Композиція для стимуляції лактації у корів і підвищення ступені засвоювання кормів

Изобретение относится к биологически активным полипептидным композициям, которые могут быть введены парентерально животным и которые характеризуются увеличенным периодом выделения, а также к методам применения таких композиций. Предлагаемая композиция содержит, %; бычий или свиной соматотропин 10-42 и растительное масло 58-90. 11 табл. зиция должна содержать высокоэффективное количество полипептида (эффективную дозу), чтобы поддерживать необходимую скорость выделения препарата в организме животного в течение увеличенного периода времени, и характеризоваться достаточно низким объемом, чтобы обеспечить удобство парентерального ввода в организм. Это особенно важно в тех случаях, когда доза полипептида, который должен быть введен в организм животного, является действительно большой. Соматотропин (бычий соматотропин) может быть растворен во множестве буферных растворов, в частности в водном растворе мочевины, забуференном с помощью трис(оксиметил)аминометана (TRIS) или другого буферирующего агента. Верхний предел концентрации мочевины примерно 6М, но в некоторых случаях используется мочевина концентрацией примерно 4,5 М. Нижний предел 1595330 концентрации мочевины 3 М, могут испольяоваться концентрации 2 М и даже 1 V, но с меньшей растворимостью при этом соматотропина. _ Величина водородного показателя буферного раствора мочевины 7-10,5. 8 этих пределах зеличин водородного показателя извлечение соматотропина в виде осадка из раствора в общем JQ случае составляет по меньшей мере примерно 60%, более высокое извлечение 0~90/О может быть обеспечено при рН 9 - 9,5. Температура раствора во время про- (5 ведения операции осаждения должна ^ быть достаточно низкой, чтобы избежать олигомеризации соматотропина, а именно менее 10 и более 5°С. Для получения полипептида, связан- 20 ного с одновалентным металлом, раствор, подвергнутый депирогенизации и стерилизации,, обрабатывают путем диафильтрации (или диализа), чтобы заменить мочевину раствором бикарбоната 25 металла (например, 25 мМ раствор NaHCO,, рН 9,5) или другой пригодной солью. Многократный обмен с помощью раствора бикарбоната металла осуществляют для обеспечения полного обмена зО (Мочевины. Полученный раствор далее подвергают обработке с помощью дополнительной диафильтрации с водой для удаления избытка NaHCO 3 , на что указывает начало выпадения в осадок свя35 занного с металлом биологически активного соматотропина „ Извлечение натрий-соматотропина с помощью процесса лиофилизации приводит к получению порошка, представляющего собой натриевую соль соматотропина. По мере добавления раствора хлорида цинка раствор соматотропина вначале имеет беловатый цвет, а затем жемчужно-белый после добавления всего стехиометрического количества цинка. Так, например, путем добавления 4 мл раствора хлорида цинка концентрацией 1 М к 400 мл раствора с рН 9,5, содержащего примерно 20 мг соматотропина на 1 мл и 0,9 М трис(оксиметил)аминометала в мочевине, имеющего концентрацию 4,5 М, получают однородную жемчужно-белую суспензию цинка-соматотропина. Можно добавить дополнительное количество хлорида цинка (например, до 10 мл раствора хлорида цинка концентрацией 1 М ) , чтобы обеспечить полное выпадание в осадок. Затем суспензию разбавляют, чтобы уменьшить тенденцию к увеличению размера частиц осадка. Разбавление с помощью примерно 3,5 объемов воды до концентрации мочевины, равной пример.но 1 М, предохраняет частицы цинкасоматотропина от агломерации. Извлечение путем диафильтрации (или многократного центрифугирования и промывания) с целью удаления мочевины, трис(оксиметил)аминометана и ионов цинка и хлора с последующей лиофилизацией обеспечивает получение порошка, имеющего размер частиц в общем случае меньше 10-20 мкм. Частицы бычьего соматотропина содержат примерно 0,3 - 1% цинка (1 4 молекулы цинка на 1 молекулу соматотропина^ . При увеличении скорости добавления цинка увеличивается количество осадка вплоть до 4-5%. Это обусловлено тем, что имеет место дополнительное присоединение цинка к активным кислотным центрам на сомаДля получения полипептида, связантотропине, т.е. на дополнительных осного с поливалентным металлом, расттатках аспарагиновой и/или глутамивор после депирогенизации и стерилиновой кислоты или гистидиновых осзации подвергают контактированию с татках, или на карбоксиконцевых групсолью поливалентного металла, такого пах полипептида. как, например, цинк. Применение раствора хлорида цинка концентрацией 1 МобесП р и м е р 1. Получение бычьего печивает получение в виде огадка со~ соматотропина, связанного с цинком. 50 матотропина-цинка из раствора мочевиБычий соматотропин с N-концевым ны соматотропина, имеющего концентраметионином (MBS) получают по известцию 4,5 М мочевины, хотя могут исному методу путем лизиса клеток бакпользоваться более высокие или более терий и последующего выделения соманизкие концентрации хлорида цинка. тотропина из остатков бактериальных Раствор хлорида цинка добавляют мед- 55 клеток, ленно, например путем титрования, Бактерии уничтожают путем обработпри одновременном перемешивании растки 50%-ной серной кислотой, что окавора соматогропина. зывается достаточным для того, 1595330 6 чтобы снизить рН ферментационного анионо- и катионообменной смол типа бульона до 1,7. Бульон нейтрализуют Biorad AG-501X8 на каждый миллилитр добавлением гидроокиси натрия и застерильного раствора полипептида. тем подвергают центрифугированию с Полученную таким образом смесь переполучением в результате пасты из клемешивают примерно в течение 10 мин ток, которую затем суспендируют в мопри 4°С, а затем подвергают фильтрачевине, подвергают гомогенизации и ции с помощью нейлонового фильтра, охлаждению до примерно 4°С (эта темимеющего отверстия 1 мкм, с целью пература поддерживалась до тех пор, удаления гранул ионообменной смолы, пока не осуществлялся процесс лиофи- 10 содержащих адсорбированные пирогены. лизации бычьего соматотропина с NПолученный депирогенированный поконцевым метионином, а затем осущелипептид - бычий соматотропин с Nствляют центрифугирование и 3-кратконцевым метионином (MBS) стерилизуют ное промывание, а также растворение путем пропускания раствора через сте15 в растворе гидрохлорида гуаиидина рилизованный радиацией (облучением) концентрацией 7М. Центрифугирование гофрированный капсульный фильтр с отнеобходимо, чтобы удалить нераствориверстиями диаметром 0, 2 мкм с целью мые примеси. Затем проводят фильтраудаления нестерильных инородных тел, цию и полученную субстанцию пропуска20 таких как бактерии или загрязнения ют через колонку, заполненную G25 со стадий предшествующей переработки. Sephadex, в которой гуанидин заменен Полипептид MBS превращают в цинкона мочевину, опять фильтруют и полувую соль полипептида (ZnMBS) добав- / ченную субстанцию далее пропускают лением 1 М хлорида цинка при одновречерез ионообменную колонку типа DE52. 25 менном перемешивании депирогенированОбъем выходящего из колонки потока його раствора полипептида MBS. Выпавуменьшают примерно в 30 раз с помощью ший в осадок ZnMBS содержит примерно ультрафильтрации через пустотелые во1% цинка. Раствор, содержащий твердый локна. Концентрированный раствор даматериал - ZnMBS, далее разбавляют лее пропускают через хроматографичесстерильной депирогенированной водой кую колонку, заполненную G75 Sephadex, 30 до концентрации мочевины в нем 1 М. а затем осуществляют другую стадию Полипептид ZnMBS извлекают центриуменьшения объема путем пропускания фугированием с ускорением 10000 g в через пустотелые волокна и далее потечение 30 мин и при этом температура лученную субстанцию подвергают обмену, в соответствии с которым мочевина 35 поддерживается равной 4°С. Указанный полипептид далее подвергают суспендивначале заменяется на раствор NaHC0 3 , рованию в стерильной депирогенирована затем на дистиллированную воду, чтоной воде ііри концентрации 50 мг ZnMBS/ бы обеспечить выпадение в осадок бычь/мл, используя при смешении высокие его соматотропина с N-концевым метиоусилия сдвига. Полипептид ZnMBS данином. Полученный осадок подвергают 40 лее снова извлекают центрифугированилиофилизации с получением в результаем при ускорении 10000 g в течение те белого твердого вещества, слабо 30 мин, затем повторно суспендируют растворимого в воде и содержащего пов стерильной депирогенированной воде липептид, представляюгщй собой бычий 45 при концентрации 50 мг ZnMBS/мл с иссоматотропин с N-концевым метионином,, пользованием высоких усилий сдвига содержащий Ш^-мет-фе( 1 )-про(2) ... при смешении. Затем полученную сублеи(126)..,фе(190)-СООН аминокислотстанцию подвергают лиофилизации с поную последовательность. Такой полипеплучением в результате белого рыхлого тид - бычий соматотропин с N-концевым 50 метионином подвергают растворению в 4,5 М растворе мочевины, 0,09 М растворе трис(оксиметил)аминометана при концентрации 21,5 мг указанного полипептида на миллилитр при 4 С и рН 9,5.5 5 Полученный раствор полипептида бычьего соматотропина с N-концевым метионином подвергают депирогенизации путем смешения с 0,2 г гранул перемешанной порошка стерильного ZnMBS. П р и м е р 2. Альтернативный способ получения ZnMBS. Депирогенированный и стерилизованный раствор, содержащий 21 мг MBS на 1 мл в растворе мочевины концентрацией 4,5 М, содержащий 0,05 М трис— (оксиметил)аминометаи, имеющий температуру Ю ° с и рН 8,8, подвергают рециркуляции через емкость с помощью 1595330 плунжерного насоса. На линию всоса насоса вводят раствор хлорида цинка концентрацией 1 М до тех пор, пока концентрация хлорида цинка в растворе не становится равной 0,01 М, что приводит к выпадению в осадок ZnMBS. Далее добавляют воду для разбавления, чтобы обеспечить концентрацию 10 мг MBS на 1 мл, приводящую к дальнейше10 му выпадению в осадок ZnMBS. Полученную таким образом суспензию ZnMBS подвергают циркулированию при 25°С через диафильтрационную мембрану, состоящую из полых волокон и которая 15 имеет отверстия, пропускающие молекулы мол.м. до 100000. Эта операция проводится до концентрации 40 мг MBS на 1 мл. Далее добавляют воду с целью подогнать скорость фильтрации через мембрану таким образом, чтобы удалить 20 из суспензии практически все количество цинка, мочевины и трис(оксиметил)аминометила. Добавление воды прекращают, чтобы обеспечить концентрацию, * примерно равную 80 мг MBS/мл. Полученную таким образом концентрированную суспензию далее подвергают лиофилизации с получением сухого белого порошка ZnMBS, имеющего размер частиц 0,5- 3 11 мкм. П р и м е р 3. Получение бычьего соматотропина, связанного с натрием. Депирогенированныи и стерилизованный раствор, содержащий 21,5 мг MBS : на 1 мл в растворе мочевины концентрацией 4,5 М, содержащий 0,05 М трис(оксиметил)аминометан, имеющий температуру 4°С и рН 9,5, подвергают диализу с целью замены мочевины вначале Ю на раствор NaHCOj, а затем на дистиллированную воду. Водный обмен останавливают в тот момент, когда начинает происходить выпадение в осадок MBS. Полученный таким образом раствор да- \5 лее подвергают фильтрации с помощью фильтра, имеющего размер отверстий 0,2 мкм, для удаления выпавшего в осадок HBS и затем подвергают лиофилизации с получением в результате натрие- ;Q вой соли (NaMBS). 8 в количестве 5% от общей массы моностеарата алюминия и кунжутного масла. Эту колбу помещают в масляную баню, имеющую температуру 155°С, и содержимое подвергают моностеарата алюминия диспергирования моностеараталюминия так быстро, как только возможно. Процесс перемешивания продолжают в течение 20 мин, за это время происходит полное растворение моностеарата алюминия в масле. Колбу затем извлекают иэ масляной бани, выдерживают под вакуумом и охлаждают до 25 С. После охлаждения полученный раствор превращается в густой гель. Охлажденный гель выгружают в шаровую мельницу, имеющую мешалку, обеспечивающую высокие усилия сдвига в слое, состоящем из шариков из нержавеющей стали, имеющих диаметры 1/8, 3/16 и 1/4 дюйма (0,32; 0,48 и 0,64 см соответственно) . В рабочем пространстве мельницы создается вакуум, и порошок ZnMBS, полученный, как в примере 1, медленно подается в рабочее пространство мельницы с использованием шнекового питателя до тех пор, пока количество ZnMBS в композиции не достигнет 40% (отношение ZnI4BS и моностеарата алюминия равно 13,3). Процесс перемешивания продолжается в течение 6 ч, за этот период средний по объему диаметр частиц ZnMBS уменьшают с 20 до 5 мкм. Полученную в результате практически безводную гелеобразную масляную суспензию ZnMBS отделяют от шариков из нержавеющей стали путем фильтрации. П р и м е р 5. Эффективность использования композиции. Практически безводную композицию получают, как в примере 4, путем растворения 5% моностеарата алюминия в кунжутном масле, нагретом до 155 С. Это масло затем охлаждают с получением в результате гелеобраэного масла. ZnMBS подвергают диспергированию и размолу в масле до тех пор, пока количество ZnMBS в композиции не достигнет 32% в непрерывной фазе масла (отношение ZnMBS и моностеарата алюминия равно 9,4). Шприцы, оснащенные иглой П р и м е р 4. Получение компози18 калибра и имеющие длину 1,5 дюйма ций, содержащие соматотропин, связанный (3,8 см), заполняют 2,54 г (2,5 мл) с цинком. Определенный объем кунжутного мас- ^ композиции с образованием дозы, содержащей 805 мг ZnMBS. Эта композиция ла 9 сорт FISHER NF, помещают в треххарактеризуется способностью к шпригорлую колбу с круглым основанием. цеванию, равной 0,36 мл/с. Получают В качестве агента противогидратации также чистые композиции кунжутного добавляют моностеарат алюминия (AIMS) 9 1595330 масла с 5% моностеарата алюминия, но без полипептида, и заполняют аналогичные шприцы 2,4 г этих композиций. Указанные композиции вводят инъекцией 23 молочным коровам породы Holstein на втором или третьем трехмесячном сроке их второй или последующей лактации. Коровы сгруппировывают в четыре группы, содержащие 5 или 6 жи10 вотных. Двум группам коров инъекции вводят внутримышечно (1 М) в область желудка, причем одной группе вводят композицию, содержащую ZnMBS, а другой, контрольной группе, - компози15 цию, не содержащую полипептид. Аналогично двум другим группам животных вводят как композицию, содержащую полипептид ZnMBS, так и композицию, не ^содержащую полипептид, подкожно в супраскапулярную область. Кумулятив- 20 ные значения, полученные методом наименьших квадратов для средней удойности по молоку (ковариантно рассчитанные через разности входных значе25 ний производительности по молоку), приведены в табл. 1. Как показано в табл. 1, единичная внутримышечная или подкожная инъекция предлагаемой композиции приводит к . 30 быстрому и продолжительному улучшению производства молока при высоки:: значениях статистической значимости. Образцы крови подвергают анализу с целью определения бычьего сомато35 тропина, который без ввода обычно присутствует в циркуляционной системе крупного рогатого скота. Результаты анализов, проведенных с помощью радиоиммунологических опытов, представлены в табл. 2. П р и м е р 6. Эффективность композиций для увеличенного периода выделения полипептида (IIBS) у животных. Эти композиции содержат ряд раз45 личных материалов. Композиции ZnMBS готовят, как в примере 5, с использованием комбинаций следующих компонентов: биологически совместимое масло и масло из семян кунжута или зем50 ляного ореха; агент противогидратации и моностеарат алюминия при концентрации 3 или 5% от масла и моностеарата алюминия; полипептид и ZnMBS при концентрации 20, 30 или 40% от общей ком(ПОЗИЦИИ. Моностеарат алюминия диспергируют масле. Дисперсию, после нагревания выдержки при 155 С в течение 15 мин. t 10 25°С охлаждают до Zb "С с получением гелеобразного масла. Далее добавляют ZnMBS и полученную смесь подвергают диспергированию в смесителе, обеспечи вающем высокие усилия сдвигаЕ в результате получают суспензию ZnMBS в гелеобразном масле. Этой суспензией заполняют туберкулиновые шприцы, осна щенные гиподермическими иглами 18 калибра. Составы композиций приведены в табл. 3. Композиции (табл.3) вводят подкожно в дорсальную (спинную) супраскулярную область крысам (самкам) породы Sprogue-Dawliy (IFS-D), которые разделяют на 16 групп по 8 шт. в каждой. У крыс подавляют иммунную систему. Образцы крови подвергают анализу с помощью радиоиммунологических опытов на бычий соматотропин. Данные приведены в табл. 4. Плазменные концентрации представлены для образцов крови, взятых перед инъекцией в день 0 (в день инъекции). Некоторые измерения точек отсчета для крыс в группах 4-7 являются более высокими по сравнению с некоторыми точками отсчета и измерениями выделенного полипептида для коров в примере 5. Это обусловлено тем, что имеют место различия в обычных концентрациях соматотропина и вследствие того, что радиоиммунологические анализы в примере 5 более точные. Средние значения концентраций для контрольных групп 1,5,9 и 13 равны в диапазоне 5 - 1 2 нг/мл на каждый из указанных дней. П р и м е р 7. Эффективность композиций, обеспечивающих увеличенный период выделения полипептида (MBS), в котбрых используются в качестве агентов противогидратации соли алюминия на основе кислот жирного ряда, в частности монопальмитат и монолаурат алюминия с кунжутным и арахисовым масламио Гелеобразные масла, содержащие 3% монолаурата и монопальмитата алюминия получают, как в примере 6. ZnMBS подвергают суспендироваиию в гелеобразных маслах при концечтр цич в равной 30% от массы всей композиции (отношение ZnMBS и монолаурата алюминия или монопальмитата алюминия равно 14 ( 3)* Каждая композиция вводится 1595330 12 Сравнение реяультатов, полученных для групп 32 и 33, показывает улучшение способности к увеличению периода выделения MBS за счет использования агента противогидратации в тех случаях, когда MRS является связанным с таким поливалентным металлом. П р и м е р 10» Готовят композиции, 7 содержащие 10" оычьего соматотропина, без при^^і^мя агента противогидратацик Й -./кжутном, арахисовом, кукурузном, оливковом, саффлоровом, хлопковом, пальмовом, рапсовом и соевом маслах. Каждое из этих масел хранят отдельно при следующих температурах: 4, 25, 50, 75, 100 и 125°С, ZnMBS подвергают диспергированию и размалыванию в каждом из масел, как в примере 4, до тех пор, пока концентрация не становится равной 10%, Процесс размельчения продолжается до достижения среднего диаметра частиц соматотропина не более 15 мкм. Каждая из композиций характеризуется способностью к шприцеванию, превышающей 0,1 мл/с. П р и м е р 11. Готовят композиции, как в примере 10, за исключением тог0 » ч т о перед добавлением соматотропина моностеарат алюминия подвергают диспергированию в каждом из масел до концентрации 5% по отношению к массе масла и моностеарата алюминия. Эти композиции характеризуются способностью к шприцеванию, превышающей 0,1 мл/с. П р и м е р 12. Готовят композиции, как в примере 10, за исключением того, что процесс добавления соматотропина продолжается до тех пор, пока содержание бычьего соматотропина не достигнет 40%. Процесс диспергирования и Каждую композицию вводят путем размельчения продолжают до достижения подкожной инъекции группам крыс по45 среднего диаметра частиц соматотропироды IFS-Dp каждая из которых состона не более 15 мкм. ит из 8 животных,, доза 300 мкл. Эти композиции характеризуются Проводят анализ образцов крови, взяспособностью к шприцеванию, превышаютых у крыс после инъекции. Концентщей 0,03 м л / с рации бычьего соматотропина в плазП р И Н Є р 13. ГОТОВЯТ КОМПОЗИЦИИ, ме приведены в табл. 10 (значения, как в примере 12, за исключением того, относящиеся к дню 0 в являлись точкой что перед добавлением соматотропина отсчета при анализах)„ моностеарат алюминия подвергают дисСравнение результатовэ полученных пергированию в каждом из масел в кондля групп 30 и 31 9 показывает улуч- _ е центрации^ равной 5% по отношению к шение способности к увеличению перио массе масла и моностеарата алюминия. да выделения MBS по меньшей мере на 7 дней за счет использования связанЭти композиции имеют способность к ного поливалентного металла. шприцеванию, превышающую 0,03 мл/с. екцией группам крыс породы IFS-D , причем каждая группа состоит из 8 животных. Дозы приведены Б табл.5. Проводят анализ образцов крови, взятых у крыс после инъекции. Концентрации бычьего соматотролина приведены в табл.. 6 (значенияэ относящиеся к дню 0„ являлись точкой отсчета при анализах). П v и м е р 8. Эффективность композиций» характеризуемых увеличенным периодом выделения полипептида (MBS), в которых используется оливковое или кукурузное маслФ. 15 Гелеобразные масла получают» как в примере 6, с использованием 3% моностеарата алюминия от массы моностеарата алюминия и масла„ Суспензии, содержащие 30 или 40% ZnMBS вводят 20 инъекцией двум группам крыс породы IFS-D9 в каждой из групп находится по 8 животных* Концентрации вводимых доз приведены в табл. 7, Проводят анализ образцов крови, 25 ВЗЯТЬЕХ у крыс после инъекции. Концентрации бычьего соматотропина приведены в табл. 8 {значения9 относящиеся к дню 0 9 являются точкой отсчета при анализах). 30 П р и м е р 9. Эффективность композицийг содержащих примерно 10% полипептидов типа MBS и ZnMBS в арахисовом масле. Период выделения полипептида мо,t жет быть еще более увеличен при использовании полипептида, связанного с металлом^, и в результате применения агента противогидратации. Композиции„ предназначенные для инъекций, 40 получают.; как в примере 6. Составы композиций приведены в табл. 9. I 13 1595330 П р и м е р 14. Готовят композиции, содержащие 10% бычьего соматотропина, который растворяют в кунжутном, кукурузном, оливковом, саффлоровом, хлопковом, пальмовом, рапсовом и соевом маслах. Каждое масло нагревают до 160 С и перемешивают с целью улучшения растворения моностеарата алюминия. По10 сле того, как достигают растворения 1% моностеарата алюминия, каждое из масел охлаждают до 25°С. ZnMBS подвергают диспергированию и размельчению в охлажденном масле, как в при15 мере 4. Этот процесс продолжают до тех пор, пока концентрация полипептида не становится равной 10%, а средний диаметр частиц - не более 15 мкм. Каждая из композиций имеет способ20 ность к шприцеванию, превышающую 0,1 мл/с. П р и м е р 15. Получают композиции, как в примере 14, за исключени- 25 ем того, что процесс добавления соматотропина продолжают до тех пор, пока содержание соматотропина не достигает 40%. Эти композиции подвергают размельчению, как в примере 4, и процесс раз30 мельчения продолжают до достижения среднего диаметра частиц не более 15 мкм. Каждая композиция характеризуется способностью к шприцеванию, большей 0,03 мл/с. 35 і П р и м е р 16. Готовят композиции, содержащие 10% бычьего соматотропина в маслах, в которых растворен моностеарат алюминия, его концентра- 40 ция 5% по отношению к массе масла и моностеарата алюминия. Используют кунжутное, арахисовое, кукурузное, "саффлоровое, хлопковое, пальмовое, рапсовое и соевое масла. Каждое масло нагревают до 160 С и перемешивают с целью улучшения растворения моностеарата алюминия. После того, как моностеарат алюминия растворяется, каждое из масел охлаждают до 25 С. 50 ZnMBS далее подвергают диспергированию и размалыванию в охлажденном масле, как в примере 4, до тех пор, пока концентрация этого полипептида в масле не становится равной 10%. Полу- 5 ченную дисперсию далее размалывают до достижения среднего диаметра частиц соматотропина не более 15 мкм. Каждая из композиций характеризуется способностью к шприцеванию, превышающей 0,1 мл/с. П р и м е р 17. Композиции, содержащие 42% бычьего соматотропина, получают путем непрерывного добавления соматотропина к композициям, указанным в примере 16, до тех пор, пока содержание соматотропнна в композиции не достигнет 42%. При поддержании масла в форме непрерывной фазы соматотропин подвергают диспергированию и размельчению, как в примере 4„ Эта операция проводится до достижения среднего диаметра частиц соматотропина не более 15 мкм. Каждая из полученных композиций, содержащих полипептид, характеризуется способностью к шприцеванию, превышающей Г,"' 0,03 мл/с. П р и м е р 18. Готовят композиции содержащие 20% бычьего соматотропина в маслах, аналогичных Применяемым в примере 11. В качестве агента противогидратации вместо моностеарата алюминия применяют один из таких агентов, как дистеарат или тристеарат алюминия, монопальмитат, дипальмитат или трипальмитат алюминия, монолаурат, дилаурат или трилаурат алюминия, моностеарат или дистеарат магния, монолаурат или дилаурат магния, монопальмитат или дипальмитат магния, а также моностеарат или дистеарат кальция, монолаурат или дилаурат кальция, монопальмитат или дипальмитат кальция. Агент противогидратации добавляют' к маслу перед добавлением соматотропина. ZnMBS добавляют, как з примере 4, до тех пор, пока его концентрация не становится равной 20%. Процессы диспергирования и размельчения продолжаются до достижения среднего диаметра частиц соматотропина не более 15 мкм. Каждая из композиций характеризуется способностью к шприцеванию, превышающей 0,03 мл/с. П р и м е р 19. Готовят композиции, содержащие другие концентрации бычьего соматотропина в маслах, типы которых соответствуют типам масел, применявшихся в примере 18, но за исключением того, что процесс добавления соматотропина продолжается до тех пор, пока концентрация соматотропина не становится равной 25, 30 или 35%, Процессы диспергирования и размельчения продолжают до достижения среднего диаметра частиц самототропина не 15 1595330 16 связанным с катионами калия или натрия. П р и м е р 21. Результаты, полученные в соответствии с этим примером, аналогичны результатам, полученным П р и м е р 20„ Получают результав примерах 10-20, для тех случаев, ты, аналогичные полученным в примекогда были использованы другие бычьи рах 10-19 в тех случаях, когда иссоматотропины, т.е. соматотропины, пользовавшийся бычий соматотропин характеризуемые следующей последовапредставлял собой химически несвя10 тельностью аминокислот: занную форму или являлся химически более 15 мкм. Каждая из композиций характеризуется способностью к шприцеванию, превышающей 0,03 мл/с. ЫН,-мет-фе(1)-про(2)...вал(126)...фе(190)-СООН Ш2-ала-фе(1)-про(2)...вал(126)...фе(190)-СООН Ш 2 -ала-фе( t )-проСО .. .леи( 126). . ,фе( 190) ЫН1-фе-(1)-про(2)...леи(126)...фе,(190)-СООН Ш 2 -фе-(1)-про(-0. ..вал(126)...фе(19Э)-СО0Н Ш2-мет-асп-глу-фе(1)-про(2)...леи(126)...фе(190)-СООН ,фе(190)-СООН Ш^-мет-асп-глу-фе(t)-npo(2)...вал(126) NHj-мет-СА)...леи(126)...фе(190)-С00Н Ша-мет-(4)...вал(126)...фе(190)-СООН П р и м е р ы 22-32, В тех случаях, когда бычий соматотропин заменяют свиным соматотропином в процеду25 pax, указанных в примерах 10-20, по-' лучают практически те же результаты, поскольку бычий и свиной соматотропины подобны. П р и м е р 33. Готовят свиной со- 30 матотропин с N-концевым аланином (APS) путем экспрессии рекомбинантной ДНК. Светопреломляющие тела, содержащие APS, выделяют и солюбилизируют, складывают и окисляют в водном раст35 воре мочевины. Дальнейший процесс очистки такой же 9 как в примере 1 для очистки MBS. Композиции APS приготавливают в основном9 как описано в при-_ мере 5, с использованием смеси кун*« жутного масла (S0) и моностеарата алюминия AIMS при концентрации AIMS 2,5 или 5% в расчете на SO/AIMS. Содержание полипептида (APS) в композиции 10 или 20% соответственно. Приме45 няют каждую полученную композицию с содержанием APS 80 мг для инъекции в жир в дорсальной супраскулярной области кроссбредных боровов массой тела 68 - 77 кг в начале опыта. Две 50 инъекции осуществляют с 2-недельным интервалом, причем наблюдают среднее ежедневное повышение массы в течение 4 недель. Степень усвояемости кормов вычисляют путем деления среднего количества ежедневного приема корма на 55 среднее ежедневное повышение массы. При этом пониженное значение степени усвояемости кормовых средств указыва ет на улучшенный результат. Необработанные боровы служат контролем. Ре-, зультаты приведены в табл. 11. П р и м е р 34. Приготавливают APS по методу, описанному в примере 33, в носителе, содержащем 95% кунжутного масла и 5% AIMS, Прибавляют количество APS, достаточное для получения концентрации 39%. Эту смесь вводят в жир на дорсальной стороне шеи і кроссбредных боровов массой тела примерно 54-63 кг в начале опыта. Одной группе боровов вводят 30 мг APS каждые 7 дней, а другой - 60 мг APS каждые 14 дней. Опыт продолжают в течение 6 недель. В течение этого времени значение степени усвояемости кормовых средств у необработанной группы контрольных боровов 3,61, значение степени усвояемости у группы, получившей 60 мг через каждые 14 дней, 3,53, а у группы, получившей 30 мг через каждые 7 дней, 3,17. Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Композиция для стимуляции лактации У коров и повышения степени усвояемости кормов, содержащая соматотропин и растительное масло, о т л и ч а ю щ а я с я тем, что в качестве соматотропина используют бычий или свиной соматотропин при следующем соотношении, мас.%: Бычий или свиной соматотропин 10-4 2 Растительное масло 58-90 і Т а б л и ц а Опыт Способ **одд Удойность (МР) через время, дни 14 7 21 30 Ctrl*, МР, кг/день % Контроль С введением ZnMBS Контроль С введением ZnMBS Контроль (1) С введением ZnMBS (2) Сравнение Внутримышечно Внутримышечно МР, Ctrl, кг/день % МР, Ctrl, кг/день % МР, Ctrl, кг/день % 23,3 26,6 22,4 26,0 22,0 24,9 21,1 22,9 20,6 22,1 5,7 Подкожно 25,1 9,6 22,9 25,9 17,1 21,1 22,5 Подкожно Внутримышечно и подкожно 16,2 24,8 21,8 11,7 25,4 24,0 9,6 21,9 22,2 13,1 13,7 14,4 24,4 ,0001 0,0001 0,0004 9,6 20,9 11,4 22,6 (2) и (О уровни значимости 1 0,0187 *Ctrl характеризует процентное относительное улучшение к среднему контрольному значению. і . Ul vD Ul W UJ о 8, 1 1595330 19 20 л Количество дней после инъекции Т_а_б_ -И-А а 2 Средняя концентрация бычьего соматотропина в плазме, нг/мл, при введении внутримышечно подкожно Контроль I ZnMBS ZnMBS 6.7 6.5 7.8 7,1 7,5 8,1 0 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 Контроль 5,1 4,6 4,3 5,7 8,7 11,1 10,1 9,8 11,2 11,9 12,9 16,5 16,6 17,5 8,1 8,0 >,9 6,8 7,6 7,0 5.6 5,4 6,0 5,7 5,6 5.8 3,5 3,8 5,9 8,4 9,0 9,1 10,1 12,0 18,2 21,2 21,3 18,2 16,7 16,2 12,9 13,8 11,2 10,6 9,8 8,4 6,8 5,9 4,0 4,5 3,1 3,9 3,6 6,6 5,2 5,2 5,4 4,1 4,4 4,3 5,3 4,4 4,9 1,1 2,5 15,7 11,7 12,0 10,0 9,5 9,0 8,5 7,4 6,7 Т а б л и ц а 3 Группа Объем до- Масло • зы, мкл 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 200 200 130 100 200 200 130 100 200 200 130 100 200 200 130 100 Кунжут ^Кунжут Кунжут Кунжут Кунжут Кунжут Кунжут Кунжут Арахис Арахис Арахис Арахис Арахис Арахис Арахис Арахис Моностеа- ZnMBS*, рат алю% миния, % 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 Нет 20 Зі) 40 Нет 20 30 40 Нет 20 30 40 Нет 20 30 40 Отношение ZnMBS и моностеарата алюминия — 8,3 14,3 22,2 5,0 8,6 13,3 8,3 14,3 22,2 5,0 8,6 13,3 *По отношению к массе: масло + моностеарат алюминия 21 22* 1595330 Т а б л и ц а Д Группа Среднее значение концентрации бычьего соматотропина в плазме, нг/мл, ' • в день после инъекции 0 1 3 4 6 7 8 10 11 12 14 15 16 1 9 10 6 11 765 494 381 255 338 11 • 383 440 309 245 91 194 258 470 391 361 178 479 413 246 281 6 6 468 735 582 753 6 6 11 7 8 7 21 138 141 169 119 203 304 237 239 146 181 151 255 14 83 113 136 86 141 149 94 134 21 60 134 152 166 171 95 197 142 ?г\ 224 143 183 146 1Е.1 49 49 83 103 32 47 72 41 106 66 146 77 ?15 135 Т а б л и ц а 5 Группа Объем дозы, Масло Агент противогидратации мкл 17 18 19 20 Кунжутное -"Арахисовое -" 130 130 130 130 Монолаурат алюминия Монопальмитат алюминия Монолаурат алюминия Монопальмитат алюминия Г а б л и ц а 6 Группа Среднее значение концентрации бычьего соматотропика в плазме , нг/мл, в день после инъекции h „ і, 17 18 19 20 143 229 162 164 431 632 421 492 9 10 11 9 21 172 277 198 210 49 58 32 17 Т а б л и ц а 7 • Группа Объем дозы, Масло ZnMBS, Отноше % мкл • 21 30 33 28 35 100 Оливко- 40 ние ZnMBS и моностеарата алюминия 22,2 вое 22 130 Кукурузное 30 14,3 18 31 35 40 44 48 25 30 41 34 67 39 35 22 15 62 48 53 35 19 32 52 29 70 49 23 24 1595330 Т а б л и ц а Группа Среднее значение концентрации бычьего соматотропина в плазме, нг/мл, в день после инъек ции 25 21 22 7 7 996 1314 314 444 174 158 98 98 Т а б л и ц а 9 Группа Полипеп- Содержа- Масло * тид ние полипептида, % • 30 MBS 10 31 ZnMBS 10 32 MBS 10 33 ZnMBS 10 36 35 Моностеарат алюминия*, Арахи- совое Арахи- совое Арахи- 1 совое Арахи- 1 совое *По отношению к массе: масло + моностеарат алюминия, і Т а б л и ц Группа Среднее значение концентрации бычьего соматотропина в плазме, нг/мл, в день после инъекции 0 30 31 32 33 а 10 14 15 12 18 135') 1800 1200 620 I 3 11 375 310 250 350 145 240 123 330 • 75 200 64 280 50 40 35 175 Т а блица Показатель SO : All IS при содержании APS —, 95:5 97, 5:2 ,5 10 Степень усвояемости кормов 20 10 3,09 3,30 3,37 і Контроль 20 3,07 3,53 11 I 14 20 20 21 125 1595330 Редактор О.Юрковецкая Составитель И.Тареева Техред М.Ходанич Корректор М.Самборская Заказ ^340 Тираж 539 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, Ш 1 I '