Гетерологічний пептидильований глюкагон-1-подібний білок та його застосування для для виготовлення лікарського засобу для лікування пацієнтів, що страждають на ожиріння та/або інсулінонезалежний діабет

1. Гетерологічний пептидильований білок, до складу якого входить перший поліпептид, зшитий із другим поліпептидом, причому першим поліпептидом є сполука GLP-1, а другий поліпептид вибраний з-посеред: a) Fc-фрагмента імуноглобуліну; b) аналога Fc-фрагмента імуноглобуліну; та c) фрагментів Fc-фрагмента імуноглобуліну, при цьому С-кінець першого поліпептиду зшитий із N-кінцем другого поліпептиду, причому другий поліпептид збільшує період напіввиведення сполук GLP-1 із кров'яного русла і цей пептидильований білок має активність GLP-1. 2. Гетерологічний пептидильований білок за п. 1, причому С-кінець першого поліпептиду зшитий з N-кінцем другого поліпептиду за допомогою пептидного лінкера. 3. Гетерологічний пептидильований білок за п. 2, причому пептидний лінкер вибраний з-посеред: a) пептиду, збагаченого гліцином; b) пептиду, що має послідовність [Gly-Gly-Gly-GlySer]n, де n - 1, 2, 3, 4, 5 або 6; та 2 (19) 1 3 81897 4 Xaa у положенні 24 - Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 25 - Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 26 - Lys, Arg, Gln, Glu, Asp або His; Xaa у положенні 27 - Leu, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 30 - Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 31 - Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 32 - Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 33 - Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 34 - Asn, Lys, Arg, Glu, Asp або His; Xaa у положенні 35 - Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 36 - Gly, Arg, Lys, Glu, Asp або His; Xaa у положенні 37 - Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, або Lys, або видалена; Xaa у положенні 38 - Ser, Arg, Lys, Glu, Asp або His, або видалена; Xaa у положенні 39 - Ser, Arg, Lys, Glu, Asp або His, або видалена; Xaa у положенні 40 - Gly, Asp, Glu або Lys, або видалена; Xaa у положенні 41 - Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp або Lys, або видалена; Xaa у положенні 42 - Ser, Pro, Lys, Glu, або Asp, або видалена; Xaa у положенні 43 - Ser, Pro, Glu, Asp або Lys, або видалена; Xaa у положенні 44 - Gly, Pro, Glu, Asp або Lys, або видалена; та Xaa у положенні 45 - Ala, Ser, Val, Glu, Asp або Lys, або видалена, за умови, що у разі, якщо амінокислота у положенні 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 або 44 видалена, кожна з амінокислот, наступних після цієї видаленої амінокислоти, також видалена. 5. Гетерологічний пептидильований білок за будьяким із попередніх пунктів, причому сполука GLP-1 має не більше шeсти амінокислот, відмінних від відповідних амінокислот у GLP-1(7-37)OH, GLP1(7-36)OH або екзендину-4. 6. Гетерологічний пептидильований білок за п. 5, причому сполука GLP-1 має не більше п'яти амінокислот, відмінних від відповідних амінокислот у GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH або екзендину-4. 7. Гетерологічний пептидильований білок за п. 6, причому сполука GLP-1 має не більше чотирьох амінокислот, відмінних від відповідних амінокислот у GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH або екзендину-4. 8. Гетерологічний пептидильований білок за п. 7, причому сполука GLP-1 має не більше трьох амінокислот, відмінних від відповідних амінокислот у GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH або екзендину-4. 9. Гетерологічний пептидильований білок за п. 8, причому сполука GLP-1 має не більше двох амінокислот, відмінних від відповідних амінокислот у GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH або екзендину-4. 10. Гетерологічний пептидильований білок за будь-яким із пп. 5-9, причому Хаа у положенні 8 є гліцин або валін. 11. Гетерологічний пептидильований білок за будь-яким із пп. 1-10 для застосування при лікуванні інсулінонезалежного цукрового діабету або ожиріння. 12. Застосування гетерологічного пептидильованого білка за будь-яким із пп. 1-10 для виготовлення лікарського засобу для лікування пацієнтів, що страждають на інсулінонезалежний цукровий діабет. 13. Застосування гетерологічного пептидильованого білка за будь-яким із пп. 1-10 для виготовлення лікарського засобу для лікування пацієнтів, що страждають на ожиріння. 14. Фармацевтична композиція для лікування пацієнтів, що страждають на інсулінонезалежний цукровий діабет, яка містить гетерологічний пептидильований білок за будь-яким із пп. 1-10. 15. Фармацевтична композиція для лікування пацієнтів, що страждають на ожиріння, яка містить гетерологічний пептидильований білок за будьяким із пп. 1-10. Цей винахід має відношення до глюкагоноподібних пептидів, у тому числі до їхніх аналогів та похідних, зши тих із білками, які мають ефект подовження періоду напіввиведення пептидів in vivo. Ці пептидильовані білки можуть застосовуватись для лікування інсулінонезалежного цукрового діабету, а також цілого ряду інших станів. Глюкагон-1-подібний пептид (GLP-1) є пептидом, який складається з 37 амінокислот і секретується L-клітинами кишечнику у відповідь на споживання їжі. Було встановлено, що глюкагон-1подібний пептид стимулює секрецію інсуліну (інсулінотропна дія), що спричинює засвоєння глюкози клітинами та зниження рівнів глюкози у сироватці [дивись, наприклад, Мойсов С (Mojsov S.), (1992), Int. J. Peptide Protein Research, 40: 333343]. GLP-1, однак, має низьку активність. Шляхом послідовного ендогенного розщеплення між шостим та сьомим положенням одержують більш сильнодіючий біологічно активний GLP-1(7-37)OH пептид. Відомі численні аналоги та похідні GLP-1, на які у цьому описі посилаються як на "сполуки GLP-1". До числа цих аналогів GLP-1 належать екзендини, які представляють собою пептиди, знайдені у отр уті ящірки-отрутозуба (Heloderma suspectum). Екзендини мають гомологію послідовностей із нативним GLP-1 і можуть зв'язувати рецептор GLP-1 та ініціювати послідовність реакцій трансдукції сигналу, яка несе відповідальність за численні активності, які приписують GLP-1(7-37)OH. 5 81897 Сполуки GLP-1 мають різноманітні фізіологічно значущі активності. Було показано, наприклад, що GLP-1 стимулює виділення інсуліну, знижує секрецію глюкагону, пригнічує випорожнення шлунка та підсилює утилізацію глюкози [Наук М.А. (Nauck M.A.) та інші, (1993) Diabetologia 36: 741-744; Гутник М. (Gutniak M.) та інші, (1992) New England J. of Med. 326: 1316-1322; Наук М.А. (Nauck M.A.) та інші, (1993) J. Clin. Invest. 91: 301-307]. GLP-1 демонструє найбільший потенціал як лікарський засіб для лікування інсулінонезалежного цукрового діабету (NIDDM). Комерційно доступним є цілий ряд пероральних лікарських засобів, призначених для лікування несприйнятливості до інсуліну, пов'язаної з інсулінононезалежним цукровим діабетом. Відповідно до розвитку захворювання пацієнти, однак, повинні переходити на методи лікування, які стимулюють виділення інсуліну і, врешті-решт, вдаватись до методів лікування, які включають впорскування інсуліну. Сучасні лікарські засоби, які стимулюють виділення інсуліну, можуть, однак, також викликати гіпоглікемію, як і у разі реального введення інсуліну. Активність GLP-1, однак, регулюється рівнями глюкози у крові. У разі, коли ці рівні падають до певного порогового значення, GLP-1 втрачає активність. Таким чином, не існує ризику гіпоглікемії, пов'язаної з лікуванням, яке включає застосування GLP-1. Однак придатність методів лікування із застосуванням GLP-1 пептидів обмежувалась їх швидким виведенням з організму та коротким періодом напіввиведення. Наприклад, період напіввиведення GLP-1(7-37) із кров'яного русла становить усього 3-5хв. Тривалість дії аміду GLP1(7-36), у разі його підшкірного введення, становить приблизно 50хв. Період напіввиведення навіть аналогів та похідних, стійких до ендопротеазного розщеплення, не є тривалим у такій мірі, яка була б достатньою для запобігання повторного введення впродовж 24-годинного періоду часу. Швидке виведення лікарського засобу є незручним у випадках необхідності підтримування високого рівня згаданого засобу у крові впродовж тривалого періоду часу, оскільки у цьому разі буде виникати потреба у його повторному введенні. Крім того, сполука тривалої дії є особливо важливою для пацієнтів, що страждають на діабет, попередня схема лікування яких включала прийняття лише пероральних лікарських засобів. Такі пацієнти часто переживають надзвичайно тяжкий час переходу на схему лікування, яка включає численні впорскування лікарського засобу. Цей винахід долає проблеми, пов'язані з доставкою сполуки, яка має короткий період напіввиведення із кров'яного русла. Сполуки за цим винаходом включають сполуки GLP-1, зшиті з іншим білком із тривалим періодом напіввиведення із кровообігу, наприклад, із Fcфрагментом імуноглобуліну або альбуміном. Взагалі, невеликі терапевтичні пептиди є важким об'єктом для маніпулювання, оскільки навіть незначні зміни їхньої структури можуть 6 негативно вплинути на стабільність та/або біологічну активність. Це особливо стосується сполук GLP-1, які розробляються на цей час. Наприклад, GLP-1(7-37)OH має схильність до конформаційних змін із переважно альфаспіральної структури на переважно бетаскладчасту конформацію. Наслідком згаданої бета-складчастої конформації є агрегований матеріал, який, як гадають, є позбавленим активності. Подив, таким чином, викликала можливість розробки біологічно активних білків, пептидильованих GLP-1, із збільшеним періодом напіввиведення. Це було особливо неочікуваним, приймаючи до уваги трудно щі роботи із самим GLP-1(7-37)OH і великий розмір лігованого партнера, порівняно з невеликим пришитим GLP-1 пептидом. До сполук за цим винаходом належать гетерологічні пептидильовані білки, які мають у своєму складі перший поліпептид із N-кінцем та Скінцем, зшитий із другим поліпептидом із N-кінцем та С-кінцем, де першим поліпептидом є сполука GLP-1, а другий поліпептид вибирають із групи, яка включає a) людський альбумін; b) аналоги людського альбуміну; та c) фрагменти людського альбуміну, та де С-кінець першого поліпептиду зшитий з N-кінцем другого поліпептиду. Сполуки за цим винаходом включають також гетерологічний пептидильований білок, який містить перший поліпептид із N-кінцем та С-кінцем, зшитий із другим поліпептидом із N-кінцем та Скінцем, де першим поліпептидом є сполука GLP-1, а другий поліпептид вибирають із групи, яка включає a) людський альбумін; b) аналоги людського альбуміну; та c) фрагменти людського альбуміну, та де С-кінець першого поліпептиду зшивається з N-кінцем другого поліпептиду за допомогою пептидного лінкера. Пептидний лінкер за варіантом, якому віддається перевага, вибирають із групи, яка включає: a) пептид, збагачений гліцином; b) пептид, що має послідовність [Gly-Gl y-Gl yGly-Ser]n , де n - 1, 2, 3, 4, 5 або 6; та c) пептид, що має послідовність [Gly-Gl y-Gl yGly-Ser]3 . Додаткові сполуки за цим винаходом містять гетерологічний пептидильований білок, який має у своєму складі перший поліпептид із N-кінцем та Скінцем, зшитий із другим поліпептидом із N-кінцем та С-кінцем, де першим поліпептидом є сполука GLP-1, а другий поліпептид вибирають із групи, яка включає a) Fc-фрагмент імуноглобуліну; b) аналог Fc-фрагмента імуноглобуліну; та c) фрагменти Fc-фрагмента імуноглобуліну, та де С-кінець першого поліпептиду зшивається з N-кінцем другого поліпептиду. Сполука GLP-1 може зшиватись із другим поліпептидом за допомогою пептидного лінкера. Пептидний лінкер за варіантом, якому віддається перевага, вибирають із групи, яка включає: 7 81897 a) пептид, збагачений гліцином; b) пептид, що має послідовність [Gly-Gl y-Gl yGly-Ser]n , де n - 1, 2, 3, 4, 5 або 6; та c) пептид, що має послідовність [Gly-Gl y-Gl yGly-Ser]3 . За загальноприйнятим варіантом, якому віддається перевага, сполука GLP-1, яка є складовою частиною гетерологічного пептидильованого білка, має не більше 6 амінокислот, які відрізняються від відповідної амінокислоти GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH або екзендину-4. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, сполука GLP-1 має не більше 5 амінокислот, які відрізняються від відповідної амінокислоти GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH або екзендину-4. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, сполука GLP-1 має не більше 4, 3 або 2 амінокислот, які відрізняються від відповідної амінокислоти GLP-1(7-37)OH, GLP-1(736)OH або екзендину-4. За варіантом, якому віддається перевага, сполука GLP-1; яка є складовою частиною гетерологічного пептидильованого білка, має гліцин або валін у положенні 8. Цей винахід включає також полінуклеотиди, що кодують гетерологічний пептидильований білок, опис якого наведено, вектори, які мають у своєму складі ці полінуклеотиди, та клітини-хазяї, трансфіковані або трансформовані векторами, опис яких наведено. Включено також спосіб продукування гетерологічного пептидильованого білка, який включає етапи транскрипції та трансляції полшуклеотиду, опис якого наведено, за умов, де гетерологічний пептидильований білок експресується у кількостях, які піддаються виявленню. Цей винахід включає також спосіб нормалізації рівнів глюкози у крові ссавця, який потребує цього, що включає введення терапевтично ефективної кількості гетерологічного пептидильованого білка, опис якого наведено. Винахід додатково ілюструється з посиланням на наведені далі фігури: Фіг.1: Амінокислотна послідовність Fcфрагмента IgG1, що охоплює шарнірну ділянку та константні ділянки СН2, СН3 важкого ланцюга імуноглобуліну. Фіг.2: Амінокислотна послідовність людського сироваткового альбуміну. Фіг.3: А. Електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (ДСНПААГЕ) та імуноблот того ж самого гелю, що ілюструє молекулярну масу IgG1-Fc та GLP-1-Fc пептидильованих білків (Стовпчик 1, стандарти молекулярної маси; Стовпчик 2, очищений Fcфрагмент; Стовпчик 3: псевдотрансфіковані живильні середовища; Стовпчик 4: Val8-GLP-1-Fc; Стовпчик 5, Екзендин-4-Fc). В. ДСН-ПААГЕ та імуноблот того ж самого гелю, що ілюструє молекулярну масу HSA та GLP-1-HSA пептидильованих білків (Стовпчик 1, стандарти молекулярної маси; Стовпчик 2, очищений HSA; Стовпчик 3: псевдотрансфіковані живильні середовища; Стовпчик 4: Val8-GLP-1-HSA; Стовпчик 5, Val8-GLP-1-[Gly-Gl y-Gl y-Gl y-Serb-HSA; 8 Стовпчик 6, Екзендин-4-HSA; Стовпчик 7, Екзендин-4-[Gly-Gly-Gly-Gly-Serb-HSA). Фіг.4: ДСН-ПААГЕ гель пептидильованих білків з очищеним Fc, альбуміном та GLP-1 (Стовпчик 1, стандарти молекулярної маси; Стовпчик 2, очищений Fc-фрагмент; Стовпчик 3: Val8-GLP-1Fc; Стовпчик 4, Екзендин-4-Fc; Стовпчик 5, стандарт молекулярної маси; Стовпчик 6, Val8GLP-1-HSA; Стовпчик 7, Екзендин-4-HSA; Стовпчик 8, Екзендин-4-fGly-Gly-Gl y-Gl y-Ser]3HSA). Фіг.5: Вектор експресії для клонування, який має у своєму складі Fc-фрагмент, ілюстрований Фіг.1. Фіг.6: Вектор експресії для клонування, який має у своєму складі послідовність альбуміну, ілюстровану Фіг.2. Фіг.7: Вектор експресії для клонування, який має у своєму складі ДНК, що кодує 15амінокислотний лінкер, зшитий у межах рамки зчитування, та 5'-кінець послідовності альбуміну, ілюстрованої Фіг.2. Фіг.8: In vitro дозозалежна активність GLP-1 пептидильованих білків. Фіг.9: Фармакокінетика GLP-1 Fc та HSA пептидильованих білків. Фіг.10. Глкжодинамічна реакція на екзендин-Fc двох нормальних голодуючи х собак. Фіг.11: Інсулінотропна реакція на екзендин-Fc двох нормальних голодуючи х собак. Фіг.12: Послідовність ДНК, що кодує Fcфрагмент людського IgGl. Фіг.13: Послідовність ДНК, що кодує людський альбуміновий білок. Гетерологічні пептидильовані білки за цим винаходом мають у своєму складі сполуку GLP-1, зшиту з людським альбуміном, аналогом людського альбуміну, фрагментом людського альбуміну, Fc-фрагментом імуноглобуліну, аналогом Fc-фрагмента імуноглобуліну або фрагментом Fc-фрагмента імуноглобуліну. Скінець сполуки GLP-1 може зшиватись із N-кінцем альбуміну або Fc білка безпосередньо або за допомогою пептидного лінкера. Ці гетерологічні пептидильовані білки є біологічно активними і мають збільшений період напіввиведення, порівняно з нативним GLP-1. За варіантом, якому віддається перевага, сполуки GLP-1, які складають частину гетерологічного пептидильованого білка, включають поліпептиди, які мають у своєму складі від приблизно двадцяти п'яти до приблизно тридцяти дев'яти природних або неприродних амінокислот, які мають достатню гомологію з нативним GLP-1(7-37)OH на такому рівні, що демонструють інсулінотропну активність шляхом зв'язування рецептора GLP-1 на β-клітинах підшлункової залози. Сполука GLP-1, як правило, представляє собою поліпептид, що має амінокислотну послідовність GLP-1(7-37)OH, аналога GLP-1(7-37)OH, фрагмента GLP-1(737)OH або фрагмента аналога GLP-1(7-37)ОН. GLP-1(7-37)OH має амінокислотну послідовність №1: 9 81897 За традицією у цій галузі, аміно-кінець GLP1(7-37)OH позначається номером залишку 7, а карбоксильний кінець номером 37. Інші амінокислоти у поліпептиді нумеруються послідовно, як показано на послідовності №1. Наприклад, положенням 12 є фенілаланін, а положенням 22 є гліцин. Сполуки GLP-1 включають також "фрагменти GLP-1". Фрагментом GLP-1 є поліпептид, одержаний після усічення однієї або декількох амінокислот із N-кінпя та/або С-кінця GLP-1(737)OH або його аналога чи похідної. Номенклатура, використана для описання GLP1(7-37)OH, є придатною також для фрагментів GLP-1. Наприклад, GLP-1(9-36)ОН означає фрагмент GLP-1, який одержали шляхом усічення двох амінокислот із N-кінця та однієї амінокислоти із С-кінця. Амінокислоти у фрагменті позначаються тим же самим числом, що і відповідні амінокислоти у GLP-1(7-37)OH. Наприклад, N-кінцева глутамінова кислота у GLP-1(9-36)OH знаходиться у положенні 9; положення 12 зайняте фенілаланіном; і положення 22 зайняте гліцином, як у GLP-1(7-37)OH. Для GLP-1(7-36)OH, гліцин у положенні 37 GLP-1(7-37)OH було видалено. Сполуки GLP-1 включають також поліпептиди, у яких одна або декілька амінокислот були додані до N-кінця та/або С-кінця GLP-1(7-37)OH або його фрагментів чи аналогів. За варіантом, якому віддається перевага, сполуки GLP-1 цього типу мають до приблизно тридцяти дев'яти амінокислот. Амінокислоти "подовженої" сполуки GLP-1 позначаються тим самим числом, що і відповідна амінокислота у GLP-1(7-37)OH. Наприклад, N-кінцева амінокислота сполуки GLP1, яка була одержана шляхом додання двох амінокислот до N-кінця GLP-1(7-37)OH, знаходиться у положенні 5; а С-кінцева амінокислота сполуки GLP-1, яка була одержана шляхом додання однієї амінокислоти до С-кінця GLP-1(7-37)OH, знаходиться у положенні 38. Таким чином, в обох згаданих "подовжених" сполуках GLP-1, як і у GLP-1(7-37)OH, положення 12 зайняте фенілаланіном, а положення 22 зайняте гліцином. Амінокислоти 1-6 подовженої сполуки GLP-1 є, за варіантом, якому віддається перевага, тими самими або консервативною заміною амінокислоти у відповідному положенні GLP-1(7-37)OH. Амінокислоти 38-45 подовженої сполуки GLP-1 за варіантом, якому віддається перевага, є тими самими або консервативною заміною амінокислоти у відповідному положенні глюкагону або екзендину-4. Сполуки GLP-1 за цим винаходом включають "аналоги GLP-1". Аналог GLP-1 має достатню гомологію із GLP-1(7-37)OH або фрагментом GLP 10 1(7-37)OH, завдяки чому аналог має інсулінотропну активність. За варіантом, якому віддається перевага, аналог GLP-1 має амінокислотну послідовність GLP-1(7-37)OH або його фрагмента, модифіковану таким чином, що однією, двома, трьома, чотирма або п'ятьма амінокислотами відрізняється від амінокислоти у відповідному положенні GLP-1(7-37)OH або фрагмента GLP-1(7-37)OH. У номенклатурі, яка використовується у цьому описі для позначення сполук GLP-1, замінна амінокислота та її положення вказуються перед вихідною структурою. Наприклад, Glu22-GLP-1(7-37)OH означає сполуку GLP-1, у якій гліцин, який звичайно знаходиться у положенні 22 GLP-1(737)OH, був замінений глутаміновою кислотою; Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH означає сполуку GLP-1, у якій аланін, який звичайно знаходиться у положенні 8 і гліцин, який звичайно знаходиться у положенні 22 GLP-1(7-37)OH, були замінені валіном та глутаміновою кислотою, відповідно. Сполуки GLP-1 за цим винаходом включають також "похідні GLP-1". Похідна GLP-1 визначається як молекула, яка має амінокислотну послідовність GLP-1 або аналога GLP-1, але додатково має хімічну модифікацію однієї або декількох своїх амінокислотних бічних груп, атомів α-вуглецю, кінцевої аміногрупи або кінцевої карбокислотної групи. Хімічна модифікація включає (але не обмежується цим) додання хімічних складових, утворення нових зв'язків та видалення хімічних складових. До модифікацій на амінокислотних бічних гр упах належить, без обмеження, ацилювання ε-аміногруп лізину, Nалкілування аргініну, гістидину або лізину, алкілування глутамінових або аспарагінових карбокислотних груп та деамідування глутаміну або аспарагіну. Модифікації кінцевої аміногрупи включають, без обмеження, модифікації дезаміногрупи, N-нижчої алкільної групи, N-динижчої алкільної групи та N-ацильної групи. Модифікації кінцевої карбоксикислотної групи включають, без обмеження, модифікації амідної групи, нижчої алкіламідної групи, діалкіламідної групи та нижчої алкілскладноефірної групи. Нижчим алкілом є С1-С4 алкіл. Крім того, одна або декілька бічних гр уп або кінцевих гр уп можуть захищатись захисними групами, відомими пересічному фа хівцю з білкової хімії, α-вуглець амінокислоти може піддаватись моно- або диметилуванню. Будь-яка сполука GLP-1 може бути складовою частиною гетерологічних пептидильованих білків за цим винаходом доти, доки сама сполука GLP-1 є здатною до зв'язування та індукування передачі сигналу через рецептор GLP-1. Зв'язування рецептора GLP-1 та трансдукція сигналу можуть визначатись за допомогою методів аналізу in vitro, таких, наприклад, як описані [у ЕР 619,322 та патенті США №5,120,712], відповідно. У цій галузі відомі численні активні фрагменти, аналоги та похідні GLP-1, і будь-який із цих аналогів та похідних може також бути складовою частиною гетерологічних пептидильованих білків за цим винаходом. У цьому описі наведені деякі 11 81897 приклади нових аналогів GLP-1, а також аналоги та похідні GLP-1, відомі у цій галузі. Деякими аналогами GLP-1 та фрагментами GLP-1, відомими у цій галузі, є, наприклад, GLP1(7-34) та GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), Gln9-GLP-1(737), D-Gln9-GLP-1(7-37), Thr16-Lys 18-GLP-1(7-37) та Lys 18-GLP-1(7-37). Аналоги GLP-1, наприклад, GLP-1(7-34) та GLP-1(7-35), розкриті у патенті США №5,118,666. Відомі також форми GLP-1, які були піддані біологічній обробці і які мають інсулінотропні властивості, наприклад, GLP-1(736). Інші відомі біологічно активні сполуки GLP-1 розкриті у [патенті США №5,977,071 на ім'я Гоффмана (Hoffmann) та інших; патенті США №5,545,618 на ім'я Баклі (Buckley) та інших, а також у роботі Адельхорста (Adelhorst) та інших, J. Вiol. Chem. 269: 6275 (1994)]. Група аналогів GLP-1, яким віддається перевага, включає аналоги GLP-1 формули І (Послідовність №2) де: Хаа у положенні 8 - Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lle, Val, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 9 - Glu, Asp, або Lys; Хаа у положенні 11 - Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, lle, Val, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 14 - Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lle, Val, Glu, Asp або Lys; Хаа у положенні 16 - Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lle, Tyr, Glu, Asp, Trp або Lys; Xaa у положенні 17 - Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lle, Val, Glu, Asp, або Lys; Xaa у положенні 18 - Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lle, Val, Glu, Asp, Trp, Туr, або L ys; Xaa у положенні 19 - Туr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gin або Lys; Xaa у положенні 20 - Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, lle, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Туr або Lys; Xaa у положенні 21 - Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 22 - Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lle, Val, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 23 - Gln, Asn, Arg, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 24 - Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lle, Val, Arg, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 25 - Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lle, Val, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 26 - Lys, Arg, Gln, Glu, Asp або His; Xaa у положенні 27 - Leu, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 30 - Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lle, Val, Glu, Asp або Lys; 12 Xaa у положенні 31 - Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 32 - Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, lle, Val, Glu, Asp або Lys; Хаа у положенні 33 - Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lle, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 34 - Asn, Lys, Arg, Glu, Asp або His; Хаа у положенні 35 - Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lle, Val, Glu, Asp або Lys; Xaa у положенні 36 - Gly, Arg, L ys, Glu, Asp або His; Хаа у положенні 37 - Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lle, Val, Glu, Asp, або Lys, або видалена; Xaa у положенні 38 - Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, або His, або видалена; Xaa у положенні 39 - Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, або His, або видалена; Xaa у положенні 40 - Gly, Asp, Glu, або Lys, або видалена; Xaa у положенні 41 - Ala, Phe, Trp, Туr, Glu, Asp, або Lys, або видалена; Xaa у положенні 42 - Ser, Pro, Lys, Glu, або Asp, або видалена; Xaa у положенні 43 - Ser, Pro, Glu, Asp, або Lys, або видалена; Xaa у положенні 44 - Gly, Pro, Glu, Asp, або Lys, або видалена; та Xaa у положенні 45 - Ala, Ser, Val, Glu, Asp, або Lys, або видалена; за умови, що у разі, коли амінокислота у положенні 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 або 44 видалена, тоді кожна амінокислота у прямому напрямку від цієї кислоти також видалена. За варіантом, якому віддається перевага, сполука GLP-1 формули І має у своєму складі менше шести амінокислот, які відрізняються від відповідної амінокислоти у GLP-1(7-37)OH або екзендину-4. За варіантом, якому віддається більша перевага, менше п'яти амінокислот відрізняються від відповідної амінокислоти у GLP1(7-37)OH або екзендину-4. За варіантом, - якому віддається ще більша перевага, менше чотирьох амінокислот відрізняються від відповідної амінокислоти у GLP-1(7-37)OH або екзендину-4. Сполуки GLP-1 за цим винаходом включають похідні сполуки формули І, наприклад, її С-1-6складний ефір або амід, або С-1-6-алкіламід, або С-1-6-діалкіламід. У публікації [WO 99/43706], яку у повному обсязі включено до цього опису як посилання, наведено опис похідних сполук GLP-1 формули І. Сполуки формули І, дериватизовані, як описано у [WO 99/43706], та недериватизовані, входять до обсягу цього винаходу. Інша гр упа сполук GLP-1, яким віддається перевага, включає аналоги GLP-1 формули II (Послідовність №3): 13 81897 де: Хаа у положенні 7: L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, βгідроксигістидин, гомогістидин, αфторметилгістидин або ос-метилгістидин; Хаа у положенні 8 - Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser або Thr; Хаа у положенні 9 - Thr, Ser, Arg, Lys, Trp, Phe, Туr, Glu, або His; Хаа у положенні 11 - Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, L ys або His; Хаа у положенні 12 - His, Trp, Phe або Тут; Хаа у положенні 16 - Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Туr, Glu або Ala; Хаа у положенні 18 - His, Pro, Asp, Glu, Arg, Ser, Ala або Lys; Хаа у положенні 22 - Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg або C ys; Хаа у положенні 23 - His, Asp, Lys, Glu, Gin або Arg; Хаа у положенні 24 - Glu, Arg, Ala або Lys; Хаа у положенні 26 - Trp, Туг, Phe, Asp, Lys, Glu або His; Хаа у положенні 27 - Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg або Lys; Хаа у положенні 30 - Ala, Glu, Asp, Ser або His; Хаа у положенні 31 - Asp, Glu, Ser, Thr, Arg, Trp або Lys; Хаа у положенні 33 - Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly або Glu; Хаа у положенні 34 - Glu, Lys або Asp; Хаа у положенні 35 - Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His або Glu; Хаа у положенні 36 - Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu або His; R у положенні 37 - Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro або видалена. Інша гр упа сполук GLP-1, яким віддається перевага, включає аналоги GLP-1 формули III (Послідовність №4): де: Хаа у положенні 7: L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, βгідроксигістидин, гомогістидин, αфторметилгістидин або а-метилгістидин; 14 Xaa у положенні 8 - Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser або Thr; Хаа у положенні 11 - Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, L ys або His; Xaa у положенні 12 - His, Tip, Phe або Тут; Xaa у положенні 16 - Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu або Ala; Xaa у положенні 22 - Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg або C ys; Xaa у положенні 23 - His, Asp, Lys, Glu або Gin; Xaa у положенні 24 - Glu, His, Ala або Lys; Xaa у положенні 25 - Asp, Lys, Glu або His; Xaa у положенні 27 - Ala, Glu, His, Phe, Туr, Trp, Arg або Lys; Xaa у положенні 30 - Ala, Glu, Asp, Ser або His; Xaa у положенні 33 - Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly або Glu; Xaa у положенні 34 - Glu, Lys або Asp; Xaa у положенні 35 - Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His або Glu; Xaa у положенні 36 - Arg, Glu або His; R у положенні 37 - Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro або видалена. Інша гр упа сполук GLP-1, яким віддається перевага, включає аналоги GLP-1 формули IV (Послідовність №5): де: Хаа у положенні 7: L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, βгідроксигістидин, гомогістидин, αфторметилгістидин або а-метилгістидин; Xaa у положенні 8 - Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser або Thr; Хаа у положенні 12 - His, Trp, Phe або Туr; Xaa у положенні 16 - Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu або Ala; Xaa у положенні 22 - Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg або C ys; Xaa у положенні 23 - His, Asp, Lys, Glu або Gin; Xaa у положенні 26 - Asp, Lys, Glu або His; Xaa у положенні 30 - Ala, Glu, Asp, Ser або His; Xaa у положенні 35 - Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His або Glu; R у положенні 37 - Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro або видалена. Інша гр упа сполук GLP-1, яким віддається перевага, включає аналоги GLP-1 формули V (Послідовність №6): 15 81897 де: Хаа у положенні 7: L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, βгідроксигістидин, гомогістидин, αфторметилгістидин або α-метилгістидин; Хаа у положенні 8 - Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser або Thr; Xaa у положенні 22 - Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg або C ys; Хаа у положенні 23 - His, Asp, Lys, Glu або Gin; Xaa у положенні 24 - Ala, Gly, His, Phe, Туг, Tip, Arg або Lys; Xaa у положенні 30 - Ala, Glu, Asp, Ser або His; R у положенні 37 - Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Туr, Phe, His, Gly, Gly-Pro або видалена. Сполуки GLP-1, яким віддається перевага, формул І, II, III, IV та V включають аналоги GLP-1 або фрагменти аналогів GLP-1, де аналоги або фрагменти мають у своєму складі у положенні 8 іншу, ніж аланін, амінокислоту (аналоги положення 8). За варіантом, якому віддається перевага, ці аналоги положення 8 мають у своєму складі одну або декілька додаткових замін у положеннях 9, 11, 12, 16, 18, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 31, 33, 34, 35, 36 та 37, порівняно з відповідною амінокислотою нативного GLP-1(7-37)OH. За варіантом, якому віддається перевага, ці аналоги також мають 6 або менше замін, порівняно з відповідними амінокислотами нативного GLP-1(7-37)OH або GLP-1(7-36)OH. Аналоги, яким віддається більша перевага, мають 5 або менше замін, порівняно з відповідними амінокислотами нативного GLP-1(737)OH або GLP-1(7-36)OH, або мають 4 або менше замін, порівняно з відповідними амінокислотами нативного GLP-1(7-37)OH або GLP-1(7-36)OH. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, ці аналоги мають 3 або менше замін, порівняно з відповідними амінокислотами нативного GLP-1(7-37)OH або GLP-1(7-36)OH. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, ці аналоги мають 2 або менше замін, порівняно з відповідними амінокислотами нативного GLP-1(7-37)OH. Було встановлено, що сполуки формул II, III, IV та V мають зменшену схильність до агрегування та утворення нерозчинних форм. Це також важливо у складі пептидильованого білка, де відносно невеликий GLP-1 пептид повинен підтримувати активну конформацію, незважаючи на літування до набагато більшого білка. Сполуками GLP-1, яким віддається перевага, формул II, III, IV та V, які включаються пептидильованими білками за цим винаходом, є аналоги GLP-1 або фрагменти аналогів GLP-1, де гліцин у положенні 22 і за варіантом, якому віддається перевага, аланін у положенні 8 були замінені іншою амінокислотою. 16 У разі, коли положення 22 займає аспарагінова кислота, глутамінова кислота, аргінін або лізин, положення 8 за варіантом, якому віддається перевага, займає гліцин, валін, лейцин, ізолейцин, серин, треонін чи метіонін або за варіантом, якому віддається більша перевага, валін або гліцин. У разі, коли положення 22 займає сульфокислота, наприклад, цистеїнова кислота, положення 8 за варіантом, якому віддається перевага, займає гліцин, валін, лейцин, ізолейцин, серин, треонін або метіонін та за варіантом, якому віддається більша перевага, валін або гліцин. Інші сполуки GLP-1, яким віддається перевага, включають аналоги GLP-1 формули IV (Послідовність №5), де згадані аналоги мають послідовність GLP-1(7-37)OH, за виключенням того, що амінокислотою у положенні 8 за варіантом, якому віддається перевага, є гліцин, валін, лейцин, ізолейцин, серин, треонін або метіонін та за варіантом, якому віддається більша перевага, - валін або гліцин, а позицію 30 займає глутамінова кислота, аспарагінова кислота, серин або гістидин, та за варіантом, якому віддається більша перевага, глутамінова кислота. Інші сполуки GLP-1, яким віддається перевага, включають аналоги GLP-1 формули IV (Послідовність №5), де згадані аналоги мають послідовність GLP-1(7-37)OH, за виключенням того, що амінокислотою у положенні 8 за варіантом, якому віддається перевага, є гліцин, валін, лейцин, ізолейцин, серин, треонін або метіонін, та за варіантом, якому віддається більша перевага, - валін або гліцин, а позицію 37 займає гістидин, лізин, аргінін, треонін, серин, глутамінова кислота, аспарагінова кислота, триптофан, тирозин, фенілаланін, та за варіантом, якому віддається більша перевага, гістидин. Інші сполуки GLP-1, яким віддається перевага, включають аналоги GLP-1 формули IV (Послідовність №5), де згадані аналоги мають послідовність GLP-1(7-37)OH, за виключенням того, що амінокислотою у положенні 8 за варіантом, якому віддається перевага, є гліцин, валін, лейцин, ізолейцин, серин, треонін або метіонін, та за варіантом, якому віддається більша перевага, валін або гліцин, а позицію 22 займає глутамінова кислота, лізин, аспарагінова кислота або аргінін, та за варіантом, якому віддається більша перевага, глутамінова кислота або лізин, а позицію 23 займає лізин, аргінін, глутамінова кислота, аспарагінова кислота та гістидин, і за варіантом, якому віддається більша перевага, лізин або глутамінова кислота. Інші сполуки GLP-1, яким віддається перевага, включають аналоги GLP-1 формули V (Послідовність №6), де згадані аналоги мають послідовність GLP-1(7-37)OH, за виключенням того, що амінокислотою у положенні 8 за варіантом, якому віддається перевага, є гліцин, валін, лейцин, ізолейцин, серин, треонін або метіонін, та за варіантом, якому віддається більша перевага, валін або гліцин, а позицію 22 займає глутамінова кислота, лізин, аспарагінова кислота або аргінін, та за варіантом, якому віддається більша перевага, глутамінова кислота або лізин, а 17 81897 позицію 27 займає аланін, лізин, аргінін, триптофан, тирозин, фенілаланін або гістидин, і за варіантом, якому віддається більша перевага, аланін. Інші сполуки GLP-1, яким віддається перевага, включають аналоги GLP-1 формули II, де згадані аналоги мають послідовність GLP-1(7-37)OH, за виключенням того, що амінокислота у положенні 8 та одна, дві або три амінокислоти, вибрані із групи, яка включає положення 9, положення 11, положення 12, положення 16, положення 18, положення 22, положення 23, положення 24, положення 26, положення 27, положення 30, положення 31, положення 33, положення 34, положення 35, положення 36 та положення 37, відрізняються від амінокислоти у відповідному положенні нативного GLP-1(7-37)OH. Інші сполуки GLP-1 формули II, яким віддається перевага, включають: Val8-GLP-1(737)OH, Gly8-GLP-1(7-37)OH, Glu 22-GLP-1(7-37)OH, Asp22-GLP-1(7-37)OH, Arg 22-GLP-1(7-37)OH, Lys 22GLP-1(7-37)OH, Cys 22-GLP-1(7-37)OH, Val 8-Glu22GLP-1(7-37)OH, Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH, Val8Arg22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Lys 22-GLP-1(7-37)OH, 8 22 Val -Cys -GLP-1(7-37)OH, Gly8-Glu22-GLP-1(78 22 37)OH, Gly -Asp -GLP-1(7-37)OH, Gly8-Arg22-GLP1(7-37)OH, Gly8-Lys 22-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Cys 22GLP-1(7-37)OH, Glu 22-GLP-1(7-36)OH, Asp 22-GLP1(7-36)OH, Arg 22-GLP-1(7-36)OH, Lys 22-GLP-1(736)OH, Cys 22-GLP-1(7-36)OH, Val8-Glu22-GLP-1(736)OH, Val8-Asp22-GLP-1(7-36)OH, Val8-Arg22-GLP1(7-36)OH, Val8-Lys 22-GLP-1(7-36)OH, Val8-Cys 22GLP- 1(7-36)OH, Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)OH, Gly8Asp22-GLP-1(7-36)OH, Gly8-Arg22-GLP-1(7-36)OH, Gly8-L ys 22-GLP-1(7-36)OH, Gly8-C ys 22-GLP-1(723 36)OH, Lys -GLP-1(7-37)OH, Val8-Lys 23-GLP-1(737)OH, Gly8-Lys 23-GLP-1(7-37)OH, His 24-GLP-1(737)OH, Val8-His 24-GLP-1(7-37)OH, Gly8-His 24-GLP1(7-37)OH, Lys 24-GLP-1(7-37)OH, Val 8-Lys 24-GLP1(7-37)OH, Gly8-Lys 23-GLP-1(7-37)OH, Glu 30-GLP1(7-37)OH, Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Glu30GLP-1(7-37)OH, Asp 30-GLP-1(7-37)OH, Val 8-Asp30GLP-1(7-37)OH, Gly8-Asp30-GLP-1(7-37)OH, Gln 30GLP-1(7-37)OH, Val8-Gln30-GLP-1(7-37)OH, Gly8Gln30-GLP-1(7-37)OH, Tyr30-GLP-1(7-37)OH, Val8Tyr 30-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Tyr 30-GLP-1(7-37)OH, 30 Ser -GLP-1(7-37)OH, Val8-Ser30-GLP-1(7-37)OH, 8 30 Gly -Ser -GLP-1(7-37)OH, His 30-GLP-1(7-37)OH, 8 30 Val -His -GLP-1(7-37)OH, Gly8-His 30-GLP-1(737)OH, Glu 34-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu34-GLP-1(737)OH, Gly8-Glu34-GLP-1(7-37)OH, Ala 34-GLP-1(737)OH, Val8-Ala34-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Ala34-GLP1(7-37)OH, Gly34-GLP-1(7-37)OH, Val8-Gly34-GLP1(7-37)OH, Gly8-Gly34-GLP-1(7-37)OH, Ala 35-GLP1(7-37)OH, Val8-Ala35-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Ala35GLP-1(7-37)OH, Lys 35-GLP-1(7-37)OH, Val 8-Lys 35GLP-1(7-37)OH, Gly8-L ys 35-GLP-1(7-37)OH, His 35GLP-1(7-37)OH Val8-His 35-GLP-1(7-37)OH, Gly8His 35-GLP-1(7-37)OH, Pro 35-GLP-1(7-37)OH, Val 8Pro35-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Pro35-GLP-1(7-37)OH, 35 Glu -GLP-1(7-37)OH Val8-Glu35-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Glu35-GLP-1(7-37)OH, Val8-Ala27-GLP-1(78 37 37)OH, Val -His -GLP-1(7-37)OH, Val 8-Glu22-Lys 23GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu22-Glu23-GLP-1(7-37)OH, 8 22 27 Val -Glu -Ala -GLP-1(7-37)OH, Val8-Gl y34-Lys 35 18 GLP-1(7-37)OH, Val8-His 37-GLP-1(7-37)OH, Gly8His 37-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(78 22 27 37)OH, Gly -Glu -Ala -GLP-1(7-37)OH, Val8-Lys 22Glu23-GLP-1(7-37)OH, та Gly8-Lys 22-Glu23-GLP-1(737)OH. Інша група аналогів та похідних GLP-1, яким віддається перевага, для застосування за цим винаходом має у своєму складі молекули формули VI (Послідовність №7) де: R1 вибирають із групи, яка включає Lгістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2аміногістидин, β-гідроксигістидин, гомогістидин, альфа-фторметилгістидин та альфаметилгістидин; X вибирають із групи, яка включає Ala, Gl y, Val, Thr, lie та альфа-метил-Ala; Υ вибирають із групи, яка включає Glu, Gln, Ala, Thr, Ser та Gly; Ζ вибирають із групи, яка включає Glu, Gln, Ala, Thr, Ser та Gl y; та R2 - Gl y-OH. Інша гр упа сполук GLP-1, яким віддається перевага, для застосування за цим винаходом розкрита у п ублікації [WO 91/11457], і вона включає по суті GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(736) або GLP-1(7-37), або їхню амідну форму та їхні фармацевтично прийнятні солі, які мають принаймні одну модифікацію, вибрану із групи, яка включає: (a) заміну лізину у положенні 26 та/або положенні 34 гліцином, серином, цистеїном, треоніном, аспарагіном, глутаміном, тирозином, аланіном, валіном, ізолейцином, лейцином, метіоніном, фенілаланіном, аргініном або Dлізином; або заміну аргініну у положенні 36 гліцином, серином, цистеїном, треоніном, аспарагіном, глутаміном, тирозином, аланіном, валіном, ізолейцином, лейцином, метіоніном, фенілаланіном, лізином або D-аргініном; (b) заміну триптофану у положенні 31 стійкою до окиснення амінокислотою; (c) заміну принаймні одного: валіну у положенні 16 тирозином; серину у положенні 18 лізином; глутамінової кислоти у положенні 21 аспарагіновою кислотою; гліцину у положенні 22 серином; глутаміну у положенні 23 аргініном; аланіну у положенні 24 аргініном; та лізину у положенні 26 глутаміном; та (d) заміну принаймні одного: аланіну у положенні 8 гліцином, серином або цистеїном; глутамінової кислоти у положенні 9 аспарагіновою кислотою, гліцином, серином, цистеїном, треоніном, аспарагіном, глутаміном, тирозином, аланіном, валіном, ізолейцином, лейцином, метіоніном або фенілаланіном; гліцину у положенні 10 серином, цистеїном, треоніном, аспарагіном, глутаміном, тирозином, аланіном, валіном, ізолейцином, лейцином, метіоніном або фенілаланіном; та аспарагінової кислоти у положенні 15 глутаміновою кислотою; та 19 81897 (e) заміну гістидину у положенні 7 гліцином, серином, цистеїном, треоніном, аспарагіном, глутаміном, тирозином, аланіном, валіном, ізолейцином, лейцином, метіоніном або фенілаланіном або гістидином у D- чи Nацилованій або алкілованій формі; де, у замшах (a), (b), (d) та (e), замінені амінокислоти можуть факультативно бути у D-формі та амінокислоти, замінені у положенні 7, можуть факультативно бути у N-ацилованій або N-алкілованій формі. Оскільки фермент, дипептидилпептидаза IV (DPP IV), може нести відповідальність за швидку інактивацію in vivo введеного GLP-1, що спостерігається [дивись, наприклад, Ментлайн P. (Mentlein R.) та інші, Eur. J. Biochem., 214: 829-835 (1993)], перевага віддається аналогам та похідним GLP-1, захищеним від активності DPP IV у складі пептидильованого білка, і ще більша перевага віддається пептидильованим білкам, де сполукою GLP-1 є GlyS-GLP-1(7-37)OH, Val 8-GLP-1(7-37)OH, α-метил-Ala8-GLP-1(7-37)OH або Gly8-Gb21-GLP1(7-37)OH. Інша гр упа сполук GLP-1, яким віддається перевага, для застосування за цим винаходом має у своєму складі сполуки формули VII (Послідовність №8), заявлені у [патенті США №5,512,549], який спеціально включено до цього опису як посилання. де: R1 вибирають із групи, яка включає 4імідазопропіоніл, 4-імідазоацетил або 4-імідазо-а,а диметил-ацетил; R2 вибирають із групи, яка включає C6-C10 нерозгалужений ацил, або є відсутнім; R3 вибирають із групи, яка включає GlyOH або NH2; і Хаа - L ys або Arg. Сполуками формули IV, яким віддається більша перевага, для застосування за цим винаходом є сполуки, де Хаа - Arg, a R2 - С6-С10 нерозгалужений ацил. Сполуками формули IV, яким віддається ще більша перевага, для застосування за цим винаходом є сполуки, де Хаа - Arg, R 2 - C6-C10 нерозгалужений ацил, a R3 - GlyOH. Іншими сполуками формули IV, яким віддається надзвичайна перевага, для застосування за цим винаходом є сполуки, де Хаа - Arg, R 2 - C6-C10 нерозгалужений ацил, R3 - Gly-OH і R1 - 4-імідазопропіоніл. Сполукою формули IV, якій віддається особлива перевага, для застосування за цим винаходом є сполука, де Хаа - Arg, R2 - С8 нерозгалужений ацил, R3 - Gly-OH і R1 - 4-імідазопропіоніл. За варіантом, якому віддається перевага, сполуки GLP-1 включають аналоги GLP-1, де остов для таких аналогів або фрагментів включає іншу, ніж аланін, амінокислоту у положенні 8 (аналоги положення 8). Остов може також 20 включати L-гістидин, D-гістидин або модифіковані форми гістидину, наприклад, дезаміногістидин, 2аміногістидин, β-гідроксигістидин, гомогістидин, αфторметилгістидин або α-метилгістидин у положенні 7. За варіантом, якому віддається перевага, ці аналоги положення 8 мають у своєму складі одну або декілька додаткових замін у положеннях 12, 16, 18, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 33 та 37, порівняно з відповідною амінокислотою нативного GLP-1(7-37)OH. За варіантом, якому віддається більша перевага, ці аналоги положення 8 мають у своєму складі одну або декілька додаткових замін у положеннях 16, 18, 22, 25 та 33, порівняно з відповідною амінокислотою нативного GLP-1(7-37)OH. За варіантом, якому віддається перевага, аналогом GLP-1 є GLP-1(7-37)OH, де амінокислоту у положенні 12 вибирають із групи, яка включає триптофан або тирозин. За варіантом, якому віддається більша перевага, крім заміни у положенні 12, амінокислота у положенні 8 замінюється гліцином, валіном, лейцином, ізолейцином, серином, треоніном або метіоніном, та за варіантом, якому віддається більша перевага, валіном або гліцином. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, крім замін у положеннях 12 та 8, амінокислота у положенні 22 замінюється глутаміновою кислотою. За іншим варіантом, якому віддається перевага, аналогом GLP-1 є GLP-1(7-37)OH, де амінокислоту у положенні 16 вибирають із групи, яка включає триптофан, ізолейцин, лейцин, фенілаланін або тирозин. За варіантом, якому віддається більша перевага, крім заміни у положенні 16, амінокислота у положенні 8 замінюється гліцином, валіном, лейцином, ізолейцином, серином, треоніном або метіоніном, та за варіантом, якому віддається більша перевага, валіном або гліцином. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, крім замін у положеннях 16 та 8, амінокислота у положенні 22 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 16 та 8, амінокислота у положенні 30 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 16 та 8, амінокислота у положенні 37 замінюється гістидином. За іншим варіантом, якому віддається перевага, аналогом GLP-1 є GLP-1(7-37)OH, де амінокислоту у положенні 18 вибирають із групи, яка включає триптофан, тирозин, фенілаланін, лізин, лейцин або ізолейцин, за варіантом, якому віддається перевага, триптофан, тирозин або ізолейцин. За варіантом, якому віддається більша перевага, крім заміни у положенні 18, амінокислота у положенні 8 замінюється гліцином, валіном, лейцином, ізолейцином, серином, треоніном або метіоніном, та за варіантом, якому віддається більша перевага, валіном або гліцином. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, крім замін у положеннях 18 та 8, амінокислота у положенні 22 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 18 21 81897 та 8, амінокислота у положенні 30 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 18 та 8, амінокислота у положенні 37 замінюється гістидином. За іншим варіантом, якому віддається перевага, аналогом GLP-1 є GLP-1(7-37)OH, де амінокислоту у положенні 19 вибирають із групи, яка включає триптофан або фенілаланін, за варіантом, якому віддається перевага, триптофан. За варіантом, якому віддається більша перевага, крім заміни у положенні 19, амінокислота у положенні 8 замінюється гліцином, валіном, лейцином, ізолейцином, серином, треоніном або метіоніном, та за варіантом, якому віддається більша перевага, валіном або гліцином. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, крім замін у положеннях 19 та 8, амінокислота у положенні 22 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 19 та 8, амінокислота у положенні 30 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 19 та 8, амінокислота у положенні 37 замінюється гістидином. За іншим варіантом, якому віддається перевага, аналогом GLP-1 є GLP-1(7-37)OH, де амінокислотою у положенні 20 є фенілаланін, тирозин або триптофан. За варіантом, якому віддається більша перевага, крім заміни у положенні 20, амінокислота у положенні 8 замінюється гліцином, валіном, лейцином, ізолейцином, серином, треоніном або метіоніном, та за варіантом, якому віддається більша перевага, валіном або гліцином. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, крім замін у положеннях 20 та 8, амінокислота у положенні 22 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 20 та 8, амінокислота у положенні 30 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 20 та 8, амінокислота у положенні 37 замінюється гістидином. За іншим варіантом, якому віддається перевага, аналогом GLP-1 є GLP-1(7-37)OH, де амінокислоту у положенні 25 вибирають із групи, яка включає валін, ізолейцин та лейцин, за варіантом, якому віддається перевага, валін. За варіантом, якому віддається більша перевага, крім заміни у положенні 25, амінокислота у положенні 8 замінюється гліцином, валіном, лейцином, ізолейцином, серином, треоніном або метіоніном, та за варіантом, якому віддається більша перевага, валіном або гліцином. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, крім замін у положеннях 25 та 8, амінокислота у положенні 22 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 25 та 8, амінокислота у положенні 30 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 25 та 8, амінокислота у положенні 37 замінюється гістидином. 22 За іншим варіантом, якому віддається перевага, аналогом GLP-1 є GLP-1(7-37)OH, де амінокислоту у положенні 27 вибирають із групи, яка включає ізолейцин або аланін. За варіантом, якому віддається більша перевага, крім заміни у положенні 27, амінокислота у положенні 8 замінюється гліцином, валіном, лейцином, ізолейцином, серином, треоніном або метіоніном, та за варіантом, якому віддається більша перевага, валіном або гліцином. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, крім замін у положеннях 27 та 8, амінокислота у положенні 22 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 27 та 8, амінокислота у положенні 30 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 27 та 8, амінокислота у положенні 37 замінюється гістидином. За іншим варіантом, якому віддається перевага, аналогом GLP-1 є GLP-1(7-37)OH, де амінокислотою у положенні 33 є ізолейцин. За варіантом, якому віддається більша перевага, крім заміни у положенні 33, амінокислота у положенні 8 замінюється гліцином, валіном, лейцином, ізолейцином, серином, треоніном або метіоніном, та за варіантом, якому віддається більша перевага, валіном або гліцином. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, крім замін у положеннях 33 та 8, амінокислота у положенні 22 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 33 та 8, амінокислота у положенні 30 замінюється глутаміновою кислотою. За варіантом, якому також віддається перевага, крім замін у положеннях 33 та 8, амінокислота у положенні 37 замінюється гістидином. Сполуки GLP-1 мають модифікації в одному або декількох із наведених далі положень: 8, 12, 16, 18, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 33 та 37. Ці сполуки GLP-1 демонструють підвищену активність порівняно з GLP-1(7-37) і включають амінокислотну послідовність формули IX (Послідовність №12) де: Хаа7 L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, βгідроксигістидин, гомогістидин, αфторметилгістидин або α-метилгістидин; Xaa8 - Ala, Gl y, Val, Leu, lle, Ser або Thr; Xaa12 - Phe, Trp або Туг; Xaa16 - Val, Trp, Ile, Leu, Phe або Туr; Хаа18 - Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, lle, Leu, Val; Xaa19 - Tyr, Trp або Phe; Xaa20 - Leu, Phe, Туr або Trp; Хаа22 - Gl y, Glu, Asp або Lys; Xaa25 - Ala, Val, lle або Leu; Xaa27 - Glu, lle або Ala; Хаа30 - Ala або Glu; Хаа33 - Val або llе; та 23 81897 Хаа37 - Gl y, His, NH 2 або відсутня. Деякі сполуки GLP-1, яким віддається перевага, формули IX включають GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)-NH 2, Gly8-GLP-1(7-37)OH, Gly8-GLP1(7-36)NH2, Val8-GLP-1(7-37)OH, Val8-GLP-1(736)NH2, Leu8-GLP-1(7-37)OH, Leu8-GLP-1(7-36)NH 2, Ile8-GLP-1(7-37)OH, Ile 8-GLP-1(7-36)NH 2, SerSGLP-1(7-37)OH, Ser8-GLP-1(7-36)NH2, Thr8-GLP1(7-37)OH, Thr8-GLP-1(7-36)NH2, Val8-Tyr 12-GLP1(7-37)OH, Val8-Tyr12-GLP-1(7-36)NH 2, Val8-Tyr 12GLP-1(7-37)OH, Val8-Tyr16-GLP-1(7-36)NH 2, Val8Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH, 8 22 Gly -Glu -GLP-1(7-37)OH, Gly8-Glu22-GLP-1(78 22 36)NH2, Val -Asp -GLP-1(7-37)OH, Val8-Asp22-GLP1(7-36)NH2, Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Asp22GLP-1(7-36)NH2, Val8-Lys 22-GLP-1(7-37)OH, Val8Lys 22-GLP-1(7-36)NH 2, Gly8-Lys 22-GLP-1(7-37)OH, Gly8-L ys 22-GLP-1(7-36)NH 2, Leu8-Glu22-GLP-1(78 22 37)OH, Leu -Glu -GLP-1(7-36)NH 2, Ile8-Glu22-GLP1(7-37)OH, Ile8-Glu22-GLP-1(7-37)NH2, Leu8-Asp22GLP-1(7-37)OH, Leu8-Asp22-GLP-1(7-36)NH 2, lle8Asp22-GLP-1(7-37)OH, Ile 8-Asp22-GLP-1(7-36)NH 2, Leu8-Lys 22-GLP-1(7-37)OH, Leu8-Lys 22-GLP-1(78 22 36)NH2, Ile -Lys -1(7-37)OH, Ile 8-Lys 22-GLP-1(736)NH2, Ser8-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Ser8-Glu22-GLP1(7-36)NH2, Thr8-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Thr8-Glu22GLP-1(7-36)NH2, Ser8-Asp22-GLP-1(7-37)OH, Ser8Asp22-GLP-1(7-36)NH 2, Thr8-Asp22-GLP-1(7-37)OH, Thr8-Asp22-GLP-1(7-36)NH 2, Ser8-Lys 22-GLP-1(737)OH, Ser8-Lys 22-GLP-1(7-36)NH 2, Thr8-Lys 22-GLP1(7-37)OH, Thr8-Lys 22-GLP-1(7-36)NH2, Glu22-GLP1(7-37)OH, Glu22-GLP-1(7-36)NH2, Asp22-GLP-1(737)OH, Asp 22-GLP-1 (7-36)NH 2, Lys 22-GLP-1(737)OH, Lys 22-GLP-1(7-36)NH 2, Val8-Ala27-GLP-1(737)OH, Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu30GLP-1(7-37)OH, Val8-Glu30-GLP-1(7-36)NH 2, Gly8Glu30-GLP-1(7-37)OH, Gly8-Glu30-GLP-1(7-36)NH 2, Leu8-Glu30-GLP-1(7-37)OH, Leu8-Glu30-GLP-1(78 30 36)NH2, Ile -Glu -GLP-1(7-37)OH, Ile 8-Glu30-GLP1(7-36)NH2, Ser8-Glu30-GLP-1(7-37)OH, Ser8-Glu30GLP-1(7-36)NH2, Thr8-Glu30-GLP-1(7-37)OH, Thr8Glu30-GLP-1(7-36)NH 2, Val8-His 37-GLP-1(7-37)OH, 8 37 Val -His -GLP-1(7-36)NH2, Gly8-His 37-GLP-1(78 37 37)OH, Gly -His -GLP-1(7-36)NH2, Leu8-His 37-GLP1(7-37)OH, Leu8-His 37-GLP-1(7-36)NH 2, Ile8-His 37GLP-1(7-37)OH, Ile 8-His 37-GLP-1(7-36)NH2, Ser8His 37-GLP-1(7-37)OH, Ser8-His 37-GLP-1(7-36)NH 2, 8 37 Thr -His -GLP-1(7-37)OH, Thr8-ffis 37-GLP-1(736)NH2. Деякі сполуки GLP-1, яким віддається перевага, формули IX, що мають численні заміни, включають GLP-1(7-37)OH, де положенням 8 є валін або гліцин, положенням 22 є глутамінова кислота, положенням 16 є тирозин, лейцин або триптофан, положенням 18 є тирозин, триптофан або ізолейцин, положенням 25 є валін і положенням 33 є ізолейцин. Інші сполуки GLP-1, яким віддається перевага, включають такі: Val8Tyr 16-GLP-1(7-37)OH, Val8-Tyr 12-Glu22-GLP-1(737)OH, Val8-Tyr16-Phe19-GLP-1(7-37)OH, Val8-Tyr 16Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Trp16-Glu22-GLP-1(737)OH, Val8-Leu16-Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Ile16Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Phe16-Glu22-GLP-1(78 16 22 37)OH, Val -Trp -Glu -GLP-1(7-37)OH, Val8-Tyr 18 24 Glu22-GLP-1(7-37)OH, Val8-Phe18-Glu22-GLP-1(78 18 22 37)OH, та Val -Ile -Glu -GLP-1(7-37)OH. Сполуки GLP-1 за цим винаходом включають також сполуки екзендину. Екзендин-3 та екзендин4 є біологічно активними пептидами, які були вперше виділені з отрути ящірки-отрутозуба Helodermatidae. Було показано, що вони зв'язують рецептор GLP-1 і стимулюють цАМФ-залежне продукування Н + у парієтальних клітинах ссавців. Обидва, екзендин-3 та екзендин-4, є 39амінокислотними пептидами, які мають приблизно 53% гомологію із GLP-1. Вони відіграють роль сильнодіючих агоністів активності GLP-1. Слід звернути увагу на те, що N-кінцево усічена похідна екзендину, відома як екзендин (9-39 амінокислот), є інгібітором екзендину-3, екзендину-4 та GLP-1. Сполука екзендину за типовим варіантом включає поліпептид, який має амінокислотну послідовність екзендину-3, екзендину-4 або їхнього аналога або фрагмента. Екзендин-3 та екзендин-4 розкриті [у патенті США №5,424,286]. Екзендин-3 має амінокислотну послідовність №9: Екзендин-4 має амінокислотну послідовність №10: Сполуки GLP-1 включають також фрагменти екзендину, які представляють собою поліпептиди, одержані після усічення однієї або декількох амінокислот із N-кінця та/або С-кінця екзендину або аналога екзендину: Крім того, сполуки GLP-1 включають поліпептиди екзендину, у яких одна або декілька амінокислот були додані до N-кінця та/або С-кінця екзендину або його фрагментів. Сполуки екзендину цього типу мають до приблизно тридцяти п'яти амінокислот. Сполуки GLP-1 включають також "аналоги екзендину". Аналог екзендину має достатню гомологію з екзендином-4, екзендином-3 або їхнім 25 81897 фрагментом, завдяки чому аналог має інсулінотропну активність. Активність фрагментів та/або аналогів екзендину може визначатись за допомогою методів аналізу in vitro, таких, наприклад, як описані у ЕР 619,322 та [патенті США №5,120,712], відповідно. За варіантом, якому віддається перевага, аналог екзендину має амінокислотну послідовність екзендину-4 або його фрагмента, модифіковану таким чином, що однією, двома, трьома, чотирма або п'ятьма амінокислотами відрізняється від амінокислоти у відповідному положенні екзендину4 або фрагмента екзендину-4. У номенклатурі, яка використовується у цьому описі для позначення сполук екзендину, замінна амінокислота та її положення вказуються перед вихідною структурою. Наприклад, Vаl8-Екзендин-4 означає сполуку екзендину, у якій гліцин, який, звичайно, знаходиться у положенні 8 екзендину-4, був замінений валіном. Інша гр упа сполук GLP-1, яким віддається перевага, включає аналоги ОЦР-1/Екзендину-4 формули VIII (Послідовність №11) де: Хаа у положенні 7: L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, βгідроксигістидин, гомогістидин, αфторметилгістидин або α-метилгістидин; Хаа у положенні 8 - Gly, Ala або Val; Хаа у положенні 16 - Leu або Val; Хаа у положенні 18 - Lys або Ser; Хаа у положенні 19 - Gin або Туr; Хаа у положенні 20 - Met або Leu; Хаа у положенні 22 - Glu або Gin; Хаа у положенні 23 - Glu або Gin; Хаа у положенні 25 - Val або Ala; Хаа у положенні 26 - Arg або Lys; Хаа у положенні 27 - Leu або Glu; Хаа у положенні 30 - Glu або Ala; Хаа у положенні 33 - Val або Lys; Хаа у положенні 34 - Asn або Lys; Хаа у положенні 36 - Gly або Arg; та R у положенні 37: Gly, Pro, Pro-Ser-Ser-Gly-AlaPro-Pro-Pro-Ser або є відсутнім. Активність 18 різних видів, які належать до цього роду, представлено у Таблиці 6. Опис додаткових аналогів екзендину, які є придатними для цього винаходу, наведено [у публікаціях WO 99/25728 (Білі (Вееіеу) та інші), WO 99/25727 (Білі (Вееіеу) та інші), WO 98/05351 (Янг (Young) та інші), WO 99/40788 (Янг (Young) та інші), WO 99/07404 (Білі (Вееіеу) та інші) та WO 99/43708 (Кнудсен (Knudsen) та інші)]. GLP-1 пептидильовані білки можуть мати у своєму складі ділянки глікозилування. 26 Глікозилування представляє собою хімічну модифікацію, під час якої до білка на специфічних ділянках додаються цукрові складові. Глікозилування білків відіграє роль у забезпеченні правильного заряду, конформації та стабільності білка, що визріває, і може спрямовувати білок на поверхню клітини та можливу секрецію білка. Важливіше те, що глікозилування впливає на швидкість виведення in vivo багатьох білків. Цукри можуть бути О-зв'язаними або N-зв'язаними. Узагалі, О-зв'язані цукри додають до кисню гідроксильної групи серину або треоніну, у той час як N-зв'язані цукри додають до амідного азоту аспарагіну. Консенсусною ділянкою для Nглікозилування є Asn X1 Х2, де X1 - будь-яка амінокислота, за виключенням Pro, a X2 - Ser або Thr. Сполуки GLP-1, як правило, не глікозилуються in vivo: цікаво, однак, те, що GLP-1 пептидильовані білки за цим винаходом, які включають сполуку GLP-1 із С-кінцевим подовженням, зшитим із Fc послідовністю, глікозилуються на останньому серпні С-кінцевого подовження (SSGAPPPS*) та на треоніні у положенні 11 на N-кінцевій ділянці Fc (AEPKSCDKTHT*CPPC...). Гетерологічні Fc пептидильовані білки: Сполуки GLP-1, опис яких було наведено перед тим, можуть зшиватись із Fc-фрагментом імуноглобуліну безпосередньо або за допомогою пептидного лінкера. Імуноглобуліни є молекулами, які мають у своєму складі поліпептидні ланцюги, які утримуються разом дисульфідними зв'язками, які за типовим варіантом мають два легкі і два важкі ланцюги. Один домен (V) у кожному ланцюзі має варіабельну амінокислотну послідовність у залежності від антитільної специфічності молекули. Інші домени (С) мають достатньо константну послідовність, спільну для молекул однакового класу. Як використано у цьому описі, Fc-фрагмент імуноглобуліну має значення, яке традиційно надається цьому терміну у галузі імунології. Конкретніше, цей термін означає фрагмент антитіла, який одержують шляхом видалення з антитіла двох ділянок зв'язування антигену (Fabфрагментів). Одним із способів видалення Fabфрагментів є розщеплення імуноглобуліну за допомогою папаїнової протеази. Таким чином, Fcфрагмент утворюється із фрагментів приблизно однакового розміру константної ділянки обох важких ланцюгів, які зв'язуються шляхом нековалентних взаємодій та дисульфідних зв'язків. Fc-фрагмент може включати шарнірні ділянки і протягуватись через константні ділянки СН2 та СН3 важкого ланцюга імуноглобуліну до С-кінця антитіла. Репрезентативні шарнірні ділянки для людських та мишачих імуноглобулінів можна знайти у [Antibody Engineering, A Practical Guide, під редакцією Борребек К.А.К. (Borrebaeck C.A.K.), видавництво W.H. Freeman and Co., 1992], яку включено до цього опису як посилання. Fcфрагмент може додатково включати одну або декілька ділянок глікозилування. Амінокислотна послідовність репрезентативного Fc білка, який 27 81897 має у своєму складі шарнірну ділянку, константні ділянки СН2 та СН3 важкого ланцюга імуноглобуліну та одн у ділянку N-глікозилування у положенні 82, представлена на Фіг.1. Існує п'ять типів Fc-фрагментів людського імуноглобуліну з різними ефекторами та фармакокінетичними властивостями: IgG, IgA, IgM, IgD та IgE. IgG є найрозповсюдженим імуноглобуліном у сироватці. IgG також має найдовший період напіввиведення із кров'яного русла, порівняно з будь-яким іншим імуноглобуліном (23 дні). На відміну від інших імуноглобулінів, IgG ефективно циркулює у замкнутому циклі після зв'язування з Fcрецептором. Існує чотири підкласи IgG, G1, G2, G3 та G4, кожен з яких має різні функції ефекторів. G1, G2 та G3 можуть зв'язувати Clq і комплемент, у той час як G4 робити цього не може. Незважаючи навіть на те, що G3 є здатним до більш ефективного зв'язування C1q, ніж G1, G1 є більш ефективним в опосередкуванні комплементспрямованого клітинного лізису. G2 дуже неефективно зв'язує комплемент. Зв'язувальний сайт C1q IgG знаходиться на карбоксильній кінцевій ділянці константної ділянки СН2 важкого ланцюга імуноглобуліну. Усі підкласи IgG є здатними до зв'язування з Fc рецепторами (CD16, CD32, CD64), причому G1 та G3 є більш ефективними, ніж G2 та G4. Зв'язувальна ділянка Fc рецептора IgG утворюється залишками, розміщеними як на шарнірних, так і на карбоксильних кінцевих ділянках константної ділянки СН2 важкого ланцюга імуноглобуліну. IgA може існувати як у мономерній, так і у димерній формі, яка утримується разом Jпептидом. IgA є другим із найрозповсюджених імуноглобулінів у сироватці, однак тривалість періоду його напіввиведення становить лише 6 днів. IgA має три функції ефекторів. Він зв'язується з IgA-специфічним рецептором на макрофагах та еозинофілах, які стимулюють фагоцитоз та дегрануляцію, відповідно. Він може також зв'язувати комплемент за допомогою невідомого альтернативного механізму. IgM експресується як пентамер або гексамер, обидва з яких утримуються разом за допомогою Jпептиду. Тривалість напіввиведення IgM із кров'яного русла дорівнює 5 дням. Він слабо зв'язується із C1q через зв'язувальну ділянку, яка знаходиться на константній ділянці СН3 важкого ланцюга імуноглобуліну. Тривалість напіввиведення IgD із кров'яного русла дорівнює 3 дням. Які функції ефекторів має цей імуноглобулін, невідомо. IgE представляє собою мономерний імуноглобулін і тривалість його напіввиведення із кров'яного русла дорівнює 2,5 дня. IgE зв'язується із двома Fc рецепторами, які стимулюють дегрануляцію, наслідком чого є вивільнення передзапальних факторів. У залежності від бажаного ефекту in vi vo, гетерологічні пептидильовані білки за цим винаходом можуть включати будь-який з ізотипів, опис яких було наведено перед тим, або мати у своєму складі Fc-фрагменти-мутанти, у яких були 28 змінені функції зв'язування комплементу та/або Fc рецептора. Так, гетерологічні пептидильовані білки за цим винаходом можуть мати у своєму складі повний Fc-фрагмент імуноглобуліну, фрагменти Fc-фрагмента імуноглобуліну або його аналоги, зшиті зі сполукою GLP-1. Пептидильовані білки за цим винаходом можуть представляти собою одноланцюгові білки або багатоланцюгові поліпептиди. Можна одержати два або декілька Fc пептидильованих білків, які будуть взаємодіяти через дисульфідні зв'язки, яка, як правило, утворюються між Fcфрагментами. Ці мультимери можуть бути гомогенними відносно сполуки GLP-1 або вони можуть мати у своєму складі різні сполуки GLP-1, пришиті до N-кінця Fc-фрагмента пептидильованого білка. Незалежно від кінцевої структури пептидильованого білка, Fc або Fc-подібна ділянка повинна служити для продовження періоду напіввиведення із кров'яного русла in vivo сполуки GLP-1, пришитої до N-кінця. Крім того, пришита сполука GLP-1 повинна зберегти деяку біологічну активність. Збільшення періоду напіввиведення може демонструватись за допомогою методу, опис якого наведено у Прикладі 7, де період напіввиведення пептидильованого білка порівнюється з періодом напіввиведення самої сполуки GLP-1. Біологічна активність може визначатись in vitro та in vivo за допомогою методів, відомих у цій галузі. Опис репрезентативних біологічних аналізів наведено у прикладах 6, 8 та 9. Оскільки Fc-фрагмент IgG, який одержали протеолізом, має такий самий період напіввиведення in vivo, що й інтактна молекула IgG, а Fab-фрагменти швидко деградують, гадають, що відповідна послідовність для подовження періоду напіввиведення знаходиться на константних ділянках СН2 та/або СН3. Крім того, у літературі було показано, що швидкість катаболізму варіантів IgG, які не зв'язують високоафінний Fc-рецептор або Clq, не відрізняються від швидкості виведення вихідного антитіла дикого типу, що є свідченням того, що катаболічна ділянка відрізняється від ділянок, залучених до зв'язування Fc-рецептора або Clq [Вавржинчак (Wawrzynczak) та інші, (1992) Molecular Immunology 29: 221]. Результати досліджень сайтспрямованого мутагенезу із застосуванням Fc-фрагмента мишачого IgGl дозволяють висунути припущення про те, що ділянка Fc-фрагмента IgGl, яка контролює катаболічну швидкість, знаходиться на поверхні розділу константних ділянок СН2-СН3. Спираючись на результати цих досліджень, Fc-фрагмент катаболічної ділянки може модифікуватись для оптимізації періоду напіввиведення пептидильованих білків. За варіантом, якому віддається перевага, Fcфрагмент, який застосовується для гетерологічних пептидильованих білків за цим винаходом повинен походити із Fc-фрагмента IgG1або IgG4. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, Fc-фрагмент повинен бути IgG4 або одержуватись 29 81897 із IgG4. За варіантом, якому віддається перевага, Fc-фрагмент IgG має у своєму складі обидві константні ділянки СН2 та СН3 важкого ланцюга імуноглобуліну, а також шарнірну ділянку. Гетерологічні альбумінові пептидильовані білки: Сполуки GLP-1, опис яких було наведено перед тим, можуть зшиватись з альбуміном або його аналогом, фрагментом або похідною безпосередньо або за допомогою пептидного лінкера. Узагалі, альбумінові білки, які є складовою частиною пептидильованих білків за цим винаходом, можуть одержуватись з альбуміну, клонованого з будь-якого виду. Перевага, однак, віддається людському альбуміну та його фрагментам і аналогам для зменшення ризику імуногенності пептидильованого білка для людей. Людський сироватковий альбумін (HSA) складається з одного неглікозилованого поліпептидного ланцюга з 585 амінокислот молекулярної маси 66500. Амінокислотну послідовність людського HSA показано на Фіг.2. [Дивись, Мелоун (Meloun) та інші, (1975) FEBS Letters 58:136; Беренс (Behrens) та інші, (1975) Fed. Ргос. 34:591; Лоун (Lawn) та інші, (1981) Nucleic Acids Research 9: 6102-6114; Мінгетті (Minghetti) та інші, (1986) J. Biol. Chem. 261: 6747]. Були описані різноманітні поліморфні варіанти, а також аналоги та фрагменти альбуміну. [Дивись, Уайткемп (Weitkamp) та інші, (1973) Ann. Hum. Genet. 37:219]. Наприклад, у [ЕР 322,094] винахідники розкривають різні коротші форми HSA. Деякі з цих фрагментів включають HSA(1373), HSA(1-388), HSA(1-389), HSA(1-369) та HSA(1-419) і фрагменти між 1-369 та 1-419. У ЕР 399,666 розкривають альбумінові фрагменти, які включають HSA(1-177) та HSA(1-200) і фрагменти між HSA(1-177) та HSA(1-200). Зрозуміло, що гетерологічні пептидильовані білки за цим винаходом включають сполуки GLP-1, зв'язані з будь-яким альбуміновим білком, у тому числі фрагментами, аналогами та похідними, де такий пептидильований білок є біологічно активним і має довший період напіввиведення із кров'яного русла, аніж сама сполука GLP-1. Так, альбумінова частина пептидильованого білка не обов'язково повинна мати період напіввиведення із кров'яного русла, рівний періоду напіввиведення нативного людського альбуміну. Відомі або можуть бути одержані фрагменти, аналоги та похідні, які мають довший період напіввиведення або тривалість їхнього періоду напіввиведення є проміжною між тривалістю відповідних періодів нативного людського альбуміну та відповідної сполуки GLP-1. Гетерологічні пептидильовані білки за цим винаходом включають білки, які мають консервативні амінокислотні заміни у сполуці GLP1 та/або Fc чи альбуміновій складовій пептидильованого білка. "Консервативною заміною" є заміна амінокислоти іншою амінокислотою, яка має такий само загальний заряд електрону та приблизно такий самий розмір та форму. Амінокислоти з аліфатичними або 30 заміненими аліфатичними амінокислотними бічними ланцюгами мають приблизно однаковий розмір, коли загальна кількість атомів вуглецю та гетероатомів у їхніх бічних ланцюга х різниться не більше, аніж приблизно на чотири. Вони мають приблизно однакову форму, коли кількість відгалужень у їхніх бічних ланцюгах різниться не більше, ніж на одну. Амінокислоти з фенільними або заміненими фенільними групами у їхніх бічних ланцюгах розглядаються як такі, що мають приблизно однаковий розмір та форму. За виключенням наведених у цьому описі особливих застережень, консервативні заміни за варіантом, якому віддається перевага, роблять за допомогою природних амінокислот. Однак термін "амінокислоти" використовують у цьому описі у найширшому розумінні, і він включає як природні, так і неприродні амінокислоти, у тому числі аналоги та похідні амінокислот. До останніх належать молекули, які мають у своєму складі амінокислотну складову. Фахівцю у цій галузі зрозуміло, з урахуванням цього широкого визначення, що посилання, які робляться на амінокислоту у цьому описі, включають, наприклад, природні протеогенні L-амінокислоти; D-амінокислоти; хімічно модифіковані амінокислоти, наприклад, аналоги та похідні амінокислот; природні непротеогенні амінокислоти, наприклад, норлейцин, β-аланін, орнітин, ГАМК то що; та хімічно синтезовані сполуки із властивостями, які, як відомо у цій галузі, є характерними для амінокислот. Як використано у цьому описі, термін "протеогенна" вказує на те, що амінокислота може бути включена до складу пептиду, поліпептиду або білка у клітині метаболічним шляхом. Включення неприродних амінокислот, у тому числі синтетичних ненативних амінокислот, замінених амінокислот, однієї або декількох Dамінокислот до гетерологічних пептидильованих білків за цим винаходом, може бути вигідним у цілий ряд різних шляхів. Пептиди та їм подібні, які мають у своєму складі D-амінокислоти, демонструють підвищену стабільність in vitro або in vi vo, порівняно із двійниками, які мають у своєму складі L-амінокислоти. Так, конструювання пептидів та їм подібних, що включають Dамінокислоти, може бути особливо корисним у разі, коли виникає потреба у підвищеній міжклітинній стабільності. Більш докладно, Dпептиди і їм подібні є стійкими до ендогенних пептидаз та протеаз, завдяки чому вони забезпечують підвищену біодоступність молекули і триваліший період життя in vivo, у разі виникнення потреби у таких властивостях. Крім того, Dпептиди і їм подібні не можуть ефективно процесуватись для презентації Т-клітинампомічникам, обмеженої головним комплексом гістосумісності II класу, і, таким чином, вони з меншою ймовірністю можуть індукувати гуморальні імунні реакції у цілому організмі. Окрім структурно-функціонального аналізу різних поліпептидів, які охоплюються цим винаходом, існують численні фактори, які можуть розглядатись під час вибору амінокислот для 31 81897 заміни. Одним із факторів, який може розглядатись під час здійснення таких замін, є гідропатичний показник амінокислот. Важливість гідропатичного показника амінокислоти при наданні білку інтерактивної біологічної функції обговорювалось Кайтом (Kyte) та Дулітлом (Doolittle), [1982, J. Моl. Віоl, 157: 105-132]. Приймається, що відносний гідропатичний характер амінокислот надає свій внесок до вторинної структури одержаного білка. Вторинна структура, у свою чергу, впливає на взаємодію білка з молекулами, наприклад, ферментами, субстратами, рецепторами, лігандами, ДНК, антитілами, антигенами тощо. Виходячи з характеристик гідрофобності та заряду, визначили гідропатичний показник кожної амінокислоти: ізолейцин (+4,5); валін (+4,2); лейцин (+3,8); фенілаланін (+2,8); цистеїн/цистин (+2,5); метіонін (+1,9); аланін (+1,8); гліцин (-0,4); треонін (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролін (-1,6); гістидин (-3,2); глутамат/глутамін/аспартат/аспарагін (-3,5); лізин (-3,9); та аргінін (-4,5). Як відомо у цій галузі, певні амінокислоти у пептиді, поліпептиді або білку можуть замінюватись іншими амінокислотами, які мають подібний гідропатичний показник або коефіцієнт, з одержанням пептиду тощо, який має подібну або навіть ліпшу біологічну активність. Під час здійснення таких замін перевага віддається тому, щоб амінокислоти, які мають гідропатичні показники у межах ±2, замінювали одна одну. Перевага віддається замінам, де амінокислоти мають гідропатичні показники у межах ±1. Найбільша перевага віддається замінам, де амінокислоти мають гідропатичні показники у межах ±0,5. Подібні амінокислоти можуть замінюватись також на основі гідрофільності. [У патенті США №4,554,101] розкрито, що найбільша місцева середня гідрофільність білка, яка визначається гідрофільністю прилеглих амінокислот, корелює з біологічними властивостями білка. Амінокислотам були приписані наведені далі значення гідрофільності: аргінін/лізин (+3,0); аспартат/глутамат (+3,0±1); серии (+0,3); аспарагін/глутамін (+0,2); гліцин (0); треонін (-0,4); пролін (-0,5±1); аланін/гістидин (-0,5); цистеїн (1,0); метіонін (-1,3); валін (-1,5); лейцин/ізолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенілаланін (-2,5); та триптофан (-3,4). Таким чином, одна амінокислота у пептиді, поліпептиді або білку може замінюватись іншою амінокислотою, яка має подібний коефіцієнт гідрофільності, з одержанням пептиду і йому подібних, який має схожу біологічну активність, тобто все ще зберігає відповідну біологічну функцію. При здійсненні таких замін за варіантом, якому віддається перевага, взаємно замінюються амінокислоти, які мають гідропатичні показники у межах ±2, більша перевага віддається амінокислотам із гідропатичними показниками у межах ±1, і найбільша перевага віддається амінокислотам із гідропатичними показниками у межах ±0,5. 32 Як згадувалось перед тим, амінокислотні заміни у пептидильованих білках за цим винаходом можуть ґрунтуватись на відносній подібності замінників бокових ланцюгів амінокислот, наприклад, їхній гідрофобності, гідрофільності, заряді, розмірі тощо. Заміни, крім того, можуть здійснюватись, виходячи зі схильності вторинної структури. Наприклад, спіральна амінокислота може замінюватись амінокислотою, яка буде зберігати спіральну структур у. Зразкові заміни, якими до уваги приймаються різноманітні попередньо згадані характеристики для здійснення консервативних амінокислотних замін із наслідковими мовчазними замінами у пептидах і їм подібних, можуть вибиратись з-посеред інших членів того класу, до якого належить природна амінокислота. Амінокислоти можуть підрозділятись на чотири наведені далі групи: (1) кислі амінокислоти; (2) основні амінокислоти; (3) нейтральні полярні амінокислоти; та (4) нейтральні неполярні амінокислоти. Загальні способи одержання гетерологічних пептидильованих білків за ним винаходом. Незважаючи на те що гетерологічні пептидильовані білки за цим винаходом можна одержати за допомогою цілого ряду різних методів, перевага віддається рекомбінантним методам. Для цілей цього винаходу, які розкриваються та заявляються у цьому описі, далі наводиться визначення загальних термінів та скорочень молекулярної біології. Терміни та скорочення, використані у цьому документі, мають своє звичайне значення, якщо не вказано інше. Наприклад, "°С" означає градуси за Цельсієм; "mmol" означає мілімоль або мілімолі; "mg" означає міліграми; "mg" означає мікрограми; "ml або mL" означає мілілітри; та "ml або mL" означає мікролітри. Скорочення амінокислот наведені у відповідності до 37 C.F.R. (Центральний Федеральний Реєстр), § 1.822 (b) (2) (1994). Термін "пара нуклеотидів" або "п.н.", який використано у цьому описі, відноситься до ДНК або РНК. Скорочення А, С, G та Τ відповідають 5'монофосфатним формам дезоксирибонуклеозидів, (дезокси)аденозину, (дезокси)цитидину, (дезокси)гуанозину та тимідину, відповідно, коли вони зустрічаються у молекулах ДНК. Скорочення U, С, G та А відповідають 5'монофосфатним формам рибонуклеозидів, уридину, ци тидину, гуанозину та аденозину, відповідно, коли вони зустрічаються у молекулах РНК. У дволанцюгових ДНК, термін "пара нуклеотидів" може означати партнерство А з Τ або С із G. У разі ДНК/РНК, термін "гетеродуплексна пара нуклеотидів" може означати партнерство А з U або С із G (Дивись наведене далі визначення терміну "комплементарний"). Термін "гідроліз" або "рестрикція" ДНК означає каталітичне розщеплення ДНК за допомогою рестриктази, яка діє лише на певні послідовності ДНК ("послідовно-специфічні ендонуклеази"). Різноманітні рестриктази, які використовуються у цьому винаході, є комерційно доступними; умови 33 81897 проведення реакцій, кофактори та інші вимоги відомі пересічному фахівцю у цій галузі. Відповідні кількості буферних розчинів та субстратів для конкретних рестриктаз указуються виробником або їх можна легко знайти у літературних джерелах. Термін "літування" означає процес утворення фосфодискладноефірних зв'язків між двома фрагментами дволанцюгових нуклеїнових кислот. Якщо не зазначене супротивне, літування може здійснюватись за допомогою відомих буферних розчинів та умов за допомогою ДНК-лігази, наприклад, Т4 ДНК-лігази. Термін "плазміда" означає позахромосомний (як правило) автореплікативний генетичний елемент. Плазміди, як правило, позначаються малою літерою "р", із подальшими буквами та/або цифрами. Вихідні плазміди, які були використані у цьому винаході, є доступними з комерційних джерел, загальнодоступними без обмежень або можуть конструюватись із доступних плазмід у відповідності до опублікованих процедур. Крім того, у цій галузі відомі плазміди, еквівалентні тим, опис яких наведено, і можливість їх використання є зрозумілою пересічному фа хівцю у цій галузі. Термін "вектор для клонування рекомбінантної ДНК", який використано у цьому описі, означає будь-який агент з автономною реплікацією, у тому числі (але без обмежень), плазміди та фаги, який має у своєму складі молекулу ДНК, до якої можна додати один або декілька додаткових сегментів ДНК. Термін "вектор для експресії рекомбінантної ДНК", який використано у цьому описі, означає будь-який вектор для клонування рекомбінантної ДНК, до якого було включено промотор для контролювання транскрипції інсерційного сегмента ДНК. Термін "транскрипція" означає процес, під час якого інформація, що міститься на нуклеотидній послідовності ДНК, передається на послідовність комплементарної РНК. Термін "трансфекція" означає поглинання вектора експресії клітиною-хазяїном, незалежно від того, відбувається фактично або ні експресія будь-якої кодувальної послідовності. Пересічному фа хівцю відомі численні методи трансфекції, наприклад, копреципітація фосфатом кальцію, трансфекція ліпосомами та електропорація. Успішною трансфекція звичайно визнається тоді, коли у клітини-хазяїна спостерігаються будь-які ознаки функціонування цього вектора. Термін "трансформація" означає введення ДНК до організму таким чином, що ДНК реплікується, за допомогою позахромосомного елемента або шляхом хромосомної інтеграції. Методи трансформування бактеріальних та еукаріотних хазяїв добре відомі у цій галузі; багато з цих методів, наприклад, ядерне впорскування, злиття протопластів або обробка кальцієм із використанням хлориду кальцію, узагальнені [у книзі Дж. Сембрука (J. Sambrook) та інших, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989)]. Взагалі, у разі введення ДНК до дріжджів, у протилежність терміну "трансфекція" використовують термін "трансформація". 34 Термін "трансляція", який використано у цьому описі, означає процес, під час якого інформація матричної РНК (мРНК) використовується для визначення та спрямування синтезу поліпептидного ланцюга. Термін "вектор" означає сполуку нуклеїнової кислоти, яка застосовується для трансфекції та/або трансформації клітин під час генних маніпуляцій, що несе полінуклеотидні послідовності, які відповідають властивим білковим молекулам, які, у разі сполучення з відповідними контрольними послідовностями, передають специфічні властивості клітині-хазяїну, яка підлягає трансфекції та/або трансформації. Придатними векторами є плазміди, віруси та бактеріофаги. Штучні вектори конструюють шляхом вирізування та сполучення молекул ДНК із різних джерел за допомогою рестриктаз та лігаз. Термін "вектор", який використано у цьому описі, включає вектори для клонування рекомбінантних ДНК та вектори для експресії рекомбінантних ДНК. Термін "комплементарний" або "комплементарність", який використано у цьому описі, означає пари нуклеотидів (пуринів та піримідинів), які об'єднуються за допомогою водневих зв'язків у дволанцюгову нуклеїнову кислоту. Комплементарними є наведені далі пари нуклеотидів: гуанін та цитозин; аденін та тимін; аденін та урацил. Термін "гібридизація", який використано у цьому описі, означає процес, під час якого нитка нуклеїнової кислоти об'єднується з комплементарною ниткою шляхом парування основ. Умови, до яких удаються під час гібридизації двох неідентичних, але дуже схожих комплементарних нуклеїнових кислот, змінюються у залежності від ступеню комплементарності двох ниток та їх довжини. Такі методи та умови добре відомі фахівцям у цій галузі. Термін "виділена амінокислотна послідовність" означає будь-яку амінокислотну послідовність, одержану методами генної інженерії або синтезовану, яка за місцезнаходженням відрізняється від природної послідовності. Термін "виділена сполука ДНК" означає будьяку послідовність ДНК, одержану методами генної інженерії або синтезовану, яка за місцезнаходженням відрізняється від свого природного місцезнаходження у геномній ДНК. Термін "виділена нуклеїновокислотна сполука" означає будь-яку послідовність РНК або ДНК, одержану методами генної інженерії або синтезовану, яка за своїм місцезнаходженням відрізняється від свого природного місцезнаходження. Термін "праймер" означає нуклеїновокислотний фрагмент, який функціонує як ініціювальний субстрат для ферментативного або синтетичного подовження. Термін "промотор" означає послідовність ДНК, яка спрямовує транскрипцію ДНК на РНК. Термін "зонд" означає нуклеїновокислотну сполуку або її фрагмент, який гібридизується з іншою нуклеїновокислотною сполукою. 35 81897 "Суворість" реакцій гібридизації легко визначається пересічним фахівцем у цій галузі і, як правило, обчислюється емпіричним шляхом, виходячи з довжини зонда, температури промивання та концентрації солі. Узагалі, зонди більшої довжини потребують більш високих температур для відповідної ренатурації, у той час як коротші зонди потребують більш низьких температур. Гібридизація, взагалі, залежить від здатності денатурованої ДНК до повторної ренатурації у разі, коли у середовищі, яке має температуру, нижчу за температуру її розтоплення, присутні комплементарні нитки. Чим вищою є ступінь необхідної гомолога між зондом та послідовністю, яка піддається гібридизації, тим вищою може бути відносна температура, яка застосовується. Як наслідок, вищі відносні температури мають схильність до перетворення умов протікання реакції на більш суворі, у той час як у більш низьких температур ця схильність проявляється з меншою інтенсивністю. Подробиці та пояснення суворості реакцій гібридизації дивись [у книзі Осубел (Ausubel) та інших, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, 1995]. Вирази "суворі умови" або "умови високої суворості", які використовуються у цьому описі, можуть визначатись (1) застосуванням розчинів низької іонної сили та високої температури під час промивки, наприклад, 15мМ розчину хлориду натрію/1,5мМ розчину цитрату натрію/0,1% розчину додецилсульфату натрію при температурі 50°С; (2) застосуванням під час гібридизації денатуруючого агента, такого як формамід, наприклад, 50% (у об'ємному відношенні) розчину формаміду з 0,1% розчином сироваткового альбуміну великої рогатої худоби/0,1% розчином фіколу/0,1% розчином полівінілпіролідону/50мМ розчином натрійфосфатного буфера (рН6,5) із 750мМ розчином хлориду натрію/75мМ розчином цитрату натрію при температурі 42°С; або (3) застосуванням 50% розчину формаміду, 5Х розчину SSC (750мМ розчин хлориду натрію, 75мМ розчин цитрату натрію), 50мм розчину фосфа ту натрію (рН6,8), 0,1% розчину пірофосфату натрію, 5Х розчину Денхардта, ДНК із гомогенату молочок лососевих, який одержали під впливом ультразвуку (50мкг/мл), 0,1% розчину додецилсульфату натрію та 10% розчину сульфату декстрану при температурі 42°С із промиванням при температурі 42°С у 0,2Х розчині SSC (30мМ розчин хлориду натрію/3мМ розчин цитрату натрію) та 50% розчині формаміду при температурі 55°С, із подальшим промиванням за умов високої суворості 0ДХ розчином SSC, до складу якого входить етилендіамінтетраоцтова кислота, при температурі 55°С. "Помірно суворі умови" можуть визначатись за описом, який наведено у книзі Сембрука (Sambrook) та інших [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, (1989)], і включати застосування промивного розчину та умов гібридизації (наприклад, температури, іонної сили та % додецилсульфату натрію) менш суворих за ті, 36 опис яких було наведено перед тим. Прикладом помірно суворих умов є інкубування впродовж ночі при температурі 37°С у розчині, який включає: 20% розчин формаміду, 5Х розчин SSC (750мМ розчин хлориду натрію, 75мМ розчин цитрату натрію), 50мМ розчин фосфату натрію (рН7,6), 5Х розчин Денхардта, 10% розчин сульфату декстрану та 20мг/мл денатурованої ДНК із гомогенату молочок лососевих, який одержали під впливом ультразвуку, яку було піддано гідродинамічному фрагментуванню, з подальшим промиванням фільтрів у 1Х розчині SSC при температурі приблизно 37-50°С. Досвідченому фа хівцю зрозуміло, яким чином відрегулювати температуру, іонну силу то що для того, щоб пристосуватись до таких факторів, як довжина зонда тощо. Термін "PCR" означає широковідому полімеразну ланцюгову реакцію із застосуванням термостабільної ДНК-полімерази. Термін "лідерна послідовність" означає послідовність амінокислот, яка може бути видалена ферментативним або хімічним шляхом з одержанням необхідного поліпептиду. Термін "послідовність сигналу секреції" означає послідовність амінокислот, присутню, як правило, на N-кінцевій ділянці більшого поліпептиду, функція якої полягає у ініціюванні об'єднання цього поліпептиду з функціональними одиницями клітинної мембрани, наприклад, ендоплазматичною сіткою, та секреції цього поліпептиду через плазматичну мембрану. Конструювання ДНК яка кодує гетерологічні пептидильовані білки за цим винаходом Альбумінові та імуноглобулінові білки дикого типу можна одержати з різноманітних джерел. Ці білки можна одержати, наприклад, із бібліотеки кДНК, яку одержали із тканин або клітин, які експресують необхідну мРНК на рівні, який піддається виявленню. Бібліотеки можна піддати скринінгу за допомогою зондів, які були сконструйовані з використанням опублікованої послідовності ДНК або білка, для виявлення конкретного необхідного білка. Наприклад, опис константних ділянок легкого або важкого ланцюга імуноглобуліну наведено у [Адамса (Adams) та інших, (1980) Biochemistry 19: 2711-2719; Гуге (Goughet) та інших, (1980) Biochemistry 19: 27022710; Долбі (Dolby) та інших, (1980) Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6027-6031; Райса (Rice) та інших, (1982) Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 79: 78627862; Фелкнера (Falkner) та інших, (1982) Nature 298: 286-288; і Моррісона (Morrison) та інших, (1984) Ann. Rev. Immunol. 2: 239-256]. Деякими джерелами, що розкривають послідовності альбумінового білка та ДНК, є [робота Мелоуна (Meloun) та інших, (1975) FEBS Letters 58: 136; Беренса (Behrens) та інших, (1975) Fed. Рrос. 34: 591; Лоуна (Lawn) та інших, (1981) Nucleic Acids Research 9: 6102-6114; і Мінгетті (Minghetti) та інших, (1986) J. Biol. Chem. 261: 6747]. Скринінг бібліотеки кДНК або геномної бібліотеки за допомогою селективного зонда може здійснюватись за стандартними процедурами, наприклад, такими, опис яких наведено у книзі 37 81897 Сембрука (Sambrook) та інших, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989). Альтернативним засобом виділення гена, що кодує альбуміновий або імуноглобуліновий білок, є використання методики полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) [Сембрук (Sambrook), дивись перед тим; Діффенбах (Dieffenbach) та інші, PCR Primer. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1995)]. ПЛР праймери можуть конструюватись, засновуючись на опублікованих послідовностях. Узагалі, повномірні послідовності дикого типу, клоновані від конкретних видів, можуть використовува тись як матриця для одержання аналогів, фрагментів та похідних, які зберігають здатність до надання довшого періоду напіввиведення із кров'яного русла сполуці GLP-1, яка є складовою частиною пептидильованого білка. Перевага, однак, надається тому, щоб Fcфрагменти та фрагменти альбуміну гетерологічних пептидильованих білків за цим винаходом одержували з нативної людської послідовності для зменшення ризику потенційної імуногенності пептидильованого білка для людей. Зокрема, перевага віддається тому, щоб імуноглобулінова частина пептидильованого білка за цим винаходом мала у своєму складі лише Fcфрагмент імуноглобуліну. У залежності від потреби у конкретній функції ефектора та від структурних характеристик пептидильованого білка, Fc-фрагмент може мати у своєму складі шарнірну ділянку разом із константними ділянками СН2 та СН3 або якусь іншу їх комбінацію. Такі Fcфрагменти можна одержати за методикою ПЛР із праймерами, сконструйованими для гібридизування з послідовностями, які відповідають необхідним кінцям фрагмента. Подібним же чином, у разі потреби у фрагментах альбуміну, можуть конструюватись ПЛР праймери, які є комплементарними до внутрішніх послідовностей альбуміну. ПЛР праймери можуть конструюватись також для створення сайтів рестрикції з метою полегшення клонування до векторів експресії. ДНК, що кодує сполуки GLP-1 за цим винаходом, можна одержати за допомогою цілого ряду різних методів, у тому числі за допомогою методів клонування, наприклад, таких, опис яких було наведено перед тим, а також шляхом хімічного синтезування. Хімічний синтез може бути привабливим, приймаючи до уваги коротку довжину пептиду, що кодується. Амінокислотна послідовність для GLP-1, а також послідовність передпроглюкагонового гена були опубліковані. [Лопес (Lopez) та інші, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80: 5485-5489; Белл (Bell) та інші, (1983) Nature, 302: 716-718; Хейндріч Г. (Heinrich G.) та інші, (1984) Endocrinol, 115: 2176-2181; Гігліон Μ. (Ghiglione Μ.), (1984) Diabetologia 27: 599-600]. Таким чином, праймери можуть конструюватись для ПЛР нативних сполук GLP-1 та їхніх фрагментів. Ген, що кодує пептидильований білок, може конструюватись шляхом літування ДНК, що кодує сполуку GLP-1 у межах рамки зчитування, із ДНК, 38 що кодує альбуміновий або Fc білок. Ген, що кодує сполуку GLP-1, і ген, що кодує альбуміновий або Fc білок, може також приєднуватись у межах рамки зчитування через посередництво ДНК, що кодує лінкерний пептид. In vi vo функціонування та стабільність гетерологічних пептидильованих білків за цим винаходом можуть оптимізуватись шляхом додання невеликих пептидних лінкерів для запобігання потенційно небажаних взаємодій доменів. Незважаючи на те що ці лінкери потенційно можуть мати будь-яку довжину і включати будь-яку комбінацію амінокислот, їхня довжина за варіантом, якому віддається перевага, повинна бути не більшою за необхідну для запобігання небажаних взаємодій доменів та/або оптимізування біологічної активності та/або стабільності. Узагалі, лінкери не повинні мати у своєму складі амінокислот із надзвичайно об'ємними боковими ланцюгами або амінокислот, які можуть ввести значну вторинну структуру. За варіантом, якому віддається перевага, лінкер повинен бути збагаченим серином-гліцином і у довжину меншим за 30 амінокислот. За варіантом, якому віддається більша перевага, лінкер у довжину повинен бути меншим за 20 амінокислот. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, лінкер у довжину повинен бути меншим за 15 амінокислот. Лінкер, якому віддається перевага, має у своєму складі повтори послідовності Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. Повторів цієї послідовності за варіантом, якому віддається перевага, повинно бути від 2 до 6. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, повторів цієї послідовності повинно бути від 3 до 4. ДНК, що кодує GLP-1 дикого типу, альбумін, Fc поліпептиди та їхні фрагменти, може піддаватись мутації або перед літування, або у складі кДНК, що кодує пептидильований білок у цілому. У цій галузі відомий цілий ряд методик мутагенезу. Наприклад, у методі мутагенної ПЛР використовують подовжувальний сегмент перекривання нитки для створення мутацій конкретних основ із метою зміни специфічної амінокислотної послідовності відповідного білка. Такий ПЛР мутагенез потребує застосування чотирьох праймерів, причому два з них із прямою орієнтацією (праймери А та С), і два зі зворотною орієнтацією (праймери В та D). Ген-мутант ампліфікується з матриці дикого типу двома різними етапами. На першому етапі відбувається половинчаста ампліфікація гена шляхом здійснення реакції А-»В і окремої реакції C®D, де праймери В і С прицільно спрямовуються на ділянку гена, що піддається мутації. Ці праймери, які мають у своєму складі помилкові парування основ, призначених для зміни, впорядковано розміщуються на ділянці-мішені. Після завершення реакцій А®В і C®D, продукти реакції виділяють і змішують для використання у ролі матриці для реакції A®D. Результатом цієї реакції є одержання повного продукту-мутанта. Після одержання гена, який кодує пептидильований білок у цілому, його можна клонувати до відповідного вектора експресії. Опис 39 81897 специфічних методик, які можна використовувати з метою одержання GLP-1 пептидильованих білків за цим винаходом, наведено у прикладі 1. Загальні методи рекомбінантної експресії гетерологічних пептидильованих білків за цим винаходом Клітини-хазяї трансфікуються або трансформуються векторами експресії або клонування, опис яких наведено, для продукування гетерологічних пептидильованих білків та культивуються у традиційних живильних середовищах, модифікованих відповідним чином для індукування промоторів, вибирання трансформантів або ампліфікації генів, що кодують необхідні послідовності. Умови культивування, такі як живильні середовища, температура, рН тощо, можуть підбиратись досвідченим фахівцем без зайвого експериментування. Узагалі, принципи, протоколи і практичні методи доведення продуктивності клітинних культур до максимального рівня можна знайти у [Mammalian Cell Biotechnology. A Practical Approach, під редакцією Μ. Батлера (Μ. Butler), (IRL Press, 1991) та у книзі Сембрука (Sambrook)], дивись перед тим. Методи трансфекції відомі пересічному фа хівцю, наприклад, СаРО4 та електропорація. Загальні аспекти трансформацій систем клітин-хазяїв ссавців [описані у патенті США №4,399,216]. Трансформації у дріжджах здійснюються, як правило, за методом [ван Солінгена (van Solingen) та інших, J. Bact. 130 (2): 946-7 (1977) та Хсяо (Hsiao) та інших, Рrос. Natl. Acad. Set, USA 76 (8): 3829-33 (1979)]. Використовуватись, однак, можуть і інші методи введення ДНК до клітин, наприклад, шляхом ядерної мікроін'єкції, електропорації, злиття бактеріальних протопластів з інтактними клітинами або за допомогою полікатіонів, наприклад, полібрену або поліомітину. Різні методики трансформування клітин ссавців, [дивись у Кеун (Keown) та інші, Methods in Enzymology 185: 527-37 (1990) та Мансур (Mansour) та інші, Nature 336 (6197): 348-52 (1988)]. До придатних клітин-хазяїв для клонування або експресії нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК) у векторах належать прокаріоти, дріжджі або клітини вищих еукаріотів. Придатними прокаріотами є (однак без обмеження) еубактерії, наприклад, грамнегативні або грампозитивні мікроорганізми, наприклад, Enterobacteriacea, наприклад, Е.соl. Різні штами Е.соlі є загальнодоступними, наприклад, Е.соlі K12 штам ММ294 (АТСС (Американська колекція типових культур) 3 1.446); Е.Соlі XI 776 (АТСС 3 1.537); Е.соlі штам W3 110 (АТСС 27.325) та K5 772 (АТСС 53.635). До інших придатних прокаріотних клітин-хазяїв належать Enterobacteriaceae, такі як Escherichia, наприклад, Е.соlі, Enterobacter, Erwinia, Klebisella, Proteus, Salmonella, наприклад, Salmonella typhimurium, Serratia, наприклад, Serratia marcescans та Shigeila, а також Bacilli, наприклад, B.subtilis та B.lichentformis [наприклад, B.licheniformis 4 1 P, розкрита у DD 266,710, опублікованому 12 квітня 1989 року], Pseudomonas, наприклад, P.aeruginosa та 40 Streptomyces. Ці приклади є, скоріш, ілюстративними, аніж обмежувальними. Штам W3110 є одним з особливо переважних хазяїв або хазяїв-попередників, оскільки це є звичайний штам-хазяїн для ферментації продуктів генної інженерії. За варіантом, якому віддається перевага, клітина-хазяїн секретує мінімальні кількості протеолітичного ферменту. Наприклад, штам W3110 може модифікуватись для здійснення генетичної мутації у генах, що кодують білки, ендогенні для хазяїна. Прикладами таких хазяїв є Е.соlі W3110 штам 1А2, який має повний генотип ronА; Е.соlі W3110 штам 9Е4, який має повний генотип ton4 ptr3; Е.соlі W3110 штам 27С7 (АТСС 55.244), який має повний генотип tonA, ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT/can'; E.coli W3110 штам 40В4, який є штамом 37D6 із неканаміцинрезистентною делеційною мутацією degP; та штам Е.соlі, що має периплазматичну протеазу-мутант, розкриту у [патенті США №4,946,783, який було видано 7 серпня 1990 року]. За альтернативним варіантом придатними є методи клонування in vivo, наприклад, ПЛР або інші нуклеїновокислотні полімеразні реакції. Разом із прокаріотами, придатними хазяями для клонування або експресії векторів пептидильованих білків є мікроби-еукаріоти, наприклад, гіфоміцети (Byphomycetes) або дріжджі. Saccharomyces cerevisiae є загальновживаним нижчим еукаріотним мікроорганізмом-хазяїном. Іншими є Schizosaccharomyces pombe [Біч (Beach) та Нерс (Nurse), Nature 290: 140-3 (1981); ЕР 139,383, опублікований 2 травня 1995 року]; хазяї Mu yveromyces [патент США №4,943,529; Флір (Fleer) та інші, Bio/Technology 9 (10): 968-75 (1991)], наприклад, K.lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574) [де Лувенкур (de Louvencourt) та інші, J. Bacteriol 154 (2): 737-42 (1983)]; K.fiagilis (ATCC 12.424), K.bulgaricus (ATCC 16.045), K.wickeramii (ATCC 24.178), K.waltii (ATCC 56.500), K.drosophilarum (ATCC 36.906) [Ван ден Берг (Van den Berg) та інші, Bio/Technology 8 (2): 135-9 (1990)]; K.thermotoierans та K.marxianus; yarrowia [EP 402,226]; Pichia pastoris (EP 183,070) [Срікришна (Sreekrishna) та інші, J. Basic Microbiol 28 (4): 265-78 (1988)]; Candida; Trichoderma reesia [EP 244,234]; Neurospora crassa [Кейз (Case) та інші, Proc. Natl Acad. Sci. USA 76 (10): 5259-63 (1979)]; Schwanniomyces, наприклад, Schwanniomyces occidentulis [EP 394,538, опублікований 31 жовтня 1990 року]; та гіфоміцети, такі, наприклад, як Neurospora, Penicillium, Tolypocladium [WO 91/00357, опублікований 10 січня 1991 року] та хазяї Aspergillus, наприклад, A.nidulans [Белланс (Ballance) та інші, Biochem. Biophys. Res. Comm. 112 (1): 284-9 (1983)]; [Тілберн (Tilburn) та інші, Gene 26 (2-3): 205-21 (1983); Йелтон (Yelton) та інші, Proc. Natl Acad. Sci. USA 81 (5): 1470-4 (1984)] та A.niger [Келлі (Kelly) та Хайнс (Hynes), EMBO J. 4 (2):475-9 (1985)]. Метилотрофні дріжджі вибирають із роду, який включає Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis та Rhodotoruia. Перелік конкретних 41 81897 видів, які є зразковими для цього класу дріжджів можна знайти у [K. Ентоні (C.Antony), The Biochemistry of Meth ylotrophs 269 (1982)]. Придатні клітини-хазяї для експресії пептидильованих білків за цим винаходом одержують із багатоклітинних організмів. Прикладами клітин безхребетних є клітини комах, наприклад, Drosophila S2 та Spodoptera Sp, Spodoptera high5, а також рослинні клітини. Прикладами придатних ліній клітин-хазяїв ссавців є клітини яєчників китайського хом'ячка (СНО) та клітини лінії COS. Більш специфічними прикладами є лінія CV1 клітин нирок мавпи, трансформованих SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); лінія клітин нирок зародка людини [293 або 293 лінія клітин, субклонованих для вирощування у суспензійній культурі, Грехем (Graham) та інші, J. Gen. Virol, 36 (1): 59-74 (1977)]; клітини яєчників китайського хом’ячка/-DHFR (дигідрофолатредуктаза) [СНО, Урлауб (Urlaub) та Чесін (Chasin), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (7): 4216-20 (1980)]; фолікулярні клітини яєчка мишей [ТМ4, Мазер (Mather), Biol Reprod. 23(1: 243-52 (1980)]; легеневі клітини людини (W138. ATCC CCL 75); клітини печінки людини (Hep G2, НВ 8065); та клітини пухлини гр удних залоз мишей (ММТ 060562, ATCC CCL51). Вибір відповідної клітини-хазяїна, як гадають, знаходиться у межах навичок у цій галузі. Пептидильовані білки за цим винаходом можуть продукуватись безпосередньо методами генної інженерії або у вигляді білка, який має сигнальну послідовність або інші додаткові послідовності, які утворюють специфічний сайт розщеплення на N-кінці зрілого пептидильованого білка. Узагалі, сигнальна послідовність може бути складовою частиною вектора або вона може бути частиною ДНК, що кодує пептидильований білок і вставляється до вектора. Сигнальною послідовністю може бути прокаріотна сигнальна послідовність, вибрана, наприклад, із групи, яка включає лужну фосфа тазу, пеніциліназу, Ірр, або лідерні послідовності термостабільного ентеротоксину II. Для дріжджової секреції сигнальною послідовністю може бути, наприклад, лідерна послідовність дріжджової інвертази, лідерна послідовність альфа-фактора (у тому числі лідерні послідовності á-факторів Saccharomyces та Kluyveromyces, опис останньої наведено у [патенті США №5,010,182]) або лідерна послідовність кислої фосфатази, лідерна послідовність глюкоамілази C.albicans [ЕР 362,179], або сигнал, опис якого наведено у публікації [WO 90/13646]. Для експресії у клітинах ссавців можуть використовуватись сигнальні послідовності ссавців для спрямування секреції білка, наприклад, сигнальні послідовності секретованих поліпептидів того ж самого або спорідненого виду, а також вірусні секреторні лідерні послідовності. Як вектори експресії, так і вектори клонування мають у своєму складі нуклеїновокислотну послідовність, що надає вектору можливість до розмноження у одній або декількох вибраних клітинах-хазяях. Такі послідовності добре відомі 42 для цілого ряду бактерій, дріжджів та вірусів. Сайт ініціювання реплікації з плазміди pBR322 є придатним для більшості грамнегативних бактерій, сайт ініціювання реплікації 2u є придатним для дріжджів і різні сайти ініціювання реплікації (SV40, поліома, аденовірус, VSV (вір ус везикулярного стоматиту) або BPV (вірус папіломи великої рогатої худоби) є придатними для клонування векторів у клітинах ссавців. Вектори експресії та клонування, як правило, мають у своєму складі вибірковий ген, який називають також селектованим маркером. Типовий вибірковий ген кодує білки, які (а) надають резистентність до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, до ампіциліну, неоміцину, метотрексату або тетрацикліну, (b) доповнюють автотрофн у недостатність або (с) постачають критичні живильні речовини, недоступні з комплексних живильних середовищ, наприклад, ген, що кодує рацемазу D-аланіну для Bacilli. Прикладами придатних селектованих маркерів для клітин ссавців є такі маркери, що забезпечують можливість ідентифікації клітин, компетентних для поглинання нуклеїнової кислоти, що кодує пептидильований білок, наприклад, DHFR або тимідинкіназа. Придатною клітиноюхазяїном, у разі використання DHFR дикого типу, є лінія клітин СНО, дефіцитна за активністю DHFR, яку одержали й розмножили за описом [Урлауб (Urlaub) та Чесін (Chasin), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77 (7): 4216-20 (1980)]. Придатним вибірковим геном для використання у дріжджах є ген trp1, присутній у дріжджовій плазміді Yrp7 [Стінчкомб (Stinchcomb) та інші, Nature 282 (5734): 39-43 (1979); Кінгсмен (Kingsman) та інші, Gene 7 (2): 141-52 (1979); Щумпер (Tschumper) та інші, Gene 10 (2): 157-66 (1980)]. Ген trp1 забезпечує вибірковий маркер для штаму-мутанта дріжджів, позбавленого здатності до росту у триптофані, наприклад, АТСС №44076 або РЕРС1 [Джоне (Jones), Genetics 85: 23-33 (1977)]. Вектори експресії та клонування, як правило, мають у своєму складі промотор, функціонально зв'язаний із нуклеїновокислотною послідовністю, що кодує пептидильований білок, для спрямування синтезу мРНК. Добре відомі промотори, що розпізнаються різноманітними потенційними клітинами-хазяями. Промоторами, придатними для використання із прокаріотними хазяями, є промоторні системи β-лактамази та лактози [Чанг (Chang) та інші, Nature 275 (5681): 617-24 (1978); Геддел (Goeddel) та інші, Nature 281 (5732): 544-8 (1979)], лужна фосфатаза, промоторна система (позитивна) триптофану [Геддел (Goeddel), Nucleic Acids Res. 8 (18): 405774 (1980); ЕР 36,776, опублікований 30 вересня 1981 року] та гібридні промотори, наприклад, tatпромотор [де Бер (de Boer) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1): 21-5 (1983)]. Промотори для застосування у бактеріальних системах також будуть мати у своєму складі послідовність ШайнаДалгарно (S.D), функціонально зв'язану із ДНК, що кодує пептидильований білок. Прикладами придатних промоторних послідовностей для застосування із дріжджовими 43 81897 хазяями є промотори для 3-фосфогліцераткінази [Хіцман (Hitzeman) та інші, J. Biol. Chem. 255 (24): 12073-80 (1980)] або інших гліколітичних ферментів [Гесс (Hess) та інші, J Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Голланд (Holland), Biochemistry 17 (23): 4900-7 (1978)], наприклад, енолази, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази, гексокінази, піруватдекарбоксилази, фосфо фр уктокінази, глюкозо-6фосфа тоізомерази, 3-фосфогліцератмутази, піруваткінази, триозефосфатізомерази, фосфоглюкозоізомерази та глюкокінази. Іншими дріжджовими промоторами, які представляють собою індуцибельні промотори, що мають додаткову перевагу, яка полягає у транскрипції, контрольованій умовами росту, є промоторні ділянки для алкогольдегідрогенази 2, ізоцитохрому С, кислої фосфатази, деградаційних ферментів, пов'язаних із метаболізмом азоту, металотіонеїну, гліцеральдегід-3фосфа тдегідрогенази та ферментів, відповідальних за утилізацію мальтози та галактози. Придатні вектори та промотори для застосування у дріжджовій експресії описані також у [ЕР 73,657]. Транскрипція мРНК, що кодує пептидильовані білки, з векторів у клітинах-хазяях ссавців, може контролюватись, наприклад, промоторами, одержаними з геномів вірусів, наприклад, вірусу поліоми, вірусу віспи птиці, аденовірусу (наприклад, аденовірусу 2), вірусу папіломи великої рогатої худоби, вір усу саркоми птиці, цитомегаловірусу, ретровірусу, вірусу гепатиту В та мавпячого вірусу 40 (SV40), із гетерологічних промоторів ссавців, наприклад, промотору актину або промотору імуноглобуліну, та із промоторів теплового шоку, за умови, що такі промотори є сумісними з системами клітин-хазяїв. Транскрипція вищими еукаріотами полінуклеотиду, що кодує пептидильований білок, може підсилюватись шляхом уведення до вектора енхансерної послідовності. Енхансерами є цисдіючі елементи ДНК, як правило, у межах від 10п.н. до 300п.н., які діють на промотор для підсилення його транскрипції. Зараз відомо багато енхансерних послідовностей із генів ссавців (глобін, еластаза, альбумін, α-кетопротеїн та інсулін). За типовим варіантом, однак, використовува тись буде енхансер з еукаріотного клітинного вірусу. Прикладами є енхансер SV40 на пізній стороні сайту ініціації реплікації (п.н. 100270), енхансер раннього промотору цитомегаловірусу, енхансер поліоми на пізній стороні сайту ініціації реплікації та аденовірусні енхансери. Енхансер може сплайсуватись у векторі у положенні 5' або 3' до кодувальної послідовності пептидильованого білка, однак за варіантом, якому віддається перевага, він розміщується на ділянці 5' від промотору. Вектори експресії, які використовуються у еукаріотних клітинах-хазяях (дріжджі, гриби, комахи, рослини, тварини, людина або клітини, що містять ядра, інших багатоклітинних організмів) будуть також мати у своєму складі послідовності, необхідні для закінчення транскрипції та для стабілізації мРНК. Такі послідовності є 44 загальнодоступними з 5', інколи з 3' нетрансльованих ділянок еукаріотних або вірусних ДНК або кДНК. Ці ділянки включають нуклеотидні сегменти, транскрибовані як поліаденіловані фрагменти, до нетрансльованої частини мРНК, що кодує пептидильований білок. З культурального середовища або з лізатів клітин-хазяїв можуть виділятись різні форми пептидильованого білка. У разі, коли він є зв'язаним із мембраною, вивільнити його можна за допомогою відповідного розчину поверхневоактивної речовини (наприклад, тритону-Х 100) або шляхом ферментативного розщеплення. Клітини, які використовуються у експресії пептидильованого білка, можуть руйнуватись різними фізичними або хімічними засобами, наприклад, періодичними циклами заморожування-відтаювання, ультразвуком, механічнім шляхом або за допомогою фактора лізису клітин. Очищення гетерологічних пептидильованих биків за цим винаходом Після експресії гетерологічних пептидильованих білків за цим винаходом у придатній клітині-хазяїні, аналоги можуть виділятись та очищатись. Наведені далі процедури є прикладами придатних процедур очищення: фракціонування на карбоксиметилцелюлозі; гель-фільтрація, наприклад, на Сефадекс G-75; аніонообмінна смола, наприклад, DEAE (діетиламіноетилцелюлоза) або Mono-Q; катіонний обмін, наприклад, на СМ (карбоксиметилсефадекс) або Mono-S; протеїн А-сефароза для видалення домішок, наприклад, IgG; металхелатні колонки для зв'язування епітоп-мічених форм поліпептиду; високоефективна рідинна хроматографія зі зворотною фазою; хроматофокусування; силікагель; осадження етанолом; та осадження сульфатом амонію. Можуть застосовува тись різноманітні методи очищення білка. Такі методи у цій галузі відомі й описані, наприклад, у [Дойчер (Deutscher), Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) та Скоупс (Scopes), Protein Purification: Principles and Practice, SpringerVerlag, NY (1982)]. Вибір етапу (етапів) очищення буде залежати від природи застосованого технологічного процесу та конкретного продукованого пептидильованого білка. Наприклад, пептидильовані білки, які включають Fc-фрагмент, можуть ефективно очищатись за допомогою Протеїн А- або Протеїн G-афінної матриці. Для елюювання пептидильованого білка з афінної матриці можуть використовуватись буферні розчини з низьким або високим рН. М'які умови елюювання допоможуть попередити незворотну денатурацію пептидильованого білка. Використовуватись можуть також буферні розчини, до складу яких входить імідазол. У Прикладі 3 наведено опис деяких успішних протоколів очищення для пептидильованих білків за цим винаходом. Визначення характеристик гетерологічних пептидильованих білків за цим винаходом 45 81897 Існують численні методи визначення характеристик пептидильованих білків за цим винаходом. Деякими з цих методів є: електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (ДСНПААГЕ) у поєднанні з методами забарвлювання білка або імуноблотингом із використанням антиIgG або анти-HSA антитіл. Деякі інші методи, з числа багатьох, включають мас-спектрометрію з іонізацією методом лазерної десорбції у матричному розчині (MALDI-MS), рідинну хроматографію/мас-спектрометрію, ізоелектричне фокусування, аналітичний аніонний обмін, хроматофокусування та круговий дихроїзм. Характеристики репрезентативної кількості гетерологічних пептидильованих білків були визначені за допомогою ДСН-ПААГЕ у поєднанні з імуноблотингом, а також із мас-спектрометрією (Дивись Приклади 4 та 5 і Фіг.3 та 4). Наприклад, таблиця 3 (дивись Приклад 5) ілюструє обчислену молекулярну масу для репрезентативної кількості пептидильованих білків, а також масу, яка була визначена засобами мас-спектрометрії. Крім того, Фіг.3 та Фіг.4 ілюструють молекулярну масу репрезентативної кількості пептидильованих білків, визначену ДСНПААГЕ. Усі випробувані гетерологічні пептидильовані білки експресувались та секретувались тимчасово. Крім того, IgK сигнальна послідовність була розщеплена для одержання білків із відповідним N-кінцем. Крім того, таблиця 3 ілюструє, що у деяких випадках маса, визначена мас-спектрометрією, є більшою за очікувану. Це є результатом глікозилування Fc-фрагмента та С-кінцевого подовження. Шляхом ферментативного розщеплення пептидильованих білків із подальшими високоефективним рідинним хроматографуванням із зворотною фазою та масспектрометрією можна ідентифікувати пептидні фракції, до складу яких входять цукрові складові. Ці фракції у подальшому можна піддати секвенуванню з метою визначення N-кінцевих амінокислотних послідовностей для ідентифікування потенційної ділянки глікозилування. Наприклад, визначення характеристик екзендин-4-Fc (Послідовність №29) показує, що серии у положенні 39 та треонін у положенні 50 є О-зв'язаними глікозилованими, а аспарагін у положенні 122 є N-зв'язаним глікозилованим. Репрезентативна кількість GLP-1 пептидильованих білків була також перевірена на активність. Існують численні методи виявлення активності GLP-1 in vitro та in vivo (дивись Приклади 6, 7, 8 та 9). Таблиця 4 (Приклад 6) ілюструє GLP-1 рецепторну активність, пов'язану з декількома зшивками GLP-1. Наведені цифри мають відношення до активності, пов'язаної з Val8GLP-1(7-37)OH. Усі перевірені пептидильовані білки мали GLP-1 рецепторну активність. Низький рівень активності in vitro не обов'язково вказує на слабкий ефект in vivo. Завдяки значному збільшенню періоду напіввиведення цих пептидильованих білків, слабка активність in vitro, 46 як правило, не є показником слабкої активності in vi vo. Фіг.7 та Приклад 7 ілюструють збільшений період напіввиведення, пов'язаний із пептидильованими білками за цим винаходом. Наприклад, Val8-GLP-1-Fc у мавп мав період напіввиведення приблизно 45 год, Val8-GLP-1-HSA у мавп мав період напіввиведення приблизно 87год., Gly8-Glu22-GLP-1-CEx-лінкер-IgG1 мав період напіввиведення у собак, у разі інтравенозного (IV) уведення приблизно 55год. і Gly8-Glu22-GLP-1-CEx-лінкер-IgG1 мав період напіввиведення у собак, у разі підшкірного (SC) уведення приблизно 38год. Композиції за цим винаходом Фізична стабільність є також суттєвою особливістю терапевтичних білкових композицій. Зі сполуками GLP-1 пов'язані особливі труднощі їх одержання та виготовлення композицій завдяки структурним змінам, які відбуваються під час обробки. Наприклад, деякі сполуки GLP-1 мають загальну тенденцію до агрегування. Крім того, було показано, що деякі сполуки GLP-1 перетворюються з розчинної та активної αспіральної форми на нерозчинну та потенційно неактивну β-складчасту форму. Зшивання сполук GLP-1 із великими білками, наприклад, Fcфрагментом lgG або альбуміном, не тільки впливає на збільшення періоду напіввиведення сполуки GLP-1, але також сприяє фізичній та конформаційній стабільності сполуки GLP-1. Наприклад, Val8-GLP-лінкер-НSА залишається стабільним у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (PBS) при температурі 37°С впродовж 30 днів. Гетерологічні пептидильовані білки за цим винаходом можуть вводитись до складу композиції з одним або декількома наповнювачами. Активні пептидильовані білки за цим винаходом можуть комбінуватись із фармацевтично прийнятним буфером із регулюванням рН для забезпечення прийнятної стабільності та одержання рН, прийнятного для введення, наприклад, парентерального введення. Факультативно, може додаватись один або декілька фармацевтично прийнятних антимікробних агентів. Фармацевтично прийнятними антимікробними агентами, яким віддається перевага, є мета-крезол та фенол. Для регулювання іонної сили або ізотонічності може додаватись одна або декілька фармацевтично прийнятних солей. Для додаткового регулювання ізотонічності композиції може додаватись один або декілька наповнювачів. Прикладом наповнювача, придатного для регулювання ізотонічності, є гліцерин. Фармацевтично прийнятні засоби, придатні для введення людині або іншій тварині, не мають у своєму складі токсичних елементів або небажаних домішок і не перешкоджають активності активних сполук. У цьому винаході може застосовуватись фармацевтично прийнятна сольова форма гетерологічних пептидильованих білків за цим винаходом. Кислотами, які традиційно застосовуються для одержання солей кислот, є неорганічні кислоти, наприклад, хлористоводнева 47 81897 кислота, бромистоводнева кислота, йодистоводнева кислота, сірчана кислота, фосфорна кислота тощо, та органічні кислоти, наприклад, р-толуолсульфонова кислота, метансульфонова кислота, щавлева кислота, рбромфенілсульфонова кислота, вугільна кислота, бурштинова кислота, лимонна кислота, бензойна кислота, оцтова кислота тощо. Перевага віддається солям кислот, одержаним за допомогою мінеральних кислот, таких як хлористоводнева кислота та бромистоводнева кислота. До солей основ належать солі, одержані за допомогою неорганічних основ, наприклад, гідроксидів, карбонатів, бікарбонатів амонію, лужних або лужноземельних металів тощо. До таких основ, придатних для одержання солей за цим винаходом, належать, таким чином, гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид амонію, карбонат калію тощо. Уведення композицій Уведення може здійснюватись будь-яким шляхом, ефективність якого є відомою пересічному лікарю. Одним із таких методів є введення периферичним, парентеральним шляхом. Парентеральне введення у медичній літературі традиційно розуміється, як упорскування дозованої форми до організму за допомогою стерильного шприца або іншого механічного пристрою, наприклад, інфузійного насоса. Периферичні, парентеральні шляхи можуть включати інтравенозні, внутрішньом'язові, підшкірні та внутрішньоочеревинні шляхи введення. Гетерологічні пептидильовані білки за цим винаходом можуть також бути придатними для введення пероральним, ректальним, назальним або респіраторним (нижні відділи дихальних шляхів) шля хами, які не є парентеральними шляхами. З цих непарентеральних шляхів перевага віддається пероральному введенню та введенню до нижніх відділів ди хальних шляхів. Пептидильовані білки за цим винаходом можуть застосовуватись для лікування найрізноманітніших захворювань та станів. Пептидильовані білки за цим винаходом здійснюють свої біологічні ефекти, головним чином, шляхом дії на рецептор, який називають "рецептором GLP-1". Суб'єкти із хворобами та/або станами, які благотворно реагують на стимуляцію рецептора GLP-1 або на введення сполук GLP-1 можуть, таким чином, лікуватись GLP-1 пептидильованими білками за цим винаходом. Кажуть, що ці суб'єкти "потребують лікування сполуками GLP-1" або "потребують стимулювання рецептора GLP-1". Сюди входять суб'єкти з інсулінонезалежним діабетом, інсулінозалежним діабетом, інсультом [дивись WO 00/16797], інфарктом міокарда [дивись WO 98/08531], ожирінням [дивись WO 98/19698], катаболічними змінами після хірургічного втручання [дивись патент США №6,006,753], функціональною диспепсією та синдромом подразненої товстої кишки [дивись WO 99/64060]. Сюди також входять суб'єкти, які потребують превентивного лікування 48 сполукою GLP-1, наприклад, суб'єкти із групи ризику розвитку інсулінонезалежного діабету [дивись WO 00/07617]. До групи ризику розвитку інсулінонезалежного діабету належать суб'єкти зі зниженою толерантністю до глюкози або зниженими рівнями глюкози крові натщесерце, суб'єкти, маса тіла яких на приблизно 25% перевищує нормальну масу тіла для зросту та будови тіла суб'єкта, суб'єкти з частковою резекцією підшлункової залози, суб'єкти, один або обидва батьки яких мають інсулінонезалежний діабет, суб'єкти, які мають діабет, обумовлений вагітністю, та суб'єкти, які мають гострий або хронічний панкреатит. "Ефективною кількістю" сполуки GLP-1 є кількість, яка викликає необхідний терапевтичний та/або профілактичний ефект, не викликаючи неприйнятних побічних ефектів у разі введення суб'єкту, який потребує стимулювання рецептора GLP-1. "Необхідний терапевтичний ефект" включає один або декілька з наведених далі пунктів: 1) поліпшення симптому (-ів), пов'язаних із захворюванням або станом; 2) затримка появи симптомів, пов'язаних із захворюванням або станом; 3) підвищення тривалості життя, порівняно з відсутністю лікування; та 4) вища якість життя, порівняно з відсутністю лікування. Наприклад, "ефективною кількістю" сполуки GLP-1 для лікування діабету є така кількість, яка забезпечить краще регулювання концентрації глюкози у крові, порівняно з відсутністю лікування, що забезпечить затримку появи діабетичних ускладнень, наприклад, ретинопатії, невропатії або захворювання нирок. "Ефективною кількістю" сполуки GLP-1 для профілактики діабету є така кількість, яка затримає, порівняно з відсутністю лікування, появу підвищених рівнів глюкози у крові, які потребують лікування за допомогою антигіпоглікемічних лікарських засобів, наприклад, сульфонілсечовини, тіазолідиндіонів, інсуліну та/або бісгуанідинів. Доза пептидильованого білка, ефективна для нормалізації рівня глюкози у крові пацієнта буде залежати від ряду факторів, до яких належать (без обмеження), стать суб'єкта, маса та вік, ступінь(тяжкість) нездатності регулювання рівнів глюкози у крові, шлях уведення та біодоступність, фармакокінетичний профіль пептидильованого білка, активність та композиція. Цей винахід включає сполуки GLP-1, які мають поліпшені біохімічні та біофізичні властивості унаслідок зшивання з альбуміновим білком, фрагментом альбуміну, аналогом альбуміну, Fc білком, Fc фрагментом або Fc аналогом. Ці гетерологічні білки можуть успішно експресуватись у клітинах-хазяях, зберігати активність передачі сигналу, пов'язану з активацією рецептора GLP-1, і мають подовжений період напіввиведення. Наведені далі приклади представлені для додаткового опису цього винаходу. Обсяг цього винаходу не повинен розглядатись як такий, що обмежується наведеними далі прикладами. Фахівцям у цій галузі зрозуміло, що конкретні реактиви, обладнання та процедури, опис яких наведено, є лише ілюстративними і не 49 81897 призначеними для обмеження цього винаходу будь-яким чином. Приклад 1: Конструювання ДНК, що кодує гетерологічні пептидильовані білки Приклад 1а. Конструювання ДНК, що кодує Val8-GLP-1(7-37)-Fc: Fc-фрагмент людського IgG1 виділяли з бібліотеки кДНК і він мав у своєму складі повну шарнірну ділянку та константні ділянки СН2 та СН3 важкого ланцюга імуноглобуліну. Фрагмент, який включає 696п.н. цього Fc-фрагмента людського IgG1, субклонували до сайтів Nhel та Есо47lll вектора експресії pJB02 ссавців для одержання pJB02/Fc (дивись Фіг.5). ДНК, що кодує сигнальну послідовність секреції IgK, зшиту з Val 8GLP-1(7-37), одержали шляхом гібридизації in vitro чотирьох комплементарних олігонуклеотидів, що перекриваються: Реакцію гібридизації здійснювали з використанням еквівалентної кількості кожного олігонуклеотиду (1пм/мкл кінцевої концентрації для кожного олігонуклеотиду). Суміш олігонуклеотидів нагрівали впродовж 5хв. при температурі 100°С у буфері для літування (50мМ розчин трис-буфера-НСІ, рН7,5, 10мМ розчин MgCl2, 10мМ розчин дитіотреїтолу (DTT), 1мМ розчин аденозин-5'-трифосфату (АТР), 25мкг/мл розчин сироваткового альбуміну великої рогатої худоби), після чого охолоджували впродовж принаймні 2год. до температури 30°С. Одержаний продукт гібридизації літували впродовж 2год. при кімнатній температурі або впродовж ночі при температурі 16°С до остова вектора pJB02/Fc, який розщеплювали за допомогою Nhel та Есо47lll. Продукти літування використовували для трансформування компетентних клітин XL-1 Blue (компанія Stratagene). Рекомбінантні плазміди перевіряли на присутність інсерційних сегментів, що кодують білок, шляхом розщеплення клонів за допомогою Ncol (кодує послідовність Козака та перший Met сигнального пептиду) та секвенування. Експресійну плазміду, яку одержали й використали для аналізу трансфекції, було позначено як pJB02V8-GLP-1-Fc (Фіг.5). Приклад 1b. Конструювання ДНК, що кодує Val8-GLP-1(7-37)-HSA: Плазміду HSA/pcDNA3.1GS купили від компанії Invitrogen (№ за каталогом H-M12523VpcDNA3.1/GS) і використали як матрицю для виділення кДНК, що кодує людський сироватковий альбумін (HSA). кДНК HSA одержали за допомогою ПЛР, де ДНК, що кодує лідерну 50 послідовність, а також шість амінокислотних пропептидів видалили з 5' кінця. Крім того, стопкодони додавали безпосередньо на 3' кінці кодувальної послідовності HSA. І, нарешті, ділянки рестрикції були сконструйовані на 5' і 3' кінці для полегшення клонування. Послідовність ДНК HSA, присутня у вихідному векторі, який було закуплено від компанії Invitrogen, мала у своєму складі точкову мутацію на 3' кінці гена (положення 667), порівняно з нативною людською послідовністю. Наслідком цієї мутації був кодон для Asn замість Asp. Таким чином, за допомогою мутагенезу методом ПЛР із перекриттям ланцюгів, який обговорювався перед тим, кодон змінили на код для Asp у цьому положенні. Одержану ДНК, що кодує HSA, клонували на сайти Nhel та Hindlll pJB02 для одержання pJB02-HSA (Фіг.6). Лідерну послідовність IgK, зшиту з послідовністю Val8-GLP-1(7-37), одержали, як обговорювалось у Прикладі 1а. Цю ДНК літували із сайтами Nhel та Fspl pJB02-HSA для одержання pJB02-Val8-GLP-1-HSA. Приклад 1с: Конструювання ДНК, що кодує Val8-GLР-1(7-37)-лінкер-HSA: Вектор pJB02-HSA одержали, як обговорювалось у Прикладі 1b. ДНК, що кодує лінкерну послідовність [GGGGS]3, лі тували у межах рамки зчитування з 5' кінцем ДНК, що кодує HSA, для одержання рJВ02-лінкер-НSА (Фіг.7). ДНК, що кодує лідерну послідовність IgK, зшиту з послідовністю Val8-GLP-1(7-37) і 5' кінцем лінкерної послідовності, одержали, як обговорювалось у прикладі 1а. Цю ДНК літували із сайтами Nhel та BspEI pJB02 для одержання pJB02-Val8-GLP-1-лінкер-HSA. Приклад 1d: Конструювання ДНК, що кодує екзендин-4-Fc: Плазміду pJB02/Fc одержали, як описано у Прикладі 1а. ДНК, що кодує сигнальну послідовність IgK, зшиту з екзендином-4, одержали шляхом гібридизації in vitro наведених далі комплементарних олігонуклеотидів, що перекриваються: Реакцію гібридизації здійснювали, як описано у Прикладі 1а. Продукт гібридизації літували з вектором pJB02, який розщеплювали за 51 81897 допомогою Nhel та Есо47lll, як описано у Прикладі 1а, для одержання рJB02-екзендин-4-Fc. Приклад 1е. Конструювання ДНК, що кодує екзендин-4-HSA: Плазміду pJB02-HSA одержали, як описано у Прикладі 1b. ДНК, що кодує сигнальну послідовність IgK, зшиту з екзендином-4, одержали шляхом гібридизації in vitro тих само комплементарних олігонуклеотидів, що перекриваються, опис яких було наведено у Прикладі 1d. Реакції гібридизації здійснювали також, як було описано перед тим. ДНК клонували до специфічних сайтів Nhel та Fspl у pJB02-HSA для одержання рJВ02-екзендин-4-HSA. І Приклад 1f. Конструювання ДНК, що кодує екзендин-4-лінкер-НSА: Плазміду рJВ02-лінкер-НSА конструювали, як описано у Прикладі 1с. ДНК, що кодує сигнальну послідовність IgK, зшиту з екзендином-4 і 5' кінцем лінкерної послідовності, одержали, як у Прикладі 1d. Цю ДНК клонували до специфічних сайтів Nhel та BspEI у рJВ02-лінкер-НSА для одержання pJB02-екзендин-4-лінкер-НSА. Приклад 1g. Конструювання ДНК, що кодує Val8-GLP-1/C-Ex-Fc: Плазміду рJВ02-екзендин-4-Fс одержали, як описано у Прикладі 1d. ДНК, що кодує екзендин-4, вирізували з вектора за допомогою Agel та Есо47lll. ДНК, що кодує Val8-GLP-1/C-Ex, одержали шляхом гібридизації in vitro наведених далі комплементарних олігонуклеотидів, що перекриваються: Реакцію гібридизації здійснювали, як описано у Прикладі 1а. Продукт гібридизації літували на місце екзендину-4 до вектора експресії pJB02екзендин-4-Fc для одержання pJB02-Val8-GLP-1/CEx-Fc. Приклад 1h. Конструювання ДНК, що кодує Val8-Glu22-GLP-1-Fc: Плазміду pJB02-екзендин-4-Fс одержали, як описано у Прикладі 1d. ДНК, що кодує екзендин-4, вирізували з вектора за допомогою Agel та Есо47lll. ДНК, що кодує Val8-Glu22-GLP-1, одержали шляхом гібридизації in vitro наведених далі комплементарних олігонуклеотидів, що перекриваються: 52 Реакцію гібридизації здійснювали, як описано у Прикладі 1а. Продукт гібридизації літували на місце екзендину-4 до вектора експресії pJB02екзендин-4-Fc для одержання pJB02-Val8-Glu22GLP-1-Fc. Приклад 1і. Конструювання ДНК, що кодує Val8-Glu22-GLP-1/C-Ex-Fc: Плазміду рJВ02-екзендин-4-Fс одержали, як описано у Прикладі 1d. ДНК, що кодує екзендин-4, вирізували з вектора за допомогою Agel та Есо47lll. ДНК, що кодує Val8-Glu22-GLP-1/C-Ex, одержали шляхом гібридизації in vitro наведених далі комплементарних олігонуклеотидів, що перекриваються: Реакцію гібридизації здійснювали, як описано у Прикладі 1а. Продукт гібридизації літували на місце екзендину-4 до вектора експресії pJB02екзендин-4-Fc для одержання pJB02-Val8-Glu22GLP-1/C-Ex-Fc. Приклад 1j. Конструювання ДНК, що кодує Gly8-GLP-1-Fc: Плазміду рJВ02-екзендин-4-Fс одержали, як описано у Прикладі 1d. ДНК, що кодує екзендин-4, вирізували з вектора за допомогою Agel та Есо47lll. ДНК, що кодує Gl y8GLP-1, одержали шляхом гібридизації in vitro наведених далі комплементарних олігонуклеотидів, що перекриваються: 53 81897 Реакцію гібридизації здійснювали, як описано у Прикладі 1а. Продукт гібридизації літували на місце екзендину-4 до вектора експресії pJB02екзендин-4-Fc для одержання pJB02-Gly8-GLP-1Fc. Приклад 2: Експресія гетерологічних пептидильованих білків Експресію пептидильованих білків, які кодувались генно-інженерними конструкціями Прикладу 1, здійснювали тимчасовим трансфікуванням клітин НЕK 293EBNA (як таких, що прикріпились, так і таких, що знаходились у суспензії). Клітини підраховували та висіювали за 24год. до трансфекції. Трансфекційну суміш одержували шляхом змішування трансфекційного реактиву FuGene™6 (компанія Roche Molecular Biochemicals, №за каталогом 1814443) із мінімальним підтримувальним середовищем OptiMEM (компанія Gibco/BRL) і інкубували при кімнатній температурі впродовж 5хв., після чого додавали ДНК і суміш додатково інкубували впродовж 15хв. Безпосередньо перед трансфекцією до планшета додавали свіже ростове середовище. У Таблицях 1 та 2 наведено додаткові подробиці трансфекції. 54 послідовних днів. Як правило, лише 10 зборів використовували для подальшого очищення білка. Приклад 3: Очищення гетерологічних пептидильованих білків Приклад 3а. Очищення Val8-GLP-1-Fc Приблизно 4,5л кондиціонованого середовища (рівень експресії пептидильованого білка приблизно 20мкг/мл) після великомасштабної трансфекції фільтрували за допомогою фільтрувальної системи CUNO і концентрували до 250мл за допомогою системи фільтрування з тангенціальним потоком ProFlux на фільтрувальній мембрані 10K. Val8-GLP-1-Fc вводили до 5мл колонки НіТrар для виділення білка А у 1 ´PBS (забуференому фосфатом фізіологічному розчині), рН7,4, зі швидкістю потоку 2мл/хв. і елюювали 50мМ розчином лимонної кислоти (рН3,3). Фракції (1мл) збирали до пробірок, які містили 4мл 1´PBS та 100мкл 1Μ розчину трис-буфера (рН8). Фракції, що включали пептидильований білок (за даними ДСН-ПААГЕ та високоефективної рідинної хроматографії зі зворотною фазою на Zorbax C8) змішували та вводили до колонки Superdex 75 60/60 у 1´PBS (рН7,4) із швидкістю потоку 10мл/хв. Позитивні фракції (20мл/пробірку) Таблиця 1 збирали та об'єднували. Після цього об'єднані фракції піддавали хроматографуванню зі Реактив и, які були в икористані під час тимчасов ої трансфекції клітин 293EBNA зворотною фазою С4 у 0,1% водному розчині трифтороцтової підтримув альне швидкістю потоку Посудина для Кількість в исіяних Мінімальне кислоти зі Об'єм ростов ого ДНК (мкг) FuGene, мкл 3мл/хв.середов ище OptiMEM (мл) середов ища (мл) Val8-GLP-1-Fc елюювали градієнтом від культивування тканин клітин 35мм 1,5 95% В (0,1% розчин трифтороцтової кислоти у 0,102 2 5´105 ацетонітрилі) до 100% В упродовж 70хв. Фракції 100мм 12 73 0,820 10 2´106 елюенту (3мл/пробірку) збирали. Ацетонітрил 700cм 2 (RB) 65 400 4,0 100 2´107 видаляли вакуумним сушінням і додавали 1мл Н2О. (КВ)=бутель, вміст якого переміщується під час його обертання Очи щений зразок (приблизно 32мл) двічі діалізували проти 4л 1´PBS (рН7,4). Після цього діалізований зразок фільтрували Таблиця і на 0,22мкм фільтрувальній установці MILLEX-GV 2 визначали концентрацію за оптичною густиною Склад жив ильних середовищ при 280нм. Приклад збирання клітин, Val8-GLP-1-HSA або Ростов е та трансфекщйне середовище Середов ище для 3b. Очищення які в иросли у культурі 8 Val -GLP-1-лінкер-HSA Модифіков ане за способом Дульбекко середов ище Ігла F12 Hybritech base Приблизно 6,5л кондиціонованого середовища 3:1 2+ (рівень пептидильованого білка 5% сироватка зародка в еликої рогатої худоби 1мМ розчин Саекспресії приблизно 10мкг/мл) фільтрували за допомогою 20мМ розчин ГЕПЕС-буфера 20мМ розчин ГЕПЕС-буфера 2мМ розчин L-глутаміну Розчин (1мкг/мл) нуселину (людський інсулін) фільтрувальної системи CUNO і концентрували до Розчин (50мкг/мл) генетицину (G418 ΝΕΟ) Розчин (1мкг/мл) людського трансферину фільтрування з 380мл за допомогою системи Розчин (50мкг/мл) тоброміцину Розчин (50мкг/мл) тоброміцину тангенціальним потоком ProFlux на фільтрувальній мембрані 10K. Для маломасштабної трансфекції (посудини Пептидильований білок уводили до 50мл 35мм-10мм) клітини промивали забуференим колонки Fast Row Q (компанія Pharmacia) у 20мМ фосфа том фізіологічним розчином і переносили розчині трис-буфера (рН7,4) зі швидкістю потоку на середовище для збирання клітин, які виросли у 5мл/хв. Білок елюювали градієнтом: від 0% до 50% культурі, через 24год. після трансфекції. 20мМ розчину трис-буфера (рН7,4), 1Μ розчин Середовище збирали й замінювали кожні 24год. NaCl у 10 постійних об'ємах, потім до 100% В у 2 упродовж декількох днів. У разі великомасштабної постійних об'ємах. 2 трансфекції (700см бутлі, вміст яких Фракції, що включали пептидильований білок, перемішується під час їх обертання), бутлі, вміст змішували й піддавали хроматографуванню зі яких перемішується під час їх обертання, зворотною фазою С4 у 0,1% водному розчині промивали забуференим фосфатом фізіологічним трифтороцтової кислоти зі швидкістю потоку розчином через 48год. після трансфекції і до них 5мл/хв. Пептидильований білок елюювали вносили середовище для збирання клітин, які градієнтом від 20% В (0,1% розчин виросли у культурі. Середовище збирали й трифтороцтової кислоти у ацетонітрилі) до 90% В замінювали кожні 24год. упродовж принаймні 10 55 81897 упродовж 120хв. Фракції (3,5мл/пробірку) збирали. Ацетонітрил видаляли вакуумним сушінням. Приблизно 9мл змішаного зразка розбавляли 1´PBS (рН7,4) до 40мл і діалізували проти 4л 1´PBS (рН7,4) упродовж ночі. Зразок фільтрували і концентрацію визначали за оптичною густиною при 280нм. Приклад 3с. Очищення екзендин-4-Fc: Приблизно 4л кондиціонованого середовища (рівень експресії пептидильованого білка приблизно 8мкг/мл) фільтрували за допомогою фільтрувальної системи CUNO і концентрували до 250мл за допомогою системи фільтрування з тангенціальним потоком ProFlux на фільтрувальній мембрані 30K. Екзендин-4-Fc вводили до 5мл колонки НіТгар для виділення білка А у 1´PBS (рН7,4) зі швидкістю потоку 2мл/хв і елюювали 50мМ розчином лимонної кислоти (рН3,3). Фракції, що включали пептидильований білок, об'єднували, фільтрували і діалізували проти 4л 1´PBS впродовж ночі. Після цього діалізований зразок уводили до колонки Superdex 75 60/60 у 1´PBS, рН7,4, 0,5Μ розчині NaCl, зі швидкістю потоку 10мл/хв. Фракції (20мл/пробірку), що включали пептидильований білок, збирали, об'єднували й концентрували до приблизно 1мг/мл. Після цього концентровані зразки фільтрували на 0,22мкм фільтрувальній установці MILLEX-GV. Приклад 3d. Очищення екзендин-4-HSA та екзендин-4-лінкер-НSА: Приблизно 1,1л кондиціонованого середовища (рівень експресії пептидильованого білка приблизно 6мкг/мл) фільтрували за допомогою фільтрувальної системи CUNO і концентрували до 175мл за допомогою системи фільтрування з тангенціальним потоком ProFlux на фільтрувальній мембрані 30K. Пептидильований білок уводили до 5мл колонки HiTrap Q-sepharose (компанія Pharmacia) у 20мМ розчині трис-буфера (рН7,4) зі швидкістю потоку 2мл/хв. Білок елюювали градієнтом від 0% до 50% 20мМ розчину трис-буфера (рН7,4), 1Μ розчин NaCl у 12 постійних об'ємах, потім до 100% В у 4 постійних об'ємах. Фракції, що включали пептидильований білок, змішували й піддавали хроматографуванню зі зворотною фазою С4 у 0,1% водному розчині трифтороцтової кислоти зі швидкістю потоку 5мл/хв. Пептидильований білок елюювали градієнтом від 10% В (0,1% розчин трифтороцтової кислоти у ацетонітрилі) до 100% В упродовж 70хв. Фракції, що включали пептидильований білок (10мл/пробірку), збирали. Ацетонітрил видаляли на вакуумній сушарці. Приблизно 8мл об'єднаного зразка діалізували проти 4л 1´PBS (рН7,4) упродовж ночі. Зразок фільтрували і концентрацію визначали за оптичною густиною при 280нм. Після цього діалізований зразок уводили до колонки Superdex 200 26/60 у 1´PBS, рН7,4, 0,5 Μ розчині NaCl, зі швидкістю потоку 2мл/хв. Фракції, що включали пептидильований білок (3мл/пробірку), збирали, об'єднували, концентрували й фільтрували. 56 Приклад 4: Визначення характеристик пептидильованих білків засобами ДСН-ПААГЕ: До ДСН-ПААГЕ з подальшим імуноблотингом удавались для аналізу як очищеного пептидильованого білка, так і кондиціонованого середовища від клітин, трансфікованих різними векторами для експресії пептидильованих білків. ДСН-ПААГЕ проводили на системі Novex Powerease 500 із використанням 16% трисгліцинових збірних гелів Novex (EC6498), протокового буфера (10´, LC2675) та буфера для зразків (L2676). Зразки відновлювали за допомогою 50мМ розчину дитіотреїтолу і перед уведенням до колонки нагрівали впродовж 3-5хв. при температурі 95°С. Після завершення ДСН-ПААГЕ, гель, для видалення додецилсульфату натрію, промивали водою та буфером для блотингу (1´ трисгліциновий Seprabuff (компанія OwlScientific, №ER26-S за каталогом) з 20% метанолу). Використовували блотинг-апарат Novex із PVDF (полівідінілендифторид) (компанія BioRad, №1620174 за каталогом) та нітроцелюлозними мембранами (компанія BioRad, №1703965 або 1703932 за каталогом). Перенесення здійснювали при кімнатній температурі впродовж 90хв. під напругою 30-35В. Мембрани блокували у 1´PBS 0,1% розчином Твін-20 (компанія Sigma, №Р-7949 за каталогом) та 5% розчином молока (компанія BioRad, №170-6404 за каталогом) упродовж 112год. при температурі 4°С. Анти тіла розбавляли 1´PBS+5% розчин молока і блоти інкубували у цих розчинах упродовж 1-2год. при температурі 4°С. Блоти між інкубуваннями чотири рази по 5хв. промивали 1´PBS та 0,2% розчином Твін-20 при кімнатній температурі. PBS готували або з 10´PBS (компанія GIBCO, №70011 за каталогом) з одержанням кінцевої композиції, яка включала 1мМ розчин одноосновного фосфату калію, 3мМ розчин двохосновного фосфату натрію, 153мМ розчин хлориду натрію (рН7,4), або з використанням стандартної розфасовки PBS компанії Sigma (№1000-3 за каталогом) з одержанням 120мМ розчину NaCl, 2,7мМ розчину KCl та 10мМ розчину фосфату (рН7,4) при температурі 25°С. Головними антитілами були або поліклональні козячі анти-IgG1 або кролячі анти-HSA. Вторинним антитілом був або анти-козячий IgG із пероксидазою із хрону (HRP), або анти-кролячий IgG із HRP. Вторинне антитіло розбавляли 1:5000. Для проявлення блотів використовували систему ECL (електрохемілюмінесцентну) (компанія Amersham Pharmacia Biotech, №RN2108 та RPN1674H за каталогом). На Фіг.3А очищений Fc білок порівнюється з кондиціонованими середовищами від pJB02-Val8GLP-1-Fc та рJВ02-екзендин-4-Fс трансфікованих клітин. Зниження рухли вості відповідає збільшенню розміру завдяки GLP-1 частині пептидильованого білка. На Фіг.3В також очищений HSA порівнюється з кондиціонованими середовищами від клітин, трансфікованих pJB02Val8-GLP-1-HSA, pJB02-Val8-GLP-1-лінкер-HSA, рJВ02-екзендин-4-НSА або рJВ02-екзендин-4 57 81897 лінкер-НSА. Фіг.4 ідентифікує препарати очищеного пептидильованого білка. Приклад 5: Визначення характеристик пептидильованих білків за допомогою масспектрометрії: Усі експерименти здійснювали на масспектрометрі Micromass TofSpec-2Т, спорядженому електронним обладнанням для фокусування з часовим запізненням, рефлектроном (який використовували для аналізу пептидів у діапазоні молекулярної маси 0-8000Да), лінійним детектором (який використовували для аналізу відношення висока маса/добрий сигнал) та післяприскорювальним детектором (або P.A.D., який використовували для аналізу відношення висока маса/надзвичайно слабкий сигнал). Ефективна довжина пробігу приладу у лінійному режимі становила 1,2м, у режимі з використанням рефлектрону - 2,3м. Два подвійні мікроканальні пластинчасті детектори були призначені для роботи у лінійному режимі та у режимі роботи з рефлектроном. Використовували азотний лазер VSL-337i (компанія Laser Science Inc.), який працював при 337нм у режимі 5 імпульсів/сек. Дані одержували за таких умов: 2ГГц, 8-бітовий вбудований цифровий перетворювач, усереднення 50 імпульсів/спектр. Прилад експлуатували у лінійному режимі для аналізу експериментальних GLP-1 пептидильованих білків. Лінійний детектор представляє собою прилад, який виявляє іони, що проходять через аналізатор мас-спектрометра з іонізацією методом лазерної десорбції у матричному розчині з часопролітним аналізатором (MALDI-ToF-MS). Він визначає кількість іонів упродовж певного періоду часу і передає сигнал на цифровий перетворювач для перетворення. Цифровий перетворювач представляє собою перетворювач аналогових сигналів на цифрові, завдяки чому сигнал із мас-спектрометра може передаватись на комп'ютер, де він перетворюється на придатний m/z спектр. Перекристалізований насичений розчин синапінової кислоти (розбавленої сумішшю (50/50) ацетонітрилу/Н2О та 0,1% розчину трифтороцтової кислоти) використовували як іонізаційну матрицю. Синапінова кислота є відповідною матрицею для білків із масою, що перевищує 10кДа. Еталонні білки відповідної маси використовувались для створення внутрішніх та зовнішніх калібраційних файлів для точного визначення маси аналізованих зразків. Усі зразки аналізували у розведенні 1:2 (зразок:матриця). На початку роботи лінійний детектор приладу настроювали таким чином: Напруга джерела живлення: 20,0кеВ Напруга екстрагування: 20,0кеВ Напруга фокусування: 16,0кеВ Лінійний детектор: 3,7кеВ Післяприскорювальний детектор: (автономний режим) Напруга імпульсу: 3,0кеВ Груба настройка лазера: 50 Точна настройка лазера: 50 Ці настройки змінювались (за потребою) для одержання найкращого відношення сигнал/шум та 58 найвищої роздільної здатності. У Таблиці 3 наведено характеристики різних GLP-1 пептидильованих білків. Таблиця 3 Очікув ана Маса, в изначена за Пептидильов аний білок маса (кДа) допомогою масспектрометра (кДа) Val8-GLP-1-IgG1 59,08 61,94 Val8-Glu22-GLP-1-IgG1 59,23 63,61 Gly 8-GLP-1-IgG1 59,00 62,93 Val8-GLP-1-CEx-IgG1 60,45 65,1-65,6 Val8-Glu22-GLP-1-CEx60,69 65,86 IgG1 Екзендин-4-IgG1 60,69 65,86 Val8-GLP-1-лінкер-HSA 70,70 69,86, 70,74 Екзендин-4-HSA 70,56 70,62 Екзендин-4-лінкер-НSА 71,56 71,62 Скорочення СЕх означає С-кінцев е подовження і включає послідов ність Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-ProSer. Лінкер - Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-GlyGly-Gly-Gly-Ser. Приклад 6: Активність гетерологічних пептидильованих білків. Здатність пептидильованих білків за цим винаходом до активації рецептора GLP-1 визначали шляхом аналізів in vitro, опис яких наведено, [наприклад, у ЕР 619,322 на ім'я Гельфанд (Gelfand) та інших, та у патенті США №5,120,712], відповідно. Активність цих сполук відносно активності Val8-GLP-1(7-37)OH представлена у Таблиці 4. На Фіг.8 представлені in vitro дозозалежні криві для Val8-GLP-1 та екзендин-4 пептидильованих білків. Крім того, у Таблицях 5а та 5b представлена in vitro активність великої групи аналогів GLP-1, які можуть зшиватись із Fc або альбуміновим білком з одержанням біологічно активних пептидильованих білків. Активність цих білків порівнюється з активністю GLP-1(7-37)OH. Таблиця 4 In vitro актив ність GLP-1 пептидильов аних білків Пептидильов аний білок Val8-GLP-1-IgG1 Екзендин-4-IgG1 Val8-GLР-1-лінкер-НSА Екзендин-4-HSA Екзендин-4-лінкер-НSА Екзендин-4 Val8-Glu22-GLP-1-IgG1 Gly 8-GLP-1-IgG1 Val8-GLP-1-CEx-IgG1 Val8-Glu22-GLP-1-CEx-IgG1 Gly 8-Glu22-GLP-1-C2-IgG1 Gly 8-Glu22-GLP-1-CEx-лінкерIgG1 Екзендин-4-C2-IgG1 Екзендин-4-лінкер-IgG1 Gly 8-Glu22-GLP-1-СЕх-лінкерHSA In vitro актив ність (у % до актив ності Val8-GLP-1) 1 240 0,2 20 90 500 3,7 3,3 3,3 29 75 150 250 330 4 59 Gly 8-Glu22-GLP-1-CEx-лінкерIgG1 81897 80 Скорочення СЕх означає С-кінцев е подовження і включає послідов ність Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser. Лінкер - Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-GlyGly-Gly-Ser. С2 - Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-Ser-Gly-Ala. Амінокислотні послідовності пептидильованих білків, опис яких наведено у Таблицях 3 та 4, представлені Послідовностями №13-31. Амінокислотна послідовність пептидильованого білка Val8-GLP-1-людський сироватковий альбумін представлена Послідовністю №13. 60