Полінуклеотид, який забезпечує можливість специфічної експресії у цілому насінні однодольної рослини

Реферат: Даний винахід стосується забезпечення засобів та способів експресії генів. Запропоновано полінуклеотид, який включає послідовність контролю експресії, яка забезпечує можливість специфічної експресії у цілому насінні однодольної рослини потрібної нуклеїнової кислоти, функціонально з'єднаної з нею у рослинах. Крім того, винахід пропонує вектори, клітинихазяїни, трансгенні рослини та способи експресії потрібних нуклеїнових кислот з використанням вищезгаданого полінуклеотиду. UA 109110 C2 (21) Номер заявки: a 2011 13710 Дата подання заявки: 22.04.2010 (22) (24) Дата, з якої є чинними 27.07.2015 UA 109110 C2 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Опис винаходу Даний винахід стосується забезпечення засобів та способів експресії генів. Зокрема, він стосується полінуклеотиду, який включає послідовність контролю експресії, яка забезпечує можливість насінно-специфічної експресії потрібної нуклеїнової кислоти, функціонально з’єднаної з нею у рослинах. Крім того, забезпечуються вектори, клітини-хазяї, трансгенні рослини та способи експресії потрібних нуклеїнових кислот на основі вищезгаданого полінуклеотиду. Одержання трансгенних рослин є основним способом біотехнології рослин, а отже, необхідною передумовою для фундаментальних досліджень на рослинах і для одержання рослин, які мають поліпшені, нові властивості для сільського господарства, для підвищення якості продуктів харчування для людини або для одержання певних хімічних речовин або фармацевтичних засобів. Основною передумовою трансгенної експресії конкретних генів у рослинах є забезпечення специфічних до рослин промоторів. Відомими є різні рослинні промотори. Конститутивні промотори, які нині переважно застосовують у рослинах, майже виключно є вірусними промоторами або промоторами, виділеними з Agrobacterium, такими як промотор вірусу мозаїки цвітної капусти CaMV355 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812). Оскільки концепції вироблення та механізми дії трансгенів стають дедалі складнішими, конститутивна експресія перестала бути оптимальною бажаною моделлю експресії. Наприклад, хоча маніпуляції зі стрес-індукованими генами можуть відігравати важливу роль у поліпшенні стійкості рослин до стресів, було виявлено, що конститутивна експресія генів, що викликаються стресом, має важкий негативний вплив на ріст та розвиток рослин за відсутності стресу (Kasuga et al, (1999) Nature Biotechnology 17(3) :287-291). Отже, потрібні промотори, що започатковують експресію, які є диференційованими у часі та/або просторі. У зернових культурах, які мають агрономічне значення, утворення насіння є кінцевою метою розвитку рослини. Насіння збирають для використання у продуктах харчування, кормах та промислових виробах. Корисність та цінність цього насіння визначають за кількістю та якістю білка, олії та крохмалю, які в них містяться. Насіння однодольних рослин може розглядатись як таке, що складається з двох головних компонентів: зародок або зав’язь, що включає клітини-попередники рослини, яка розвивається з насіння, та ендосперм, який служить як місце накопичення поживних компонентів (зокрема, крохмалю, білків та олії), які споживаються під час проростання насіння та раннього розвитку кільчиків. Насіння дводольних рослин складається здебільшого з зародкової частини, оскільки живильна функція у дводольних рослинах, що розвиваються, забезпечується запасами поживних речовин з-поза меж насіння. Було розпізнано й охарактеризовано багато промоторів, які є здатними започатковувати експресія трансгенів у різних комбінаціях просторових та часових моделей експресії. Також спеціалістам є відомими деякі промотори, які керують експресією в насінні рослин. Відомі промотори керують експресією у частинах насіння рослин або у цілому насінні. Наприклад, було виявлено, що промотори запасних білків насіння є основними ініціаторами експресії у насінні. До них належать промотори фазеолінів (US 5,504,200, Bustos M. M. et al., Plant Cell. 1989, 2(9): 839-53), 2S альбуміну (Joseffson L. G. et al., J. Biol. Chem. 1987, 262: 12196-12201), легуміну (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989, 215(2): 326-331), USP (невідомий білок насіння; Bäumlein H, et al., Molecular & General Genetics 1991, 225(3): 459-67) напіну (Stalberg K., et al., L. Planta 1996, 199: 515-519), сахарозозв’язувального білка (WO 00/26388) або LeB4 (Bäumlein H. et al., Mol Gen Genet 1991, 225: 121-128). Криптичний промотор зі специфічністю до коробочки було виявлено у тютюні шляхом "Т-ДНК-мічення" (Fobert P. R. et al., Plant Journal 1994, 6(4): 567-77; US 5,824,863; WO 99/53067). Насінно-специфічні промотори, які спрямовують експресію у цілому насінні, а отже, як в ендоспермі, так і у зав’язі, описуються лише для дводольних рослин, але не для однодольних. Єдиними доступними промоторами для експресії у цілому насінні однодольних рослин є конститутивні промотори, які експресуються в обох основних відділеннях насіння, а також започатковують експресію трансгенів у більшості тканин або в усіх інших тканинах. Однак засоби та способи надійно керованої експресії потрібних нуклеїнових кислот у цілому насінні однодольних рослин досі є відсутніми і дуже бажаними. Таким чином, технічна проблема, яка лежить в основі цього винаходу, може розглядатись як забезпечення засобів та способів, які дозволяють задовольняти вищезгадані потреби. Ця технічна проблема розв’язується завдяки варіантам втілення винаходу, які характеризуються у представленій нижче формулі винаходу. Відповідно, даний винахід стосується полінуклеотиду, який включає послідовність контролю експресії, що забезпечує можливість насінно-специфічної експресії потрібної нуклеїнової 1 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислоти, функціонально з’єднаної з нею у рослинах, причому вищезгадану послідовність контролю експресії вибирають із групи, до якої належать: (a) послідовність контролю експресії, яка має нуклеїновокислотну послідовність, як показано у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: з 1 по 3; (b) послідовність контролю експресії, яка має нуклеїновокислотну послідовність, яка принаймні на 80% є ідентичною нуклеїновокислотній послідовності, показаній у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: з 1 по 3; (c) послідовність контролю експресії, яка має нуклеїновокислотну послідовність, яка гібридизується за жорстких умов з нуклеїновокислотною послідовністю, показаною у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: з 1 по 3; (d) послідовність контролю експресії, яка має нуклеїновокислотну послідовність, яка гібридизується з нуклеїновокислотними послідовностями, розташованими перед послідовністю відкритої рамки зчитування, показаною у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 4, 6 або 8; (e) послідовність контролю експресії, яка має нуклеїновокислотну послідовність, яка гібридизується з нуклеїновокислотними послідовностями, розташованими перед послідовністю відкритої рамки зчитування, яка кодує амінокислотну послідовність, показану у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 5, 7 або 9; (f) послідовність контролю експресії, яка має нуклеїновокислотну послідовність, яка гібридизується з нуклеїновокислотними послідовностями, розташованими перед послідовністю відкритої рамки зчитування, яка принаймні на 80% є ідентичною послідовності відкритої рамки зчитування, показаній у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 4, 6 або 8, причому відкрита рамка зчитування кодує білок насіння; (g) послідовність контролю експресії, яка має нуклеїновокислотну послідовність, яка гібридизується з нуклеїновокислотними послідовностями, розташованими перед відкритою рамкою зчитування, яка кодує амінокислотну послідовність, яка принаймні на 80% є ідентичною амінокислотній послідовності, показаній у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 5, 7 або 9, причому відкрита рамка зчитування кодує білок насіння; (h) послідовність контролю експресії, яку одержують шляхом прогулянки по 5´ геному або шляхом термічної асиметричної переміжної полімеразної ланцюгової реакції (TAIL-PCR) на геномній ДНК з першого екзону послідовності відкритої рамки зчитування, показаної у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 4, 6 або 8; та (i) послідовність контролю експресії, яку одержують шляхом прогулянки по 5´ геному або TAIL PCR на геномній ДНК з першого екзону послідовності відкритої рамки зчитування, яка принаймні на 80% є ідентичною відкритій рамці зчитування, показаній у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 4, 6 або 8, причому відкрита рамка зчитування кодує білок насіння; та (j) послідовність контролю експресії, яку одержують шляхом прогулянки по 5´ геному або TAIL PCR на геномній ДНК з першого екзону послідовності відкритої рамки зчитування, яка кодує амінокислотну послідовність, яка принаймні на 80% є ідентичною амінокислотній послідовності, яка кодується відкритою рамкою зчитування, показаною у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 5, 7 або 9, причому відкрита рамка зчитування кодує білок насіння. Термін "полінуклеотид" у контексті даного опису означає лінійну або циклічну молекулу нуклеїнової кислоти. В оптимальному варіанті він охоплює молекули ДНК. Полінуклеотид згідно з даним винаходом характеризується тим, що включає послідовність контролю експресії, яка визначається у будь-якому іншому розділі цього опису. Додатково до послідовності контролю експресії полінуклеотид згідно з даним винаходом в оптимальному варіанті також включає принаймні одну потрібну нуклеїнову кислоту, яка є функціонально з’єднаною з послідовністю контролю експресії та/або принаймні однією термінуючою транскрипцію послідовністю. Таким чином, полінуклеотид згідно з даним винаходом в оптимальному варіанті включає експресійну касету для експресії принаймні однієї потрібної нуклеїнової кислоти. Замість потрібної нуклеїнової кислоти або додатково до потрібної нуклеїнової кислоти принаймні одна експресійна касета також може включати сайт множинного клонування та/або термінуючу послідовність для транскрипції. У такому разі сайт множинного клонування в оптимальному варіанті є розташованим таким чином, щоб забезпечувалася можливість функціонального з’єднання нуклеїнової кислоти, яка має вводитись у сайт множинного клонування з послідовністю контролю експресії. Додатково до вищезгаданих компонентів полінуклеотид згідно з даним винаходом в оптимальному варіанті може включати компоненти, необхідні для гомологічної рекомбінації, тобто, фланкуючі геномні послідовності з заданого локусу. Однак також можливим є полінуклеотид, який по суті складається з вищезгаданої послідовності контролю експресії. 2 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "послідовність контролю експресії" у контексті даного опису означає нуклеїнову кислоту, здатну керувати експресією іншої нуклеїнової кислоти, функціонально з’єднаної з нею, наприклад, потрібної нуклеїнової кислоти, яка детально вказується в іншому розділі цього опису. Послідовність контролю експресії згідно з даним винаходом в оптимальному варіанті включає мотиви послідовності, які розпізнаються й зв’язуються поліпептидами, тобто, фактори транскрипції. Вищезгадані фактори транскрипції після зв’язування залучають РНК-полімерази, в оптимальному варіанті – РНК-полімеразу I, II або III, у ще кращому варіанті – РНК-полімеразу II або III, у найкращому варіанті – РНК-полімеразу II. Таким чином, започатковується експресія нуклеїнової кислоти, функціонально з’єднаної з послідовністю контролю експресії. Слід розуміти, що, залежно від типу нуклеїнової кислоти, яка має експресуватися, тобто, потрібної нуклеїнової кислоти, експресія у контексті даного винаходу може включати транскрипцію полінуклеотидів РНК з нуклеїновокислотної послідовності (підходящу, наприклад, у випадках з застосуванням антисмислових послідовностей або РНКі) або може включати транскрипцію полінуклеотидів РНК з наступною трансляцією вищезгаданих полінуклеотидів РНК у поліпептиди (підходящу, наприклад, у випадках з застосуванням експресії генів та вироблення рекомбінантних поліпептидів). З метою керування експресією нуклеїнової кислоти послідовність контролю експресії може бути розташована безпосередньо суміжно з нуклеїновою кислотою, яка має бути експресована, тобто, фізично з’єднана з вищезгаданою нуклеїновою кислотою на її 5´ кінці. В альтернативному варіанті вона може бути розташована у фізичній близькості. Однак в останньому разі послідовність має розташовуватися таким чином, щоб забезпечувалася можливість функціональної взаємодії з нуклеїновою кислотою, яка має бути експресована. Зазначена авторами послідовність контролю експресії в оптимальному варіанті має довжину від 200 до 5000 нуклеотидів. У ще кращому варіанті вона включає від 500 до 2500 нуклеотидів і у ще кращому варіанті – від 1000 до 1500 нуклеотидів. Як було згадано вище, послідовність контролю експресії в оптимальному варіанті включає певну кількість мотивів послідовності, які вимагаються для зв’язування фактора транскрипції або для надання певної структури полінуклеотидові, який включає послідовність контролю експресії. Мотиви послідовності також іноді називаються цис-регуляторними елементами і у контексті даного винаходу включають промоторні елементи, а також енхансерні елементи. Послідовність контролю експресії згідно з даним винаходом забезпечує можливість насінно-специфічної експресії і, таким чином, включає цис-регуляторні елементи, які можуть залучати РНК-полімерази у вищезгадану тканину для забезпечення можливості тканинноспецифічної транскрипції нуклеїнових кислот, функціонально з’єднаних з вищезгаданою послідовністю контролю експресії. Оптимальні послідовності контролю експресії, які мають бути включені до полінуклеотиду згідно з даним винаходом, мають нуклеїновокислотну послідовність, як показано у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: з 1 по 3. У ще одному оптимальному варіанті послідовність контролю експресії, включена у полінуклеотид згідно з даним винаходом, має нуклеїновокислотну послідовність, яка гібридизується з нуклеїновокислотними послідовностями, розташованими перед послідовністю відкритої рамки зчитування, як показано у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 4, 6 або 8, тобто, є варіантною послідовністю контролю експресії. Слід розуміти, що послідовності контролю експресії можуть дещо відрізнятися за послідовністю через алельні варіації. Відповідно, даний винахід також передбачає послідовність контролю експресії, яка може бути похідною від послідовності контролю експресії, показаної у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: з 1 по 3. Вищезгадані послідовності контролю експресії здатні гібридизуватися, в оптимальному варіанті – за жорстких умов, з розташованими перед ними послідовностями відкритої рамки зчитування, показаними у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 5, 6 або 8, тобто, з послідовностями контролю експресії, показаними у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: з 1 по 3. Жорсткими умовами гібридизації у контексті даного винаходу в оптимальному варіанті є умови гібридизації у 6  хлориду натрію/цитрату натрію (SSC) при приблизно 45 °C, з наступними одним або кількома етапами промивання у 0,2  SSC, 0,1% SDS при температурі від 53 до 65 °C, в оптимальному варіанті – при 55 °C, 56 °C, 57 °C, 58 °C, 59 °C, 60 °C, 61 °C, 62 °C, 63 °C, 64 °C або 65 °C. Спеціалістам у даній галузі відомо, що ці умови гібридизації можуть бути різними, залежно від типу нуклеїнової кислоти та, наприклад, у разі присутності органічних розчинників, за температурою та концентрацією буфера. Наприклад, за "стандартних умов гібридизації" температура коливається, залежно від типу нуклеїнової кислоти, між 42 °C та 58 °C у водному буфері з концентрацією від 0,1 до 5  SSC (pH 7,2). Якщо у вищезгаданому буфері є присутнім органічний розчинник, наприклад 50% формамід, температура за стандартних умов становить приблизно 42 °C. Умови гібридизації для ДНК:ДНК гібридів в оптимальному варіанті відповідають, наприклад 0,1  SSC і від 20 °C до 45 °C, в 3 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 оптимальному варіанті – від 30 °C до 45 °C. Умови гібридизації для ДНК:РНК гібридів в оптимальному варіанті відповідають, наприклад, 0,1  SSC і від 30 °C до 55 °C, в оптимальному варіанті – від 45 °C до 55 °C. Вищезгадані температури гібридизації визначають, наприклад для нуклеїнової кислоти довжиною приблизно 100 п. н. (пар нуклеотидів) і вміст G + C 50% за відсутності формаміду. Такі послідовності контролю експресії, що гібридизуються, у кращому варіанті є принаймні на 70%, принаймні на 80%, принаймні на 90%, принаймні на 91%, принаймні на 92%, принаймні на 93%, принаймні на 94% принаймні на 95%, принаймні на 96%, принаймні на 97%, принаймні на 98% або принаймні на 99% ідентичними послідовностям контролю експресії, як показано у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: з 1 по 3. Відсоткові показники ідентичності в оптимальному варіанті розраховують по всій ділянці нуклеїновокислотної послідовності. Спеціалістам відома низка програм на основі різних алгоритмів для порівняння різних послідовностей. У цьому контексті алгоритми Нідлмана-Вунша або Сміта-Вотермана дають особливо надійні результати. Для здійснення вирівнювання послідовності застосовують програму PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins 1989, CABIOS, 5: 151-153) або програми Gap and BestFit (Needleman 1970 J. Mol. Biol. 48; 443-453 та Smith 1981, Adv. Appl. Math. 2; 482-489), які є частиною пакету програм GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Медісон, Вісконсін, США 53711, версія 1991). Показники ідентичності послідовностей, вказані вище у відсотках (%), в оптимальному варіанті визначають, застосовуючи програму GAP по всій ділянці послідовності з такими настройками: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10,000 та Average Mismatch: 0,000, які, якщо не вказано іншого, завжди мають використовуватись як стандартні настройки для вирівнювання послідовностей. Крім того, послідовності контролю експресії, які забезпечують можливість насінноспецифічної експресії, можуть знаходитися не лише перед вищезгаданими відкритими рамками зчитування, які мають нуклеїновокислотну послідовність, як показано у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 4, 6 або 8. Послідовності контролю експресії, які забезпечують можливість насінно-специфічної експресії, також можуть знаходитися перед ортологічними, паралогічними або гомологічними генами (тобто, відкритими рамками зчитування). Таким чином, в одному з оптимальних варіантів варіантна послідовність контролю експресії, яка складається з полінуклеотиду згідно з даним винаходом, має нуклеїновокислотну послідовність, яка гібридизується з нуклеїновокислотними послідовностями, розташованими перед послідовністю відкритої рамки зчитування, яка є принаймні на 70%, у ще кращому варіанті – принаймні на 80%, принаймні на 90%, принаймні на 91%, принаймні на 92%, принаймні на 93%, принаймні на 94% принаймні на 95%, принаймні на 96%, принаймні на 97%, принаймні на 98% або принаймні на 99% ідентичною послідовності, показаній у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 4, 6 або 8. Вищезгадана варіантна відкрита рамка зчитування кодує поліпептид, який має біологічну активність відповідного поліпептиду, що кодується відкритою рамкою зчитування, як показано у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 4, 6 або 8. У цьому контексті слід зазначити, що відкрита рамка зчитування, показана у SEQ ID NO: 4, кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, показану у SEQ ID NO: 5, і в оптимальному варіанті кодує білок насіння. Відкрита рамка зчитування, показана у SEQ ID NO: 6, кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, показану у SEQ ID NO: 7, і в оптимальному варіанті кодує білок насіння, більш конкретно – внутрішній білок тонопласта 3-1. Відкрита рамка зчитування, показана у SEQ ID NO: 8, кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, показану у SEQ ID NO: 9, в оптимальному варіанті кодує білок насіння. Також в оптимальному варіанті варіантна послідовність контролю експресії, яка складається з полінуклеотиду згідно з даним винаходом, (i) одержують шляхом прогулянки по 5´ геному або TAIL PCR з послідовності відкритої рамки зчитування, показаної у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 4, 6 або 8, або (ii) одержують шляхом прогулянки по 5´ геному або TAIL PCR з послідовності відкритої рамки зчитування, яка є принаймні на 80% ідентичною відкритій рамці зчитування, показаній у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 4, 6 або 8. Варіантні послідовності контролю експресії одержують без особливих проблем за допомогою технології прогулянки по геному або шляхом термічної асиметричної переміжної полімеразної ланцюгової реакції (TAIL-PCR), яка може здійснюватись, як описано у супровідних Прикладах, з застосуванням, наприклад, комплектів серійного виробництва. Варіантні послідовності контролю експресії, вказані в цьому описі для послідовності контролю експресії, показаної у SEQ ID NO: 1, в оптимальному варіанті включають принаймні 10, принаймні 20, принаймні 30 або всі мотиви послідовності, наведені у Таблиці 4. Варіантні послідовності контролю експресії, вказані в цьому описі для послідовності контролю експресії, показаної у SEQ ID NO: 2, в оптимальному варіанті включають принаймні 10, принаймні 20, 4 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 принаймні 30, принаймні 40, принаймні 50 або всі мотиви послідовності, наведені у Таблиці 9. Варіантні послідовності контролю експресії, вказані в цьому описі для послідовності контролю експресії, показаної у SEQ ID NO: 3, в оптимальному варіанті включають принаймні 10, принаймні 20, принаймні 30, принаймні 40, принаймні 50 або всі мотиви послідовності, наведені у Таблиці 10. Приклади оптимальних варіантних послідовностей контролю експресії показано у SEQ ID NO: 120, 121 та 122 (варіанти SEQ ID NO:3), у SEQ ID NO:123 та 124 (варіанти SEQ ID NO:2) і у SEQ ID NO: 125, 126 та 127 (варіанти SEQ ID NO:1). Порівняно з відповідними послідовностями контролю експресії, вищезгадані варіанти (як показано у SEQ ID NO з 120 по 127) не включають старт-кодонів (ATG). Старт-кодони є заміненими на BVH або BVH та стоп-кодоном між будьякими двома старт-кодонами (згідно з номенклатурою IUPAC: B представляє C або G або T, V представляє A або C або G, і H представляє A або C або T). Таким чином, варіантна послідовність контролю експресії може бути одержана шляхом мутації путативного старткодону, як описано вище. Інші приклади варіантних послідовностей контролю експресії показано у SEQ ID NO: 129, 130 та 131 (варіанти SEQ ID NO: 1). Вищезгадані послідовності контролю експресії не включають коротких відкритих рамок зчитування, які мають гомологію з токсичними або алергенними пептидами або поліпептидами (див. Приклад 3). Слід розуміти, що несуттєві послідовності послідовності контролю експресії згідно з винаходом можуть бути видалені без значного зашкодження зазначеним властивостям. Обмеження послідовності контролю експресії конкретними суттєвими регуляторними ділянками також може здійснюватися за допомогою комп’ютерної програми, такої, як програма PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements") (Higo K et al. (1999) Nucleic Acids Res 27:1, 297-300) або бази даних від BIOBASE "Transfac" (Biologische Datenbanken GmbH, Брауншвейг). За допомогою таких заходів можуть бути штучно утворені варіантні послідовності контролю експресії, які вказано вище. Крім того, спеціалістам у даній галузі відомі способи мутагенізації нуклеїновокислотних послідовностей, і до цих способів належать, наприклад, застосування олігонуклеотидів, які мають одну або кілька мутацій порівняно з ділянкою, яка піддається мутації (наприклад, у рамках сайт-специфічного мутагенезу). Зазвичай застосовують праймери, які мають від приблизно 15 до приблизно 75 нуклеотидів або більше, в оптимальному варіанті з нуклеотидними залишками у кількості від приблизно 10 до приблизно 25 або більше, які розташовуються з обох боків послідовності, яка піддається модифікації. Деталі та процедури вищезгаданих способів мутагенезу є відомими спеціалістам у даній галузі (Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol 154:367-382; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12:1656; Upender et al. (1995) Biotechniques 18(1):29-30; Патент США № 4,237,224). Мутагенез також може досягатися шляхом обробки, наприклад, векторів, які включають послідовність контролю експресії згідно з винаходом, мутагенізуючими агентами, такими як гідроксиламін. Мутагенез також забезпечує варіантні полінуклеотиди згідно з винаходом, як зазначено вище. Послідовність контролю експресії, яка є включеною до полінуклеотиду згідно з даним винаходом, забезпечує можливість насінно-специфічної експресії. Зокрема, вищезгадана послідовність контролю експресії забезпечує можливість специфічної експресії як у зав’язі, так і в ендоспермі насіння, а отже, у цілому насінні. Таким чином, "насіння" у контексті даного опису в оптимальному варіанті означає ендосперм та тканини зав’язі. В оптимальному варіанті послідовність контролю експресії згідно з даним винаходом забезпечує можливість насінноспецифічної експресії на всіх стадіях розвитку насіння (наприклад, кукурудзяному насінні до 3540 днів після запилення, див. Приклади). Крім того, послідовність контролю експресії також може забезпечувати можливість експресії у пилку (див. Приклади). "Специфічна" у контексті винаходу означає, що потрібні нуклеїнові кислоти, які є функціонально з’єднаними з вказаною авторами послідовністю контролю експресії, переважно (тобто, в оптимальному варіанті) експресуються у вказаних тканинах або клітинах у разі присутності у рослинах. Слід розуміти, що виключна експресія за допомогою тканинно-специфічних промоторів у тканині зазвичай не досягається. Скоріше тканинно-специфічний промотор, очевидно, в оптимальному варіанті активізується у деяких тканинах, тим не менш, маючи певну фонову активність в інших тканинах. Це явище відоме як лікова експресія. Однак під специфічною експресією у контексті цього винаходу слід розуміти переважну експресію у зазначеній рослинній тканині. Переважна експресія у контексті даного винаходу характеризується статистично значущою більшою кількістю транскрипції, що піддається виявленню, у вищезгаданій тканині або клітинах порівняно з іншими рослинними тканинами. Статистично значущий вищий рівень експресії в оптимальному варіанті означає кількість, яка принаймні вдвічі, втричі, вчетверо, уп’ятеро, у десять разів, у сто разів, у п’ятсот разів або у тисячу разів є більшою за рівень, який виявляється у принаймні одній з інших тканин з транскрипцією, що піддається виявленню. В 5 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 альтернативному варіанті вона є експресією у вказаній тканині або клітині, причому рівень експресії в інших тканинах або клітинах є нижчим за 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% або, у найкращому варіанті, 15% від загального (уся рослина) рівня експресії. Рівень експресії прямо корелюється з кількістю транскриптів (тобто, РНК) або поліпептидів, які кодуються транскриптами, присутніми у клітині або тканині. Прийнятні способи вимірювання транскрипції на основі РНК або поліпептидів є добре відомими спеціалістам у даній галузі. Тканинна або клітинна специфічність в альтернативному варіанті і, в оптимальному варіанті, додатково до вищезазначеного, означає, що експресія обмежується або майже обмежується зазначеними тканиною або клітинами, тобто, транскрипція в інших тканинах практично не виявляється. Майже обмежена у контексті даного винаходу означає, що неспецифічна експресія виявляється менш, ніж у десяти, менш, ніж у п’яти, менш, ніж у чотирьох, менш, ніж у трьох, менш, ніж у двох або одній тканині(ах). Насінно-специфічна експресія може визначатися, наприклад, шляхом порівняння експресії потрібної нуклеїнової кислоти, наприклад, гена-репортера, такого, як [бета]-глюкуронідаза (GUS), функціонально з’єднаного з послідовністю контролю експресії у таких тканинах та стадіях розвитку: 1) коріння та листя на стадії 5 листа, 2) стебло на стадії V-7, 3) листя, лузга та ниткоподібні шовковисті маточки на стадії цвітіння, 4) Колоски/султани при запиленні, 5) качани або зерна на 5, 10, 15, 20 та 25 дні після запилення (див. також Приклади). В оптимальному варіанті експресія потрібної нуклеїнової кислоти може виявлятись у качанах або зернах на 5, 10, 15, 20 та 25 дні після запилення у вищезгаданому аналізі, як показано на супровідних Фігурах. Експресія потрібної нуклеїнової кислоти може визначатися різними загальновідомими способами, наприклад, за допомогою нозерн-блотингу або in situ гібридизації, як описано у WO 02/102970, в оптимальному варіанті – як описано у супровідних Прикладах. Трансгенні рослини для аналізу насінно-специфічної експресії також можуть бути одержані способами, які є добре відомими спеціалістам у даній галузі і які обговорюються в іншому розділі цього опису. Термін "потрібна нуклеїнова кислота" означає нуклеїнову кислоту, яка має бути експресована під контролем вказаної авторами послідовності контролю експресії. В оптимальному варіанті потрібна нуклеїнова кислота кодує поліпептид, присутність якого є бажаною у вказаній авторами клітині або рослині, зокрема, у насінні рослини. Таким поліпептидом може бути будь-який функціонально активний або інертний білок, який накопичується у насінні і/або забезпечує сприятливий вплив на рослину або насіння після їх експресії. Слід розуміти, що у разі, якщо потрібна нуклеїнова кислота кодує поліпептид, може вимагатися транскрипція нуклеїнової кислоти в РНК та трансляція транскрибованої РНК у поліпептид. Потрібна нуклеїнова кислота в одному з оптимальних варіантів включає біологічно активні молекули РНК та, у ще кращому варіанті, антисмислові РНК, рибозими, мікро-РНК або міРНК. Вищезгадані біологічно активні молекули РНК можуть застосовуватися для зміни кількості заданого поліпептиду, присутнього у клітині або рослині. Наприклад, небажана ферментна активність у насінні може бути знижена через насінно-специфічну експресію антисмислових РНК, рибозимів, мікро-РНК або міРНК. Основні біологічні принципи дії вищезгаданих біологічно активних молекул РНК є добре відомими спеціалістам у даній галузі. Крім того, спеціалістам у даній галузі добре відомі способи одержання нуклеїнових кислот, які кодують такі біологічно активні молекули РНК. Слід розуміти, що біологічно активні молекули РНК можуть бути прямо одержані шляхом транскрипції потрібної нуклеїнової кислоти, тобто, без трансляції у поліпептид. В оптимальному варіанті принаймні одна потрібна нуклеїнова кислота, яка має бути експресована під контролем послідовності контролю експресії згідно з даним винаходом, є гетерологічною щодо вищезгаданої послідовності контролю експресії, тобто, у природі вона не перебуває під її контролем, але вищезгаданий контроль забезпечується у штучний спосіб (наприклад, за допомогою способів генної інженерії). Термін "функціонально з’єднана" у контексті даного опису означає, що послідовність контролю експресії згідно з даним винаходом та потрібна нуклеїнова кислота є з’єднаними таким чином, щоб експресія могла бути керована вищезгаданою послідовністю контролю експресії, тобто, послідовність контролю експресії функціонально з’єднується з вищезгаданою нуклеїновокислотною послідовністю, яка має бути експресована. Відповідно, послідовність контролю експресії та нуклеїновокислотна послідовність, яка має бути експресована, можуть бути фізично з’єднані одна з одною, наприклад, шляхом включення послідовності контролю експресії на 5´кінці нуклеїновокислотної послідовності, яка має бути експресована. В альтернативному варіанті послідовність контролю експресії та нуклеїнова кислота, яка має бути експресована, можуть лише перебувати у фізичній близькості, таким чином щоб послідовність контролю експресії могла керувати експресією принаймні однієї потрібної нуклеїновокислотної послідовності. Послідовність контролю експресії та нуклеїнова кислота, яка має бути 6 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресована, в оптимальному варіанті є відокремленими не більше, ніж 700 п. н., 500 п. н., 300 п. н., 100 п. н., 80 п. н., 60 п. н., 40 п. н., 20 п. н., 10 п. н. або 5 п. н. У процесі досліджень, на яких ґрунтується даний винахід, було виявлено, що експресія потрібної нуклеїнової кислоти, специфічна до (цілого) насіння, може бути надійно досягнута шляхом експресії вищезгаданих потрібних нуклеїнових кислот під контролем послідовності контролю експресії з кукурудзи або варіантної послідовності контролю експресії, як зазначено вище (див., наприклад, Таблиці 4A, 11 та 12). Завдяки даному винаходові, існує можливість (i) специфічного маніпулювання біохімічними процесами у тканинах насіння, наприклад, шляхом експресії гетерологічних ферментів або біологічно активних РНК, як вказано вище, або (ii) одержання гетерологічних білків у вищезгаданих тканинах насіння. В принципі, даний винахід передбачає застосування полінуклеотиду, вектора, клітини-хазяїна або рослини для експресії потрібної нуклеїнової кислоти. Насінно-специфічні промотори, описані у джерелах існуючого рівня техніки, забезпечують лише експресію у зав’язі або ендоспермі насіння однодольної рослини, але не у цілому насінні. Даний винахід також стосується вектора, який включає полінуклеотид згідно з даним винаходом. Термін "вектор" в оптимальному варіанті охоплює плазміди, вектори експресії, вектори TДНК, а також штучні хромосоми, такі як бактеріальні або дріжджові штучні хромосоми. Крім того, термін також стосується спрямовуючих послідовностей, які забезпечують можливість випадкового або сайт-специфічного включення спрямовуючої послідовності у геномну ДНК. Такі спрямовуючі послідовності в оптимальному варіанті включають ДНК достатньої довжини для гомологічної або гетерологічної рекомбінації, як докладно описується нижче. Вектор, який включає полінуклеотиди згідно з даним винаходом, в оптимальному варіанті також включає селектовані маркери для розмноження та/або селекції у хазяїні. Вектор може бути включений у клітину-хазяїн різними способами, добре відомими спеціалістам у даній галузі. У разі включення у клітину-хазяїн вектор може перебувати у цитоплазмі або може бути включений у геном. В останньому разі слід розуміти, що вектор також може включати нуклеїновокислотні послідовності, які забезпечують можливість гомологічної рекомбінації або гетерологічної інсерції. Вектори можуть бути включені у прокаріотні або еукаріотні клітини за допомогою традиційних способів трансформації або трансфекції. Терміни "трансформація" та "трансфекція", кон’югація та трансдукція, вжиті у даному контексті, охоплюють багато відомих у галузі способів включення чужорідної нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК) у клітину-хазяїн, включаючи спільне осадження з фосфатом кальцію, хлоридом рубідію або хлоридом кальцію, опосередковану діетиламіноетилдекстраном трансфекцію, ліпофекцію, природну компетентність, кластери на основі вуглецю, хімічно опосередковане перенесення, електропорацію або бомбардування частинками (наприклад, "генні гармати"). Прийнятні способи трансформації або трансфекції клітин-хазяїв, включаючи рослинні клітини, описуються nd у публікаціях Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) та інших інструкціях з виконання лабораторних робіт, таких як Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Ed.: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. В оптимальному варіанті вказаний авторами вектор є прийнятним як клонуючий вектор, тобто, здатний до відтворення у мікробних системах. Такі вектори забезпечують ефективне клонування у бактеріях, в оптимальному варіанті – у дріжджах або грибках, і дозволяють здійснювати стійку трансформацію рослин. "Клонуючі вектори" зазвичай містять сайти розпізнавання рестрикційної ендонуклеази, у які можуть бути вставлені чужорідні послідовності ДНК з можливістю визначення без втрати суттєвої біологічної функції вектора, а також маркерний ген, придатний для використання у розпізнаванні та відборі клітин, трансформованих клонуючим вектором. До маркерних генів зазвичай належать гени, які забезпечують, наприклад, резистентність до канаміцину, резистентність до стрептоміцину, резистентність до спектиноміцину, резистентність до тетрацикліну, резистентність до гігроміцину або резистентність до ампіциліну. Векторними системами, які слід згадати, зокрема, є різні бінарні та коінтегровані векторні системи, які є придатними для T-ДНК-опосередкованої трансформації. Такі векторні системи, як правило, характеризуються тим, що містять принаймні vir-гени, які є необхідними для Agrobacterium-опосередкованої трансформації, та послідовності, які визначають межі T-ДНК. Ці векторні системи в оптимальному варіанті, також включають інші цис-регуляторні ділянки, такі як промотори та термінатори, та/або селекційні маркери, за допомогою яких можуть розпізнаватися прийнятні трансформовані клітини-хазяї або організми. Якщо коінтегровані векторні системи мають vir-гени та послідовності T-ДНК, розташовані на одному векторі, то в 7 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 основі бінарних систем лежать принаймні два вектори, один з яких має vir-гени, але без T-ДНК, а другий має T-ДНК, але без vir-гена. Внаслідок цього останні вектори є відносно малими, легко піддаються маніпуляціям і можуть бути репліковані як в E. coli, так і в Agrobacterium. До цих бінарних векторів належать вектори з груп pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Оптимальними для застосування згідно з винаходом є pBin19, pBI101, pBinAR, pGPTV, pSUN, pPZP та pCAMBIA. Огляд бінарних векторів та їх застосування представлено у публікації Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451. Крім того, завдяки застосуванню підходящих клонуючих векторів, полінуклеотид згідно з винаходом може включатись у клітини та/або рослини-хазяї і, таким чином, може застосовуватися для трансформації рослин, наприклад, як вказано у публікаціях: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), chapter 6/7, pp. 71- 119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225. Приклади рослинних векторів експресії включають ті, які детально описуються у публікаціях: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195- 1197; та Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, p. 15-38. Рослинна експресійна касета в оптимальному варіанті включає регуляторні послідовності, здатні контролювати експресію генів у рослинних клітинах і функціонально з’єднані, таким чином, щоб кожна послідовність могла виконувати свою функцію, таку, як транскрипційна термінація, наприклад сигнали поліаденілування. Оптимальними сигналами поліаденілування є ті, які походять з T-ДНК Agrobacterium tumefaciens, такі як ген 3 Ti-плазміди pTiACH5, відомий як октопінсинтаза (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 et seq.), або їх функціональні еквіваленти, але всі інші термінатори, які є функціонально активними у рослинах, також є прийнятними. Оскільки експресія генів у рослинах дуже часто не обмежується транскрипційними рівнями, рослинна експресійна касета в оптимальному варіанті включає інші функціонально з’єднані послідовності, такі як енхансери трансляції, наприклад, послідовність прискорення, яка включає 5’-нетрансльовану лідерну послідовність вірусу тютюнової мозаїки, що збільшує співвідношення білка/РНК (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711). Інші оптимальні послідовності для застосування для функціонального з’єднання у рослинних касетах експресії генів є спрямовуючими послідовностями, які вимагаються для спрямування генного продукту потрібної нуклеїнової кислоти у відповідний відділ клітини (огляд див. у публікації Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423 та наведених у ній посиланнях), наприклад у вакуоль, ядро, усі типи пластидів, такі як амілопласти, хромопласти, позаклітинний простір, мітохондрії, ендоплазматичний ретикулум, олійні тільця, пероксисоми та інші відділи рослинних клітин. Слід розуміти, що бінарний вектор або будь-який інший вектор може бути модифікований з застосуванням звичайних способів рекомбінації ДНК, розмножений в E. coli і включений до Agrobacterium, наприклад, за допомогою електропорації або інших способів трансформації (Mozo and Hooykaas, Plant MoI. Biol.16:917-918 (1991)). Даний винахід також передбачає клітину-хазяїн, яка включає полінуклеотид або вектор згідно з даним винаходом. Клітини-хазяї в оптимальному варіанті є трансгенними клітинами або клітинними лініями рослинного походження. У ще кращому варіанті вищезгадані клітини-хазяї є взятими з однодольних рослин. Оптимальні однодольні рослини згадуються в інших розділах даного опису. До клітин-хазяїв рослинного походження належать клітини певних тканин, органів та частин рослин в усіх їхніх фенотипічних формах, таких як пиляки, волокна, кореневі волоски, стебла, зав’язі, калюси, сім’ядолі, черешки, зібраний матеріал, рослинна тканина, репродуктивна тканина, та клітинні культури, які є взятими з існуючої трансгенної рослини і/або можуть використовуватися для одержання трансгенної рослини. Слід розуміти, що полінуклеотид або вектор згідно з даним винаходом також може бути присутнім у прокаріотному або еукаріотному одноклітинному організмі (такі організми також називаються мікроорганізмами), зокрема, для клонування (наприклад, в E. coli) і для трансформації рослин (наприклад, в Agrobacterium). Таким чином, термін "клітина-хазяїн" в оптимальному варіанті також включає прокаріотні або еукаріотні одноклітинні організми (також відомі як мікроорганізми). Зокрема, як прокаріотні клітини-хазяї у контексті даного винаходу розглядаються клітини Rhizobiaceae, особливо, роду Agrobacterium. Оптимальними клітинами 8 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Agrobacterium є клітини Agrobacterium tumefaciens та Agrobacterium rhizogenes. Agrobacterium є ґрунтовим фітопатогеном, який об’єднує частину ДНК (T-ДНК) у геном рослини (Chilton, et al., 1977 Cell 11: 263-271; Hoekema, et al., 1985 Nature 303: 179-180; Bevan, 1984 Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721; Sheng and Citovsky, 1996 The Plant Cell, Vol. 8. 16991710). В оптимальному варіанті клітини/штами Agrobacterium є знешкодженими, тобто, не мають властивостей опосередковування хвороби корончастого гала або не мають властивостей опосередковування хвороби бородатого кореня, але в інших відношеннях забезпечують функції інфекції рослин. Клітини Agrobacterium у контексті даного винаходу в оптимальному варіанті є вибраними з-поміж LBA4404, GV2260, GV3600, EHA101, EHA105, AGL-1, LBA9402, GV3101, COR341, COR356, UIA143, pCH32, BIBAC2, C58C1, pMP90 та AGT121. В оптимальному варіанті втілення клітини Agrobacterium вибирають із групи, до якої належать C58C1, EHA101, pMP90 та LBA4404. Способи культивування вищезгаданих видів Agrobacterium species є добре відомим спеціалістам у даній галузі. Даний винахід також стосується трансгенної рослини або її насіння, що включає полінуклеотид або вектор згідно з даним винаходом. Полінуклеотид або вектор може бути присутнім у цитоплазмі клітин вищезгаданої рослини або її насіння. В оптимальному варіанті полінуклеотид або вектор є стійко включеним у геном клітин, які містяться у вищезгаданій рослині або рослинному насінні. Спосіб стійкого включення полінуклеотиду або вектора (зокрема, вектора T-ДНК) у геном рослинної клітини є добре відомим спеціалістам у даній галузі і описується в іншому розділі цього опису. У контексті даного винаходу, зокрема, передбачається, що полінуклеотид або вектор має бути стійко включений у геном шляхом опосередкованої Agrobacterium трансформації. Оптимальними рослинами, які мають використовуватися для одержання трансгенних рослин згідно з даним винаходом, є однодольні рослини. "Однодольна рослина" у контексті даного опису в оптимальному варіанті означає квіткову рослину з однією сім’ядолею у насінні. Однодольними рослинами, яким віддають особливу перевагу, є кукурудза, пшениця, рис, ячмінь, овес, жито, сорго, просо, tricalate, банан, плевел або коїкс. Термін "однодольна рослина" в оптимальному варіанті охоплює рослини родів підродин Andropogonoideae (зокрема, родів Saccharum, Sorghum або Zea), Arundineae (зокрема, роду Phragmites), Oryzoideae (зокрема, роду Oryza), Panicoideae та, у ще кращому варіанті – Pooideae (Festuciadeae) (зокрема, родів Poa, Festuca, Lolium, Trisetum, Agrostis, Phleum, Dactylis, Alopecurus, Avena, Triticum, Secale та Hordeum). Оптимальними однодольними рослинами є Avena sativa (овес), Saccharum officinarum (цукрова тростина), Triticum dicoccum (пшениця двозернянка), Triticum monococcum (пшениця однозернянка), Triticum spelta (пшениця спельта), Triticum durum (пшениця), Triticum turgidum, Triticum aestivum (пшениця), Zea mays (кукурудза), Panicum miliaceum (просо звичайне), Pennisetum thiphoides (просо тростинне), Hordeum vulgare або H. sativum (ячмінь), Oryza sativa (рис), Zizania aquatica (дикий рис), Secale cereale (жито), Сорго bicolor (S. vulgare) (сорго). Серед рослин, яким віддають більшу перевагу – пшениця (Triticum spp.), рис (Oryza spp.), ячмінь (Hordeum spp.), овес (Avena spp.), жито (Secale spp.), кукурудза (Zea mays), сорго та просо (Pennisettum spp). У найкращому варіанті однодольною рослиною є Zea mays. Крім того, даний винахід охоплює певні тканини, органи та частини вищезгаданих однодольних рослин у всіх їхніх фенотипічних формах, такі як пиляки, волокна, кореневі волоски, стебла, зав’язі, калюси, сім’ядолі, черешки, зібраний матеріал, рослинна тканина, репродуктивна тканина та клітинні культури, які є взятими з існуючої трансгенної рослини і/або можуть використовуватися для одержання трансгенної рослини. Трансгенні рослини або трансгенні клітини-хазяї згідно з даним винаходом можуть бути одержані з застосуванням способів трансформації, які описуються у таких публікаціях: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), chapter 6/7, pp.71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225; Transgenic Plants: Methods and Protocols Editor: Leandro Peña, Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, Valencia Spain Series: Methods in Molecular Biology, volume 286 (2004), або у WO2006/133983. В оптимальному варіанті трансгенні рослини можуть бути одержані шляхом опосередкованої T-ДНК трансформації. Такі векторні системи, як правило, характеризуються тим, що вони містять принаймні vir-гени, які вимагаються для опосередкованої Agrobacterium трансформації, та послідовності, які визначають межі T-ДНК. 9 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Прийнятні вектори детально описуються в іншому розділі цього опису. Даний винахід також стосується способу експресії потрібної нуклеїнової кислоти у клітиніхазяїні, причому спосіб включає (a) включення полінуклеотиду або вектора згідно з даним винаходом у клітину-хазяїн; та (b) експресію принаймні однієї потрібної нуклеїнової кислоти у вищезгаданій клітині-хазяїні. Полінуклеотид або вектор згідно з даним винаходом може бути включений у клітину-хазяїн шляхом застосування прийнятних способів трансфекції або трансформації, які вказуються в інших розділах цього опису. Потрібна нуклеїнова кислота має експресуватися у клітині-хазяїні за відповідних умов. Для цього клітину-хазяїн культивують в умовах, які, в принципі, забезпечують можливість транскрипції нуклеїнових кислот. Крім того, клітина-хазяїн в оптимальному варіанті включає екзогенно введений або ендогенно присутній механізм транскрипції, який вимагається для експресії потрібної нуклеїнової кислоти послідовністю контролю експресії. В оптимальному варіанті вищезгадана клітина-хазяїн є клітиною однодольної рослини. Крім того, даний винахід включає спосіб експресії потрібної нуклеїнової кислоти у рослині, причому спосіб включає (a) включення полінуклеотиду або вектора згідно з даним винаходом у рослину; та (b) експресію принаймні однієї потрібної нуклеїнової кислоти у вищезгаданій рослині. Полінуклеотид або вектор згідно з даним винаходом може бути включений у рослину відповідними способами, як описується в іншому розділі цього опису. Також даний винахід стосується способу насінно-специфічної експресії потрібної нуклеїнової кислоти у рослині, причому спосіб включає (a) включення полінуклеотиду або вектора згідно з даним винаходом у рослину; та (b) експресію принаймні однієї потрібної нуклеїнової кислоти у вищезгаданій рослині. Далі деякі оптимальні варіанти втілення даного винаходу описуються більш детально. В оптимальному варіанті втілення полінуклеотид згідно з даним винаходом також включає інші генетичні контрольні послідовності. Генетичну контрольну послідовність згідно з даним винаходом слід розуміти в широкому сенсі, і вона означає всі послідовності, які мають вплив на виникнення функції трансгенної експресійної касети згідно з винаходом. Генетичні контрольні послідовності модифікують, наприклад, транскрипцію та трансляцію в еукаріотних організмах. Експресійні касети згідно з винаходом в оптимальному варіанті включають, як додаткову генетичну контрольну послідовність, один з промоторів згідно з винаходом ближче до 5’-кінця, ніж конкретна нуклеїновокислотна послідовність, яка має бути трансгенно експресована, та термінаторну послідовність ближче до 3’-кінця, і, у відповідних випадках, інші звичайні регуляторні елементи, які у кожному разі є функціонально з’єднаними з нуклеїновокислотною послідовністю, яка має бути трансгенно експресована. Генетичні контрольні послідовності також включають інші промотори, промоторні елементи або мінімальні промотори, здатні змінювати властивості контролю експресії. Таким чином, наприклад, через генетичні контрольні послідовності, існує можливість здійснення додаткової тканинноспецифічної експресії, залежно від конкретних стрес-факторів. Відповідні елементи описуються, наприклад, для водного стресу, абсцизової кислоти (Lam E and Chua N H, (1991) J Biol Chem 266(26):17131-17135) та температурного стресу (Schöffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217(2-3):246-53). Інша можливість існує для інших промоторів, які забезпечують можливість експресії в інших рослинних тканинах або в інших організмах, таких, як, наприклад, бактерії E. coli, які мають бути функціонально з’єднаними з нуклеїновокислотною послідовністю, яка має бути експресована. Прийнятними рослинними промоторами в принципі є всі описані вище промотори. Наприклад, можливою є ситуація, коли певна нуклеїновокислотна послідовність описується промотором (наприклад, одним з промоторів згідно з винаходом) в одній рослинній тканині як смислова РНК і транслюється у відповідний білок, і та ж сама нуклеїновокислотна послідовність транскрибується іншим промотором з іншою специфічністю в іншій тканині в антисмислову РНК, і відповідний білок зазнає знижувальної регуляції. Це може здійснюватись експресійною касетою згідно з винаходом одним промотором, розташованим перед нуклеїновокислотною послідовністю, яка має бути трансгенно експресована, та іншим промотором позаду. Було продемонстровано, що нетрансльовані ділянки можуть виконувати значні функції у регулюванні експресії генів. Таким чином, було продемонстровано, що 5'-нетрансльовані послідовності можуть посилювати тимчасову експресію гетерологічних генів. Крім того, вони можуть сприяти тканинній специфічності (Rouster J et al. (1998) Plant J. 15:435-440.). І навпаки, 5'-нетрансльована ділянка гена opaque-2 пригнічує експресію. Делеція відповідної ділянки цього гена веде до збільшення активності гена (Lohmer S et al. (1993) Plant Cell 5:65-73). Інші 5'нетрансльовані послідовності та інтрони з функцією сприяння експресії є відомими спеціалістам 10 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у даній галузі. McElroy та співробітники (McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231(1):150-160) повідомляли про послідовність на основі промотора актину рису 1 (Act1) для трансформації однодольних рослин. Застосування інтрона Act1 у комбінації з 35S промотором у трансгенних клітинах рису забезпечувало рівень експресії, який був у десять разів вищим порівняно з виділеним 35S промотором. Оптимізація послідовності навколо сайту ініціації трансляції генарепортера [бета]-глюкуронідази (GUS) в результаті в чотири рази підвищувало експресію GUS у трансформованих клітинах рису. Комбінація оптимізованого сайту ініціації трансляції та інтрона Act1 в результаті забезпечувала 40-разове підвищення експресії GUS промотором CaMV35S у трансформованих клітинах рису; подібні результати отримували з трансформованими клітинами кукурудзи. Взагалі, з описаних вище досліджень було зроблено висновок, що вектори експресії на основі промотора Act1 є прийнятними для контролювання достатньо сильної і конститутивної експресії чужорідної ДНК у трансформованих клітинах однодольних рослин. Крім того, профіль експресії ділянки контролю експресії згідно з винаходом може бути підвищений інтронами посилення експресії та/або термінуючими транскрипцію послідовностями. Таким чином, в оптимальному варіанті втілення полінуклеотид згідно з винаходом включає принаймні один додатковий елемент, вибраний з групи, до якої належать a) 5'-нетрансльовані ділянки та b) кодуючі послідовності інтронів та c) термінуючі транскрипцію послідовності. "Кодуюча послідовність інтрона" в оптимальному варіанті являє собою інтрон, який кодує інтрон посилення експресії з однодольної рослини. У кращому варіанті кодуюча послідовність інтрона являє собою інтрон з гена убіквітину, актину або алкогольдегідрогенази. У найкращому варіанті кодуюча послідовність інтрона являє собою перший інтрон рослинного гена, що кодує поліпептид Metallothionin 1 (MET1), металотіонеїноподібний поліпептид (MET-like) або його функціональний еквівалент або ортолог. Оптимальні перші інтрони з рослинного гена, який кодує металотіонеїноподібний поліпептид (або його функціональний еквівалент або гомолог) описуються у WO2006/094976 та WO2008/099013 які включаються до цього опису шляхом посилання. В оптимальному варіанті вищезгаданий перший інтрон походить з MET-подібного гена з однодольної рослини. У ще кращому варіанті вищезгаданий перший інтрон походить з Oryza sativa (див. Приклади). У ще кращому варіанті перший інтрон походить з MET-подібного гена, який кодує поліпептид, як показано у SEQ ID NO: 118. У найкращому варіанті перший інтрон рослинного гена, який кодує Metallothionin 1, має послідовність, як показано у SEQ ID NO: 119. Також передбачається, що кодуюча ділянка інтрона являє собою варіант першого інтрона рослинного гена, який кодує Metallothionin-подібний білок, зокрема, варіант першого інтрона, який має послідовність, показану у SEQ ID NO: 120. Такий варіант в оптимальному варіанті є принаймні на 70%, принаймні на 80%, принаймні на 90%, принаймні на 91%, принаймні на 92%, принаймні на 93%, принаймні на 94% принаймні на 95%, принаймні на 96%, принаймні на 97%, принаймні на 98% або принаймні на 99% ідентичним вищезгаданому першому інтронові. Спосіб визначення ступеня ідентичності описується в іншому розділі цього опису. В оптимальному варіанті кодуючу послідовність інтрона вставляють в експресійну послідовність у 5'-нетрансльованій ділянці потрібної нуклеїнової кислоти, яка має бути експресована (тобто, між послідовністю контролю експресії та кодуючою послідовністю білка (відкритою рамкою зчитування) або потрібною нуклеїновою кислотою). У контексті даного винаходу було продемонстровано, що Met1-1 інтрон посилює експресію послідовностей контролю експресії згідно з даним винаходом у тканині насіння. Експресійна касета також може включати одну або кілька так званих енхансерних послідовностей, функціонально з’єднаних з промотором, що забезпечує можливість підвищеної трансгенної експресії нуклеїновокислотної послідовності. Також існує можливість інсерції додаткових потрібних послідовностей, таких як додаткові регуляторні елементи або термінатори, на 3' кінці нуклеїновокислотних послідовностей, які мають бути трансгенно експресовані. Контрольні послідовності також означають ті, які забезпечують можливість гомологічної рекомбінації або інсерції у геном організму-хазяїна, або які дозволяють здійснювати делецію з геному. У гомологічній рекомбінації, наприклад, для природного промотора конкретного гена, існує можливість заміни на один з промоторів згідно з винаходом. Такі способи, як технологія cre/lox, забезпечують можливість тканинноспецифічної делеції, яка може викликатися за деяких обставин, експресійної касети з геному організму-хазяїна (Sauer B. (1998) Methods. 14(4):38192). У цьому разі певні фланкуючі послідовності (lox-послідовності) приєднуються до генамішені і потім забезпечують можливість делеції за допомогою cre-рекомбінази. Промотор, який має бути включений, може бути поміщений за допомогою гомологічної рекомбінації перед 11 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 геном-мішенню, який має бути трансгенно експресований шляхом зв’язування промотора з послідовностями ДНК, які, наприклад, є гомологічними ендогенним послідовностям, які передують рамці зчитування гена-мішені. Такі послідовності мають розглядатись як генетичні контрольні послідовності. Після трансформації клітини відповідною послідовністю ДНК дві гомологічні послідовності можуть взаємодіяти і, таким чином, помістити промотору послідовність у потрібне місце перед геном-мішенню, таким чином, щоб промоторна послідовність тепер була функціонально з’єднаною з геном-мішенню і утворювала експресійну касету згідно з винаходом. Вибір гомологічних послідовностей визначає місце інсерції промотора. У цьому разі існує можливість створення експресійної касети шляхом гомологічної рекомбінації за допомогою одиночної або подвійної взаємної рекомбінації. При одиночній взаємній рекомбінації використовується лише одна рекомбінаційна послідовність, і вставляється повна включена ДНК. При подвійній взаємній рекомбінації ДНК, яка має бути включена, оточується двома гомологічними послідовностями, і вставляється фланкуюча ділянка. Останній спосіб є прийнятним для заміни, як описано вище, природного промотора конкретного гена на один з промоторів згідно з винаходом, а отже, зміни місця та часу експресії генів. Цей функціональний зв’язок представляє експресійну касету згідно з винаходом. Для успішного відбору гомологічно рекомбінованих або іншим чином трансформованих клітин зазвичай є необхідним додаткове включення селектабельного маркера. Різні прийнятні маркери вказуються нижче. Селекційний маркер дозволяє відокремлювати трансформовані клітини від нетрансформованих. Гомологічна рекомбінація є відносно рідкісною подією у вищих еукаріотах, зокрема, у рослинах. Переважає випадкова інтеграція у геном хазяїна. Одна з можливостей делеції випадково інтегрованих послідовностей і, таким чином, збагачення клітинних клонів, які мають належну гомологічну рекомбінацію, полягає у застосуванні системи специфічної до послідовності рекомбінації, як описано у US 6,110,736. Сигнали поліаденілування, прийнятні як генетичні контрольні послідовності, є рослинними сигналами поліаденілування, в оптимальному варіанті – з Agrobacterium tumefaciens. У варіанті втілення, якому віддають особливу перевагу, експресійна касета включає термінаторну послідовність, яка функціонує у рослинах. Термінаторні послідовності, які функціонують у рослинах, як правило, означають послідовності, здатні викликати термінацію транскрипції послідовності ДНК у рослинах. Прикладами прийнятних термінаторних послідовностей є термінатор OCS (октопінсинтази) та термінатор NOS (нопалін-синтази). Однак особливу перевагу віддають рослинним термінаторним послідовностям. Рослинні термінаторні послідовності, як правило, являють собою послідовності, які є складовими природного рослинного гена. Особливу перевагу у цьому зв’язку віддають термінаторові інгібуючого гена катепсину D картоплі (GenBank Acc. No.: X74985) або термінаторові гена запасного білка кінського бобу VfLEIB3 (GenBank Acc. No.: Z26489). Ці термінатори є принаймні рівноцінними вірусним або T-ДНК термінаторам, описаним у джерелах існуючого рівня техніки. Спеціалістам у даній галузі також відомо про велику кількість нуклеїнових кислот та білків, рекомбінантна експресія яких є сприятливою під контролем експресійних касет або способів згідно з винаходом. Нижче наводяться деякі приклади потрібних нуклеїнових кислот, експресія яких забезпечує сприятливий ефект. Спеціалістам у даній галузі також відомо про велику кількість генів, через пригнічення або відключення яких за допомогою експресії відповідної антисмислової РНК так само існує можливість досягнення сприятливих ефектів. Необмежувальними прикладами сприятливих ефектів, які можуть бути згадані, є: полегшене одержання трансгенного організму, наприклад, через експресію селекційних маркерів, досягнення резистентності до абіотичних стрес-факторів (спека, холод, сухість, підвищена вологість, посуха, зовнішні токсини, ультрафіолетові промені), досягнення резистентності до біотичних стрес-факторів (патогенів, вірусів, комах та хвороб), поліпшення властивостей продуктів харчування для людини або кормів для тварин, поліпшення швидкості росту врожаю. Найчастіше біотичним стрес-фактором є хвороба насіння (здебільшого грибкові хвороби, наприклад, тверда сажка (Tilletia tritici); смугастість листя (Pyrenophora graminea) та пилова сажка (Ustilago nuda), здебільшого у ячмені. Крім того, найбільше зернові культури, зокрема кукурудза, застосовуються для кормів або продуктів харчування. Включення генів, які змінюють склад зерна, може значною мірою підвищити кормову або харчову цінність. Головними компонентами зерна є крохмаль, білок та олія. Кожен з цих головних компонентів зерна може бути поліпшений шляхом зміни його рівня або складу. Головними компонентами зерна є крохмаль, білок та олія. Кожен з цих головних компонентів зерна може бути поліпшений шляхом зміни його рівня або складу (у тому сенсі, що поживна цінність структурних елементів для кожного компонента, або, в альтернативному варіанті, відповідних структур олій та крохмалів, може бути змінена для поліпшення їх 12 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поживного вмісту). Білок зерен багатьох злаків є неоптимальним для кормів та продуктів харчування, зокрема, для годування свиней, домашньої птиці та харчування людини. У білку бракує кількох амінокислот, які є незамінними у раціоні цих видів, які потребують додавання добавок до зерна. Обмеженими незамінними амінокислотами можуть бути лізин, метіонін, триптофан, треонін, валін, аргінін та гістидин. Рівень цих незамінних амінокислот у насінні та зерні може бути підвищений з застосуванням механізмів, до яких належать включення генів для підвищення біосинтезу амінокислот, зменшення розпаду амінокислот, збільшення запасів амінокислот у білках або збільшення перенесення амінокислот до насіння або зерна. Одним з механізмів підвищення біосинтезу амінокислот є включення генів, які дерегулюють біосинтетичні шляхи амінокислот, таким чином, що рослина перестає належним чином контролювати рівень продукування. Це може здійснюватися шляхом дерегуляції або обходження етапів у біосинтетичному шляху амінокислоти, які за нормальних умов регулюються рівнем амінокислотного кінцевого продукту шляху. Прикладами є включення генів, які кодують дерегульовані варіанти ферментів аспарагінкінази або дигідропіколінової кислоти (DHDP)-синтази для підвищення вироблення лізину та треоніну та антранілат-синтази для підвищення вироблення триптофану. Зменшення катаболізму амінокислот може здійснюватися шляхом включення послідовностей ДНК, які знижують або усувають експресію генів, що кодують ферменти, які каталізують етапи у катаболічних шляхах, таких як фермент лізинкетоглутарат-редуктаза. Білковий склад зерна може бути змінений для поліпшення балансу амінокислот різними способами, включаючи підвищення експресії природних білків, зниження експресії білків з небажаним складом, зміну складу природних білків або включення генів, які кодують цілком нові білки, що мають кращий склад. Може бути включена ДНК, яка знижує експресію представників зеїнової групи запасних білків. Ця ДНК може кодувати рибозими або антисмислові послідовності, спрямовані на послаблення експресії зеїнових білків або експресії регуляторів експресії зеїну, таких як генний продукт opaque-2. Білковий склад зерна може бути змінений через таке явище як косупресія, тобто, інгібування експресії ендогенного гена через експресію ідентичного структурного гена або фрагмента гена, включеного шляхом трансформації. Крім того, включена ДНК може кодувати ферменти, які руйнують зеїни. Зниження експресії зеїну, яке досягається, може супроводжуватися збільшенням білків з більш бажаним амінокислотним складом або збільшенням інших головних складових насіння, таких як крохмаль. В альтернативному варіанті може бути введений химерний ген, який включає кодуючу послідовність для природного білка належного амінокислотного складу, наприклад, для одного з глобулінових білків або 10 кДа зеїну кукурудзи, та промотор або іншу регуляторну послідовність, призначену для підвищення експресії вищезгаданого білка. Кодуюча послідовність вищезгаданого гена може включати додаткові або заміщувальні кодони для незамінних амінокислот. Крім того, може застосовуватися кодуюча послідовність, одержана з іншого виду або частково або повністю синтетична послідовність, яка кодує цілком унікальну пептидну послідовність, призначену для збільшення амінокислотного складу насіння. Цінним може бути включення генів, які змінюють вміст олії у зерні. Збільшення вмісту олії в результаті може забезпечувати підвищення вмісту обмінної енергії та густини насіння для застосування у кормах та харчових продуктах. Включені гени можуть кодувати ферменти, які усувають або зменшують обмеження швидкості або регульовані етапи у біосинтезі жирних кислот або ліпідів. Такими генами, наприклад, є ті, які кодують ацетил-CoA карбоксилазу, ACPацилтрансферазу, бета-кетоацил-ACP синтазу та інші загальновідомі види біосинтетичної активності жирних кислот. Можуть бути включені гени, які збільшують поживну цінність крохмального компонента зерна, наприклад, шляхом підвищення ступеня галуження, в результаті чого поліпшується використання крохмалю в організмі корів через затримку його метаболізму. Корм або харчовий продукт, який включає деякі зерна злаків, містить недостатню кількість вітамінів і потребує добавок для забезпечення достатньої поживної цінності. Може бути передбачене включення генів, які підвищують біосинтез вітамінів у насінні, включаючи, наприклад, вітаміни A, E, B12, холін і т. ін. Властивості крохмалю можуть бути сприятливим чином змінені шляхом зміни співвідношення амілози з амілопектином, розміру молекул крохмалю або моделі їх галуження. Через такі зміни можуть бути змінені багато властивостей, до яких належать, наприклад, температура желатинізації, тепло желатинізації, прозорість плівок та паст. Для здійснення цих змін властивостей окремо у комбінації можуть бути включені гени, які кодують активність гранулозв’язаної синтази або синтази розчинного крохмалю або активність розгалужувального 13 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ферменту. Також можуть застосовуватися ДНК, такі як антисмислові послідовності, для зниження рівня ендогенної активності цих ферментів. Крім того, зерна деяких злаків, які використовують у кормах та харчових продуктах, мають недостатню кількість вітамінів і потребують добавок для забезпечення належної поживної цінності; може бути передбачене включення генів, які підвищують біосинтез вітамінів у насінні, включаючи, наприклад, вітаміни A, E, B12, холін і т. ін. Крім того, може розглядатися використання рослини для продукування або виробництва корисних біологічних сполук, які або зовсім не продукувалися, або не продукувалися в рослині раніше на такому самому рівні. Нові рослини, які продукують ці сполуки, можуть бути одержані шляхом включення та експресії генів з застосування способів трансформації. Ці можливості передбачають застосування, наприклад, будь-якої біологічної сполуки, яка у даний час продукується будь-яким організмом, такої, як білки, нуклеїнові кислоти, первинні та проміжні метаболіти, вуглеводні полімери і т. ін. Сполуки можуть продукуватися рослиною, може бути видобута після збирання врожаю та/або обробки і застосована з будь-якою визнаною на даний час корисною метою, наприклад, у фармацевтиці, у виробництві парфумів, промислових ферментів і т. ін. До потрібних нуклеїновокислотних послідовностей, які можуть комбінуватися з послідовністю контролю експресії згідно з даним винаходом, в оптимальному варіанті належать ті, які кодують запасні білки насіння, ферменти шляху жирних кислот, ферменти біосинтезу токоферолу, ферменти біосинтезу амінокислот та ферменти галуження крохмалю. Послідовності контролю експресії згідно з даним винаходом можуть застосовуватися для експресії метаболічних ферментів для застосування у галузі виробництва продуктів харчування та кормів, наприклад, фітаз та целюлаз. Особливу перевагу віддають нуклеїновим кислотам, таким, як штучна кДНК, яка кодує мікробну фітазу (GenBank Ace. No.: A19451 ) або її функціональні еквіваленти. Експресія генів, які викликають накопичення чистих хімікатів, таких як токофероли, токотриєноли або каротеноїди. Прикладом, який може бути згаданий, є фітоїн десатураза. Перевагу віддають нуклеїновим кислотам, які кодують фітоїн десатуразу Narcissus pseudonarcissus (GenBank Ace. No.: X78815), або їх функціональним еквівалентам. Послідовності контролю експресії згідно з даним винаходом можуть застосовуватися для експресії потрібних нуклеїнових кислот з модифікованим продукуванням олій (Патент США № 6,444,876), високим продукуванням олій (Патенти США №№ 5,608,149 та 6,476,295) або модифікованим вмістом жирних кислот (Патент США № 6,537,750). До оптимальних ферментів шляху жирних кислот належать тіоестерази (Патенти США №№ 5,512,482; 5,530,186; 5,945,585; 5,639,790; 5,807,893; 5,955,650; 5,955,329; 5,759,829; 5,147,792; 5,304,481; 5,298,421; 5,344,771 та 5,760,206), діацилгліцерин ацилтрансферази (публікації патентів США 200301 15632A1 та 20030028923A1) та десатурази (Патенти США №№ 5,689,050; 5,663,068; 5,614,393; 5,856,157; 6,117,677; 6,043,411; 6,194,167; 5,705,391; 5,663,068; 5,552,306; 6,075,183; 6,051,754; 5,689,050; 5,789,220; 5,057,419; 5,654,402; 5,659,645; 6,100,091; 5,760,206; 6,172,106; 5,952,544; 5,866,789; 5,443,974 та 5,093,249), які включено до цього опису шляхом посилання. Продукування нутрицевтиків, таких, як, наприклад, поліненасичені жирні кислоти, такі як, наприклад, арахідонова кислота або EP (ейкозапентаенова кислота) або DHA (докозагексаенова кислота) шляхом експресії елонгаз та/або десатураз жирних кислот або продукування білків, які мають поліпшену поживну цінність, наприклад, таких, що мають високий вміст незамінних амінокислот (наприклад, гена багатого на метіонін 2S альбуміну бразильського горіха). Оптимальними нуклеїновими кислотами є ті, що кодують багатий на метіонін 2S альбумін з Bertholletia excelsa (GenBank Acc. No.: AB044391), [дельта]6-ацилліпід десатураза з Physcomitrella patens (GenBank Acc. No.: AJ222980; Girke et al. (1998) Plant J 15:3948), [дельта]6десатураза з Mortierelia alpina (Sakuradani et al. (1999) Gene 238:445-453), [дельта]5-десатураза з Caenorhabditis elegans (Michaelson et al. 1998, FEBS Letters 439:215-218), [дельта]5-жирної кислоти десатураза (des-5) з Caenorhabditis elegans (GenBank Acc. No.: AF078796), [дельта]5десатураза з Mortierella alpina (Michaelson et al. J Biol Chem 273:19055-19059), [дельта]6елонгаза з Caenorhabditis elegans (Beaudoin et al. (2000) Proc Natl. Acad Sci USA 97:6421-6426), [дельта]6-елонгаза з Physcomitrella patens (Zank et al. (2000) Biochemical Society Transactions 28:654-657) або їх функціональні еквіваленти. Досягнення підвищеної накопичувальної здатності у клітинах, які зазвичай включають малу кількість запасних білків або ліпідів, з метою збільшення виходу цих речовин, наприклад, шляхом експресії ацетил-CoA карбоксилази. Оптимальними нуклеїновими кислотами є ті, що кодують ацетил-CoA карбоксилазу (accase) з Medicago sativa (GenBank Acc. No.: L25042) або їх функціональні еквіваленти. Інші приклади оптимальних генів згадуються, наприклад, у публікації Dunwell J M (2000) J Exp Bot. 51 Spec No:487-96. В альтернативному варіанті підвищений вміст 14 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 запасного білка може бути бажаним для високого рівня продукування білкового продукту. До оптимальних запасних білків насіння належать зеїни. Потрібна нуклеїнова кислота також може забезпечувати резистентність до хвороб насіння, викликаних вірусами, бактеріями, грибками, комахами (наприклад, шляхом експресії відповідного Bt гена) та нематодами. Наприклад, потрібна нуклеїнова кислота може забезпечувати резистентність до грибків, які уражують насіння під час зберігання, таких як грибки роду Aspergillus, Penicilium або Fusarium, зокрема, Fusarium moniliformere. Резистентність до Fusarium в оптимальному варіанті може досягатися через функціональне з’єднання послідовностей контролю експресії згідно з даним винаходом з нуклеїновокислотною послідовністю, яка кодує Cry-1A(b) або будь-який інший Cry варіант, що забезпечує резистентність до Fusarium. Крім того, потрібна нуклеїнова кислота може забезпечувати резистентність до нематоди Anguina tritici, яка може викликати значну втрату врожаю пшениці двозернянки (Triticum monococcum), жита (Secale cereale), пшениці спельти (T. spelta) та пшениці (T. aestivum). Також потрібна нуклеїнова кислота може забезпечувати резистентність до видів Cnephasia, зокрема, до листовійки злакових (Cnephasia pumicana) та таких листовійок, як Cnephasia longana. Також передбачається, що потрібна нуклеїнова кислота може забезпечувати резистентність до сірих польових слимаків, таких як Deroceras reticulatum або Deroceras agreste. Резистентність до вірусів може забезпечуватися через експресію нових генів. Наприклад, було продемонстровано, що експресія білка вірусної оболонки у трансгенній рослині може забезпечувати стійкість до інфікування рослини цим вірусом і, можливо, іншими близько спорідненими вірусами. Передбачається, що експресія антисмислових генів, спрямованих на суттєві вірусні функції, може забезпечувати резистентність до вищезгаданого вірусу. Наприклад, антисмисловий ген, спрямований на ген, який відповідає за реплікацію вірусної нуклеїнової кислоти може інгібувати вищезгадану реплікацію і забезпечувати резистентність до вірусу. Вважається, що перешкоджання іншим вірусним функціям через застосування антисмислових генів також може підвищувати резистентність до вірусів. Експресія нуклеїнових кислот під контролем промоторів згідно з винаходом є можливою у будь-якому потрібному відділі клітини, такому, як, наприклад, ендомембранна система, вакуолі та хлоропласти. Потрібні реакції глікозилування, зокрема, фолдинг і т. ін., є можливими завдяки застосуванню секреторного шляху. Секреція білка-мішені на поверхню клітини або секреція у культуральне середовище, наприклад, при використанні культивованих у суспензії клітин або протопластів, також є можливою. Послідовності-мішені для цієї мети, таким чином, можуть враховуватися в окремих варіантах вектора і включатися, разом з геном-мішенню, який піддається клонуванню, у вектор через застосування прийнятної методики клонування. Існує можливість застосування як послідовностей-мішеней внутрішніх послідовностей генів, за їх наявності, або гетерологічних послідовностей. Додатковими гетерологічними послідовностями, які є оптимальними, але не обмежувальними для функціонального зв’язку, є інші спрямовуючі послідовності для забезпечення субклітинної локалізації в апопластах, у вакуолях, у пластидах, у мітохондріях, в ендоплазматичному ретикулумі (ER), у ядрах клітин, в елайопластах або інших відділах; та енхансери трансляції, такі як 5' лідерна послідовність з вірусу тютюнової мозаїки (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15 8693-8711) і т. ін. Описується перенесення білків, які не є локалізованими per se у пластидах, у спрямований спосіб у пластиди (Klosgen R B & Weil J H (1991) Mol Gen Genet 225(2):297-304; Van Breusegem F et al. (1998) Plant Mol Biol 38(3):491-496). Оптимальними послідовностями є a) мала субодиниця (SSU) рибулозобісфосфаткарбоксилази (Rubisco ssu) з гороху, кукурудзи, соняшника b) транзитні пептиди, похідні від генів біосинтезу рослинних жирних кислот, такі як транзитний пептид пластидного білка перенесення ацилу (ACP), стеарил-ACP десатурази, [бета]-кетоацил-ACP синтази або ацил-ACP тіоестерази c) транзитний пептид для GBSSI (зв’язана з крохмальним зерном крохмальна синтаза 1) d) LHCP II гени. Послідовності-мішені можуть бути зв’язані з іншими послідовностями-мішенями, які відрізняються від кодуючих транзитний пептид послідовностей, для забезпечення субклітинної локалізації в апопластах, у вакуолях, у пластидах, у мітохондріях, в ендоплазматичному ретикулумі (ER), у ядрах клітин, в елайопластах або інших відділах. Також можливим є застосування енхансерів трансляції, таких як 5' лідерна послідовність з вірусу тютюнової мозаїки (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693- 8711) і т. ін. Спеціалістам у даній галузі також відомо, що немає потреби в експресії описаних вище генів 15 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 безпосередньо з застосуванням нуклеїновокислотних послідовностей, які кодують ці гени, або в їх пригніченні, наприклад, за допомогою антисмислових технологій. Вони також можуть застосовувати, наприклад штучні фактори транскрипції, які належать до типу білків "цинкових пальців" (Beerli R R et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(4):1495-500). Ці фактори зв’язуються у регуляторних ділянках ендогенних генів, які мають експресуватися або пригнічуватись і в результаті, залежно від конструкції фактора, ведуть до експресії або пригнічення ендогенного гена. Таким чином, потрібні ефекти також можуть досягатися шляхом експресії відповідного фактора транскрипції "цинкових пальців" під контролем одного з промоторів згідно з винаходом. Експресійні касети згідно з винаходом подібним чином можуть застосовуватися для насінноспецифічного пригнічення або зниження реплікації або/та трансляції генів-мішеней шляхом сайленсингу генів. Експресійні касети згідно з винаходом також можуть застосовуватися для насінноспецифічної експресії нуклеїнових кислот, які опосередковують так звані антисмислові ефекти і, таким чином, є здатними, наприклад, знижувати експресію білка-мішені. Оптимальні гени та білки, пригнічення яких є умовою для потрібного фенотипу, включають, як необмежувальний приклад: a) зниження експресії алергенних білків, як описано, наприклад, у публікаціях Tada Y et al. (1996) FEBS Lett 391(3):341-345 або Nakamura R (1996) Biosci Biotechnol Biochem 60(8):12151221. b) зміну вмісту амілози/амілопектину у крохмалі шляхом пригнічення розгалужувального ферменту Q, який відповідає за [альфа]-1,6-глікозидний зв’язок. Описуються відповідні процедури (наприклад, у публікації Schwall G P et al. (2000) Nat Biotechnol 18(5):551-554). В оптимальному варіанті з цією метою застосовують нуклеїновокислотні послідовності, такі як послідовність ферменту II галуження крохмалю картоплі (GenBank Acc. No.: AR123356; Патент США № 6,169,226) або його гомологи з інших родів та видів. "Антисмислова" нуклеїнова кислота насамперед означає нуклеїновокислотну послідовність, яка повністюабо частково є комплементарною принаймні частині смислового кодуючого ланцюга вищезгаданого білка-мішені. Спеціалістам у даній галузі відомо, що в альтернативному варіанті може застосовуватися кДНК відповідного гена як вихідний шаблон для відповідних антисмислових послідовностей. Антисмислова нуклеїнова кислота в оптимальному варіанті є комплементарною кодуючій ділянці білка-мішені або її частині. Однак антисмислова нуклеїнова кислота також може бути комплементарною некодуючій ділянці або її частині. На основі інформації про послідовність білка-мішені антисмислова нуклеїнова кислота може бути побудована у спосіб, відомий спеціалістам у даній галузі з врахуванням правил пар основ Вотсона та Кріка. Антисмислова нуклеїнова кислота може бути комплементарною всій нуклеїновокислотній послідовності білка-мішені або її частині. В оптимальному варіанті втілення антисмислова нуклеїнова кислота являє собою олігонуклеотид довжиною, наприклад, у 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50 нуклеотидів. Антисмислова нуклеїнова кислота в оптимальному варіанті втілення включає [альфа]аномерні молекули нуклеїнових кислот. [Альфа]-аномерні молекули нуклеїнових кислот, зокрема, утворюють дволанцюгові гібриди з комплементарною РНК, в якій ланцюги проходять паралельно один одному, на відміну від нормальних [бета] одиниць (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:6625-6641). Застосування описаних вище послідовностей у смисловій орієнтації також передбачається і може, як відомо спеціалістам у даній галузі, вести до косупресії. Експресія смислової РНК до ендогенного гена може знижувати або відключати його експресію у спосіб, подібний до описаного для антисмислових підходів (Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224:447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2:291-299). Крім того, включена послідовність має представляти ген, який редукується повністю або лише частково. Можливість трансляції не є необхідною. Також особливу перевагу віддають застосуванню таких способів, як генна регуляція за допомогою дволанцюгової РНК (інтерференції дволанцюгової РНК). Відповідні способи є відомими спеціалістам у даній галузі і описуються детально (наприклад, у публікаціях Matzke M A et al. (2000) Plant Mol Biol 43:401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Прямо вказуються процеси та способи, описані у зазначених джерелах. Високоефективне пригнічення природних генів викликається через одночасне включення ланцюга та комплементарного ланцюга. Можливим і бажаним є поєднання антисмислової стратегії з рибозимним процесом. Рибозими є каталітично активними послідовностями РНК, які, будучи з’єднаними з 16 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антисмисловими послідовностями, каталітично розщеплюють послідовності-мішені (Tanner N K. FEMS Microbiol Rev. 1999; 23 (3):257-75). Це може підвищувати ефективність антисмислової стратегії. Експресія рибозимів для зменшення конкретних білків є відомою спеціалістам у даній галузі і описується, наприклад, у EP-A1 0 291 533, EP-A1 0 321 201 та EP-A1 0 360 257. Прийнятні послідовності-мішені та рибозими можуть бути визначені, як описано у публікації Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds. Academic Press, Inc. (1995), 449-460), шляхом розрахунків вторинної структури рибозимної РНК та РНК-мішені та їх взаємодії (Bayley C C et al., Plant Mol Biol. 1992; 18(2):353-361; Lloyd A M and Davis R W et al., Mol Gen Genet. 1994 March; 242(6):653-657). Прикладами, які слід згадати, є рибозими у формі головки молота (Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585- 591). Оптимальні рибозими мають в основі похідні L-19 IVS РНК тетрахімен (Патент США № 4,987,071; Патент США № 5,116,742). Можуть бути вибрані й інші рибозими, які мають селективність до L119 мРНК (Bartel D and Szostak J W (1993) Science 261:1411- 1418). В іншому варіанті втілення експресія білка-мішені може бути знижена через застосування нуклеїновокислотних послідовностей, які є комплементарними регуляторним елементам генів білка-мішені, утворюють з останніми потрійну спіральну структуру і, таким чином, запобігають транскрипції генів (Helene C (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sci 660:27-36; Maher L J (1992) Bioassays 14(12):807-815). Експресійні касети згідно з винаходом та вектори, які від них походять, можуть включати додаткові функціональні елементи. Термін "функціональний елемент" слід розуміти у широкому сенсі, і він означає всі елементи, які мають вплив на продукування, збільшення функції експресійних касет згідно з винаходом або векторів або організмів, які від них походять. Необмежувальними прикладами, які можуть бути згадані, є: a) Гени-репортери або білки кодують білки, які легко піддаються кількісному визначенню, і через характерний колір або ферментну активність дозволяють визначати ефективність трансформації або місце або час експресії (Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(1):2944). Прикладами, які слід згадати, є: білок зеленої флуоресценції (GFP) (Chui W L et al., Curr Biol 1996, 6:325-330; Leffel S M et al., Biotechniques. 23(5):912-8, 1997; Sheen et al. (1995) Plant Journal 8(5):777- 784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228), хлорамфенікол трансфераза (Fromm et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:5824-5828), люцифераза (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414; Ow et al. (1986) Science, 234:856-859); дозволяє виявляти біолюмінесценцію, [бета]-галактозидазу, кодує фермент, для якого є наявними різні хромогенні субстрати, [бета]-глюкуронідазу (GUS) (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907) або uidA ген, який кодує фермент для різних хромогенних субстратів, білок генного продукту Rлокусу, який регулює продукування пігментів антоціаніну (червоне забарвлення) у рослинних тканинах і, таким чином, дозволяє здійснювати прямий аналіз активності промотора без додаткових допоміжних засобів або хромогенних субстратів (Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium 11:263-282, 1988), [бета]-лактамазу (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75:3737-3741), фермент для різних хромогенних субстратів (наприклад PADAC, хромогенний цефалоспорин), xyIE генний продукт (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:1101-1105), катехол діоксигеназу, яка може перетворювати хромогенні катехоли, альфа-амілазу (Ikuta et al. (1990) Biol Technol. 8:241242, тирозиназу (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129:2703-2714), фермент, який окиснює тирозин до DOPA та допахінону, які згодом утворюють меланін, що легко піддається виявленню, екворин (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268), можуть застосовуватися при виявленні чутливої до кальцію біолюмінесценції. b) Джерела реплікації, які забезпечують розмноження експресійних касет або векторів згідно з винаходом, наприклад, в E. coli. Прикладами, які можуть бути згадані, є ORI (джерело реплікації ДНК), pBR322 ori або P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). c) Елементи, наприклад, "межові послідовності", які забезпечують можливість agrobacteriaопосередкованого перенесення у рослинні клітини для перенесення та включення у геном рослини, такі як, наприклад, права або ліва межа T-ДНК або vir-області. d) Ділянки множинного клонування (MCS) дозволяють здійснювати і сприяють інсерції однієї або кількох нуклеїновокислотних послідовностей. Спеціалістам у даній галузі відомі різні шляхи одержання експресійної касети згідно з винаходом. Продукування експресійної касети згідно з винаходом відбувається, наприклад, через злиття однієї з послідовностей контролю експресії згідно з винаходом з потрібною 17 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїновокислотною послідовністю, яка має бути експресована, у відповідному разі – з послідовністю, яка кодує транзитний пептид, що в оптимальному варіанті розташовується між промотором та відповідною нуклеїновокислотною послідовністю, і з термінатором або сигнал поліаденілування. З цією метою застосовують традиційні способи рекомбінації та клонування (як описано вище). Також існує можливість аналогічного поміщення нуклеїновокислотної послідовності, яка має бути трансгенно експресована, наприклад, шляхом гомологічної рекомбінації, за ендогенним, природним промотором, в результаті чого одержують експресійну касету згідно з винаходом, яка контролює експресію нуклеїновокислотної послідовності, яка має бути трансгенно експресована. В принципі, винахід також охоплює клітини, клітинні культури, частини, такі як, наприклад, коріння, листя, насіння і т. ін., у разі трансгенних рослинних організмів та трансгенного матеріалу для розмноження, такого, як насіння або плоди, що походить від описаних вище трансгенних організмів. Генетично модифіковані рослини згідно з винаходом, які можуть споживатися людиною та тваринами, також можуть використовуватись як продукти харчування для людини або корм для тварин, наприклад, без обробки або після обробки, у спосіб, який є відомим per se. Ще один аспект винаходу, таким чином, стосується застосування описаних вище трансгенних організмів згідно з винаходом та клітин, клітинних культури, частин, таких, як, наприклад, коріння, листя, насіння і т. ін., у разі трансгенних рослинних організмів та трансгенного матеріалу для розмноження, такого, як насіння або плоди, одержані з них, для виробництва продуктів харчування для людини або корму для тварин, фармацевтичних засобів або чистих хімікатів. Також віддають перевагу способові рекомбінантного продукування фармацевтичних препаратів або чистих хімікатів в організмах-хазяях, при якому організм-хазяїн трансформують однією з експресійних касет або одним з векторів, описаних вище, і ця експресійна касета включає один або кілька структурних генів, які кодують потрібний чистий хімікат або каталізують біосинтез потрібного чистого хімікату, трансформований організм-хазяїн культивують і потрібний чистий хімікат відокремлюють від культурального середовища. Цей спосіб широко застосовують до чистих хімікатів, таких як ферменти, вітаміни, амінокислоти, цукри, жирні кислоти, природні та синтетичні ароматизатори, ароматичні речовини та барвники. Особливу перевагу віддають продукуванню токоферолів та токотриєнолів і каротеноїдів. Культивування трансформованих організмів-хазяїв та відокремлення від організмів-хазяїв або від культурального середовища здійснюють за допомогою способів, відомих спеціалістам у даній галузі. Продукування фармацевтичних засобів, таких, як, наприклад, антитіла або вакцини, описується у публікації Hood E E, Jilka J M (1999). Curr Opin Biotechnol 10(4):382-6; Ma J K, Vine N D (1999). Curr Top Microbiol Immunol 236:275-92. Усі джерела, наведені в цьому описі, є включеними шляхом посилання у повному обсязі по відношенню до їх повного змісту розкриття та змісту розкриття, спеціально вказаного в цьому описі. опис фігур Фігура 1. Послідовність KG_Fragment 86 (SEQ ID NO: 10) Фігура 2. Послідовність 62260557.f_o13_1 Maize (SEQ ID NO: 11) Фігура 3. Результати q-RT-PCR, які показують специфічну до цілого насіння експресію 62260557.f_o13_1 Maize. [Коріння_dv: суміш коріння через 5, 15, 30 днів після запилення (DAP); Листя_dv: суміш листя через 5, 15, 30 DAP; Качан: суміш качанів через 5 та 10 DAP; Ціле насіння: суміш цілого насіння через 15, 20, 30 DAP; Ендосперм: суміш ендосперму через 15, 20, 30 DAP; Зав’язь: суміш зав’язі через 15, 20, 30 DAP; Коріння_V2+V4: суміш коріння на стадіях V2 та V4; Пагони/листя_V2 +V4: суміш кільчиків V2 та листя V4; Квітки_GS: суміш квіток та пророщуваного насіння.] Фігура 4. Відповідна CDS послідовність KG_Fragment 86 (SEQ ID NO:4) Фігура 5. Амінокислотна послідовність розшифрованого білка відповідного гена KG_Fragment 86 (SEQ ID NO: 5) Фігура 6. Послідовність AZM5_7833 (SEQ ID NO: 128), яка містить прогнозовану CDS послідовність та розташовану перед нею промоторну ділянку. 5’ UTR (127 п. н.) визначали шляхом порівняння геномної послідовності з EST послідовністю кукурудзи, і вона позначається курсивом, прогнозована відкрита рамка зчитування є підкресленою, а праймери, застосовані для відокремлення промоторної ділянки, позначено жирним шрифтом. Фігура 7. Послідовність Promoter KG86 (p-KG86) (SEQ ID NO: 1) Фігура 8. Діаграма вектора RKF126 18 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Фігура 9. Послідовність RKF126 (SEQ ID NO: 56) Фігура 10. Експресія GUS у різних тканинах на різних стадіях розвитку, започаткована за допомогою p-KG86 у трансгенній кукурудзі з RKF126 Фігура 11. A) Послідовності ZM1s61973481 (SEQ ID NO: 57), B) ZM1s61221800 (SEQ ID NO: 58) та C) ZM1s62042561 (SEQ ID NO: 59) Фігура 12. Результати q-RT-PCR, які показують специфічну до цілого насіння експресію MAWS42 [Коріння_dv: суміш коріння через 5, 15, 30 днів після запилення (DAP); Листя_dv: суміш листя через 5, 15, 30 DAP; Качан: суміш качанів через 5 та 10 DAP; Ціле насіння: суміш цілого насіння через 15, 20, 30 DAP; Ендосперм: суміш ендосперму через 15, 20, 30 DAP; Зав’язь: суміш зав’язі через 15, 20, 30 DAP; Коріння_V2+V4: суміш коріння на стадіях V2 та V4; Пагони/листя_V2 +V4: суміш пагонів V2 та листя V4; Квітки_GS: суміш квіток та пророщуваного насіння.] Фігура 13. Результати q-RT-PCR, які показують специфічну до цілого насіння експресію MAWS45 [Коріння_dv: суміш коріння через 5, 15, 30 днів після запилення (DAP); Листя_dv: суміш листя через 5, 15, 30 DAP; Качан: суміш качанів через 5 та 10 DAP; Ціле насіння: суміш цілого насіння через 15, 20, 30 DAP; Ендосперм: суміш ендосперму через 15, 20, 30 DAP; Зав’язь: суміш зав’язі через 15, 20, 30 DAP; Коріння_V2+V4: суміш коріння на стадіях V2 та V4; Пагони/листя_V2 +V4: суміш пагонів V2 та листя V4; Квітки_GS: суміш квіток та пророщуваного насіння.] Фігура 14. Відповідна CDS послідовність MAWS42 (SEQ ID NO: 6) Фігура 15. Амінокислотна послідовність ZmTIP3-1 відповідного гена до MAWS42 (SEQ ID NO: 7) Фігура 16. Відповідна CDS послідовність MAWS45 (SEQ ID NO: 8) Фігура 17. Амінокислотна послідовність відповідного гена до MAWS45 (SEQ ID NO: 9) Фігура 18. Послідовності AZM5_17960 (SEQ ID NO: 70) та AZM5_6324 (SEQ ID NO: 71), які містять прогнозовану CDS послідовність (ATG позначено підкресленням та жирним шрифтом), прогнозовану 5’-UTR (курсив) та додаткову путативну промоторну послідовність. 5’ UTR послідовності визначали шляхом порівняння геномної послідовності з EST кукурудзи. Фігура 19. Послідовності промотора MAWS42 (p-MAWS42), SEQ ID NO: 2 та промотора MAWS45 (p-MAWS45), SEQ ID NO: 3 Фігура 20. Діаграма RTP1052 Фігура 21. Послідовність RTP1052 (SEQ ID NO: 116) Фігура 22. Діаграма RTP1057 Фігура 23. Послідовність RTP1057 (SEQ ID NO: 117) Фігура 24. Експресія GUS у різних тканинах на різних стадіях розвитку, започаткована за допомогою p-MAWS42 у трансгенній кукурудзі з RTP1052 Фігура 25. Експресія GUS у різних тканинах на різних стадіях розвитку, започаткована за допомогою p-MAWS45 у трансгенній кукурудзі з RTP1057 ПРИКЛАДИ Далі винахід пояснюється на Прикладах, які жодним чином не обмежують обсяг цієї заявки. Приклад 1: Ідентифікація та оцінка промотора KG86 °F цілого насіння кукурудзи Ідентифікація транскрипту KG86 Профілюючий аналіз експресії генів у кукурудзі здійснювали, застосовуючи промислову технологію AFLP для порівняльної експресії (Keygene N.V., P.O. Box 216, 6700 AE Wageningen, Нідерланди) з використанням групи зразків РНК з 23 тканин кукурудзи, генерованих за допомогою BASF (Таблиця 1). Серед AFLP-смуг, які було визначено як такі, що мають експресію, специфічну для всього насіння, був фрагмент з 231 п. н., позначений як "KG_Fragment 86". Послідовність KG_Fragment 86 показано на Фігурі 1. 50 19 UA 109110 C2 Таблиця 1 Тканини кукурудзи, застосовані для експерименту профілювання експресії мРНК Зразок № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 5 10 15 Тканина Коріння листя над качаном повний качан Ціле насіння Ендосперм Зав’язь Жіноча маточкова квітка пророщуване насіння коріння, вег. стан коріння, вег. стан листя, вег. стан листя, вег. стан Час та кількість рослин 9 год (4 рослини) 9 год (4 рослини) 9 год (4 рослини) 9 год (6 рослин) 9 год (6 рослин) 9 год (6 рослин) 9 год (6 рослин) 9 год (6 рослин) 9 год (6 рослин) 9 год (6 рослин) 9 год (6 рослин) 9 год (6 рослин) 9 год (6 рослин) 9 год(6 рослин) 9 год (6 рослин) 9 год (6 рослин) 9 год (6 рослин) 6 рослин 20 зерен насіння Дні після запилення 5 15 30 5 15 30 5 10 15 20 30 15 20 30 15 20 30 до запилення набухання протягом 3 днів V2 V4 V2 V4 Визначення гена, який відповідає KG_Fragment 86 Послідовність KG_Fragment 86 застосовували як запит для BLASTN пошуку по власній базі даних BASF, HySeq All EST. Послідовність, позначена як 62260557.f_o13_1 Maize, яка має 97% ідентичності до KG_Fragment 86, визначали як таку, що має найвищу гомологію з KG_Fragment 86. Послідовність 62260557.f_o13_1 Maize показано на Фігурі 2. Підтвердження моделі експресії 62260557.f_o13_1 Maize з застосуванням кількісної зворотної транскриптази – полімеразної ланцюгової реакції (qRT-PCR). З метою підтвердження природної моделі експресії 62260557.f_o13_1 Maize здійснювали ПЛР з кількісною зворотною транскрипцією (q-RT-PCR) з застосуванням повної РНК, виділеної з тих самих матеріалів, як ті, що застосовувалися для AFLP профілювання експресії (Таблиця 1). Праймери для qRT-PCR будували на основі послідовностей 62260557.f_o13_1 Maize та KG_Fragment 86 з застосуванням пакета програм Vector NTI (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США). Застосовували два набори праймерів для ПЛР ампліфікації 62260557.f_o13_1 Maize (Таблиця 2). Ген гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH) використовували як контроль з метою нормалізації. Таблиця 2 Праймерні послідовності для q-RT-PCR Праймер 62260557_Forward_1 62260557_Reverse_1 62260557_Forward_2 62260557_Reverse_2 GAPDH_Forward GAPDH_Reverse 20 Послідовність (SEQ ID NO) CAGCTAGCGGCTTAGTCT (12) CTCTTCGCCTGGAGGTTC (13) TGGTTTCATTGGATGCAGC (14) TGCAGTGCGAGTCAGAGA( 15) GTAAAGTTCTTCCTGATCTGAAT (16) TCGGAAGCAGCCTTAATA (17) q-RT-PCR здійснювали з застосуванням SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, 20 UA 109110 C2 5 10 15 20 25 Карлсбад, Каліфорнія, США) та SYBR Green QPCR Master Mix (Eurogentec, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) у системі виявлення послідовностей ABI Prism 7000. КДНК синтезували, застосовуючи 2-3 мкг повної РНК та 1 мкл зворотної транскриптази в об’ємі 20 мкл. КДНК розводили до певних меж концентрації (15-20 нг/мкл). Від тридцяти до сорока нг кДНК застосовували для кількісної ПЛР (qPCR) в об’ємі 30 мкл з SYBR Green QPCR Master Mix з дотриманням інструкції виробника. Умови термоциклування були такими: інкубування при 50°C протягом 2 хвилин, денатурування при 95°C протягом 10 хвилин та здійснення 40 циклів при 95°C протягом 15 секунд і 60°C протягом 1 хвилини для ампліфікації. Після останнього циклу ампліфікації здійснювали аналіз кривої дисоціації для підтвердження того, що ампліфікація відбулася специфічно, і не було утворено димерних продуктів праймера під час процесу ампліфікації. Конститутивний ген гліцеральдегід-3-фосфат-дегідрогенази (GAPDH, праймерні послідовності у Таблиці 2) застосовували як ендогенний еталонний ген для нормалізації розрахунку з застосуванням способу оцінки Comparative Ct (цикл порогу). Значення ∆CT одержували шляхом віднімання значення Ct гена GAPDH від значення Ct гена-кандидата (62260557.f_o13_1 Maize), і відносну кількість транскрипції (рівень експресії) гена-кандидата -∆CT виражали як 2 . Результати q-RT-PCR зведено на Фігурі 3. Обидва набори праймерів давали подібні моделі експресії, які є рівноцінними моделям експресії, одержаним з даних AFLP. Анотація KG_Fragment 86 Кодуючу послідовність KG_Fragment 86 анотували на основі in silico результатів, одержаних у процесі BLASTX пошуку послідовності EST 62260557.f_o13_1Maize по базі даних білків GenBank (nr) та результату in silico трансляції послідовності з застосуванням пакету програм Vector NTI. Послідовність EST 62260557.f_o13_1 Maize кодує частковий білок з найвищою гомологією до гена рису, анотованого як гіпотетичний білок OsI_025737 (Інвентарний номер GenBank: EAZ04505.1). Перші 15 гомологічних послідовностей, визначених у BlastX запиті, представлено у Таблиці 3. Таблиця 3 Результати BLASTX пошуку EST 62260557.f_o13_1 Maize Інв. номер EAZO4505.1 BAC22280.1 EAZ40462.1 CAO61483.1 ABK28018.1 NP_001117365.1 AAF99742.1 XP_001751813.1 XP_001778474.1 CAN72846.1 XP_001763429.1 CAO14607.1 NP_001067585.1 ABK28287.1 NP_198895.1 30 35 Опис гіпотетичний білок OsI_025737 Oryza sativa (група сортів indica)] гіпотетичний білок [Oryza sativa (japonica)] гіпотетичний білок OsJ_023945[Oryza sativa (japonica)] неназваний білковий продукт [Vitis vinifera] невідомий [Arabidopsis thaliana] невідомий [Arabidopsis thaliana] F17L21.26 [Arabidopsis thaliana] прогнозований білок [Physcomitrella patens підв. Patens] прогнозований білок [Physcomitrella patens підв. Patens] гіпотетичний білок [Vitis vinifera] прогнозований білок [Physcomitrella patens підв. Patens] неназваний білковий продукт [Vitis vinifera] Os11g0241200 [Oryza sativa (japonica)] невідомий [Arabidopsis thaliana] невідомий білок [Arabidopsis thaliana] Показник E-значення 152 8e-36 152 8e-36 146 5e-34 114 100 100 100 2e-24 6e-20 6e-20 6e-20 75 1e-12 74 5e-12 69 2e-10 67 6e-10 55 52 51 51 2e-06 1e-05 3e-05 3e-05 CDS послідовність KG_Fragment 86 показано на Фігурі 4, а розшифровану амінокислотну послідовність показано на Фігурі 5. Ідентифікація промоторної ділянки Для ідентифікації промотора послідовність перед старт-кодоном прогнозованого гена KG_Fragment 86 визначали як промотор p-KG86. Для ідентифікації цієї промоторної ділянки послідовність 62260557.f_o13_1 картували по власній базі даних послідовностей геномних ДНК BASF Plant Science, PUB_tigr_maize_genomic_partial_5.0.nt. Було ідентифіковано одну послідовність геномних ДНК кукурудзи, AZM5_7833 (5084 п. н.). Ця послідовність з 5084 п. н. 21 UA 109110 C2 5 10 15 вміщувала CDS фрагмента KG_Fragment 86 і понад 2 т. н. перед послідовністю старт-кодону ATG цього гена (Фігура 6). Виділення промоторної ділянки шляхом ПЛР-ампліфікації Путативну промоторну ділянку виділяли через геномну ПЛР, використовуючи такі специфічні до послідовності праймери: Прямий праймер: tcccgtgtccgtcaatgtgata (SEQ ID NO: 18) Зворотний праймер: Ggactcacgagctgaggctcgg (SEQ ID NO: 19) Очікуваний фрагмент з 1198 п. н. ампліфікували з геномної ДНК кукурудзи і анотували як Promoter KG86 (p-KG86). Послідовність p-KG86 було показано на Фігурі 7. PLACE аналіз Promoter KG86 Діючі у цис-позиції мотиви у промоторній ділянці з 1198 п. н. KG86 ідентифікували з застосуванням PLACE (бази даних рослинних діючих у цис-позиції Регуляторних елементів ДНК) за допомогою набору бази даних Genomatix. Результати перелічено у Таблиці 4. Хоча у прямому ланцюгу не було ідентифіковано путативний консенсусний TATA-бокс, виявлено мотив CAAT-бокс у позиції нуклеотидів 701 - 705 у прямому ланцюгу. Таблиця 4 Результати аналізу PLACE для промотора з 1198 п. н., p-KG86 Початк. Кінц. поз. поз. WBOXATNPR1 2 16 DPBFCOREDCDC3 2 8 ASF1MOTIFCAMV 7 19 S1FBOXSORPS1L21 41 46 RYREPEATGMGY2 42 52 DRECRTCOREAT 61 67 GCCCORE 65 71 BIHD1OS 103 107 SORLIP1AT 131 143 GT1GMSCAM4 159 164 IBOXCORE 171 177 TBOXATGAPB 180 185 BIHD1OS 184 188 S1FBOXSORPS1L21 188 193 MYB1AT 208 213 TATABOX4 211 217 MYBST1 244 250 IBOXCORE 275 281 BIHD1OS 300 304 MYBCOREATCYCB1 306 310 RYREPEATGMGY2 315 325 CCAATBOX1 322 326 CGACGOSAMY3 328 332 CGCGBOXAT 345 350 CGCGBOXAT 345 350 SURECOREATSULTR11 347 353 DPBFCOREDCDC3 351 357 PALBOXAPC 362 368 CMSRE1IBSPOA 362 368 SORLIP1AT 379 391 ABREATRD2 383 395 CACGTGMOTIF 384 396 RAV1AAT 395 399 ASF1MOTIFCAMV 411 423 ASF1MOTIFCAMV 438 450 LTRE1HVBLT49 450 455 BIHD1OS 460 464 IUPAC Ланцюг + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 22 Невідпо- ПоказПослідовність (SEQ ID NO) відності ник 0 1 ATTGACGGACACGGG (20) 0 1 ACACGGG 0 1 CACATTGACGGAC (21) 0 1 ATGGTA 0 1 ACCATGCATAC (22) 0 1 GCCGACC 0 1 GGCCGCC 0 1 TGTCA 0 1 TAGCTAGCCACGC (23) 0 1 GAAAAA 0 1 GATAATA 0 1 ACTTTG 0 1 TGTCA 0 1 ATGGTA 0 1 TAACCA 0 1 TATATAA 0 1 AGGATAG 0 1 GATAAAA 0 1 TGTCA 0 1 AACGG 0 1 CGCATGCATTG (24) 0 1 CCAAT 0 1 CGACG 0 1 GCGCGT 0 1 ACGCGC 0 1 GAGACGC 0 1 ACACGAG 0 1 CCGTCCA 0 1 TGGACGG 0 1 TCTCACGCCACGT (25) 0 1 GAGCACGTGGCGT (26) 0 1 CGCCACGTGCTCA (27) 0 1 CAACA 0 1 GCTGGTGACGAAC (28) 0 1 AGGGATGACGCAT (29) 0 1 CCGAAA 0 1 TGTCA UA 109110 C2 Таблиця 4 Результати аналізу PLACE для промотора з 1198 п. н., p-KG86 Початк. Кінц. Невідпо- ПоказЛанцюг Послідовність (SEQ ID NO) поз. поз. відності ник MYBST1 485 491 0 1 TGGATAT TATCCAOSAMY 486 492 + 0 1 TATCCAA RAV1AAT 490 494 + 0 1 CAACA EMHVCHORD 524 532 + 0 1 TGTAAAGTC 300ELEMENT 524 532 + 0 1 TGTAAAGTC TAAAGSTKST1 524 530 + 0 1 TGTAAAG NTBBF1ARROLB 525 531 0 1 ACTTTAC CACGTGMOTIF 544 556 0 1 CTGCACGTGCTGT (30) CACGTGMOTIF 545 557 + 0 1 CAGCACGTGCAGA (31) HEXMOTIFTAH3H4 561 573 + 0 1 ATTAACGTCATTA (32) TGACGTVMAMY 563 575 0 1 AATAATGACGTTA (33) CPBCSPOR 572 577 + 0 1 TATTAG RYREPEATGMGY2 588 598 0 1 ATCATGCATCT (34) DPBFCOREDCDC3 618 624 + 0 1 ACACAAG OSE2ROOTNODULE 622 626 0 1 CTCTT MYBPLANT 667 677 0 1 CACCAACCAGC (35) BOXLCOREDCPAL 670 676 0 1 ACCAACC CGCGBOXAT 684 689 + 0 1 GCGCGC CGCGBOXAT 684 689 0 1 GCGCGC CCAATBOX1 696 700 0 1 CCAAT CCAATBOX1 701 705 + 0 1 CCAAT SORLIP1AT 721 733 + 0 1 CCACTCGCCACGC (36) SORLIP2AT 738 748 0 1 GGGGCCATTCA (37) CGCGBOXAT 774 779 + 0 1 CCGCGC CGCGBOXAT 774 779 0 1 GCGCGG CGCGBOXAT 776 781 + 0 1 GCGCGC CGCGBOXAT 776 781 0 1 GCGCGC SITEIIATCYTC 777 787 0 1 TGGGCCGCGCG (38) CGCGBOXAT 778 783 + 0 1 GCGCGG CGCGBOXAT 778 783 0 1 CCGCGC DRECRTCOREAT 793 799 0 1 GCCGACT SORLIP1AT 801 813 + 0 1 GAACGCGCCACGG (39) CGCGBOXAT 803 808 + 0 1 ACGCGC CGCGBOXAT 803 808 0 1 GCGCGT SORLIP2AT 829 839 + 0 1 AGGGCCGAGGC (40) CGCGBOXAT 841 846 + 0 1 GCGCGG CGCGBOXAT 841 846 0 1 CCGCGC OCTAMOTIF2 842 849 + 0 1 CGCGGCAT BS1EGCCR 864 869 + 0 1 AGCGGG RYREPEATBNNAPA 876 886 0 1 TGCATGCAGGT (41) INTRONLOWER 877 882 0 1 TGCAGG RYREPEATBNNAPA 879 889 + 0 1 TGCATGCAGCC (42) ASF1MOTIFCAMV 902 914 0 1 ACGACTGACGAGG (43) BOXCPSAS1 921 927 + 0 1 CTCCCAC MYBPZM 937 943 + 0 1 CCCAACC CGCGBOXAT 963 968 + 0 1 ACGCGC CGCGBOXAT 963 968 0 1 GCGCGT ABREMOTIFAOSOSEM 985 997 + 0 1 GCCTACGTGTCGG (44) DRECRTCOREAT 992 998 0 1 GCCGACA ABREOSRAB21 1014 1026 0 1 GGGTACGTGGGCG (45) CCCGCCCCGTTCTCCCACG UPRMOTIFIIAT 1025 1043 + 0 1 (46) IUPAC 23 UA 109110 C2 Таблиця 4 Результати аналізу PLACE для промотора з 1198 п. н., p-KG86 Початк. поз. MYBCOREATCYCB1 1031 IRO2OS 1036 BOXCPSAS1 1036 ABREOSRAB21 1037 CGCGBOXAT 1057 CGCGBOXAT 1057 CGCGBOXAT 1059 CGCGBOXAT 1059 CCAATBOX1 1068 WBOXNTCHN48 1072 CGCGBOXAT 1092 CGCGBOXAT 1092 SORLIP2AT 1107 SORLIP2AT 1110 HEXAMERATH4 1129 CGACGOSAMY3 1130 CGACGOSAMY3 1133 SURECOREATSULTR11 1135 SITEIIATCYTC 1154 QELEMENTZMZM13 1159 WBOXNTCHN48 1164 SORLIP2AT 1167 IUPAC 5 10 15 20 25 Кінц. Невідпо- ПоказЛанцюг Послідовність (SEQ ID NO) поз. відності ник 1035 0 1 AACGG 1048 0 1 GGGCACGTGGGAG (47) 1042 + 0 1 CTCCCAC 1049 + 0 1 TCCCACGTGCCCC (48) 1062 + 0 1 GCGCGC 1062 0 1 GCGCGC 1064 + 0 1 GCGCGT 1064 0 1 ACGCGC 1072 0 1 CCAAT 1086 + 0 1 GCTGACCCGCCCTTC (49) 1097 + 0 1 CCGCGC 1097 0 1 GCGCGG 1117 0 1 GGGGCCCGGAC (50) 1120 + 0 1 CGGGCCCCAAC (51) 1134 + 0 1 CCGTCG 1134 0 1 CGACG 1137 0 1 CGACG 1141 0 1 GAGACGA 1164 0 1 TGGGCTCGATC (52) 1173 0 1 CCAGGTCAGTGGGCT (53) 1178 + 0 1 ACTGACCTGGCCCCC (54) 1177 0 1 GGGGCCAGGTC (55) Побудова бінарного вектора для трансформації кукурудзи з метою оцінки функції p-KG86 Для сприяння субклонуванню фрагмент промотора з 1198 п. н. модифікували шляхом додавання сайта PacI рестрикційного ферменту на його 5’ кінці та сайта BsiWI на його 3’ кінці. Фрагмент промотора PacI-pKG86-BsiWI розщеплювали і лігували у розщеплений PacI та BsiWI BPS основний бінарний вектор HF84. HF84 включає експресійну касету з рослинним селектабельним маркером (p-Ubi:c-EcEsdA:t-NOS), а також касету оцінки промотора, яка складається з сайта множинного клонування для інсерції путативних промоторів через PacI та BsiWI, MET1-1 інтрон рису для забезпечення інтрон-опосередкованого посилення в однодольних клітинах, GUS ген-репортер та NOS термінатор. Одержаний в результаті бінарний вектор, який включав експресійну касету p-KG86:i-MET1 :GUS:t-NOS, було названо RKF126, і його застосовували для оцінки моделі експресії, започаткованої промотором p-KG86. Фігура 8 є діаграмою RKF126. Послідовність бінарного вектора RKF126 показано на Фігурі 9. Оцінка промотора у трансгенній кукурудзі з RKF126 Моделі та рівні експресії, викликаної промотором p-KG86, вимірювали, застосовуючи Гістохімічний аналіз GUS з дотриманням прийнятого у галузі протоколу (Jefferson 1987). Трансформацію кукурудзи здійснювали, застосовуючи систему Agrobacterium-опосередкованої трансформації. Для аналізу промотора вибирали десять та п’ять унікальних подій для рослин T0 та T1. Експресію GUS вимірювали на різних стадіях розвитку: 1) Коріння та листя на стадії 5 листа 2) Стебло на стадії V-7 2) Листя, лузга та ниткоподібні шовковисті маточки на стадії цвітіння (перша поява ниткоподібних шовковистих маточок) 3) Колоски/султани (при запиленні) 5) Качани або зерна на 5, 10, 15, 20 та 25 дні після запилення (DAP) Результати показували, що промотор p-KG86 RKF126 специфічно експресується у пилку і у цілому насінні (Фігура 10). 24 UA 109110 C2 Таблиця 4A: Зведені дані по випробуваних тканинах та відносної інтенсивності експресії для pKG86 Тканини Випробувані Колоски/ Незапи- Запишовковисті ендоспе стадії Листя Коріння Стебло лузга султани/п лений лений пагін маточки рм илок початок початок проросток (5 листків) V-7 Цвітіння (поява шовковисти х маточок) запилення ++ 5DAP + 10DAP ++ ++ 15DAP ++ ++ 20DAP +++ +++ 25DAP +++ +++ 48 год після ++++ ++++ набухання 72 год після ++++ ++++ набухання 1 тиждень проростання 5 10 15 20 25 30 - = відсутність експресії, + = слабка експресія, ++ = середня експресія, +++ = сильна експресія, ++++ = дуже сильна експресія Приклад 2: Ідентифікація та оцінка промотора цілого насіння кукурудзи MAWS42 та MAWS45 Ідентифікація транскрипту MAWS42 та MAWS45 Дослідження мікрочіпів здійснювали для ідентифікації транскриптів зі специфічною до цілого насіння експресією у кукурудзі з застосуванням однакового набору зразків РНК кукурудзи, показаних у Таблиці 1. Двадцять три мічених РНК цих тканин кукурудзи окремо гібридизували з 23 спеціально побудованими чіпами Affymetrix для BPS кукурудзи, мітили флуоресцентним антитілом зі стрептавідином, промивали, забарвлювали і сканували, як вказано у технічній інструкції з аналізу експресії системи Affymetrix. Дані гібридизації чіпа аналізували з застосуванням програми Genedata Specialist і відносний рівень експресії визначали на основі інтенсивності сигналу гібридизації кожної тканини. Три випробувальні набори чіпів для BPS кукурудзи вибирали як транскрипти-кандидати, які демонструють у 3-8 разів вищу експресію в цілому насінні порівняно з іншими тканинами: ZM1s61973481_at, ZM1s61221800_s_at та ZM1s62042561_at. Консенсусні послідовності ZM1s61973481_at, ZM1s61221800_s_at та ZM1s62042561_at показано на Фігурі 11. Попередній аналіз послідовностей показав, що ZM1s61221800 був включений до ZM1s62042561, отже, ми розглядали ZM1s61221800 та ZM1s62042561 як такі, що представляють один ген; подальші дослідження цього гена здійснювали на основі ZM1s62042561. Для зручності представлення ми вказували ZM1s61973481 як кандидат MAWS42 і ZM1s62042561 як MAWS45. Підтвердження моделі експресії MAWS42 та MAWS45 з застосуванням кількісної зворотної транскриптази-полімеразної ланцюгової реакції (q-RT-PCR) Підтвердження природної моделі експресії MAWS42 та MAWS45 здійснювали через ПЛР з кількісною зворотною транскрипцією (q-RT-PCR) з застосуванням повної РНК, виділеної з тих самих матеріалів, як ті, що застосовувалися для дослідження на чіпах (Таблиця 1). Праймери для qRT-PCR будували на основі послідовностей ZM1s61973481 для MAWS42 і ZM1s62042561 для MAWS45 з застосуванням пакету програм Vector NTI. Застосовували два набори праймерів для ПЛР ампліфікації кожного гена. Послідовності праймерів представлено у Таблиці 5. Ген гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH) використовували як контроль з метою нормалізації. 25 UA 109110 C2 Таблиця 5 Праймерні послідовності для q-RT-PCR Праймер MAWS42_Forward_1 MAWS42_Reverse_1 MAWS42_Forward_2 MAWS42_Reverse_2 MAWS45_Forward_1 MAWS45_Reverse_1 MAWS45_Forward_2 MAWS45_Reverse_2 GAPDH_Forward GAPDH_Reverse 5 10 15 20 25 Послідовності (SEQ ID No) CTGGCCGTGGGCTTCCTGCT (60) AAGGGCCCAGCCAGTACACCCA (61) TGGAGGCACCACTGGGTGTACTGG (62) GCTAGTAGTCCTCTGGCGCGAGCG (63) GCCAACTCTTCCATTTCGCCAAGG (64) GGAGGATTGGCGGTGACAGTCTCA (65) AGGAAAAAATGGCGGCTCGCTGG (66) CCATGCAAATGGAGGATTGGCGG (67) GTAAAGTTCTTCCTGATCTGAAT (68) TCGGAAGCAGCCTTAATA (69) q-RT-PCR здійснювали з застосуванням SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США) та SYBR Green QPCR Master Mix (Eurogentec, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) у системі виявлення послідовностей ABI Prism 7000. КДНК синтезували, застосовуючи 2-3 мкг повної РНК та 1 мкл зворотної транскриптази в об’ємі 20 мкл. КДНК розводили до певних меж концентрації (15-20 нг/мкл). Від тридцяти до сорока нг кДНК застосовували для кількісної ПЛР (qPCR) в об’ємі 30 мкл з SYBR Green QPCR Master Mix з дотриманням інструкції виробника. Умови термоциклування були такими: інкубування при 50ºC протягом 2 хвилин, денатурування при 95ºC протягом 10 хвилин та здійснення 40 циклів при 95ºC протягом 15 секунд і 60ºC протягом 1 хвилини для ампліфікації. Після останнього циклу ампліфікації здійснювали аналіз кривої дисоціації для підтвердження того, що ампліфікація відбулася специфічно, і не було утворено димерних продуктів праймера під час процесу ампліфікації. Конститутивний ген гліцеральдегід-3-фосфат-дегідрогенази (GAPDH, праймерні послідовності у Таблиці 2) застосовували як ендогенний еталонний ген для нормалізації розрахунку з застосуванням способу оцінки Comparative Ct (цикл порогу). Значення ∆CT одержували шляхом віднімання значення Ct гена GAPDH від значення Ct генів-кандидатів. Відносну кількість транскрипції (рівень експресії) гена-кандидата виражали як 2-∆CT. Результати qRT-PCR було зведено на Фігурі 12 та Фігурі 13. Обидва набори праймерів давали моделі експресії, подібні до тих, які одержували при дослідженні на чіпах. Анотація MAWS42 та MAWS45 Кодуючі послідовності, які відповідали генам MAWS42 та MAWS45, анотували на основі in silico результатів, одержаних від BLASTX консенсусних послідовностей чіпів ZM1s61973481 та ZM1s62042561 по базі даних білків GenBank (nr), та результатів програми трансляції пакету програм Vector NTI. ZM1s61973481 частково кодує внутрішній білок тонопласта кукурудзи 31(ZmTIP3). CDS ZmTIP3-1 (Інвентарний номер GenBank:NP_0011050321) показано на Фігурі 14, трансльовану амінокислотну послідовність показано на Фігурі 15, і 15 головних гомологічних послідовностей з запиту BLASTX представлено у Таблиці 6. 26 UA 109110 C2 Таблиця 6 Результати BLASTX пошуку ZM1s61973481 кукурудзи (MAWS42) Інв. № NP_001105032.1 NP_001064933.1 NP_001105045.1 BAA08107.1 CAA44669.1 BAA08108.1 ABK22410.1 ABK22242.1 NP_001053371.1| CAA64952.1 EAY94920.1 CAB39758.1 AAC39480.1 CAO62035.1 BAD04010.1 5 Опис TIP31_MAIZE Аквапорин TIP3-1 (внутрішній білок тонопласта 3-1) Os10g0492600 [Oryza sativa (japonica)] TIP32_MAIZE Аквапорин TIP3-2 (внутрішній білок тонопласта 3-2) (ZmTIP3-2) мембранний білок MP23 прекурсор [гарбуз, сорт Kurokawa Amakuri] внутрішній білок тонопласта [Phaseolus vulgaris] T10253 мембранний білок MP28 [гарбуз, сорт Kurokawa Amakuri] невідомий [Picea sitchensis] невідомий [Picea sitchensis] Os04g0527900 [Oryza sativa (група сортів japonica)] внутрішній білок тонопласта [Tulipa gesneriana] гіпотетичний білок OsI_016153 [Oryza sativa (група сортів indica)] головний внутрішній білок [Picea abies] аквапорин [Vernicia fordii] неназваний білковий продукт [Vitis vinifera] внутрішній білок тонопласта [Prunus persica] Показник E-значення 150 8e-73 147 4e-64 139 5e-63 98 5e-42 98 4e-40 92 6e-39 98 94 6e-33 5e-32 85 2e-24 96 2e-24 86 2e-24 111 87 110 109 4e-24 8e-24 5e-22 6e-22 ZM1s62042561(MAWS45) кодує частковий білок, який має найвищу гомологію з невідомим білком кукурудзи (Інвентарний номер GenBank: ACF84237.1). CDS цього гена показано на Фігурі 16, трансльовану амінокислотну послідовність показано на Фігурі 17, і 15 головних гомологічних послідовностей з BLASTX запиту представлено у Таблиці 7. Таблиця 7 Результати BLASTX пошуку ZM1s62042561 кукурудзи (MAWS45) Інв. № ACF84237.1 ACG56678.1 NP_001054761.1 EAY96695.1 EAY96696.1 EAY72702.1 BAD68317.1 EAZ10701.1 ACF80703.1 EAZ33023.1 AAM69848.1 NP_001042135.1 CAO64270.1 CAN80923.1 CAO16122.1 Опис Показник E-значення невідомий [Zea mays] 536 e-152 триптофан амінотрансфераза [Zea mays] 534 e-151 Os05g0169300 [Oryza sativa (група сортів japonica)] 239 e-100 гіпотетичний білок OsI_017928 [Oryza sativa (сорт indica)] 239 e-100 гіпотетичний білок OsI_017929 [Oryza sativa (група сортів 233 4e-98 indica)] гіпотетичний білок OsI_000549 [Oryza sativa (група сортів 167 9e-85 indica)] путативний прекурсор аліїнази [Oryza sativa Japonica Group] 167 9e-85 гіпотетичний білок OsJ_000526 [Oryza sativa (група сортів 167 9e-85 japonica)] невідомий [Zea mays] 204 2e-79 гіпотетичний білок OsJ_016506 [Oryza sativa (група сортів 158 3e-75 japonica)] путативна аліїн ліаза [Aegilops tauschii] 265 1e-73 Os01g0169800 [Oryza sativa (група сортів japonica)] 167 7e-73 неназваний білковий продукт [Vitis vinifera] 221 5e-71 гіпотетичний білок [Vitis vinifera] 221 7e-71 неназваний білковий продукт [Vitis vinifera] 157 1e-61 Ідентифікація промоторної ділянки 27 UA 109110 C2 5 10 15 Послідовності перед старт-кодонами відповідних генів до MAWS42 та MAWS45 визначали як путативні промотори p-MAWS42 та p-MAWS45. Для ідентифікації цих путативних промоторних ділянок послідовності ZM1s61973481 та ZM1s62042561 картували по власній базі даних послідовностей геномних ДНК BASF Plant Science, PUB_tigr_maize_genomic_partial_5.0.nt. Ідентифікували дві послідовності геномних ДНК кукурудзи, AZM5_17960 (3985 п. н.) та AZM5_6324 (4565 п. н.), відповідно. Послідовність AZM5_17960 має послідовність приблизно 1 т. н. перед прогнозованою послідовністю CDS відповідного гена до MAWS42, і AZM5_6324 має послідовність приблизно 1,5 т. н. перед прогнозованою послідовністю CDS відповідного гена до MAWS45. Ці розташовані попереду послідовності розглядали як путативний промотор MAWS42 (p-MAWS42) та промотор MAWS45 (p-MAWS45). Фігура 18 показує послідовності AZM5_17960 та послідовність AZM5_6324. Виділення промоторної ділянки шляхом ПЛР-ампліфікації Послідовності путативного промотора виділяли за допомогою геномної ПЛР з застосуванням специфічних до послідовності праймерів, вказаних у Таблиці 8. Фрагмент з 1008 п. н. AZM5_17960 та фрагмент з 1492 п. н. AZM5_6324 ампліфікували з геномної ДНК кукурудзи. Ці фрагменти було названо промотором MAWS42 (p-MAWS42) та промотором MAWS45 (pMAWS45), відповідно. Послідовності p-MAWS42 та p-MAWS45 показано на Фігурі 19. Таблиця 8 Праймери для ПЛР-клонування pMAWS42 та p-MAWS45 Праймер p-MAWS42_forward p-MAWS42_reverse p-MAWS45_forward p-MAWS45_reverse 20 Послідовність (SEQ ID NO) taactcatatccggttagata (72) gtcgtcgccaaataaaaacctacc (73) atttaaatgtgttggataatct (74) ctcctcctcctcctcctcctcct (75) PLACE аналіз промоторів MAWS42 та MAWS45 Діючі у цис-позиції мотиви у промоторних ділянках з 1008 п. н. p-MAWS42 і з 1492 п. н. pMAWS45 ідентифікували з застосуванням PLACE (бази даних рослинних діючих у цис-позиції регуляторних елементів ДНК) за допомогою набору бази даних Genomatix. Результати перелічено у Таблиці 9 та Таблиці 10. 25 Таблиця 9 Результати PLACE аналізу промотора з 1008 п. н. p-MAWS42 PREATPRODH REBETALGLHCB21 NAPINMOTIFBN CPBCSPOR SEF1MOTIF SP8BFIBSP8BIB SEF1MOTIF TATABOXOSPAL PREATPRODH BIHD1OS CCAATBOX1 Початк. поз. 3 7 27 50 52 74 85 86 92 109 126 ELRECOREPCRP1 140 154 + 0 1 CPBCSPOR D3GMAUX28 MYBPZM TATABOX2 IBOXCORE SREATMSD 155 172 186 214 218 219 160 182 192 220 224 225 + + + 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 IUPAC Кінц. Ланцюг Невідповідності Показник поз. 8 + 0 1 13 0 1 33 + 0 1 55 0 1 60 0 1 80 0 1 93 0 1 92 0 1 97 0 1 113 0 1 130 0 1 28 Послідовність (SEQ ID No) ACTCAT CGGATAT TACACAT TATTAG ATATTTATT TACTATT ATATTTAAT TATTTAA ACTCAT TGTCA CCAAT ATTGACCCTATTTTG (76) TATTAG TATTTGCTTAA (77) TCCTACC TATAAAT GATAATT ATTATCC