку, стерильне водне середовище можна легко одержати стандартними способами, відомими фахівцеві в даній галузі. Для трансдермапьного застосування (наприклад, місцевого), готуються розчинні стерильні водні або частково водні розчини (як правило, з концентрацією 0,1-5%), подібні до вищезазначених розчинів для парентерального застосування. Способи приготування різних фармацевтичних композицій з прийнятною кількістю активного інгредієнта є відомими або зрозумілими з опису для. фа хівця в даній галузі. Приклади способів приготування фармацевтичних композицій дивіться в Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th Edition (1995). Протокол дослідження Метою даного дослідження є визначення здатності відновлення кісткової маси оваріектомізованих пацюків за допомогою селективних агоністів ЕР4 рецептора, зокрема 7-{2-(3-гідрокси-4-феніл-бутил)-5-оксо-піролідин1-іл)-гептанової кислоти. Пацюків чоловічої статі Sprague-Dawley оваріектомізували (OVX) у віці 3,5 місяці. Через десять місяців після оваріектомізації, пацюкам підшкірно вводили наповнювач або 7-{2-(3-гідрокси-4-феніл-бутил)-5-оксопіролідин-1-іл)-гептанову кислоту (30мг/кг/день) протягом 28 днів. Пацюків розтинали. Під час аутопсії вилучали у кожного пацюка праве стегно і сканували його, застосовуючи подвійний абсорбційний рентгеноспектральний аналіз DEXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA), оснащений програмним забезпеченням "Regional High Resolution Scan" (Hologic Inc., Waltham, MA). Розмір поля сканування - 5,08 ´ 1,902см, дозвіл - 0,0254 ´ 0,0127см і швидкість сканування - 7,25мм/с. Аналізували відскановані зображення стегон. Вміст мінералів у кістці (ВМС), густину мінералів у кістці (BMD) усього стегна (WF), метафізи дистального стегна (DFM) і тіло стегнової кістки (FS) визначали способами, описаними в Η. Ζ. Ке et al., Droloxifene, a New Estrogen Antagonist/Agonist, Prevents Bone Loss in Ovariectomized Rats. ENDOCRINOLOGY 136:2435-2441,1995. Результати дослідження і обговорення Порівняно з OVX пацюками, яких обробляли наповнювачем, у OVX пацюків, яких обробляли 7-{2-(3гідрокси-4-феніл-бутил)-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептановою кислотою, загальний ВМС стегна збільшився на 17%, загальний BMD стегна збільшився на 13%, ВМС дистального стегна збільшився на 8%, BMD дистального стегна збільшився на 8%, ВМС тіла стегнової кістки збільшився на 20%, і BMD тіла стегнової кістки збільшився на 18%. У пацюків, яких обробляли 7-{2-(3-гідрокси-4-феніл-бутил)-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептановою кислотою, не спостерігалося побічних ефектів типу PGE2. Ці дані показують, що 7-{2-(3-гідрокси-4-феніл-бутил)-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанова кислота, селективний PGE2 агоніст ЕР4 рецептора, стимулює остеогенез і відновлення кісток у остеопорозних OVX пацюків. Загальні експериметри Спектри ЯМР були записані на спектрометрі Varian Unity 400 (Varian Co., Palo Alto, California) при майже 23°C при 400МГц на протонових ядрах. Хімічні зрушення виражали в частинах на міліон. Максимальні точки позначили наступним чином: с., синглет; д., дублет, т., триплет; к., квартет; м:, мультиплет; ш.с.=широкий синглет. Масспектр хімічної іонізації при атмосферному тиску (АРСІ) одержали на спектрометрі Fisons Platform II. При описуванні інтенсивності іонів, що містять хлорин або бромін, відслідковували очікуване співвідношення інтенсивності (приблизно 3:1 для іонів, що містять 35СІ/37СІ) та 1:1 для 79Вг/ 81Вг) і надавали дані стосовно інтенсивності лише нижчої маси. Хроматографію середнього тиску проводили з використанням очисної системи Biotage (Biotage, Dyax Corporation, Charlottesville, Virginia) над азотним тиском. Флеш-хроматографію проводили або на сілікагелі Baker (40 m) (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.) або на сілікагелі 60 (EM Sciences, Gibbstown, NJ.) в скляній колонці під низьким азотним тиском. Радіальну хроматографію проводили з використанням хроматотрона (модель 7924Т, Harrison Research). Препаративну хроматографію проводили з використанням сілікагелю GF Anaitech Uniplates (20x20 cm) (Analtecn, Inc. Newark, DE). Диметилформамід (ДМФ), тетрагідрофуран (ТГФ) і дихлорметан (СН2СІ2), що використовувалися як розчинники реакції були безводними, і надавалися компанією Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin). Термін "концентрований" стосується виділення розчинника при тиску для аспірації води на роторному випарнику. Абревіатура "год." означає "години". Термін "ТБАФ" стосується тетрабутиламонієвого фториду. Термін "ДМАП" стосується диметиламінопіридину. Терміни "дихлорметан" і "метиленовий хлорид" є синонімами і використовуються почергово в описі, а також в Прикладах і Приготуваннях. Приклад 1 7-{2S-[4-(3-Хлор-феніл)-ЗR-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанова кислота Стадія А: Етиловий естер 7-{2R-[4-(3-хлор-феніл-3-оксо-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти. До розчину диметилового естеру [3-(3-хлор-феніл)-2-оксо-пропіл]-фосфонової кислоти (2,66г, 9,63ммоль) в ТГФ (35мл) при 0°С додавали порціями NaH (60% ваги в маслі, 426мг, 10,7ммоль). Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 40 хвилин. Суміш охолоджували до 0°С і додавали розчин етилового естеру 7-{2R-форміл-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанової кислоти (з розрахунку 10,6ммоль, одержаного способом, описаним в Приготуванні 7, але з використанням відмінних кількостей реагентів) в ТГФ, і реакцію перемішували протягом 18 год. Додавали АсОН і суміш розбавляли ЕtОАс. Органічний розчин промивали послідовно насиченим розчином NaHCOs (2x), водою (1 х), і соляним розчином (1х). Органічний розчин просушували (MgSO 4), фільтрували і концентрували. Залишок очищали за допомогою хроматографії середнього тиску, використовуючи в якості елюанта 15% ацетон в толуолі для одержання етилового естеру 7{2R-[4-(3-хлор-феніл)-3-оксо-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (2,26г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,27-7,15 (м., ЗН), 7,08 (м., 1Н), 6,66 (дд., 1Н), 6,20 (д., 1Н), 4.17 (м., 1Н), 4,11 (к., 2Н), 3,82 (с., 2Н), 3,55 (м., 1Н), 2,72 (м., 1Н), 2,46-2,23 (м., 5Н), 1,79 (м., 1Н), 1,58 (м., 2Н), 1,47-1,20 (м., 9Н); МС 420,2 (М+1), 418,2 (М-1). Стадія В: Етиловий естер 7-{2R-[4-(3-хлор-феніл)-3S-гідрокси-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептановоЇ кислоти. До розчину етилового естеру 7-{2R-[4-(3-хлор-феніл)-3-оксо-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}гептанової кислоти (2,1г, 5,0ммоль) в безводному СН 2СІ2 (200мл) додавали (R)-2-метил-СВS-оксазаборолідин (1М в толуолі, 5мл, 5ммоль) і розчин охолоджували до -45°С. Реакцію перемішували протягом 20 хвилин і додавали катехолборан (1M в ТГФ, 15мл, 15ммоль). Суміш перемішували протягом 18 год. при -45°С. Додавали водний НСІ (1N, 100мл) і суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 18 год. Кислотний водний шар відокремлювали і органічний розчин промивали льодяним 1 N NaOH (2x), а потім соляним розчином (1х). Органічний розчин просушували (MgSO 4), фільтрували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (1:1 ЕtОАс:гексани до 80% ЕtОАс в гексанах) одержали етиловий естер 7{2RІ-[4-(3-хлор-феніл)-3S-гідрокси-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (800 мг), як суміш у приблизному співвідношенні 6:1 3S:3R спиртових діастереомерів при 1Н-ЯМР. 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,23-7,17 (м., ЗН), 7,06 (м., 1Н), 5,67 (д.д., 1 Н), 5,46 (дд., 1Н), 4,37 (м., 1Н), 4,08 (к., 2Н), 4,00 (м., 1Н), 3,44 (м., 1Н), 2,80 (м., 2Н), 2,67 (м., 1Н), 2,41-2,12 (м., 5Н), 1,70-1,20 (м., 13Н); МС 422,3 (М+1). Стадія С: Етиловий естер 7-{2S-[4-(3-хлор-феніл)-ЗR-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1 іл}-гептанової кислоти. До розчину етилового естеру 7-{2R-[4-(3-хлор-феніл)-3S-гідрокси-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}гептанової кислоти (800мг, 1,90ммоль) в EtOH (50мл) додавали 10% паладію на вуглеці (80мг). Суміш гідрували на шейкері Parr при 45 psi протягом 4,5 год. Каталізатор виділяли шляхом фільтрування через Celite® з додаванням ЕtOН. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (1:1 гексани:ЕtOАс до 4:1 ЕtOАс:гексани) одержали етиловий естер 7-{2S-[4-(3-хлор-феніл)-ЗR-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}гептанової кислоти (625 мг). 1Н-ЯМР (СDСІ3) δ 7,27-7,21 (м., ЗН), 7,09 (м., 1Н), 4,10 (м., 2Н), 3,84 (м., 1Н), 3,61 (м., 2Н), 2,90 (м., 1Н), 2,78 (дд., 1Н). 2,68 (м., 1Н), 2,47-2,25 (м., 4Н), 2,12 (м., 1Н), 1,92-1,22 (м., 17Н); МС 424,3 (М+1). Стадія D: 7-{2S-[4-(3-хлор-феніл)-ЗR-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанова кислота. До розчину етилового естеру 7-{2S-[4-(3-хлор-феніл)-ЗR-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (595мг, 1,40ммоль) в ЕtOН (25мл) додавали 2Ν NaOH (6мл). Суміш перемішували протягом 24 год. при кімнатній температурі і концентрували у вакуумі до приблизно 3/4 вихідного об'єму. Водний 1 N НСІ додавали для одержання рівня рН 2. Водний розчин промивали метиленхлоридом (Зх). Комбіновані органічні шари промивали водою, а потім соляним розчином. Органічний розчин просушували (MgSO4), фільтрували і концентрували для одержання сполуки, зазначеної в заголовку Прикладу 1 (500мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,267,18 (м., ЗН), 7,08 (м., 1Н), 3,84 (м., 1Н), 3,58 (м., 2Н), 2,90 (м., 1Н), 2,77 (дд., 1Н), 2,68 (м., 1Н), 2,43-2,28 (м., 4Н), 2,10 (м., 1Н), 1,78 (м., 1Н), 1,66-1,22 (м., 13Н); МС 396,2 (М+1), 394,2 (М-1). Приклад 2 7-{2S-[ЗR-Гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанова кислота Стадія А: Етиловий естер 7-{2-оксо-5R-[З-оксо-4-(3-трифторметил-феніл)-бут-1-еніл]-піролідин-1-іл}гептанової кислоти. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 1, Стадія А, аніон, одержаний з диметилового естеру [2-оксо-3-(3-трифторметил-феніл)-пропіл]-фосфонової кислоти (4,16г, 13,40ммоль) та NaH (60% в маслі, 590мг, 14,7ммоль) піддавали реакції з етиловим естером 7-{2R-форміл-5-оксо-піролідин-1іл)-гептанової кислоти (з розрахунку 14,74ммоль) протягом 24 год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (градієнт розчинника 20% ЕtOАс в гексанах до ЕtOАс) одержали етиловий естер 7-{2-оксо5R-[3-оксо-4-(3-трифторметил-феніл)-бут-1-еніл]-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (4,29г). 1 Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,52 (д., 1 Η), 7,44 (м., 2Η), 7,37 (д., 1 Η), 6,67 (д.д., 1 Η), 6,22 (д., 1Η}, 4,80 (м., 1Η), 4,08 (к., 2Н), 3,90 (с., 2Η), 3,54 (м., 1 Η), 2,70 (м., 1 Η), 2,37 (м., 2Н), 2,24 (м., ЗН), 1,78 (м., 1Η), 1,56 (м., 2Н), 1,441,20 (м., 9Н); МС 454,2 (М+1), 452,2 (М-1). Стадія В: Етиловий естер 7-{2R-[3S-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}гептанової кислоти. До розчину етилового естеру 7-{2-okco-5R-[3-оксо-4-(3-трифторметил-феніл)-бут-1-еніл]піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (1,5г, 3,31ммоль) та (R)-2-метил-СВS-оксазаборолідину (1M в толуолі, 0,5мл, 0,5ммоль) в СН2СІ2 (100мл) при -45°С додавали краплями катехолборан (1M в ТГФ, 9,9мл, 9,9ммоль).Розчин перемішували протягом 24 год. при -45°С і додавали 1 N НСІ. Суміш перемішували протягом 1 год. при кімнатній температурі і відділяли шари. Водний розчин промивали СН 2СІ2 (2х) і комбіновані органічні шари промивали послідовно льодяним 0,5Ν NaOH та соляним розчином (двічі). Органічний розчин просушували (MgSC4), фільтрували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (50% ЕtOАс в гексанах до 60% ЕtOАс в гексанах до 80% ЕtOАс в гексанах до ЕtOАс до 5% МеОН в СН2СІ2) одержали етиловий естер 7-{2R-[3S-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бут1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (1,23г) як суміш у приблизному співвідношенні 5,5:1 3S:3R спиртових діастереомерів при аналізі HPLC. 1Н-ЯМР (GDCI3) δ 7,51-7,35 (м., 4Н), 5,72 (д.д., 1 Η), 5,50 (д.д., 1 Η), 4,44 (м., 1Н), 4,09 (к., 2Н), 4,01 (м., 1Н), 3,44 (м., 1Н), 2,90 (д., 2Н), 2,71 (м., 1Н), 2,37-2,12 (м., 5Н), 1,70-1,21 (м., 13Н); МС 456,3 (М+1), 454,3 (М-1). Стадія С: Етиловий естер 7-{2S-[3R-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}гептанової кислоти. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 1, Стадія С, розчин етилового естеру 7{2R-[3S-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (1,18г, 2,59ммоль) в ЕtOН (50мл) гідрували в присутності 10% паладію на вуглеці (120мг) при 40-45 psi на шейкері Parr протягом 24 год. В результаті очищення хроматографії середнього тиску (50% ЕtOАс в гексанах до ЕtOАс до 1%, МеОН в СН2СІ2 до 3% МеОН в СН2СІ2 до 5% МеОН в СН2СІ2 до 10% МеОН в СН2СІ2) одержали етиловий естер 7-{2S-[3R-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (1,08г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,51-7,39 (м., 4Н), 4,09 (к., 2Н), 3,86 (м., 1Н), 3,60 (м., 2Н), 2,89 (м., 2Н), 2,76 (м., 1Н), 2,33 (м., 4Н), 2,11 (м., 1Н), 1,80 (м., 1Н), 1,68-1,21 (м., 16Н). Стадія D: Етиловий естер 7-{2S-[3R-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}гептанової кислоти. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 1, Стадія D, етиловий естер 7-{2S-[3Rгідрокси-4-(3-триФторметил-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (1,93г, 4,22ммоль) гідролізували 6Ν NaOH (26 мл) в EtOH (52 мл) протягом 24 год. В результаті хроматографії середнього тиску (ЕtOАс до 1% МеОН в СН2СІ2 до 3% МеОН в СН2СІ2 до 5% МеОН в СН2СІ2 до 10% МеОН в СН2СІ2) одержали 7-{2S-[3R-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанову кислоту (1,66 г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,51-7,39 (м., 4Н), 3,88 (м., 1Н), 3,58 (м., 2Н), 2,84 (м., ЗН), 2,34 (м., 4Н), 2,10 (м., 1Н), 1,80 (м., 1Н), 1,67-1,26 (м., 13Н); МС 430,4 (М+1). Стадія Е: Натрієва сіль 7-{2S-[3R-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}гептанової кислоти. До розчину 7-{2S-[3R-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}гептанової кислоти (1,66г, 3,87ммоль) в ЕtOН (16мл) додавали NaНСОз (325мг, 3,87ммоль) у воді ( мл). Суміш перемішували протягом 5 год. і концентрували у вакуумі. Залишок азеотропували СН 2СІ2 (Зх) для одержання натрієвої солі сполуки, зазначеної у заголовку Прикладу 2 (1,698г.). 1Н-ЯМР (CDCl3) δ 7,48 (м., 4Н), 3,80 (м., 1Н), 3,69 (м., 1Н), 3,52 (м., 1Н), 2,94 (м., 1Н), 2,81 (м., 2Н), 2,32 (м., 2Н), 2,13 (м., ЗН), 1,81 (м., 1Н), 1,69-1,26 (м., 13Н); МС 430,3 (M-Na+1), 428,2 (M-Na-1). Приклад З 5S-[4-(3-Хлор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он Стадія А: 7-{2R-[4-(3-Хлор-феніл)-3-оксо-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітріл. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 2, Стадія А, аніон, одержаний з диметилового естеру [3-(3-хлор-феніл)-2-оксопропіл]-фосфонової кислоти (3,35г, 12,12ммоль) та NaH,(60% в маслі, 533мг, 13,3ммоль) піддавали реакції з 7{2R-форміл-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептаннітрілом (з розрахунку 13,3ммоль) протягом 18год. В результаті хроматографії середнього тиску (20% EtOAc в гексанах до 80% EtOAc в гексанах) одержали 7-{2R-[4-(3-хлорфеніл)-3-оксо-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітріл (1,52г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,24 (м., 2Н), 7,17 (с., 1Н), 7,06 (м., 1Н), 6,64 (д.д., 1Н), 6,20 (д., 1 Η), 4,15 (м., 1Н), 3,80 (с., 2Н), 3,50 (м., 1Н), 2,72 (м., 1Н), 2,46-2,20 (м., 5Н), 1,78 (м., 1Н), 1,59 (м., 2Н), 1,40 (м., 4Н), 1,24(м.,2Н). Стадія В: 7-{2S-[4-(3-[хлор-феніл)-3-оксо-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл} гептаннітріл. Дотримуючись процедури Прикладу 1, Стадія С, 7-{2В-[4-(3-хлор-феніл)-3-оксо-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітріл (860мг, 2,31ммоль) в МеОН (40мл) гідрогенували в присутності 10% паладію на вуглеці (86мг) протягом 1 год. В результаті очищення радіальною хроматографією (гексани до 20% EtOAc в гексанах до 70% EtOAc в гексанах) одержали 7-{2S-[4-(3-хлор-феніл)-3-оксо-бутил]-5-оксо-піролідин-1 -іл}-гептаннітріл (730мг). Стадія С: 7-{2S-[4-(3-Хлор-феніл)-3-гідрокси-бутил}-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептаннітріл. До розчину 7-{2S[4-(3-хлор-феніл)-3-оксо-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітрілу (730мг, 1,87ммоль) в МеОН (ЗОмл) при 0°С додавали NaBH4 (35мг, 0,921ммоль). Суміш перемішували при 0°С протягом 45 хвилин і додавали воду. Леткі компоненти виділили у вакуумі і водний розчин, що залишився, розбавляли метиленхлоридом. Органічний розчин промивали водою, а потім соляним розчином, просушували (MgSO4), фільтрували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (1:1 гексани: EtOAc до EtOAc до 3% МеОН в СН 2СІг) одержали 7-{2S-[4-(3-хлор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітріл (730мг). 1 Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,22 (м., ЗН), 7,07 (д., 1Н), 3,80 (м., 1Н), 3,57 (м., 2Н), 2,88 (м., 1Н), 2,78 (м., 1 Н), 2,64 (м., 1 Н), 2,31 (м., 4Н), 2,10 (м., 1 Н), 1,65-1,22 (м., 14Н); MS 377,3 (М+1). Стадія D: 5S-[4-(3-Хлор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он. Розчин 7{2S-[4-(3-хлор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітрілу (730мг,1,94ммоль), триметилсілілазиду (0,63мл, 0,475ммоль) і оксид дибутилтину (96мг, 3,87ммоль) в толуолі (ЗОмл) нагрівали із зворотнім холодильником протягом 18 год. Леткі компоненти виділяли у вакуумі і залишок розводили СН 2СІ2. Органічний розчин промивали 1 N НСІ, а потім соляним розчином. Органічний розчин просушували (MgSO 4), фільтрували і концентрували. Залишок очищали хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта EtOAc до 2% МеОН в СН2СІ 2 до 7% МеОН в СН2СІ2 для одержання комплексу ТМС. Залишок розбавляли МеОН і додавали 2N НСІ, розчин перемішували протягом 40 хвилин. Розчин розбавляли СН 2СІ2 і органічний шар промивали водою, а потім соляним розчином. Органічний розчин просушували (MgSO 4), фільтрували і концентрували. Залишок очищали хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта EtOAc до 7% МеОН в СН2СІ2 для одержання 5S-[4-(3-хлор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-1-[6-(2Нтетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он (521мг). 1Н-ЯМР (СDСІз) δ 7,23 (м., ЗН), 7,09 (д., 1Н), 3,85 (м., 1Н), 3,66 (м., 1Н), 3,53 (м., 1Н), 2,96 (м., ЗН), 2,81 (м., 1Н), 2,70 (м., 1Н), 2,44 (м., 2Н), 2,18 (м., 1Н), 1,88-1,27 (м., 14Н); МС 420,2 (М+1), 418,3 (М-1). Приклад 4 5S-[ЗR-Гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он Стадія А: 7-{2-Оксо-5R-[З-оксо-4-(3-трифторметил-феніл)-бут-1-еніл]-піролідин-1-іл}-гептаннітрил. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 1, Стадія А, аніон, одержаний з диметилового естеру [2-оксо-3(3-трифторметил-феніл)-пропіл]-фосфонової кислоти (2,68г, 8,64ммоль) та NaH (60% в маслі, 400мг, 10ммоль) піддавали реакції з 7-{2R-форміп-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептаннітрилом (з розрахунку 10ммоль) протягом 18 год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (30% EtOAc в гексанах до 80% EtOAc в гексанах) одержали 7-{2-оксо-5R-[3-оксо-4-(3-трифторметил-феніл)-бут-1-еніл]-піролідин-1-іл}-гептаннітріл (1,2г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,52 (м., 1Η), 7,45 (м., 2Н), 7,37 (м., 1Н), 6,67 (д.д., 1Н), 6,23 (д., 1Н), 4,18 (м., 1Н), 3,90 (с., 2Н), 3,53 (м., 1Н), 2,73 (м., 1Н), 2,45-2,23 (м., 5Н), 1,79 (м., 1Н), 1,60 (м., 2Н), 1,41 (м., 4Н), 1,24 (м., 2Н); MS 407,2 (М+1), 405,3 (М-1). Стадія В: 7-{2R-[3S-Гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітрил. До розчину 7-{2-оксо-5R-[3-оксо-4-(3-трифторметил-феніл)-бут-1-еніл]-піролідин-1-іл}-гептаннітрилу (1,14г, 2,81ммоль) та (R)-2-метил-СВS-оксазаборолідину (1M в толуолі, 0,42 мл, 0,42 ммоль) в СН2СІ2 (112 мл) при 45°С краплями додавали катехолборан (1M в ТГФ, 8,4мл, 8,4ммоль). Суміш перемішували при -45°С протягом 18год. і додавали 1N НСІ. Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 40 хвилин і відокремлювали шари. Органічний розчин промивали холодним 1 N NaOH (тричі). Органічний розчин промивали послідовно 1 N НСІ, водою і соляним розчином. Органічний розчин просушували (MgSO 4), фільтрували і концентрували. В результаті хроматографії середнього тиску (1:1 гексани: EtOAc до 80% EtOAc в гексанах) одержали 7-{2R-[3S-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бут-1-еніл]5-оксо-піролідин-1 -іл}-гептаннітріл (820 мг) як приблизне співвідношення 2,5:1 3S:3R спиртових діастереомерів при 1Н-ЯМР, 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,51:7,38 (м., 4Н), 5,72 (д.д., 1Н), 5,49 (Д.Д., 1Н), 4,45 (м., 1Н), 4,02 (м., 1Н), 3,47 (м., 1Н), 2,90 (м., 2Н), 2,71 (м., 1Н), 2,34 (м., 4Н), 2,18 (м., 1Н), 1,66 (м., 4Н), 1,44 (м., 4Н), 1,27 (м.,2Н); MS 409,2 (М+1). Стадія С: 7-{2R-[ЗS-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітрил. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 1, Стадія С, 7-{2R-[3S-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бут1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітрил (810мг) в МеОН (40мл) гідрували в присутності 10% паладію на вуглеці (100мг) при 50 psi протягом 18 год. на шейкері Parr. В результаті очищеня хроматографією середнього тиску (1:1 гексани:EtOAc до EtOAc до 3% МеОН в СН 2СІ2) одержали 7-{2S-[3R-гідрокси-4-(3-трифторметилфеніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітріл (720 мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,44 (м., 4Η), 3,84 (м., 1Η), 3,58 (м., 2Н), 2,88 (м., 2Н), 2,73 (м., 1Н), 2,32 (м., 4Н), 2,11 (м.,1Н), 1,78 (м., 1 Н), 1,65-1,37 (м., 11 Н), 1,30 (м., 2Н); МС 411,2 (М+1). Стадія D: 5S-[3R-Гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 3, Стадія D, 7-{2S-[3R-гідрокси-4-(З-трифторметил-феніл)бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітріл (710мг, 1,73ммоль) піддавали реакції з азидотриметилсиланом (399мг, 3,46ммоль) та дибутилтиновим оксидом (43мг, 1,7ммоль) в толуолі (25мл), нагрівали із зворотнім холодильником протягом 18 год. Леткі компоненти вилучали у вакуумі і залишок розводили СН 2СІ2. Органічний розчин промивали послідовно 1 N НСІ (двічі), водою (1 раз) і соляним розчином (1 раз). Органічний розчин просушували (MgS04), фільтрували і концентрували. В результаті очищення залишку хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта EtOAc до2% МеОН в СН2СІ2 до 8% МеОН в СН2СІ2, одержали 5S-[3R-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл}-гексил]-піролідин-2-он (450мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,44 (м., 4Н), 3,87 (м., 1 Н), 3,65 (м., 1 Н), 3.50 (м., 1Н), 3,01-2,73 (м., 5Н),2,42 (м., 2Н), 2,16 (м., 1Н), 1,86-1,23 (м., 14Н); МС 454,4 (М+1), 452,4 (М-1). Стадія Е: Натрієва сіль 5S-[3R-гідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл]-гексил]піролідин-2-он. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 2, Стадія Е, в результаті обробки 5S-[3Rгідрокси-4-(3-трифторметил-феніл)-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл]-гексил]-піролідин-2-он (428мг, 0,944ммоль) NaHCO3 (79мг, 0,94ммоль) одержали натрієву сіль (430мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,48 (м., 4Н), 3,79 (м., 1Н), 3,67 (м., 1Н), 3.51 (м., 1Н), 2,86 (м., 5Н), 2,30 (м., 2Н), 2,12 (м., 1Н), 1,84-1,27 (м., 14Н); МС 454,4 (М-Na+1), 452,4 (MNa-1). Приклад 5 5-[4-(4-Фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он "\ і Стадія А: 7-{2-[З-(трет-Бутил-диметил-сіланилокси)-4-(4-фтор-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідинін-1-іл}гептаннітріл. Розчин 5-[3-(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-4-(4-фтор-феніл)-бутил]-піролідин-2-ону (150мг, 0,41ммоль) в ДМФ (5мл) додавали до NaH (60% ваги в маслі, 16мг, 0,41ммоль) в ДМФ (10мл). Через 1,5 год. додавали 7-бромгептаннітріл (78мг, 0,41ммоль) в ДМФ (5мл) і суміш перемішували протягом 2,5 год. при 90°С. Додавали воду (20 мл) і водний розчин промивали EtOAc (4 x15мл). Комбіновані органічні розчини промивали водою (2x15мл), просушували (MgSO 4), фільтрували і концентрували. В результаті очищення залишку хроматографією середнього тиску (1:1 гексани:EtOAc) одержали 7-{2-[3-(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-4(4-фтор-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іп}-гептаннітріл (161мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,09 (м., 2Н), 6,95 (м., 2Н), 3,81 (Μ., 1Н), 3,54 (м., 2Н), 2,86 (м., 1Н), 2,68 (м., 2Н), 2,29 (м., 4Н), 2,06 (м., 1Н), 1,74-1,23 (м., 13Н), 0,85 (а, 9Н), 0,04 (м., 3R), 0,19 (м., 3R); Μ 475,1 (М+1). Стадія В: 7-{2-[4-(4-Фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептаннітріл. До розчину 7-{2-[3(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-4-(4-фтор-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітрілу (158мг, 0,333ммоль) в ТГФ (20мл) при 0°С додавали TBAF (1 M в ТГФ, 0,50мл, 0,50ммоль). Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 3 год. і додавали насичений водний NaНСОз. Леткі компоненти виділяли у вакуумі. Водний розчин, що залишився, промивали СНСІз (4x5мл) і комбіновані органічні розчини просушували (MgS04), фільтрували і концентрували. В результаті очищення залишка хроматографією середнього тиску (1:1 гексани: EtOAc до EtOAc) одержали 7-{2-[4-(4-фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-5-оксопіролідин-1-іл}-гептаннітріл (82мг). 'Н-ЯМР (СОСІз) δ 7,15 (м., 2Н), 7,00 (м., 2Н), 3,77 (м., .1Н), 3,58 (м., 2Н), 2,89 (м., 1Н), 2,79 (м., 1Н), 2,64 (м., 1Н), 2,34 (м., 4Н), 2,12 (м., 1Н), 1,68-1,24 (м., 14Н); МС 361,2 (М+1). Стадія С: 5-[4-(4-Фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 3, Стадія D, 7-{2-[4-(4-фторо-феніл)-3-гідрокси-бутил]-5-оксопіролідин-1-іл}-гептаннітріл (71мг, 0,197ммоль) піддавали реакції з азидотриметилсіланом (45мг, 0,394ммоль) та дибутилтиновим оксидом (5мг, 0,02ммоль) в толуолі (10мл), нагрівали із зворотнім холодильником протягом 16 год. Додавали азидотриметилсілан (200мг) та дибутилтиновий оксид (50мг) і суміш нагрівали із зворотнім холодильником протягом 5 год. Суміш підкислювали 1Ν НСІ до рН=2 (5мл) і водний розчин промивали EtOAc (4x10мл). Комбіновані органічні розчини просушували (MgS04), фільтр ували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (EtOAc до 39:1 EtOAc:MeOH до 19:1 EtOAc:МеОН) одержали сполуку, зазначену у заголовку Прикладу 5А (39мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,16 (м., 2Н), 7,00 (м., 2Н), 3,81 (м., 1Н), 3,68 (м., 1Н), 3,53 (м., 1Н), 2,99 (м., 3R), 2,80 (м., 1Н), 2,68 (м., 1Н), 2,47 (м., 2Н), 2,20 (м., 1Н), 1,88-1,22 (м., 14Н); МС 404,3 (М+1); 402,3 (М-1). Приклад 6 5-(4-Біфеніл-3-іл-3-гідрокси-бутил)-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он Стадія А: 7{2-[4-Біфеніл-3-іл-3-(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}гептаннітріл. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 5, Стадія А, аніон, одержаний з 5-[4-біфеніл-3-іл3-(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-бутил]-піролідин-2-он (239,1мг, 0,564ммоль) та NaHMDS (1M в ТГФ, 0,67мл, 0,67ммоль) алкіпували 7-бромгептаннітрілом (118 мг, 0,620 ммоль) при 70°С протягом 24 год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (СН2СІ2 до 1 % МеОН в СН2СІ2 до 2% МеОН в СН2СІ2 до 4% МеОН в СН2Сl2) одержали 7-{2-[4-біфеніл-3-іл-3-(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-бутил]-5-оксопіролідин-1-іл}-гептаннітріл (187мг). МС 533,3 (М+1). Стадія В: 7-[2-(4-Біфеніл-3-іл-3-гідрокси-бутил)-5-оксо-піролідин-1-іл]-гептаннітріл. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 5, Стадія В, 7-{2-[4-біфеніл-3-іл-3-(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-бутил]-5оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітріл (187мг, 0,351ммоль) депротектували TBAF (1M в ТГФ, 0,53мл, 0,53ммоль). Додавали при 0°С і суміш перемішували при кімнатний температурі протягом 24 год. В результаті очи щення хроматографією середнього тиску (СН2СІ2 до 1 % МеОН в СН 2СІ2 до 2% МеОН в СН 2СІ2 до 6% МеОН в СН 2СІ2 до 10% МеОН в СН2СІ2) одержали 7-[2-(4-біфеніл-3-іл-3-гідрокси-бутил)-5-оксо-піролідин-1-іл]-гептаннітріл (85мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,58 (м., 1Н), 7,51-7,33 (м., 4Н), 7,21-7,12 (м., 4Н), 3,85 (м., 1Н), 3,60 (м., 2Н), 2,90 (м., 1Н), 2,83-2,60 (м., 2Н), 2,45-2,30 (м., 4Н), 2,14 (м., 1Н), 1,73-1,25 (м., 14Н). Стадія С: 5-(4-Біфеніл-З-іл-3-гідрокси-бутил)-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 3, Стадія D, 7-[2-(4-біфеніл-3-іл-3-гідрокси-бутил)-5-оксо-піролідин-1-іл]гептаннітріл (109мг, 0,260ммоль) піддавали реакції з азидотриметилсіланом (0,69мл, 0,52ммоль) та дибутилтиновим оксидом (11мг, 0,044ммоль) в толуолі (5,3мл) і нагрівали із зворотнім холодильником протягом 72 год. Суміш охолоджували і додавали воду. Суміш підкислювали 1 N НСІ до рН=2 і водний розчин промивали 5% МеОН в СН2СІ2 (тричі). Комбіновані органічні розчини просушували (MgS04), фільтрували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (1:1 гексани:EtOAc до EtOAc до 2% МеОН в СН 2СІ2 to 4% МеОН in CH2CI2 to 8% МеОН in CH2CI2) одержали сполуку, зазначену у заголовку Прикладу 6 (107мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,57 (м., 1 Η), 7,51-7,32 (м., 4Н), 7,25-7,13 (м., 4Н), 3,91 (м., 1Н), 3,743,50 (м., 2Н), 2,96 (м., 3R), 2,77 (м., 1Н), 2,50 (м., 2Н), 2,22 (м., 1Н), 2,07 (м., 1Н), 1,90-1,22 (м., 14Н); МС 462,2 (М+1), 460,1 (М-1). Приклад 7 5-[4-(3-Фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он Стадія А: 7-{2-[3-(трет-Бутил-диметил-сіланилокси)-4-(3-Фтор-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1 -іл)гептаннітріл. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 5, Стадія А, аніон, одержаний з 5-[3-(трет-бутилдиметил-сіланилокси)-4-(3-фтор-феніл)-бутил]-піролідин-2-ону (250мг, 0,684ммоль) та NaHMDS (1M в ТГФ, 0,80мл, 0,80ммоль) алкілували 7-бромгептаннітрілом (142мг, 0,748ммоль) при 70°С протягом 72 год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (1:1 гексани:EtOAc до EtOAc до 5% МеОН в СН2СІ2) одержали 7-{2-[3-(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-4-(3-фтор-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннпріл (261,7мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,26 (м., 1Н), 6,92 (м., 3R), 3,89 (м., 1Н), 3,59 (м., 2Н), 2,89 (м., 1Н), 2,75 (м., 2Н), 2,36 (м., 4Н), 2,11 (м., 1Н), 1,72-1,26 (м., 13Н), 0,89 (с., 9Η), 0,09 (s, 6H); МС 475,3 (М+1). Стадія В: 7-{2-[4-(З-Фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітріл. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 5, Стадія В, 7-{2-[3-(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-4-(3-фтор-феніл)бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітріл (261,7мг, 0,551ммоль) депротектували TBAF (1 M в тетрагідрофурани, 0,83мл, 0,83ммоль). Додавали при 0°С і суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 24 год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (СН2СІ2 до 1 % МеОН в СН2СІ2 до 2% МеОН в СН 2СІ2 до 4% МеОН в СН 2СІ2) одержали 7-{2-[4-(3-фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин1-іл}-гептаннпріл (141мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,32 (м., 1Н), 6,98 (м., 3R), 3,86 (м., 1Н), 3,64 (м., 2Н), 2,99-2,80 (м., 2Н), 2,71 (м., 1Н), 2,38 (м., 4Н), 2,16(м., 1Н), 1,74-1,29 (м., 14Н); МС 361,3 (М+1). Стадія С: 5-[4-(3-Фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-1л)-гексил] піролідин-2-он. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 6, Стадія С, 7-{2-[4-(3-фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-5-оксопіролідин-1-іл}-гептаннітріл (141,3мг, 0,392ммоль) піддавали реакції з азидотриметилсіланом (0,210мл, 1,57ммоль) та дибутилтиновим оксидом (29мг, 0,116ммоль) в толуолі (8мл) і нагрівали із зворотнім холодильником протягом 72 год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (СН2СІ2 до 2% МеОН в СН 2СІ2 до 4% МеОН в СН2С12 до 6% МеОН в СН2Сl2) одержали сполуку, зазначену у заголовку Прикладу 5С (101,5мг). 1Н-ЯМР (CDCi3) δ 7,26 (м., 1 Η), 6,94 (м,, 3R), 3,87 (м., 1Н), 3,70 (м., 1Н), 3,52 (м., 1Н), 2,98 (м., 3R), 2,78 (м., 2Н), 2,48 (м., 2Н), 2,20 (м., 1Н), 1,89-1,24 (м., 14Н); МС 404,2 (М+1), 401,9 (М-1). Приклад 8 5S-[4-(3-Хпор-феніл)-ЗR-гідрокси-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он Стадія А: 7-{2R-[ЗS-гідрокси-4-(3-хлор-феніл-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітрілу. До розчину 7{2-оксо-5R-[3-оксо-4-(3-хлор-феніл)-бут-1-еніл]-піролідин-1-іл}-гептаннітріл (1,62г, 4,34ммоль) в СН2СІ2 (200мл) при -45°С додавали (R)-2-метил-СВS-оксазаборолідин (1M в толуолі, 1,3мл, 1,3ммоль). Після перемішування протягом 20 хвилин краплями додавали катехолборан (1М в ТГФ, 13мл, 13ммоль). Реакцію перемішували при -45°С протягом 16 год. і додавали 1 N НСІ. Суміш нагрівали до кімнатної температури і відділяли шари. Органічний розчин промивали охолодженим 1 N NaOH (тричі). Органічний розчин промивали послідовно 1 N НСІ, водою і соляним розчином. Органічний розчин просушували (МgSO4), фільтрували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (1:1 гексани:EtOAc до 20% МеОН в СН2СІ2) одержали 7-{2R-[3S-гідрокси-4-(3-хлор-феніл)-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітріл (536мг) як суміш 8,2:1 3S:2R спирту при HPLC. 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,24-7,17 (м., 3R), 7,07 (м., 1Н), 5,69 (д.д., 1Н), 5,46 (д.д., 1Н), 4,40 (м., 1Н), 4,01 (м., 1Н), 3,46 (м., 1Н), 2,81 (м., 2Н), 2,68 (м., 1Н), 2,42-2,28 (м., 4Н), 2,20 (м., 1Н), 1,73-1,59 (м., 4Н). 1,42 (м., 4Н), 1,25 (м., 2Н); МС 375 (М+1). Стадія В: 7-{2S-[4-(3-хлор-феніл)-3R-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептаннітріл. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 4, Стадія С, 7-{2R-[3S-гідрокси-4-(3-хлор-феніл)-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1іл}-гептаннітріл (536мг) в ЕtOН (ЗОмл) гідрували в присутності 10% паладію на вуглеці (60мг) протягом 3,5год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (1:1 гексани:EtOAc до 20% МеОН в СН 2СІ2 ) одержали 7-{2S-[4-(3-хлор-феніл)-3R-гідрокси-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітріл (440мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,22 (м., 3R), 7,08 (м., 1Н), 3,83 (м., 1Н), 3,59 (м., 2Н), 2,90 (м., 1Н), 2,77 (д.д., 1Н), 2,66 (д.д., 1Н), 2,39-2,29 (м., 4Н), 2,11 (м., 1Н), 1,78 (м., 1Н), 1,68-1,39 (м., 11Н), 1,29 (м., 2Н); МС 377,2 (М+1). Стадія С: S-[4-(3-Хлор-феніл-3R-гідрокси-бутилі-1]-6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 3, Стадія D, суміш 7-{2S-[4-(3-хлор-феніл)-3R-гідрокси-бутил]5-оксо-піролідин-1-іл}-гептаннітрілу (420мг, 1,114ммоль), триметилсилілазиду (257мг, 2,23ммоль) і дибутилтинового оксиду (56мг) в толуолі (ЗОмл) нагрівали із зворотнім холодильником протягом 16год. Леткі речовини виділяли у вакуумі і залишок розчиняли в МеОН і перемішували з 3N НСІ протягом 3год. Реакцію розбавляли водою та СН 2СІ2 і вщділяли шари. Органічні шари промивали водою, а потім соляним розчином. Органічний розчин просушували (MgSO 4), фільтрували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (EtOAc до 2% МеОН в СН 2СІ2 до 7% МеОН в СН2СІ2) одержали 5S-[4-(3хлор-феніл)-3R-гідрокси-бутил]-1-[6-(2Н-тетразол-5-іл)-гексил]-піролідин-2-он (311мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,22 (м., 3R), 7,08 (м., 1Н), 3,86 (м., 1Н), 3,66 (м., 1Н), 3,52 (м., 1Н), 2,96 (м., 3R), 2,82-2,68 (м., 2Н), 2,45 (м., 2Н), 2,17(м., 1Н), 1,88-1,22 (м., 14Н); МС 420,2 (М+1), 418,3 (М-1). Приклад 9 7-{2R-[3-Гідрокси-4-(3-фенокси-феніл)-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанова кислота Стадія А: Етиловий естер 7-{2-оксо-5R-(3-оксо-4-(3-фенокси-феніл)-бут-1-еніл]-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 1, Стадія А, аніон, одержаний з диметилового естеру [2-оксо-3-(3-фенокси-феніл)-пропіл]-фосфонової кислоти (633мг, 1,98ммоль) та NaH (60% в маслі, 70мг, 1,74ммоль) піддавали реакції з етиловим естером 7-{2R-форміл-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанової кислоти (з розрахунку 1,58ммоль) більше 24 год. В результаті хроматографії середнього тиску (EtOAc) одержали етиловий естер 7-{2-оксо-5R-(3-оксо-4-(3-фенокси-феніл)-бут-1-еніл]-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (215мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,28 (м., 3R), 7,08 (м., 1Н), 6,97 (м., 2Н), 6,89 (м., 2Н), 6,83 (м., 1Н), 6,62 (д.д., 1Н), 6,19 (д., 1Н), 4,13 (м., 1Н), 4,08 (к., 2Н), 3,79 (с., 2Н), 3,51 (м., 1Н), 2,68 (м., 1Н), 2,35 (м., 2Н), 2,24 (м., 3R), 2,24 (м., 3R), 1,75 (м., 1Н), 1,54 (м., 2Н), 1,43-1,20 (м.,9Н). Стадія В: Етиловий естер 7-{2R-[З-гідрокси-4-(3-фенокси-феніп)-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл)гептанової кислоти. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі З, Стадія С, етиловий естер 7-{2-оксо-5R[3-оксо-4-(3-фенокси-феніл)-бут-1-еніл]-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (215мг, 0,451ммоль) піддавали реакції з NaBH4 (17мг, 0,45ммоль) в EtOH (3мл) при 0°С більше 4 год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (EtOAc) одержали етиловий естер 7-{2R-[3-гідрокси-4-(3-фенокси-феніл)-бут-1-еніл]-5-оксо піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (167мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,33 (м., 2Н), 7,25 (м., 1Н), 7,10 (м., 1Н), 6,99 (м., 2Н), 6,93 (м., 1Н), 6,86 (м., 2Н), 5,72 (м., 1Н), 5,45 (м., 1Н>, 4,37 (м., 1Н), 4,10 (q, 2Н), 3,47 (м., 1Н), 2,82 (м., 3R), 2,35 (м., 2Н), 2,26 (t, 2Н), 2,15(м.,1Н), 1,70-1,21 (м., 13Н). Стадія С: 7-{2R-[3-гідрокси-4-(3-фенокси-феніл)-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанова кислота. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 1, Стадія D, етиловий естер 7-{2R-[3-гідрокси-4-(3-феноксифеніл)-5ут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гєптанової кислоти (29мг, 0,060ммоль) гідролізували 2М NaOH в EtOH (4,0мл) при кімнатній температурі більше 24 год. з метою одержання сполуки, зазначеної у заголовку (20мг). 1 Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,33-7,21 (м., 3R), 7,08 (м., 1Н), 6,98-6,84 (м., 5Н), 5,70 (м., 1Н), 5,44 (м., 1Н), 4,36 (м., 1Н), 4,00 (м., 1Н), 3,44 (м.,*1Н), 2,85-2,51 (м., 3R), 2,32 (м., 4Н), 2,14 (м., 1Н), 1,68-1,18 (м., 10Н). Приклад 10 7-{2S-[3-Гідрокси-4-(3-фенокси-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанова кислота Стадія А: Етиловий естер 7-{2S-[3-гідрокси-4-(3-Фенокси-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанової кислоти. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 1. Стадія С, суміш етилового естеру 7-{2R-[3-гідрокси4-(3-фенокси-феніл)-бут-1-еніл]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (139мг, 0,290ммоль), МеОН (30мл) та 10% паладію на вуглеці (14мг) гідрували на шейкері Рагг при 50 psi протягом 18 год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (1:1 гексани:EtOAc) одержали етиловий естер 7-{2S-[3-гідрокси-4-(3фенокси-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (86мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,35-7,24 (м., 3R), 7,10 (м., 1Н), 6,99 (м., 2Н), 6,93 (м., 1Н), 6,87 (м., 2Н), 4,09 (q, 2Н), 3,80 (м., 1Н), 3,58 (м., 2Н), 2,82 (м., 2Н), 2,64 (м., 1Н), 2,42-2,24 (м., 4Н), 2,10 (м., 1Н), 1,77 (м., 1Н), 1,66-1,21 (м., 16Н). Стадія В: 7-{2S-[З-Гідрокси-4-(3-Фенокси-феніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанова кислота. Дотримуючись процедури, описаної в Прикладі 1, Стадія D, етиловий естер 7-{2S-[3-гідрокси-4-(3-феноксифеніл)-бутил]-5-оксо-піролідин-1-іл}-гептанової кислоти (86мг, 1,79ммоль) гідролізували 2N NaOH в МеОН (4мл) більше 18 год, з метою одержання сполуки, зазначеної у заголовку (62мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,33-7,23 (м., 3R), 7,09 (м., 1Н), 6,98 (м., 2Н), 6,91 (м., 1Н), 6,86 (м., 2Н), 3,80 (м., 1Н), 3,56 (м., 2Н), 2,88 (м., 1Н), 2,77 (м., 1Н), 2,64 (м., 1Н), 2,38-2,28 (м., 4Н), 2,09 (м., 1Н), 1,77 (м., 1Н), 1,64-1,21 (м., 13Н). Приготування 1 7-{2R-Гідроксиметил-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептаннітріл Стадія А: 7-[2R-(трет-Бутил-диметил-сіланилоксиметил)-5-оксо-піролідин-1-іл]-гептаннітріл. До суміші NaH (60% в маслі, 3,836г, 0,0959ммоль, промитого 25мл ДМФ) в ДМФ (250мл) додавали розчин 5R-(трет-бутилдиметил-сіланилоксиметил)-піролідин-2-ону (Tetrahdedron: Asymmetry, 1996, 7, 2113) (20,00г, 87,19ммоль) в ДМФ (50мл). Реакцію перемішували при кімнатній температурі протягом 1,5 год. і додавали розчин 7бромгептаннітрілу (16,574г, 87,19ммоль) в ДМФ (50мл). Реакцію перемішували при 90°С протягом 3 год. Реакцію охолоджували до кімнатної температури і додавали воду (750мл). Водний розчин промивали EtOAc (4x250мл). Комбіновані органічні розчини промивали водою (2x250мл), просушували (MgSО 4), фільтрували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта розчинний градієнт. (9:1 гексани:EtOAc до 7:3 гексани:EtOAc до 1:1 гексани:EtOAc) одержали 7-[2R-(третбутил-диметил-сіланилоксиметил)-5-оксо-піролідин-1-іл]-гептаннітріл (22,46 г). 1Н-ЯМР (CDCI3) 5 3,69-3,55 (м., 4Н), 2,99 (м., 1Н), 2,42 (м., 1Н), 2,34-2,24 (м., 3R), 2,05 (м., 1Н), 1,81 (м., 1Н), 1,67-1,42 (м., 6Н), 1,31 (м., 2Н), 0,86 (s, 9H), 0,03 (s, 6H); MC 339,3 (М+1). Стадія В: 7-{2R-Гідроксимєтил-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептаннітріл. Розчин фториду тетрабутиламонію (1М в ТГФ, 100,0мл, 100,0ммоль) обережно додавали до розчину 7-[2R-(трет-бутил-диметил-сіланилоксиметил)-5оксо-піролідин-1-іл]-гептаннітрілу (22,39г, 66,13ммоль) в ТГФ (400мл) при 0°С. Реакцію нагрівали до кімнатної температури і перемішували протягом 4 год. Додавали насичений водний NaHCCb (250мл) і у вакуумі виділяли леткі речовини. Водний розчин, що залишився, промивали СНСІ3 (4x200мл). Комбіновані органічні розчини просушувапи (MgSO4), фільтрували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта розчинний градієнт (9:1 гексани:EtOAc до 4:1 гексани:EtOAc до 7:3 гексани:EtOAc до 6:4 гексани:EtOAc до 1:1 гексани:EtOAc до EtOAc до 9:1 EtOAc:Ме ОН) одержали 7-{2R-гідроксиметил-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептаннітріл (14,922г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 3,78 (д.д., 1Н), 3,71-3,58 (м., 3R), 3,00 (м., 1Н), 2,46 (м., 1Н), 2,36-2,27 (м., 3R), 2,08 (м., 1Н), 1,93 (м., 1 Н), 1,77 (м., 1 Н), 1,681,43 (м., 6Н), 1,32 (м., 2Н); МС 225,1 (М+1). Приготування 2 Етиловий естер 7-(2R-гідроксиметил-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанової кислоти Стадія А: Етиловий естер 7-[2R-(трет-бутил-диметил-сіланилоксиметил)-5-оксо-піролідин-1-іл]-гептанової кислоти. Дотримуючись процедури, описаної в Приготуванні 1, Стадія А, аніон, одержаний з 5R-(трет-бутилдиметил-сіланилоксиметил)-піролідин-2-ону (30,000г, 130,8ммоль) і NaH (60% в маслі, 5,756г, 143,9ммоль) в ДМФ (600мл) піддавали реакції з етил 7-бромгептаноатом (32,559г, 137,3ммоль) протягом 3 год. при 90°C. В результаті очищення хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта розчинний градієнт (9:1 гексани:EtOAc до 4:1 гексани:EtOAc до 7:3 гексани:EtOAc до 6:4 гексани:EtOAc) одержали етиловий естер 7-[2R-(трет-бутил-диметил-сіланилоксиметил)-5-оксо-піролідин-1-іл]-гептанової кислоти (39,46г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 4,10 (к., 2Н), 3,62 (м., 4Н), 2,95 (м., 1Н), 2,42 (м., 1Н), 2,27 (м., 3R), 2,04 (м., 1Н), 1,81 (м.,1Н), 1,651,26 (м., 8Н), 1,23 (t, 3R), 0,86 (s, 9Н), 0,03 (s, 6Н); МС 386,2 (М+1). Стадія В: Етиловий естер 7-(2R-гідроксиіиетил-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанової кислоти. Дотримуючись процедури, описаної в Приготуванні 1, Стадія В, етиловий естер 7-[2R-(трет-бутил-диметилсіланилоксиіиетил)-5-оксо-піролідин-1-іл]-гептанової кислоти (39,46г, 102,3ммоль) депротектували TBAF (1 M в ТГФ,. 154,0мл, 154,0ммоль) з тривалістю реакції 2,5 год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта розчинний градієнт (9:1 гексани:EtOAc до 6:4 гексани:EtOAc до 1:1 гексани:EtOAc до EtOAc до 19:1 EtOAc:МеОН) одержали етиловий естер 7-[2R-гідроксиметил-5-оксопіролідин-1-іл)-гептанової кислоти (25,41г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 4,10 (к., 2Н), 3,77 (д.д., 1Н), 3,64 (м., 3R), 2,96 (м., 1Н), 2,46 (м, 1Н), 2,35-2,25 (м., 3R), 2,08 (м., 1Н), 1,93 (м., 1Н), 1,71 (м., 1Н), 1,63-1,27 (м., 8Н), 1,23 (т., 3Н); МС 272,2 (М+1). Приготування З Диметиловий естер [2-оксо-3-(3-трифторметил-феніл)-пропіл]-фосфонової кислоти Стадія А: N-Метокси-N-метил-2-(3-трифторметил-феніл)-ацетамід. До розчину Ν,Οдиметилгідроксиламінового гідрохлориду (1,577г, 16,2ммоль) в ДМФ (25мл) та СН 2С12 (25мл) при 0°С додавали триетиламін (2,25мл). Після перемішування протягом 5 хвилин додавали 3трифторметилфенілоцтову кислоту (3,0г, 14,7ммоль), НОВТ (3,177г, 23,5ммоль) і DEC (2диетиламіноетилхлоридпдрохлорид, 3,10г, 16,2ммоль). Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 18 год. і концентрували у вакуумі. Залишок разбавляли EtOAc і органічний розчин промивали послідовно 1N NaOH (двічі), водою і соляним розчином. Органічний розчин просушували (MgSO 4), фільтрували і концентрували у вакуумі. В результаті хроматографії середнього тиску (20% EtOAc в гексанах до 50% EtOAc в гексанах) одержали N-метокси-N-метил-2-(3-трифторметил-феніл)-ацетамін. Стадія В: Диметиловий естер [2-оксо-3-(3-трифторметил-феніл)-пропіл]-фосфонової кислоти. До розчину диметил метилрфосфонату (9,4г, 75,8ммоль) в толуолі (80мл) при -78°С обережно додавали n-BuLi (2,5М в гексанах, 28мл, 70ммоль). Суміш перемішували протягом 1 год. і обережно додавали розчин N-метокси-Nметил-2-(3-трифторметил-феніл)-ацетаміду (14,39г) в толуолі (50мл). Суміш перемішували протягом 2,5 год. і додавали АсОН (40мл). Суміш нагрівали до кімнатної температури і додавали воду. Органічний шар промивали водою, а потім соляним розчином. Органічний розчин просушували (MgSO4), фільтрували і концентрували у вакуумі. В результаті хроматографії середнього тиску (СН2СІ2 до 2% МеОН в СН2СІ2) одержали сполуку, зазначену у заголовку Приготування 3 (9,37г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,52 (м., 1 Η), 7,44 (м., 2Н), 7,37 (м., 1 Н), 3,96 (с., 2Η), 3,87 (с., 3R), 3,76 (с., 3R), 3 ,12 (д.,2Н). Приготування 4 Диметиловий естер [3-(3-хлор-феніл)-2-оксо-пропіл]-фосфонової кислоти Замістивши відповідні вихідні речовини, дотримуючись процедури, аналогічної процедурі, описаній в Приготуванні 3, приготували сполуку, зазначену у заголовку Приготування 4. Приготування 5 Диметиловий естер [3-(3-Хлор-феніл)-2-оксо-пропіл]-фосфонової кислоти До розчину диметилметилфосфонату (17,93г, 144ммоль) в ТГФ (270мл) при -78°С обережно додавали nBuLi (2,5М, 64,2мл, 160,6ммоль). Суміш перемішували протягом 1 год. і обережно додавали метиловий естер (З-хлор-феніл)-оцтової кислоти (26,93г, 146ммоль). Суміш нагрівали до кімнатної температури і перемішували протягом 24 год. Додавали АсОН (15мл) і у вакуумі вилучали леткі речовини. Залишок розводили СН 2СІ2 і органічний розчин обережно промивали насиченим водним NaHCOs (тричі). Органічний шар промивали (MgSO4), фільтрували і концентрували у вакуумі. В результаті очи щення хроматографією середнього тиску (20% EtOAc в гексанах до EtOAc) одержали сполуку, зазначену в заголовку (9,28г). Приготування 6 Тетрагідро-піролізин-3,5-діон Сполуку, зазначену у заголовку Пригтування 6, одержали, дотримуючись процедури, описаної в Патенті США № 4 663 464. Приготування 7 Етиловий естер 7-{2R-форміл-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанової кислоти До розчину етилового естеру 7-{2R-гідроксиметил-5-оксо-піролідин-1-іл)-гептанової кислоти (1,63г, 6,01ммоль) в бензолі (50мл) додавали 1-(3-диметиламінопропіл)-3-етилкарбодіімідовий гідрохлорид (3,46г, 18,03ммоль) і DMSO (1,5мл, 24,04ммоль). Розчин охолоджували до 0°С і додавали трифторацетат піридинію (1,28 г, 6,61 ммоль). Суміш перемішували при 0°С протягом 15 хвилин, а потім при кімнатній температурі протягом 2 год. Розчин зливали з маслянистого осаду. Осад промивали бензолом (тричі) і комбіновану бензолову промивку концентрували у вакуумі з метою одержання етилового естеру 7-{2R-форміл-5-оксопіролідин-1-іл)-гептанової кислоти, який використовували без подальшого очищення. Приготування 8 Метиловий естер 4-(3{2-[4-бiфeнiл-3-iл-3-(mpem-бyтил-димeтил-ciлaнилoкси)-бyтил]-5-оксо-піролідин-1-іл}пропіл)-бензойної кислоти Стадія А: 5-(3-Бром-3-оксо-бутил)-піролідин-2-он. До розчину тетрагідро-піролізин-3,5-діону (5г, 36ммоль) в СН2СІ2 (320мл) при 0°С додавали краплями бромід 3-бромбензилмагнію (0.25М в Et 2, 155 мл, 38,8 ммоль). Розчин перемішували при 0°С протягом 2 год. і гасили насиченим водним хлоридом амонію. Додавали 1 N НСІ для одержання рН=3. Після нагрівання до кімнатної температури водний розчин екстрагували додаванням СН2СІ2 (Зх). Комбіновані органічні екстракти просушували (MgSO 4), фільтрували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта розчинний градієнт (1:1 гексани:EtOAc до EtOAc до 5% МеОН в СН2СІ2) одержали 5-(3-бром-3-оксо-бутил)-піролідин-2-он (7,84г). 1НЯМР (CDCI3) δ 7,41-7,11 (м., 4Н), 6,24 (ш.с., 1 Η), 3,67 (с., 2Н), 3,60 (м., 1Н), 2,52 (т., 2Н), 2,32 (м., 2Н), 2,20 (М..1Н), 1,88-1,60 (м.,3Н). Стадія В: 5-(3-Бром-3-гідрокси-бутил)-піролідин-2-он. До розчину 5-(3-бром-3-оксо-бутил)-піролідин-2-ону (7,84г, 25,3ммоль) в EtOH (130мл) при 0°С додавали NaBH4 (480мг, 12,6ммоль) і суміш перемішували при 0°С протягом 2,5 год. Реакцію гасили насиченим водним хлоридом амонію. Додавали воду і СН 2СІ2 . Водний шар промивали СН 2СІ2 (Зх) і комбіновані органічні екстракти просушували (MgSO 4), фільтрували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта розчинний градієнт (1:1 гексани:EtOAc до EtOAc до 1 % МеОН в СН2Сl2 до 3% МеОН в СН2СІ2 до 5% МеОН в СН2СІ2 до 8% МеОН в СН2Сl2) одержали 5-(3-бром-3-гідрокси-бутил)-піролідин-2-он (6,76 г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,36-7,09 (м., 4Н), 6,27 (д., 1Н), 3,78 (м., 1Н), 3,63 (м., 1Н), 2,75 (м., 1Н), 2,62 (м., 1Н), 2,32-2,18 (м., 3H), 1,88 (м., 1Н), 1,73-1,42 (м., 5Н); МС 312,2,-314,1 (М+). Стадія С: 5-[3-Бром-3-(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-бутил]-піролідин-2-он. До розчину 5-(3-бром-3гідрокси-бутил)-піролідин-2-ону (6,76г, 21,6ммоль) в ДМФ (86мл) додавали трет-бутилдиметилсиліловий хлорид (3,59г, 23,8ммоль), а потім імідазол (2,95г, 43,3ммоль) і DMAP (264мг, 2,16ммоль). Реакцію перемішували протягом 24 годин і гасили насиченим водним хлоридом амонію. Водний розчин промивали EtOAc (Зх) і комбіновані органічні екстракти просушували (MgS04), фільтрували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта розчинний градієнт (СН2СІ2 до 1% МеОН в СН 2СІ2 до 3% МеОН в СН 2СІ2 до 5% МеОН в СН 2СІ2 до 8% МеОН в СН 2СІ2) одержали 5-(3-бром-3(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-бутил]-піролідин-2-он (7,45г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,30 (м., 2Н), 7,12 (м., 1Н), 7,04 (м., 1Н), 5,71 (м., 1Н), 3,81 (м., 1Н), 3,56 (м., 1Н), 2,66 (м., 2Н), 2,32-2,17 (м., 3Н), 1,70-1,35 (м., 5Н), 0,82 (с., 9Н), -0,06 (д., 3Н), -0,24 (д., 3Н); МС 426,2, 428,2 (М+). Стадія D: 5-[4-Біфеніл-3-іл-3-(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-бутил]-піролідин-2-он. До розчину 5-[3бром-3-(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-бутил]-піролідин-2-ону (750мг, 1,76ммоль) в DME (15мл) додавали фенілборонову кислоту (236мг, 1,93ммоль). Додавали ацетат паладію (26,8мг, 0,088ммоль) і три-отолілфосфін (39,5мг, 0,176ммоль), а потім розчин Na2CO3 (37,3мг, 3,52ммоль) у воді (1,8мл). Реакцію нагрівали із зворотнім холодильником протягом 24 год. Реакцію охолоджували і леткі речовини вилучали у вакуумі. Залишок розбавляли соляним розчином і EtOAc. Водний розчин промивали EtOAc (Зх) і комбіновані органічні екстракти просушували (МдSО4), фільтрували і концентрували. В результаті очищення хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта розчинний градієнт (1:1 гексани:EtOAc до EtOAc до 1% МеОН в СН2СІ2 до 3% МеОН в СН2СІ2 до 5% МеОН в СН2СІ2) одержали 5-[4-біфеніл-3-іл-3-(третбутил-диметил-сіланилокси)-бутил]-піролідин-2-он (717,3мг). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ ,7,57 (м., 2Н), 7,43 (м., 2Н), 7,33 (м., 3Н), 7,11 (м., 2Н), 5,78 (м., 1Н), 3,91 (м., 1Н), 3,59 (м., 1Н), 2,76 (м., 2Н), 2,27 (м., зн), 1,73-1,38 (м., 5Н), 0,83 (с., 9Н), -0,03 (д., 3Н), -0,16 (д., 3Н); МС 424,3 (М+1). Приготування 9 5-[3-(трет-Бутил-диметил-сіланилокси)-4-(3-фтор-феніл)-бутил]-піролідин-2-он Стадія А: 5-[4-(3-Фтор-фєніл-3-оксо-бутил]-піролідин-2-он. Дотримуючись процедури, описаної в Приготуванні 8, Стадія А, тетрагідро-піролізин-3,5-діон (2 г, 14 ммоль) піддавали реакції з хлоридом 3фторбензилмагнію (0,25М в Et2O, 62мл, 15,5ммоль) більше 2,5 год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта розчинний градієнт (1:1 гексани:EtOAc до 2:1 EtOAc гексани до EtOAc до 2% МеОН в СН2СІ2 до 10% МеОН в СН2СІ2) одержали 5-[4-(3-фтор-феніл)-3-оксо-бутил]піролідин-2-он (2,1730г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,32-7,27 (м., 1Н), 7,00-6,90 (м., 3H), 6,12 (ш.с, 1Н), 3,69 (с., 2Н), 3,59 (м., 1Н), 2,52 (т., 2Н), 2,30 (м., 2Н), 2,19 (м., 1Н), 1,75 (м., 2Н), 1,65 (m,1Н Стадія В: 5-[4-(3-Фтор-феніл-3-гідрокси-бутил]-піролідин-2-он. Дотримуючись процедури, описаної в Приготуванні 8, Стадія В, 5-[4-(3-фтор-феніл)-3-оксо-бутил]-піролідин-2-он (2,17г, 8,71ммоль) відновлювали NaBH4 (165мг, 4,35ммоль). В результаті очищення хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта розчинний градієнт (1:1 гексани:EtOAc до EtOAc до 1% МеОН в СН2СІ2 до 3% МеОН в СН2СІ2 до 6% МеОН в СН 2СІ 2) одержали 5-[4-(3-фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-піролідин-2-он (2,23г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,27 (м., 1Н), 6,94 (м., 3Н), 6,38 (м., 1Н), 3,82 (м., 1Н), 3,66 (м., 1Н), 2,79 (м., 1Н), 2,67 (м., 1Н), 2,33-2,21 (м., 3Н), 1,92 (д., J=4,15 Hz, 1Н), 1,75-1,40 (м., 5Н); МС 252,2 (М+1). СтадіяС: 5-[З-(трет-Бутил-диметил-сіланилокси)-4-(3-фтор-феніл)-бутил]-піролідин-2-он. Дотримуючись процедури, описаної в Приготуванні 8, Стадія С, 5-[4-(3-фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-піролідин-2-он (2,23г, 8,87ммоль) піддавали реакції з трет-бутилдиметилсілиловим хлоридом (1,47г, 9,76ммоль). В результаті очищення хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта розчинний градієнт (1:1 гексани:EtOAc до EtOAc до 1% МеОН в СН2СІ 2 до 2% МеОН в СН2СІ2 до 4% МеОН в СН2СІг) одержали 5-[3(трет-бутил-диметил-сіланилокси)-4-(3-фтор-феніл)-бутил]-піролідин-2-он (2,84г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,23 (м., 1Н), 6,88 (м., 3Н), 5,75 (м., 1Н), 3,85 (м., 1Н), 3,57 (м., 1Н), 2,71 (м., 2Н), 2,30 (м., 2Н), 2,25 (м., 1Н), 1,70-1,38 (м., 5Н), 0,84 (с., 9Н), 0 (с., 3Н),-0,2(с., 3Н). Приготування 10 5-[3-(трет-Бутил-диметил-сіланилокси)-4-(4-фтор-феніл)-бутил]-піролідин-2-он Стадія А: 5-[4-(4-Фтор-феніл)-3-оксо-бутил]-піролідин-2-он. Дотримуючись процедури, описаної в Приготуванні 8, Стадія А, тетрагідро-піролізин-3,5-діон (1,41г, 10,1ммоль) піддавали реакції з хлоридом 4фторбензилмагнію (0.25М в Et2O, 50мл, 12,5ммоль) більше 5 год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску (2% МеОН в СН 2СІ2) одержали 5-[4-(4-фтор-феніл)-3-оксо-бутил]-піролідин-2-он (2,64г). 1НЯМР (CDCI3) δ 7,18 (м., 2Н), 7,03 (м., 2Н), 6,34 (м., 1Н), 3,70 (с., 2Н), 3,62 (м., 1Н), 2,54 (т., 2Н), 2,34-2,15 (м-, 3Н), 1,82-1,61 (м., 3Н). Стадія В: 5-[4-(4-Фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-піролідин-2-он. Дотримуючись процедури, описаної в Приготуванні 8, Стадія В, 5-[4-(4-фтор-феніл)-3-оксо-бутил]-піролідин-2-он (2,64г, ммоль) відновлювали NaBH4 (400мг, ммоль) при кімнатній температурі протягом 1 год. Додатково додавали NaBH4 (150мг) і реакцію перемішували протягом 20 год. В результаті очищення хроматографією середнього тиску, використовуючи в якості елюанта розчинний градієнт (СН2СІ2 до 2% МеОН в CH2CI2 дo 4% МеОН в СН2Сl2) одержали 5-[4-(4фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-піролідин-2-он (2,01г). 1Н-ЯМР (CDCI3) δ 7,14 (м., 2Н), 6,98 (м., 2Н), 6,78 (м., 1Н), 3,76 (м., 1Н), 3,65 (м., 1Н), 2,76 (м., 1Н), 2,64 (м., 1Н), 2,32-2,18 (м., 4Н), 1,72-1,47 (м., 5Н). Стадія С: 5-[3-(трет-Бутил-диметил-сіланилокси)-4-(4-фтор-феніл)-бутил]-піролідин-2-он. Дотримуючись процедури, описаної в Приготуванні 8, Стадія С, 5-[4-(4-фтор-феніл)-3-гідрокси-бутил]-піролідин-2-он (1,95г, 7,79ммоль) піддавали реакції з трет-бутилдиметилсілиловим хлоридом (1,47г, 9,76ммоль). В результаті очищення хроматографією середнього тиску (1% МеОН в СН2СІ2) одержали 5-[3-(трет-бутил-диметилсіланилокси)-4-(4-фтор-феніл)-бутил]-піролідин-2-он. 1Н-ЯМР (CDCl3) δ 7,12 (м., 2Н), 6,97 (м., 2Н), 5,75 (м., 1Н), 3,83 (м., 1Н), 3,60 (м., 1Н), 2,71 (м., 2Н), 2,36-2,24 (м., 3Н), 1,70-1,38 (м., 5Н), 0,84 (с., 9Н), -0,05 (д., 3Н), -0,2 (д., 3Н). Приготування 11 Диметиловий естер [2-оксо-3-(3-фенокси-феніп)-пропіл]-фосфонової кислоти Шляхом заміщення відповідного вихідного матеріалу за способом, описаним для сполуки Приготування 5, одержали сполуку, зазначену у заголовку Приготування 11.