Ізольований або рекомбінантний полінуклеотид, що кодує поліпептид, який має активність гліфосат-n-ацетилтрансферази (gat)

1. Ізольований або рекомбінантний полінуклеотид, що кодує поліпептид, який має активність глiфосат-N-ацетилтрансферази, що включає нуклеотидну послідовність, що кодує послідовність амінокислот, яка має щонайменше 60 % iдентичностi послiдовностi по всій довжині послідовності, вибраної з групи, що включає SEQ. ID. No.: 300, SEQ. ID. No.: 445 i SEQ. ID. No.: 457. 2. Ізольований або рекомбінантний полінуклеотид, що кодує поліпептид, який має активність глiфосат-N-ацетилтрансферази, що включає нуклеотидну послідовність, яка кодує щонайменше 140 суміжних амінокислот амінокислотної послідовності, вибраної з групи, що включає SEQ. ID. No.: 300, SEQ. ID. No.: 445 i SEQ. ID. No.: 457. 3. Полінуклеотид за п. 2, де (а) батьківський кодон був замінений синонімічним кодоном, що переважно застосовується в рослинах порівняно з батьківським кодоном; i/або (b) згаданий полінуклеотид додатково включає нуклеотидну послідовність, що кодує N-кiнцевий хлоропласт-транзитний пептид. 2 (19) 1 3 86918 4 (h) в положенні 11 амінокислотний залишок являє (ao) в положенні 62 амінокислотний залишок являє собою D або E; собою P, S або T; (i) в положенні 12 амінокислотний залишок являє (ap) в положенні 63 амінокислотний залишок являє собою T або A; собою E, G або D; (j) в положенні 14 амінокислотний залишок являє (aq) в положенні 65 амінокислотний залишок являє собою E або K; собою E, D, V або Q; (k) в положенні 15 амінокислотний залишок являє (ar) в положенні 67 амінокислотний залишок являє собою I або L; собою Q, E, R, L, H або K; (l) в положенні 17 амінокислотний залишок являє (as) в положенні 68 амінокислотний залишок являє собою H або Q; собою K, R, E або N; (m) в положенні 18 амінокислотний залишок являє (at) в положенні 69 амінокислотний залишок являє собою R, C або K; собою Q або P; (n) в положенні 19 амінокислотний залишок являє (au) в положенні 79 амінокислотний залишок являє собою I або V; собою E або D; (o) в положенні 24 амінокислотний залишок являє (av) в положенні 80 амінокислотний залишок являє собою Q або R; собою G або E; (p) в положенні 26 амінокислотний залишок являє (aw) в положенні 81 амінокислотний залишок явсобою L або I; ляє собою Y, N або F; (q) в положенні 27 амінокислотний залишок являє (ax) в положенні 82 амінокислотний залишок являє собою E або D; собою R або H; (r) в положенні 28 амінокислотний залишок являє (ay) в положенні 83 амінокислотний залишок являє собою A або V; собою E, G або D; (s) в положенні 30 амінокислотний залишок являє (az) в положенні 84 амінокислотний залишок являє собою K, M або R; собою Q, R або L; (t) в положенні 31 амінокислотний залишок являє (ba) в положенні 86 амінокислотний залишок являє собою Y або F; собою A або V; (u) в положенні 32 амінокислотний залишок являє (bb) в положенні 89 амінокислотний залишок являє собою E або G; собою T або S; (v) в положенні 33 амінокислотний залишок являє (bc) в положенні 90 амінокислотний залишок являє собою T, A або S; собою L або I; (w) в положенні 35 амінокислотний залишок являє (bd) в положенні 91 амінокислотний залишок являє собою L, S або M; собою I або V; (x) в положенні 37 амінокислотний залишок являє (be) в положенні 92 амінокислотний залишок являє собою R, G, E або Q; собою R або K; (y) в положенні 38 амінокислотний залишок являє (bf) в положенні 93 амінокислотний залишок являє собою G або S; собою H, Y або Q; (z) в положенні 39 амінокислотний залишок являє (bg) в положенні 96 амінокислотний залишок являє собою T, A або S; собою E, A або Q; (aa) в положенні 40 амінокислотний залишок являє (bh) в положенні 97 амінокислотний залишок являє собою F, L або S; собою L або I; (ab) в положенні 45 амінокислотний залишок являє (bi) в положенні 100 амінокислотний залишок явсобою Y або F; ляє собою K, R, N або E; (ac) в положенні 47 амінокислотний залишок являє (bj) в положенні 101 амінокислотний залишок явсобою R, Q або G; ляє собою K або R; (ad) в положенні 48 амінокислотний залишок являє (bk) в положенні 103 амінокислотний залишок явсобою G або D; ляє собою A або V; (ae) в положенні 49 амінокислотний залишок являє (bl) в положенні 104 амінокислотний залишок явсобою K, R, E або Q; ляє собою D або N; (af) в положенні 51 амінокислотний залишок являє (bm) в положенні 105 амінокислотний залишок собою I або V; являє собою L або M; (ag) в положенні 52 амінокислотний залишок являє (bn) в положенні 106 амінокислотний залишок явсобою S, C або G; ляє собою L або I; (ah) в положенні 53 амінокислотний залишок являє (bo) в положенні 112 амінокислотний залишок явсобою I або T; ляє собою T або I; (ai) в положенні 54 амінокислотний залишок являє (bp) в положенні 113 амінокислотний залишок явсобою A або V; ляє собою S, T або F; (aj) в положенні 57 амінокислотний залишок являє (bq) в положенні 114 амінокислотний залишок явсобою H або N; ляє собою A або V; (ak) в положенні 58 амінокислотний залишок являє (br) в положенні 115 амінокислотний залишок явсобою Q, K, N або P; ляє собою S, R або A; (al) в положенні 59 амінокислотний залишок являє (bs) в положенні 119 амінокислотний залишок явсобою A або S; ляє собою K, E або R; (am) в положенні 60 амінокислотний залишок яв(bt) в положенні 120 амінокислотний залишок являє собою E, K, G, V або D; ляє собою K або R; (an) в положенні 61 амінокислотний залишок являє (bu) в положенні 123 амінокислотний залишок явсобою H або Q; ляє собою F або L; 5 86918 6 (bv) в положенні 124 амінокислотний залишок яв(dc) в положенні 77 амінокислотний залишок являє ляє собою S або R; собою T; (bw) в положенні 125 амінокислотний залишок яв(dd) в положенні 107 амінокислотний залишок являє собою E, K, G або D; ляє собою W; i (bx) в положенні 126 амінокислотний залишок яв(de) в положеннях 13, 46, 70, 117 i 118 амінокислоляє собою Q або H; тний залишок являє собою Y. (by) в положенні 128 амінокислотний залишок яв8. Ізольований або рекомбінантний полінуклеотид ляє собою E, G або K; за п. 1, де згаданий полінуклеотид включає нукле(bz) в положенні 129 амінокислотний залишок явотидну послідовність, що кодує послідовність аміляє собою V, I або A; нокислот, яка має щонайменше 70 % iдентичностi (ca) в положенні 130 амінокислотний залишок явпослiдовностi по всій довжині послідовності, вибляє собою Y, H, F або C; раної з групи, що включає SEQ. ID. Nо.: 300, SEQ. (cb) в положенні 131 амінокислотний залишок явID. Nо.: 445 i SEQ. ID. Nо.: 457. ляє собою D, G, N або E; 9. Ізольований або рекомбінантний полінуклеотид (cc) в положенні 132 амінокислотний залишок явза п. 1, де згаданий полінуклеотид включає нуклеляє собою I, T, A, M, V або L; отидну послідовність, що кодує послідовність амі(cd) в положенні 135 амінокислотний залишок явнокислот, яка має щонайменше 80 % iдентичностi ляє собою V, T, A або I; послiдовностi по всій довжині послідовності, виб(ce) в положенні 138 амінокислотний залишок явраної з групи, що включає SEQ. ID. Nо.: 300, SEQ. ляє собою H або Y; ID. Nо.: 445 i SEQ. ID. Nо.: 457. (cf) в положенні 139 амінокислотний залишок яв10. Ізольований або рекомбінантний полінуклеоляє собою I або V; тид за п. 1, (cg) в положенні 140 амінокислотний залишок яв(i) в якому поліпептид каталiзує ацетилювання ляє собою L або S; глiфосату з kкат/Km щонайменше 10 мМ-1хв.-1 до (ch) в положенні 142 амінокислотний залишок явглiфосату; i/або ляє собою Y або H; (ii) поліпептид каталiзує ацетилювання (ci) в положенні 143 амінокислотний залишок явамiнометилфосфонової кислоти; i/або ляє собою K, T або E; (iii) щонайменше 80 % положень поліпептиду узго(cj) в положенні 144 амінокислотний залишок явджуються з такими обмеженнями: ляє собою K, E або R; (a) в положенні 9, 76, 94 i 110 амінокислотний за(ck) в положенні 145 амінокислотний залишок явлишок являє собою А; ляє собою L або I; i (b) в положеннях 29 i 108 амінокислотний залишок (cl) в положенні 146 амінокислотний залишок явявляє собою С; ляє собою T або A; (с) в положенні 34 амінокислотний залишок являє (cm) в положенні 9, 76, 94 i 110 амінокислотний собою D; залишок являє собою А; (d) в положенні 95 амінокислотний залишок являє (cn) в положеннях 29 i 108 амінокислотний залисобою Е; шок являє собою С; (е) в положенні 56 амінокислотний залишок являє (сo) в положенні 34 амінокислотний залишок являє собою F; собою D; (f) в положеннях 43, 44, 66, 74, 87, 102, 116, 122, (cp) в положенні 95 амінокислотний залишок являє 127 i 136 амінокислотний залишок являє собою G; собою Е; (g) в положенні 41 амінокислотний залишок являє (cq) в положенні 56 амінокислотний залишок являє собою H; собою F; (h) в положенні 7 амінокислотний залишок являє (cr) в положеннях 43, 44, 66, 74, 87, 102, 116, 122, собою I; 127 i 136 амінокислотний залишок являє собою G; (i) в положенні 85 амінокислотний залишок являє (cs) в положенні 41 амінокислотний залишок являє собою K; собою H; (j) в положеннях 20, 36, 42, 50, 72, 78, 98 i 121 амі(ct) в положенні 7 амінокислотний залишок являє нокислотний залишок являє собою L; собою I; (k) в положеннях 1, 75 i 141 амінокислотний зали(cu) в положенні 85 амінокислотний залишок являє шок являє собою M; собою K; (l) в положеннях 23, 64 i 109 амінокислотний за(cv) в положеннях 20, 36, 42, 50, 72, 78, 98 i 121 лишок являє собою N; амінокислотний залишок являє собою L; (m) в положеннях 22, 25, 133, 134 i 137 амінокис(cw) в положеннях 1, 75 i 141 амінокислотний залотний залишок являє собою P; лишок являє собою M; (n) в положенні 71 амінокислотний залишок являє (cx) в положеннях 23, 64 i 109 амінокислотний засобою Q; лишок являє собою N; (o) в положеннях 16, 21, 73, 99 i 111 амінокислот(cy) в положеннях 22, 25, 133, 134 i 137 амінокисний залишок являє собою R; лотний залишок являє собою P; (p) в положеннях 55 i 88 амінокислотний залишок (cz) в положенні 71 амінокислотний залишок являє являє собою S; собою Q; (q) в положенні 77 амінокислотний залишок являє (da) в положеннях 16, 21, 73, 99 i 111 амінокислотсобою T; ний залишок являє собою R; (r) в положенні 107 амінокислотний залишок являє (db) в положеннях 55 i 88 амінокислотний залишок собою W; i являє собою S; 7 86918 8 (s) в положеннях 13, 46, 70, 117 i 118 амінокислотAvena, Hordeum, Saccharum, Coix, Glycine i ний залишок являє собою Y. Gossypium. 11. Ізольований або рекомбінантний полінуклео21. Трансгенна рослина, насіння або культура ткатид за п. 1, в якому поліпептид включає нини трансгенної рослини за п. 19 або 20, де росамiнокислотну послiдовнiсть, вибрану з SEQ. ID. лина або культура тканини рослини виявляє підNo.: 300, SEQ. ID. No.:445 i SEQ. ID. No.:457. вищену стійкість до глiфосату порівняно з дикою 12. Ізольований або рекомбінантний полінуклеорослиною того ж виду, лінією або культурним сортид за п. 11, що включає нуклеотидну потом. слiдовнiсть, вибрану з SEQ. ID. No.: 48, SEQ. ID. 22. Ізольований або рекомбінантний поліпептид, No.: 193 або SEQ. ID. No.: 205. що має активність глiфосат-N-ацетилтрансферази, 13. Ізольований або рекомбінантний полінуклеоде згаданий поліпептид включає амінокислотну тид за будь-яким з пп. 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12, послідовність, яка має щонайменше 60 % де iдентичностi послiдовностi по всій довжині послі(а) батьківський кодон був замінений синонімічним довності, вибраної з групи, що включає SEQ. ID. кодоном, що переважно застосовується в рослиNо.: 300, SEQ. ID. Nо.: 445 i SEQ. ID. Nо.: 457. нах порівняно з батьківським кодоном; i/або 23. Ізольований або рекомбінантний поліпептид за (b) згаданий полінуклеотид додатково включає п. 22, де згаданий поліпептид включає амінокислонуклеотидну послідовність, що кодує N-кiнцевий тну послідовність, яка має щонайменше 70 % хлоропласт-транзитний пептид. iдентичностi послiдовностi по всій довжині послі14. Нуклеїновокислотна конструкція, що включає довності, вибраної з групи, що включає SEQ. ID. полінуклеотид за будь-яким з пп. 1-13, де згадана Nо.: 300, SEQ. ID. Nо.: 445 i SEQ. ID. Nо.: 457. конструкція включає промотор, оперативно зв'яза24. Ізольований або рекомбінантний поліпептид за ний зі згаданим полінуклеотидом, при цьому проп. 22, де згаданий поліпептид включає амінокисломотор є гетерологiчним відносно полінуклеотиду i тну послідовність, яка має щонайменше 80 % здатен ефективно викликати достатню експресію iдентичностi послiдовностi по всій довжині послізакодованого поліпептиду для посилення толерадовності, вибраної з групи, що включає SEQ. ID. нтності до глiфосату рослинної клiтини, трансфоNо.: 300, SEQ. ID. Nо.: 445 i SEQ. ID. Nо.: 457. рмованої нуклеїновокислотною конструкцією. 25. Ізольований або рекомбінантний поліпептид за 15. Нуклеїновокислотна конструкція за п. 14, яка п. 22, де поліпептид каталізує ацетилювання додатково включає другу полінуклеотидну посліглiфосату з kкат/Km щонайменше 10мМ-1хв.-1 до довність, що кодує другий поліпептид, який надає глiфосату; i/або клітині або організму, що експресує другий поліпе(i) де поліпептид каталізує ацетилювання птид на ефективному рівні, фенотипову ознаку, амiнометилфосфонової кислоти; i/або яка може бути виявлена; i/або (ii) де щонайменше 80 % положень поліпептиду не де конструкція включає Т-ДНК-послiдовнiсть; i/або порушують наступні рестрикції: де полінуклеотид є оперативно зв'язаним з регу(a) в положенні 9, 76, 94 i 110 амінокислотний заляторною послідовністю; i/або лишок являє собою А; де конструкція являє собою вектор трансформації (b) в положеннях 29 i 108 амінокислотний залишок рослин. являє собою С; 16. Клітина-хозяїн, що включає щонайменше один (с) в положенні 34 амінокислотний залишок являє полінуклеотид за будь-яким з пп. 1-13 або щонайсобою D; менше одну конструкцію за п. 14 або 15, де полі(d) в положенні 95 амінокислотний залишок являє нуклеотид, що кодує активність глiфосат-Nсобою Е; ацетилтрансферази, є гетерологiчним до клітини. (е) в положенні 56 амінокислотний залишок являє 17. Клітина-хозяїн за п. 16, де клітина є рослинною собою F; клітиною. (f) в положеннях 43, 44, 66, 74, 87, 102, 116, 122, 18. Клітина-хозяїн за п. 17, що додатково містить 127 i 136 амінокислотний залишок являє собою G; метаболічний продукт гліфосату, який є N(g) в положенні 41 амінокислотний залишок являє ацетилгліфосатом, де зазначений метаболічний собою H; продукт утворений поліпептидом, що містить амі(h) в положенні 7 амінокислотний залишок являє нокислотну послідовність, яка має щонайменше 80 собою I; % послідовностей, ідентичних до амінокислотної (i) в положенні 85 амінокислотний залишок являє послідовності, що знаходиться у SEQ. ID. No.: 300, собою K; 445 або 457. (j) в положеннях 20, 36, 42, 50, 72, 78, 98 i 121 амі19. Трансгенна рослина або насіння, вироблене нокислотний залишок являє собою L; нею, або культура тканини трансгенної рослини, (k) в положеннях 1, 75 i 141 амінокислотний залищо включає клітину за п. 17, де рослина або кульшок являє собою M; тура тканини рослини експресує поліпептид з ак(l) в положеннях 23, 64 i 109 амінокислотний зативністю глiфосат-N-ацетилтрансферази. лишок являє собою N; 20. Трансгенна рослина, насіння або культура тка(m) в положеннях 22, 25, 133, 134 i 137 амінокиснини трансгенної рослини за п. 19, при цьому лотний залишок являє собою P; трансгенна рослина або культура тканини рослини (n) в положенні 71 амінокислотний залишок являє являє собою культурну рослину, вибрану серед собою Q; родів Eleusine, Lollium, Bambusa, Brassica, Dactylis, (o) в положеннях 16, 21, 73, 99 i 111 амінокислотSorghum, Pennisetum, Zea, Oryza, Triticum, Secale, ний залишок являє собою R; 9 86918 10 (p) в положеннях 55 i 88 амінокислотний залишок (j) в положенні 14 амінокислотний залишок являє являє собою S; собою E або K; (q) в положенні 77 амінокислотний залишок являє (k) в положенні 15 амінокислотний залишок являє собою T; собою I або L; (r) в положенні 107 амінокислотний залишок являє (l) в положенні 17 амінокислотний залишок являє собою W; i собою H або Q; (s) в положеннях 13, 46, 70, 117 i 118 амінокислот(m) в положенні 18 амінокислотний залишок являє ний залишок являє собою Y. собою R, C або K; 26. Ізольований або рекомбінантний поліпептид за (n) в положенні 19 амінокислотний залишок являє п. 22, де поліпептид включає амiнонокислотну пособою I або V; слідовність, вибрану з групи, що включає SEQ. ID. (o) в положенні 24 амінокислотний залишок являє No.: 300, SEQ. ID. No.: 445 i SEQ. ID. No.: 457. собою Q або R; 27. Ізольований або рекомбінантний поліпептид, (p) в положенні 26 амінокислотний залишок являє що має активність глiфосат-N-ацетилтрансферази, собою L або I; де згаданий поліпептид включає щонайменше 140 (q) в положенні 27 амінокислотний залишок являє суміжних амінокислот амінокислотної послідовноссобою E або D; ті, вибраної з групи, що включає SEQ. ID. No.: 300, (r) в положенні 28 амінокислотний залишок являє SEQ. ID. No.: 445 i SEQ. ID. No.: 457. собою A або V; 28. Ізольований або рекомбінантний поліпептид за (s) в положенні 30 амінокислотний залишок являє п. 27, який додатково містить N-кiнцевий хлорособою K, M або R; пласт-транзитний пептид; та/або додатково міс(t) в положенні 31 амінокислотний залишок являє тить послідовність секреції або послідовність лособою Y або F; калізації. (u) в положенні 32 амінокислотний залишок являє 29. Ізольований або рекомбінантний поліпептид, собою E або G; що має активність глiфосат-N-ацетилтрансферази, (v) в положенні 33 амінокислотний залишок являє який кодується нуклеотидною послідовністю, яка собою T, A або S; гібридизується в жорстких умовах по суті по всій (w) в положенні 35 амінокислотний залишок являє довжині з комплементом нуклеотидної послідовсобою L, S або M; ності, що кодує амінокислотну послідовність, виб(x) в положенні 37 амінокислотний залишок являє рану з групи, що включає SEQ. ID. No.: 300, SEQ. собою R, G, E або Q; ID. No.: 445 i SEQ. ID. No.: 457, де до жорстких (y) в положенні 38 амінокислотний залишок являє умов гібридизації належить 50%-й формамід з 1 мг собою G або S; гепарину при 42°С, при проведенні гібридизації (z) в положенні 39 амінокислотний залишок являє протягом ночі і промивка 0,2 х SSC при 65°С прособою T, A або S; тягом 15 хвилин. (aa) в положенні 40 амінокислотний залишок являє 30. Ізольований або рекомбінантний поліпептид за собою F, L або S; п. 29, який додатково містить N-кiнцевий хлоро(ab) в положенні 45 амінокислотний залишок являє пласт-транзитний пептид; та/або додатково міссобою Y або F; тить послідовність секреції або послідовність ло(ac) в положенні 47 амінокислотний залишок являє калізації. собою R, Q або G; 31. Ізольований або рекомбінантний поліпептид за (ad) в положенні 48 амінокислотний залишок являє п. 22, де згаданий поліпептид має: собою G або D; (а) Km до глiфосату щонайменше близько 2 мМ або (ae) в положенні 49 амінокислотний залишок являє менше; Km до ацетил-СоА щонайменше близько собою K, R, E або Q; 200 мкМ або менше; i kкат дорівнює щонайменше (af) в положенні 51 амінокислотний залишок являє близько 6/хвилину; або собою I або V; (b) щонайменше 80 % положень поліпептиду узго(ag) в положенні 52 амінокислотний залишок являє джуються з такими обмеженнями: собою S, C або G; (а) в положенні 2 амінокислотний залишок являє (ah) в положенні 53 амінокислотний залишок являє собою I або L; собою I або T; (b) в положенні 3 амінокислотний залишок являє (ai) в положенні 54 амінокислотний залишок являє собою Е або D; собою A або V; (c) в положенні 4 амінокислотний залишок являє (aj) в положенні 57 амінокислотний залишок являє собою V, A або I; собою H або N; (d) в положенні 5 амінокислотний залишок являє (ak) в положенні 58 амінокислотний залишок являє собою K, R або N; собою Q, K, N або P; (e) в положенні 6 амінокислотний залишок являє (al) в положенні 59 амінокислотний залишок являє собою P або L; собою A або S; (f) в положенні 8 амінокислотний залишок являє (am) в положенні 60 амінокислотний залишок явсобою N, S або T; ляє собою E, K, G, V або D; (g) в положенні 10 амінокислотний залишок являє (an) в положенні 61 амінокислотний залишок являє собою E або G; собою H або Q; (h) в положенні 11 амінокислотний залишок являє (ao) в положенні 62 амінокислотний залишок являє собою D або E; собою P, S або T; (i) в положенні 12 амінокислотний залишок являє (ap) в положенні 63 амінокислотний залишок являє собою T або A; собою E, G або D; 11 86918 12 (aq) в положенні 65 амінокислотний залишок являє (bx) в положенні 126 амінокислотний залишок явсобою E, D, V або Q; ляє собою Q або H; (ar) в положенні 67 амінокислотний залишок являє (by) в положенні 128 амінокислотний залишок явсобою Q, E, R, L, H або K; ляє собою E, G або K; (as) в положенні 68 амінокислотний залишок являє (bz) в положенні 129 амінокислотний залишок явсобою K, R, E або N; ляє собою V, I або A; (at) в положенні 69 амінокислотний залишок являє (ca) в положенні 130 амінокислотний залишок явсобою Q або P; ляє собою Y, H, F або C; (au) в положенні 79 амінокислотний залишок являє (cb) в положенні 131 амінокислотний залишок явсобою E або D; ляє собою D, G, N або E; (av) в положенні 80 амінокислотний залишок являє (cc) в положенні 132 амінокислотний залишок явсобою G або E; ляє собою I, T, A, M, V або L; (aw) в положенні 81 амінокислотний залишок яв(cd) в положенні 135 амінокислотний залишок являє собою Y, N або F; ляє собою V, T, A або I; (ax) в положенні 82 амінокислотний залишок являє (ce) в положенні 138 амінокислотний залишок явсобою R або H; ляє собою H або Y; (ay) в положенні 83 амінокислотний залишок являє (cf) в положенні 139 амінокислотний залишок явсобою E, G або D; ляє собою I або V; (az) в положенні 84 амінокислотний залишок являє (cg) в положенні 140 амінокислотний залишок явсобою Q, R або L; ляє собою L або S; (ba) в положенні 86 амінокислотний залишок являє (ch) в положенні 142 амінокислотний залишок явсобою A або V; ляє собою Y або H; (bb) в положенні 89 амінокислотний залишок являє (ci) в положенні 143 амінокислотний залишок явсобою T або S; ляє собою K, T або E; (bc) в положенні 90 амінокислотний залишок являє (cj) в положенні 144 амінокислотний залишок явсобою L або I; ляє собою K, E або R; (bd) в положенні 91 амінокислотний залишок являє (ck) в положенні 145 амінокислотний залишок явсобою I або V; ляє собою L або I; i (be) в положенні 92 амінокислотний залишок являє (cl) в положенні 146 амінокислотний залишок явсобою R або K; ляє собою T або A. (bf) в положенні 93 амінокислотний залишок являє 32. Ізольований або рекомбінантний поліпептид за собою H, Y або Q; будь-яким з пп. 22-28 або 31, що додатково вклю(bg) в положенні 96 амінокислотний залишок являє чає N-кінцевий хлоропласт-транзитний пептид; собою E, A або Q; i/або додатково включає послідовність, яка відпо(bh) в положенні 97 амінокислотний залишок являє відає за секрецію, або послідовність, яка відповісобою L або I; дає за локалізацію. (bi) в положенні 100 амінокислотний залишок яв33. Спосіб одержання поліпептиду, що має активляє собою K, R, N або E; ність глiфосат-N-ацетилтрансферази, при цьому (bj) в положенні 101 амінокислотний залишок явспосіб включає культивування клітини за п. 16 або ляє собою K або R; 17 або рослини, насіння або культури тканини ро(bk) в положенні 103 амінокислотний залишок явслини за пп. 19, 20 або 21. ляє собою A або V; 34. Спосіб одержання трансгенної рослини, стійкої (bl) в положенні 104 амінокислотний залишок явдо гліфосату, її насіння або рослинної клітини, ляє собою D або N; який включає: (bm) в положенні 105 амінокислотний залишок (а) трансформацію рослини або рослинної клітини являє собою L або M; полінуклеотидом за будь-яким з пп. 1-13 або тим, (bn) в положенні 106 амінокислотний залишок явщо включається у конструкцію за п. 14 або 15; i ляє собою L або I; (b) можливо, регенерацію трансгенної рослини з (bo) в положенні 112 амінокислотний залишок явтрансформованої рослинної клітини. ляє собою T або I; 35. Спосіб за п. 34, що додатково включає виро(bp) в положенні 113 амінокислотний залишок явщування трансформованої рослини або рослинної ляє собою S, T або F; клітини при такій концентрації глiфосату, яка (bq) в положенні 114 амінокислотний залишок явiнгiбує ріст дикої рослини того ж виду, причому ця ляє собою A або V; концентрація не iнгiбує ріст трансформованої рос(br) в положенні 115 амінокислотний залишок явлини, ляє собою S, R або A; де згадане вирощування відбувається при концен(bs) в положенні 119 амінокислотний залишок явтраціях глiфосату, що підвищуються, i/або ляє собою K, E або R; де згадане вирощування відбувається при концен(bt) в положенні 120 амінокислотний залишок явтрації глiфосату, що є летальною для дикої рослиляє собою K або R; ни або рослинної клітини того ж виду. (bu) в положенні 123 амінокислотний залишок яв36. Спосіб за будь-яким з пп. 34-35, який додатколяє собою F або L; во включає розмноження згаданої трансгенної (bv) в положенні 124 амінокислотний залишок яврослини шляхом схрещування згаданої трансгенляє собою S або R; ної рослини з другою рослиною, так, щоб щонай(bw) в положенні 125 амінокислотний залишок явменше частина потомства схрещування показуваляє собою E, K, G або D; ла толерантність до глiфосату. 13 86918 14 37. Спосіб селективної боротьби з бур'яном на 41. Спосіб за п. 40, де додатковий гербіцид, що полі з рослинною культурою, що включає: наносять, вибирають з групи, яка включає інгібітор (а) засів поля насінням або рослинами, які є толегiдроксифенiлпiруватдiоксигенази, сульфонамiд, рантними до гліфосату в результаті трансформації iмiдазолiнон, бiалафос, фосфiнотрицин, азаїх полінуклеотидом за будь-яким з пп. 1-13 чи фенiдин, бутафенацил, сульфосат, глуфосiнат та конструкції за пп. 14-15; i протокс-iнгiбiтор. (b) нанесення на культуру i бур'ян на полі достат42. Спосіб за п. 41, де згаданий додатковий гербіньої кількості глiфосату для боротьби з бур'яном цид наносять одночасно або по черзі. без суттєвого впливу на культуру. 43. Спосіб оцінювання активності GAT-поліпептида 38. Трансгенна рослина або культура тканини у рослинній тканині, що включає обробку рослини трансгенної рослини, що має підвищену толерантгліфосатом та аналізування рослинної тканини ність до глiфосату, де рослина або культура тказазначеної рослини на присутність Nнини рослини експресує поліпептид з активністю ацетилгліфосату, де зазначений GAT-поліпептид глiфосат-N-ацетилтрансферази, де поліпептид з містить амінокислотну послідовність, яка має щоактивністю глiфосат-N-ацетилтрансферази екснайменше 80 % послідовностей, ідентичних до пресується з полінуклеотиду за будь-яким з пп. 1амінокислотної послідовності, що знаходиться у 13 i SEQ. ID. No.: 300, 445 або 457. (а) щонайменше один поліпептид, який надає то44. Спосіб визначення присутності GATлерантність до глiфосату за допомогою додаткополіпептиду у рослинній тканині, що включає анавого механізму, i/або лізування рослинної тканини на присутність N(b) щонайменше один поліпептид, який надає тоацетилгліфосату, де зазначений GAT-поліпептид лерантність до додаткового гербіциду. містить амінокислотну послідовність, яка має що39. Трансгенна рослина або культура тканини найменше 80 % послідовностей, ідентичних до трансгенної рослини за п. 38, де амінокислотної послідовності, що знаходиться у (а) щонайменше один поліпептид, який надає тоSEQ. ID. No.: 300, 445 або 457. лерантність до глiфосату за допомогою додатко45. Спосіб за п. 44, де зазначений спосіб включає вого механізму, являє собою толерантну до гліфоаналізування рослинної тканини, що використовусату 5-енолпiрувiлшикiмат-3-фосфат-синтазу або ється в імуноаналізі. толерантну до гліфосату глiфосат46. Спосіб визначення присутності полінуклеотиду, оксидоредуктазу, i/або що кодує GAT-поліпептид, який включає аналізу(b) щонайменше один поліпептид, який надає товання рослинної тканини з використанням ПЦРлерантність до додаткового гербіциду, являє соампліфікації, де зазначений полінуклеотид, що бою мутовану гiдроксифенiлпiруватдiоксигеназу, кодує GAT-поліпептид, містить амінокислотну посульфонамiд-толерантну ацетолактатсинтазу, суслідовність, яка має щонайменше 80 % послідовльфонамiд-толерантну ацетогiдроксикислотну синостей, ідентичних до амінокислотної послідовнонтазу, iмiдазолiнон-толерантну ацетолактатсинтасті, що знаходиться у SEQ. ID. No.: 300, 445 або зу, iмiдазолiнон-толерантну ацетогiдроксикислотну 457. синтазу, фосфiнотрицин-ацетилтрансферазу або 47. Спосіб визначення, чи надає GAT-поліпептид мутовану протопорфiриноген-оксидазу. трансгенним рослинам стійкості до гліфосату, що 40. Спосіб боротьби з бур'яном на полі з рослинвключає етапи: трансформування рослини GATною культурою, який включає: полінуклеотидом, який кодує GAT-поліпептид, що (а) засів поля насінням або рослинами культури за містить амінокислотну послідовність, яка має щобудь-яким з пп. 38-39 i найменше 80% послідовностей, ідентичних до (b) нанесення на культуру i бур'ян на полі ефектиамінокислотної послідовності, що знаходиться у вної кількості глiфосату, достатньої для SEQ. ID. No.: 300, 445 або 457; обробка трансфоiнгiбування росту бур'яну на полі без суттєвого рмованої рослини гліфосатом; та визначення, чи впливу на культуру, i рослина уражена або вбита обробкою гліфосатом. (с) можливо, нанесення на культуру i бур'ян на полі одночасно або почергово глiфосату i, можливо, додаткового гербіциду. Ця заявка підтверджує пріоритет і користь тимчасової патентної заявки США сер. №60/244,385, зареєстрованої 30 жовтня 2000p., опис якоївключений в цю заявку у вигляді посилання у всій його повноті для будь-якого призначення. Частина опису цього патентного документу містить матеріали, що підлягають захисту авторських прав. Власник авторських прав не має заперечень щодо копіювання будь-якого з патентних документів або опису патенту після його реєстрації в бюро патентів і торгових марок, але у протилежному випадку залишає за собою всі авторські права. Селективність-сільськогосподарських культур до специфічних гербіцидів може надаватися шляхом конструювання генів з отриманням культур, які кодують відповідні гербіцид-метаболізуючі ферменти. В деяких випадках ці ферменти і нуклеїнові кислоти, їх кодуючі, утворюються в рослині. В інших випадках вони походять з інших організмів, таких як мікроби. Див., наприклад, Padgette et al. (1996) New weed control opportunities: Development of soybeans with a Round UP Ready™ gene" in Herbicide-Resistant 15 86918 16 Crops (Duke, ed.), pp.54-84, CRC Press, Boca Стійкі рослини несуть ген bar з Streptomyces Raton; і Vasil (1996) "Phosphinothricin-resistant hygroscopicus і отримують стійкість завдяки Ncrops" in Herbicide-Resistant Crops (Duke, ed.), ацетилюючої активності bar, який модифікує і pp.85-91. Дійсно, були сконструйовані трансгенні детоксифікує глуфосинат. рослини, що експресують різноманітні гени толеФермент, здатний ацетилювати первинний рантності/метаболізації гербіцидів з різноманітамін АМРА, описаний в заявці РСТ них організмів. Наприклад, у велику кількість ро№WO00/29596. Цей фермент не описаний там як слин вводять синтазу ацетогідроксикислоти, що, здатний ацетилювати сполуку з вторинним аміяк з'ясувалося, надає рослинам, які експресують ном (наприклад, гліфосатом). цей фермент, стійкість до багатьох типів гербіциХоча існує безліч стратегій надання стійкості дів {див., наприклад, Hattori et al. (1995) Моl Gen до гербіцидів, як вказано вище, але додаткові Genet 246:419. Інші гени, що надають толерантпідходи могли б мати велику комерційну цінність. ність до гербіцидів, включають: ген, кодуючий Цей винахід стосується, наприклад, нових полінухимерний протеїн оксидоредуктази цитохрому клеотидів і поліпептидів для надання толерантщура Р4507А1 і NADPH-цитохрому дріжджів Р450 ності до гербіцидів, а також багатьох інших кори(Shiota et al. (1994) Plant PhysiolPlant Physiol сних особливостей, як буде зрозуміло з 106:17), гени глутатіон-редуктази і супероксидподальшого опису. дисмутази (Aono et al. (1995) Plant Cell Physiol Задача цього винаходу складається в ство36:1687 і гени різних фосфотрансфераз (Datta et ренні способів і реагентів для надання організму, al. (1992) Plant Моl Biol 20:619. такому як рослина, стійкості до гліфосату. Ця та Одним з гербіцидів, який є предметом широінші задачі винаходу вирішуються за допомогою кого дослідження в цьому напрямку, є Nодного або більше варіантів здійснення винаходу, фосфонометилгліцин, загальновідомий як гліфоописаних нижче. сат. Гліфосат являє собою гербіцид, який корисОдин з варіантів здійснення винаходу стосутується найвищим попитом у всьому світі, і, за ється нових поліпептидів, що називаються тут прогнозами, об'єм його продажу у 2003 році досяGAT-поліпептидами. GAT-поліпептиди відрізнягне 5 млрд. доларів. Це гербіцид широкого спектються їх структурною подібністю один до одного, ру дії, який знищує як листяні, так і трав'яні роснаприклад, подібністю послідовностей GATлини. Вдалий шлях надання трансгенним поліпептидів, коли вони вирівняні один з одним. рослинам стійкості до гліфосату на комерційному Деякі GAT-поліпептиди мають активність гліфорівні складається у введенні модифікованого гена сат-N-ацетил-трансферази, тобто, здатність ка5-енолпірувілшикімат-3-фосфат-синтази талізувати ацетилювання гліфосату. Деякі GATAgrobacterium CP4 (званої тут EPSP-синтазою поліпептиди також здатні каталізувати ацетилабо EPSPS). Трансген таргетований на хлороювання аналогів гліфосату і/або метаболітів гліпласт, де він зберігає здатність синтезувати фосату, наприклад, амінометилфосфонової кисEPSP з фосфоенолпірувінової кислоти (PEP) і лоти. шикімат-3-фосфату в присутності гліфосату. У Також пропонуються нові полінуклеотиди, що протилежність цьому, нативна EPSP-синтаза інгіназиваються тут GAT-полінуклеотидами. GATбується гліфосатом. Без цього трансгена рослиполінуклеотиди відрізняються їх здатністю кодуни, обприскані гліфосатом, швидко гинуть внаслівати GAT-поліпептиди. В деяких варіантах здійсдок інгібування EPSP-синтази, яка зупиняє нення винаходу GAT-полінуклеотид конструюють низхідний путь, необхідний для біосинтезу ародля кращої експресії рослиною шляхом заміни матичних амінокислот, гормонів і вітамінів, гліфоодного або більше батьківських кодонів на синосат-стійкі СР4-трансгенні соєві рослини випускає, німічний кодон, який переважно застосовується в наприклад, компанія Monsanto під торговою маррослинах порівняно з батьківським кодоном. В кою "Round UP Ready™". інших варіантах здійснення GAT-полінуклеотид В навколишньому середовищі розкладення модифікують шляхом введення нуклеотидної гліфосату здійснюється головним чином через послідовності, що кодує N-кінцевий хлоропластметаболізм грунтової мікрофлори. Первинний транзитний пептид. метаболіт гліфосату в грунті був ідентифікований GAT-поліпептиди, GAT-полінуклеотиди і акяк амінометилфосфонова кислота (АМРА), яка тивність гліфосат-N-ацетил-трансферази детальзрештою перетворюється на амоній, фосфат і ніше описані нижче. Винахід також включає певні двооксид вуглецю. Запропонована схема метафрагменти GAT-поліпептидів і GATболізму, яка описує розкладення гліфосату в груполінуклеотидів, описані нижче. нті через АМРА, показана на Фіг.8. АльтернативВинахід включає ненативні варіанти поліпепний путь метаболізму для розщеплення тидів і полінуклеотидів, описаних тут, в яких одна гліфосату певними грунтовими бактеріями, тобто, або більше амінокислот закодованого поліпептисаркозиновий путь, відбувається через початкове ду були мутовані. розщеплення зв'язку С-Р з утворенням неорганіВинахід також стосується нуклеїновокислотчного фосфату і саркозину, як показано на Фіг.9. ної конструкції, що включає полінуклеотид за виІншу вдалу комбінацію гербіциду і трансгеннаходом. Ця конструкція може являти собою векної рослини являє собою глуфосінат (фосфіноттор, такий як рослинний вектор трансформації. В рицин) і LibertyLinkTM, що випускається, напридеяких аспектах вектор за винаходом буде вклюклад, компанією Aventis. Глуфосінат також є чати Т-ДНК послідовність. Конструкція може гербіцидом широкого спектра дії. Він таргетовавключати (необов'язково) регуляторну послідовний на фермент глутамат-синтазу хлоропласта. ність (наприклад, промотор), оперативно зв'язану 17 86918 18 з GAT-полінуклеотидом, де промотор є гетеролоацетилтрансферази, закодований нуклеїновою гічним до полінуклеотиду і здатен ефективно викислотою за винаходом. Винахід також стосуєтькликати достатню експресію закодованого поліся трансгенного насіння, що виробляється транспептиду для посилення толерантності до генними рослинами за винаходом. гліфосату рослинних клітин, трансформованих Винахід також стосується трансгенних рослин нуклеїновокислотною конструкцією. або трансгенних рослинних експлантатів, що маВ деяких аспектах винаходу GATють підвищену толерантність до гліфосату завдяполінуклеотид функціонує як маркер, що селекки експресії поліпептиду з активністю гліфосат-Nтується, наприклад, у рослинах, бактеріях, актиацетилтрансферази і поліпептиду, який надає номіцетах, водоростях, дріжджах чи інших грибтолерантність до гліфосату за допомогою іншого ках. Наприклад, організм, що був механізму, такого як гліфосат-толерантна 5трансформований вектором, включаючим GATенолпірувілшикімат-3-фосфат-синтаза і/або гліполінуклеотидний маркер, що селектується, може фосат-толерантна гліфосат-оксидо-редуктаза. В бути селектований на основі його здатності рости іншому варіанті здійснення винахід стосується в присутності гліфосату. GAT-маркерний ген мотрансгенних рослин або трансгенних рослинних же бути застосований для селекції або скринінгу експлантатів, що мають підвищену толерантність на трансформовані клітини, що екпресують цей до гліфосату, а також толерантність до додаткоген. вого гербіциду завдяки експресії поліпептиду з Винахід також стосується векторів з комбіноактивністю гліфосат-ІМ-ацетилтрансферази, пованими ознаками, тобто, векторів, які кодують ліпептиду, який надає толерантність до гліфосату GAT і які також включають другу полінуклеотидну за допомогою іншого механізму, такого як гліфопослідовність, що кодує другий поліпептид, який сат-толерантна 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатнадає клітині або організму, експресуючому друсинтаза і/або гліфосат-толерантна гліфосатгий поліпептид на ефективному рівні, фенотипову оксидо-редуктаза, і поліпептиду, який надає тоознаку, що може бути виявлена. Фенотипова лерантність до додаткового гербіциду, такого як ознака, що може бути виявлена, може функціомутована гідроксифенілпіруватдіоксигеназа, сунувати як маркер, що селектується, наприклад, льфонамід-толерантна ацетолактатсинтаза, сушляхом надання стійкості до гербіцидів, стійкості льфонамід-толерантна синтаза ацетогідроксикидо шкідників або утворення деякого різновиду слоти, імідазолінон-толерантна видимого маркера. ацетолактатсинтаза, імідазолінон-толерантна В одному з варіантів здійснення винахід стосинтаза ацетогідроксикислоти, фосфінотрицинсується композиції, що включає один або більше ацетилтрансфераза і мутована протопорфіринополінуклеотидів за винаходом. ген-оксидаза. Композиції, що містять один або більше GATВинахід також стосується трансгенних рослин полінуклеотидів або закодованих поліпептидів, є або трансгенних рослинних експлантатів, що марисою цього винаходу. В деяких випадках ці комють підвищену толерантність до гліфосату, а тапозиції являють собою бібліотеки нуклеїнових кож толерантність до додаткового гербіциду закислот, які містять, наприклад, щонайменше три вдяки експресії поліпептиду з активністю або більше нуклеїнових кислот. Композиції, вирогліфосат-N-ацетилтрансферази і поліпептиду, блені шляхом ферментативного розщеплення який надає толерантність до додаткового гербінуклеїнових кислот за винаходом рестрикційною циду, такого як мутована гідроксифенілпіруватдіендонуклеазою, ДНК-азою або РНК-азою, або оксигеназа, сульфонамід-толерантна ацетолакіншим способом фрагментування нуклеїнових татсинтаза, сульфонамід-толерантна синтаза кислот, наприклад, механічним розрізанням, хіміацетогідроксикислоти, імідазолінон-толерантна чним розщепленням і т.д., також є рисою цього ацетолактатсинтаза, імідазолінон-толерантна винаходу, як і композиції, утворені шляхом інкусинтаза ацетогідроксикислоти, фосфінотрицинбації нуклеїнової кислоти за винаходом з дезоацетилтрансфераза і мутована протопорфіриноксирибонуклеотидтрифосфатами і полімеразою ген-оксидаза. нуклеїнових кислот, такою як термостабільна Способи отримання поліпептидів за винахополімераза нуклеїнових кислот. дом шляхом введення нуклеїнових кислот, що їх Клітини, трансдуковані вектором за винахокодують, в клітини, а потім експресії і виділення їх дом або такі, що включають нуклеїнову кислоту з клітин або з середовища культури, є рисою цьоза винаходом іншим способом, є аспектом винаго винаходу. У переважних варіантах здійснення ходу. У переважному варіанті здійснення винахоклітини, що експресують поліпептиди за винаходу клітини експресують поліпептид, закодований дом, є трансгенними рослинними клітинами. нуклеїновою кислотою. Поліпептиди, які специфічно зв'язуються з В деяких варіантах здійснення винаходу кліполіклональною антисироваткою, яка реагує на тини, що включають нуклеїнові кислоти за винаантиген, що походить з SEQ ID NOS: 6-10 і 263ходом, є рослинними клітинами. Трансгенні рос514, але не з спорідненою природною послідовнілини, трансгенні рослинні клітини і трансгенні стю, наприклад, пептидом, представленим послірослинні експлантати, що включають нуклеїнові довністю з GenBank під інвентарним номером кислоти за винаходом, також є рисою цього винаСАА70664, а також антитіла, які продукуються ходу. В деяких варіантах здійснення трансгенні шляхом введення антигена, що походить з SEQ рослини, трансгенні рослинні клітини і трансгенні ID NOs 6-10 і 263-514, і/або які специфічно зв'ярослинні експлантати експресують екзогенний зуються з такими антигенами і які специфічно не поліпептид з активністю гліфосат-Nзв'язуються з природним поліпептидом, що від 19 86918 20 повідає інвентарному номеру GenBank турою, які включають засадження поля насінням CAA70664, усі є рисами цього винаходу. або рослинами культури, які є гліфосатІнший аспект винаходу стосується способів толерантними внаслідок трансформації їх геном, диверсифікації полінуклеотидів для отримання кодуючим гліфосат-N-ацетилтрансферазу, і генових GAT-полінуклеотидів і полі пептидів шляном, кодуючим поліпептид, який надає толерантхом рекомбінації або мутації нуклеїнових кислот ність до гліфосату за допомогою іншого механізза винаходом in vitro або in vivo. В одному з варіму, такий як гліфосат-толерантна 5антів здійснення винаходу рекомбінація забезпеенолпірувілшикімат-3-фосфат-синтаза і/або глічує щонайменше одну бібліотеку рекомбінантних фосат-толерантна гліфосат-оксидо-редуктаза, і GAT-полінуклеотидів. Бібліотеки, вироблені тананесення на культуру і бур'ян на цьому полі доким чином, є варіантами здійснення цього винастатньої кількості гліфосату для боротьби з буходу, як і клітини, що складають бібліотеки. Крім р'яном без суттєвого впливу на культуру. того, способи вироблення модифікованого GATВ наступному варіанті здійснення винахід полінуклеотиду шляхом мутації нуклеїнової кисстосується способів боротьби з бур'яном на полі і лоти за винаходом є варіантами здійснення визапобігання виникненню гербіцид-стійкого бур'яну находу. Рекомбінантні і мутантні GATна полі з рослинною культурою, які включають полінуклеотиди і поліпептиди, вироблені спосозасадження поля насінням або рослинами кульбами за винаходом, також є варіантами здійснентури, які є гліфосат-толерантними внаслідок ня винаходу. трансформації їх геном, кодуючим гліфосат-NВ деяких аспектах цього винаходу диверсиацетилтрансферазу, геном, кодуючим поліпепфікація здійснюється шляхом застосування рекутид, який надає толерантність до гліфосату за рсивної рекомбінації, яка може бути проведена in допомогою іншого механізму, такий як гліфосатvitro, in vivo, in silico або шляхом комбінації цих толерантна 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатспособів. Деякі приклади способів диверсифікасинтаза і/або гліфосат-толерантна гліфосатції, описані нижче більш детально, являють сооксидо-редуктаза, і геном, кодуючим поліпептид, бою способи родового шафлінгу та синтетичні який надає толерантність до додаткового гербіспособи шафлінгу. циду, такий як мутована гідроксифенілпіруватдіоВинахід стосується способів вироблення гліксигеназа, сульфонамід-толерантна ацетолактафосат-стійкої трансгенної рослини або рослинної тсинтаза, сульфонамід-толерантна синтаза клітини, який включає трансформацію рослини ацетогідроксикислоти, імідазолінон-толерантна або рослинної клітини полінуклеотидом, що кодує ацетолактатсинтаза, імідазолінон-толерантна гліфосат-N-ацетилтрансферазу і, можливо, регесинтаза ацетогідроксикислоти, фосфінотрициннерацію трансгенної рослини з трансформованої ацетилтрансфераза і мутована протопорфіринорослинної клітини. В деяких аспектах полінуклеоген-оксидаза, і нанесення на культуру і бур'ян на тид являє собою GAT-полінуклеотид, можливо, цьому полі достатньої кількості гліфосату і додатGAT-полінуклеотид, що походить з бактеріальнокового гербіциду, такого як інгібітор гідроксифеніго джерела. В деяких аспектах винаходу спосіб лпіруватдіоксигенази, сульфонамід, імідазолінон, може включати вирощування трансформованої біалафос, фосфінотрицин, азафенідин, бутаферослини або рослинної клітини при такій конценнацил, сульфосат, глуфосінат та Protox-інгібітор трації гліфосату, яка інгібує ріст дикої рослини для боротьби з бур'яном без суттєвого впливу на того ж виду, але не інгібує росту трансформовакультуру. ної рослини. Спосіб може включати вирощування Винахід також стосується способів боротьби трансформованої рослини або рослинної клітини, з бур'яном на полі і запобігання виникненню герабо потомства цієї рослини або рослинної клітибіцид-стійкого бур'яну на полі з рослинною кульни при концентраціях гліфосату, що підвищуютьтурою, які включають засадження поля насінням ся і/або при такій концентрації гліфосату, яка є або рослинами культури, які є гліфосатлетальною для дикої рослини або рослинної клітолерантними внаслідок трансформації їх геном, тини того ж виду. кодуючим гліфосат-N-ацетилтрансферазу, і геГліфосат-стійка трансгенна рослина, виробном, кодуючим поліпептид, який надає толерантлена способом за винаходом, може бути розмноність до додаткового гербіциду, такий як мутоважена, наприклад, шляхом схрещування її з друна гідроксифенілпіруватдіоксигеназа, гою рослиною, так щоб щонайменше частина сульфонамід-толерантна ацетолактатсинтаза, потомства після схрещування показувала толесульфонамід-толерантна синтаза ацетогідроксирантність до гліфосату. кислоти, імідазолінон-толерантна ацетолактатсиВинахід також стосується способів селективнтаза, імідазолінон-толерантна синтаза ацетогідної боротьби з бур'яном на полі з рослинною роксикислоти, фосфінотрицинкультурою, які включають засадження поля наацетилтрансфераза і мутована протопорфіриносінням або рослинами культури, які є гліфосатген-оксидаза, і нанесення на культуру і бур'ян на толерантними внаслідок трансформації їх геном, цьому полі достатньої кількості гліфосату і додаткодуючим гліфосат-N-ацетилтрансферазу, і накового гербіциду, такого як інгібітор гідроксифенінесення на культуру і бур'ян на цьому полі досталпіруватдіоксигенази, сульфонамід, імідазолінон, тньої кількості гліфосату для боротьби з бур'яном біалафос, фосфінотрицин, азафенідин, бутафебез суттєвого впливу на культуру. нацил, сульфосат, глуфосінат та протокс-інгібітор Винахід також стосується способів боротьби для боротьби з бур'яном без суттєвого впливу на з бур'яном на полі і запобігання виникненню глікультуру. фосат-стійкого бур'яну на полі з рослинною куль 21 86918 22 Винахід також стосується способів отримання Фіг.7 являє собою графік кінетичних даних, генетично трансформованої рослини, що є толеотриманих з даних Фіг.6, з яких було розраховано рантною до гліфосату, які включають інсертуванКм=2мкМ для ацетил-СоА. ня в геном рослинної клітини рекомбінантної двоФіг.8 являє собою схему, що описує розщепспіральної молекули ДНК, що містить: (і) лення гліфосату в грунті через АМРА-шлях. промотор, який функціонує в рослинних клітинах, Фіг.9 являє собою схему, що описує саркозивикликаючи вироблення РНК-послідовності; (іі) новий шлях розщеплення гліфосату. структурну ДНК-послідовність, яка викликає виФіг.10 показує матрицю BLOSUM62. роблення РНК-послідовності, що кодує GAT; і (ііі) Фіг.11 являє собою карту плазміди 3'-нетрансльовану область, яка функціонує в роpMAXY2190. слинних клітинах, викликаючи приєднання відрізФіг.12 показує конструкцію Т-ДНК з маркером ку з поліаденілових нуклеотидів до 3'-закінчення gat, що селектується. РНК-послідовності; при цьому промотор є гетеФіг.13 показує вектор експресії дріжджів з рологічним до структурної ДНК-послідовності і маркером gat, що селектується. адаптованим таким чином, щоб викликати достаЦей винахід стосується нового класу ферметню експресію закодованого поліпептиду для нтів, що проявляють активність Nпідвищення толерантності до гліфосату рослинацетилтрансферази. В одному з аспектів винахід ної клітини, трансформованої молекулою ДНК; стосується нового класу ферментів, що здатні отримання трансформованої рослинної клітини; і ацетилювати гліфосат і аналоги гліфосату, нарегенерацію з трансформованої рослинної клітиприклад, ферментів, що мають активність гліфони генетично трансформованої рослини, що має сат-N-ацетилтрансферази (GAT). Такі ферменти підвищену толерантність до гліфосату. відрізняються здатністю ацетилювати вторинний Винахід також стосується способів отримання амін сполуки. В деяких аспектах винаходу сполукультури, які включають вирощування рослини ка є гербіцидом, таким як гліфосат, схематично культури, яка є гліфосат-толерантною внаслідок показаний на Фіг.1. Сполука також може бути трансформації її геном, кодуючим гліфосат-Nаналогом гліфосату або метаболічним продуктом ацетилтрансферазу, в таких умовах, щоб рослирозщеплення гліфосату, як, наприклад, аміномена культури продукувала культуру; і збирання тилфосфонова кислота. Хоча ацетилювання гліврожаю культури, отриманої з рослини культури. фосату є головним каталітичним етапом в одноЦі способи часто включають нанесення гліфосату му з метаболічних шляхів катаболізму гліфосату, на рослину культури з концентрацією, ефективферментативне ацетилювання гліфосату прироною для боротьби з бур'яном. Приклади рослин дними, ізольованими або рекомбінантними феркультур включають бавовну, кукурудзу і сою. ментами раніш не було описано. Таким чином, Винахід також стосується комп'ютерів, носіїв, нуклеїнові кислоти і поліпептиди за винаходом що зчитуються комп'ютерами, і інтегрованих сисстворюють новий біохімічний шлях надання стійтем, включаючи бази даних, складені з записів кості до гербіцидів. послідовностей, що включають ланцюги симвоВ одному з аспектів винахід стосується нових лів, відповідні до SEQ ID NOs: 1-514. Такі інтегрогенів, що кодують GAT-поліпептиди. Ізольовані і вані системи можуть (необов'язково) включати рекомбінантні GAT-полінуклеотиди, які відповіодин або більше наборів команд щодо селекції, дають природним полінуклеотидам, а також ревирівнювання, трансляції, зворотної трансляції комбінантні і сконструйовані, наприклад, диверабо порівняння одного або більше ланцюгів симсифіковані, GAT-полінуклеотиди є рисою цього волів, відповідних до SEQ ID NOs: 1-514, один з винаходу. Прикладами GAT-полінуклеотидів є одним і/або з будь-якою додатковою нуклеїновопослідовності SEQ ID NOS: 1-5 і 11-262. Специкислотною або амінокислотною послідовністю. фічні послідовності GAT-полінуклеотидів і GATФіг.1 показує N-ацетилювання гліфосату, каполіпептидів наведені лише у якості прикладів талізоване гліфосат-N-ацетилтрансферазою для ілюстрації винаходу і не обмежують класу ("GAT"). GAT-полінуклеотидів і GAT-поліпептидів, описаФіг.2 ілюструє мас-спектроскопічне виявленного і/або заявленого тут. ня N-ацетилгліфосату, виробленого типовою Винахід також стосується способів виробленкультурою Bacillus, яка експресує нативну GATня і селекції диверсифікованих бібліотек для активність. отримання додаткових GAT-полінуклеотидів, Фіг.3 є таблицею, що ілюструє відносну іденвключаючи полінуклеотиди, що кодують GATтичність між GAT-послідовностями, ізольованими поліпептиди з покращеними і/або підвищеними з різних штамів бактерій, і yitl з Bacillus subtilis. характеристиками, наприклад, зміненою Км до Фіг.4 являє собою карту плазміди гліфосату, підвищеною швидкістю каталізу, підpMAXY2120 для експресії і очищення GATвищеною стабільністю і т.д., на основі селекції ферменту з культур Е.соlі. полінуклеотидного компонента бібліотеки на нові Фіг.5 являє собою результати масабо покращені активності, описані тут. Такі поліспектрометрії, що показують підвищення продунуклеотиди особливо корисні для застосування у кування N-ацетилгліфосату з часом в типовій виробленні гліфосат-стійких трансгенних рослин. реакційній суміші GAT-ферменту. GAT-поліпептиди за винаходом показують Фіг.6 являє собою графік кінетичних даних нову ферментативну активність. Зокрема, ферGAT-ферменту, з яких було розраховано ментативне ацетилювання синтетичного гербіциКм=2,9мМ для гліфосату. ду гліфосату до цього винаходу не було описано. Таким чином, описані тут поліпептиди, зокрема, 23 86918 24 приклади SEQ ID NOS: 6-10 і 263-514, визначаполімер з нуклеотидів (A, C, T, U, G і т.д. або приють новий біохімічний шлях детоксифікації гліфородні або штучні нуклеотидні аналоги), наприсату, що є функціональним in vivo, наприклад, в клад, ДНК або РНК, або їх представлення, таке як рослинах. ланцюг символів і т.п., у залежності від контексту. Таким чином, нуклеїнові кислоти і поліпептиДаний полінуклеотид або комплементарний поліди за винаходом мають значну корисність для нуклеотид може бути визначений з будь-якої вироблення гліфосат-стійких рослин шляхом встановленої нуклеотидної послідовності. утворення нових нуклеїнових кислот, поліпептиПодібним чином, "амінокислотна послідовдів і біохімічних шляхів для конструювання гербіність" являє собою полімер з амінокислот (протецидної селективності в трансгенних рослинах. їн, поліпептид і т.д.) або ланцюг символів, що Перед детальним описом цього винаходу відображає амінокислотний полімер, у залежності слід пояснити, що цей винахід не обмежений від контексту. Вирази "протеїн", "поліпептид" і окремими композиціями або біологічними систе"пептид" використовуються тут взаємозамінно. мами, які, звичайно, можуть варіюватися. Слід Полінуклеотид, поліпептид або інший компотакож зазначити, що використана тут термінолонент є "ізольованим", якщо він частково або погія призначена лише для опису окремих варіантів вністю відокремлений від компонентів, з якими здійснення і не є обмежуючою. Використані в він є звичайно асоційованим (інші протеїни, нукцьому описі і в формулі винаходу форми однини леїнові кислоти, клітини, синтетичні реагенти і включають множинні об'єкти, якщо в контексті не т.д.). Нуклеїнова кислота або поліпептид є "рековказано інше. Так, наприклад, посилання на мбінантним", якщо він є штучним або сконструйо"прилад" включає комбінацію двох або більше ваним, або похідним з штучного протеїну або таких приладів, посилання на "конструкцію злиття нуклеїнової кислоти. Наприклад, полінуклеотид, генів" включає суміші конструкцій і т.п. вставлений в вектор або будь-яку іншу гетеролоЯкщо не вказано інше, всі технічні і наукові гічну локацію, наприклад, в геном рекомбінантнотерміни, використані тут, мають загальноприйняго організму, так, що він не асоційований з нуклетні у відповідній області значення, знайомі фахівотидними послідовностями, які звичайно цю середньої кваліфікації. Хоча на практиці для фланкують полінуклеотид в його природному випробування цього винаходу можуть бути викостані, є рекомбінантним полінуклеотидом. Протеристані будь-які способи й матеріали, подібні або їн, що експресується in vivo або in vitro з рекомбіеквівалентні описаним тут, нижче описані деякі нантного полінуклеотиду, є прикладом рекомбіспецифічні приклади відповідних матеріалів і спонантного поліпептиду. Подібним чином, собів. полінуклеотидна послідовність, яка не зустрічаВ описі і формулі цього винаходу буде викоється в природі, наприклад, варіант природного ристана така термінологія відповідно до визнагена, є рекомбінантною. чень, наведених нижче. Вирази "поліпептид гліфосат-NВираз "гліфосат" в цьому винаході включає ацетилтрансферази" і "GAT-поліпептид" викорисбудь-яку гербіцидно ефективну форму Nтовуються тут взаємозамінно для будь-якого пофосфонометилгліцину (в тому числі будь-яку ліпептиду з сімейства нових поліпептидів, що його сіль) та інші форми, які утворюють аніон пропонуються тут. гліфосату в рослинах. Вираз "аналог гліфосату" Вирази "полінуклеотид гліфосат-Nстосується будь-якого структурного аналога гліацетилтрансферази" і "GAT-полінуклеотид" викофосату, який здатен інгібувати EPSPS у такій ристовуються тут взаємозамінно для полінуклеомірі, щоб аналог гліфосату був гербіцидно ефектиду, що кодує GAT-поліпептид. тивним. "Підпослідовність" або "фрагмент" являє соВираз "активність гліфосат-Nбою будь-яку частину цілої послідовності. ацетилтрансферази" або "GAT-активність" тут Нумерація амінокислотного або нуклеотидностосується здатності каталізувати ацетилювання го полімера відповідає нумерації вибраного амівторинної аміногрупи гліфосату, як показано, нокислотного полімера або нуклеїнової кислоти, наприклад, на Фіг.1. ''Гліфосат-Nколи положення даного мономерного компонента ацетилтрансфераза" або "GAT" означає фер(амінокислотного залишку, вбудованого нуклеомент, який каталізує ацетилювання аміногрупи тиду і т.д.) полімера відповідає такому самому гліфосату, аналога гліфосату і/або первинного положенню залишку у вибраному еталонному метаболіту гліфосату (тобто, АМРА або саркозиполіпептиді або полінуклеотиді. ну). В деяких переважних варіантах здійснення Вектор являє собою композицію для полегвинаходу GAT здатна переносити ацетильну грушення трансдукції клітини вибраною нуклеїновою пу з ацетил-СоА (ацетил-коферменту А) до втокислотою або експресії нуклеїнової кислоти в ринної аміногрупи гліфосату і первинного аміну клітині. Вектори включають, наприклад, плазміди, АМРА. Типові GAT, описані тут, є активними в косміди, віруси, YACs (дріжджові штучні хромодіапазоні рН 5-9, з оптимальною активністю в соми), бактерії, полілізин, вектори інтеграції хродіапазоні рН 6,5-8,0. Активність може бути оцінемосом, епісомні вектори і т.д. на з використанням різних кінетичних параметрів, "По суті повна довжина полінуклеотидної або добре відомих у відповідній області, наприклад, амінокислотної послідовності" означає щонаймеkкат, Км і kкат/Км. Ці кінетичні параметри можуть нше ~70%, звичайно щонайменше ~80%, або бути визначені, як описано нижче в Прикладі 7. типово ~90% послідовності або більше. Вирази "полінуклеотид", "нуклеотидна посліВираз "антитіло" тут означає протеїн, що місдовність" і "нуклеїнова кислота" тут означають тить один або більше поліпептидів, по суті або 25 86918 26 частково закодованих генами імуноглобулінів або во використаний вакуолярний таргетинг-сигнал фрагментами генів імуноглобулінів. Гени імуно(вище), або, якщо в ендоплазматичну сітку, - сигглобулінів, що впізнаються, включають гени конснал утримання в ендоплазматичній сітці (вище). тантних областей каппа, лямбда, альфа, гамма, Якщо протеїн повинен бути направлений в ядро, дельта, епсілон і мю, а також міріади генів варіабудь-який присутній сигнальний пептид повинен бельних областей імуноглобулінів. Легкі ланцюги бути видалений, а замість нього введений сигнал класифікуються як каппа або лямбда. Важкі ланядерної локалізації (Raikhel, N. (1992) Plant Phys. цюги класифікуються як гамма, мю, альфа, дель100: 1627-1632). та або епсілон, які, в свою чергу, визначають клаВирази "диверсифікація" і "різноманітність" си імуноглобулінів, IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, стосовно полінуклеотидів означають вироблення відповідно. Типовий структурний елемент імуномножини модифікованих форм батьківського поглобуліну (антитіла) включає тетрамер. Кожний лінуклеотиду, або множини батьківських полінуктетрамер складається з двох ідентичних пар полеотидів. У випадку, коли полінуклеотид кодує ліпептидних ланцюгів, де кожна пара має один поліпептид, різноманітність в нуклеотидній послі"легкий" (близько 25кДа) і один "важкий" ланцюг довності полінуклеотиду може привести до різ(близько 50-70кДа). N-закінчення кожного ланцюноманітності у відповідному закодованому поліга визначає варіабельну область розміром блипептиді, наприклад, до різноманітного пулу зько 100-110 або більше амінокислот, у першу полінуклеотидів, кодуючих множину поліпептидчергу відповідальних за впізнавання антигенів. них варіантів. У деяких варіантах здійснення виВирази "варіабельний легкий ланцюг" (VL) і "варінаходу ця різноманітність послідовностей викоабельний важкий ланцюг" (VH) стосуються цих ристовується для скринінгу/селекції бібліотек легких і важких ланцюгів, відповідно. Антитіла диверсифікованих полінуклеотидів на варіанти з існують як повні імуноглобуліни або як декілька бажаними функціональними атрибутами, напридобре визначених фрагментів, отриманих шляклад, полінуклеотид, що кодує GAT-поліпептид з хом ферментаційного розщеплення різними пеппокращеними функціональними характеристикатидазами. Так, наприклад, пепсин розщеплює ми. антитіло нижче дисульфідних зв'язків у шарнірній Вираз "кодуючий" означає здатність нуклеообласті, утворюючи фрагмент F(ab)'2, димер Fab, тидної послідовності кодувати одну або більше що сам є легким ланцюгом, приєднаним до VHамінокислот. Це поняття не потребує стартового CH1 дисульфідним зв'язком. F(ab)'2 може бути або стоп-кодона. Амінокислотна послідовність відновлений в м'яких умовах з розривом дисульможе бути закодована в одній з шести різних рафідного зв'язку в шарнірній області, що перетвомок зчитування, що утворюються полінуклеотидрює димер F(ab)'2 на мономер Fab'. Мономер ною послідовністю і її комплементом. Fab' по суті являє собою мономер Fab з частиною Вираз "штучний варіант" тут означає поліпепшарнірної області (більш детальний опис інших тид, що має GAT-активність, закодований модифрагментів антитіл див. у Fundamental фікованим GAT-полінуклеотидом, наприклад, Immunology, 4th Edition, W.E. Paul (ed.), Raven модифікованою формою будь-якої з SEQ ID NOS: Press, N.Y. (1998)). Хоча різні фрагменти антитіл 1-5 і 11-262, або природним GATвизначені на основі ферментаційного розщепполінуклеотидом, ізольованим з організму. Молення повного антитіла, фахівцю буде зрозуміло, дифікований полінуклеотид, з якого шляхом ексщо такі Fab'-фрагменти можуть бути синтезовані пресії в придатному хазяїні виробляють штучний de novo хімічним шляхом або з використанням варіант, отримують модифікацією GATтехнології рекомбінантних ДНК. Таким чином, полінуклеотиду через втручання людини. вираз "антитіло" тут також включає фрагменти Вираз "нуклеїновокислотна конструкція" або антитіл, отримані шляхом модифікації повних "полінуклеотидна конструкція" означає молекулу антитіл або синтезовані de novo з використанням нуклеїнової кислоти, одно- або двоспіральну, яка технології рекомбінантних ДНК. Антитіла вклює ізольованою з природного гена або була модичають одноланцюгові антитіла, в тому числі одфікована таким чином, що вона містить сегменти ноланцюгові Fv (sFv)-aнтитіла, в яких варіабельнуклеїнових кислот у порядку, який в природі не ний важкий і варіабельний легкий ланцюг з'єднані існує. Вираз "нуклеїновокислотна конструкція" є між собою (безпосередньо або пептидним лінкесинонімом до виразу "касета експресії", якщо ром) з утворенням суцільного поліпептиду. нуклеїновокислотна конструкція містить контро"Хлоропласт-транзитний пептид" являє сольні послідовності, потрібні для експресії кодуюбою амінокислотну послідовність, яка транслючої послідовності за цим винаходом. ється разом з протеїном і направляє протеїн у Вираз "контрольні послідовності" тут включає хлоропласт або інші типи пластид, присутні у всі компоненти, що є необхідними або переважклітині, в якій протеїн виробляється. Вираз "хлоними для експресії поліпептиду за цим винахоропласт-транзитна послідовність" стосується нудом. Кожна контрольна послідовність може бути клеотидної послідовності, яка кодує хлоропластнативною або чужорідною до нуклеотидної послітранзитний пептид. довності, що кодує поліпептид. Такі контрольні "Сигнальний пептид" являє собою амінокиспослідовності включають, але не обмежуються, лотну послідовність, яка транслюється разом з лідерну послідовність, поліаденілаційну послідопротеїном і направляє протеїн у секреторну сисвність, пропептидну послідовність, промотор, тему (Chrispeels, J.J., (1991) Ann. Rev. Plant Phys. послідовність сигнального пептиду і термінатор Plant Моl. Biol. 42:21-53). Якщо протеїн повинен транскрипції. Як мінімум, контрольні послідовносбути направлений у вакуоль, може бути додаткоті включають промотор і транскрипційні і транс 27 86918 28 ляційні стоп-сигнали. Контрольні послідовності ду, - кодуючої послідовності, яка в природі не можуть бути забезпечені лінкерами для введення асоційована з цим промотором (наприклад, генеспецифічних рестрикційних сайтів, полегшуючих тично сконструйована кодуюча послідовність або лігування контрольних послідовностей з кодуюаллель з іншого екотипу чи різновиду). Приклачою областю нуклеотидної послідовності, яка дом гетерологічного поліпептиду є поліпептид, кодує поліпептид. експресований з рекомбінантного полінуклеотиду Вираз "оперативно зв'язаний" тут означає в трансгенному організмі. Гетерологічні полінукконфігурацію, в якій контрольна послідовність леотиди і поліпептиди є формами рекомбінантрозміщена у відповідному положенні відносно них молекул. кодуючої послідовності ДНК-послідовності, так Крім того, далі визначено або описано іншим що контрольна послідовність направляє екпресію способом багато додаткових термінів. поліпептиду. Гліфосат-N-ацетилтрансферазиВираз "кодуюча послідовність" тут включає В одному з аспектів винахід стосується новонуклеотидну послідовність, яка безпосередньо го сімейства ізольованих або рекомбінантних визначає амінокислотну послідовність її протеїферментів, що називаються тут " гліфосат-Nнового продукту. Межі кодуючої послідовності ацетилтрансферазами", "GATs" або "GATзагалом визначаються відкритою рамкою зчитуферментами". GATs є ферментами, що мають вання, яка звичайно починається стартовим коGAT-активність, переважно достатню активність доном ATG. Типова кодуюча послідовність вклюдля надання деякого ступеню толерантності до чає ДНК, кДНК і/або рекомбінантну нуклеотидну гліфосату трансгенній рослині, сконструйованій зі послідовність. здатністю експресувати GAT. Деякі приклади В цьому контексті вираз "експресія" включає GATs включають GAT-поліпептиди, детальніше будь-який етап вироблення поліпептиду, вклюописані нижче. чаючи, але не тільки, транскрипцію, трансляцію, Звичайно, GAT-опосереднена толерантність пост-трансляційну модифікацію і секрецію. до гліфосату є комплексною функцією GATВ цьому контексті вираз "вектор експресії" активності, рівнів експресії GAT в транс генній включає молекулу ДНК, лінійну або циклічну, яка рослині, конкретної рослини, природи і режиму містить сегмент, кодуючий поліпептид за винахонанесення гербіциду і т.д. Досвідчений фахівець дом, і яка є оперативно зв'язаною з додатковими може без надмірного експериментування визнасегментами, що забезпечують її транскрипцію. чити рівень GAT-активності, необхідний для наВираз "клітина-хазяїн" тут включає будь-який дання толерантності до гліфосату в конкретній тип клітин, схильний до трансформації нуклеїноситуації. вокислотною конструкцією. GAT-активність може бути оцінена з викорисВираз "рослина" включає цілі рослини, патанням звичайних кінетичних параметрів kкат, Км і росткові вегетативні органи/структури (наприkкат/Км. kкат можна представити як міру швидкості клад, листя, стебла і бульби), корені, квітки і квітацетилювання, зокрема, при високих концентракові органи/структури (наприклад, приквітники, ціях субстрату, Км є мірою афінності GAT до її чашолистки, пелюстки, тичинки, плодолистики, субстратів (наприклад, ацетил-СоА і гліфосату), а пильовики і насінні зачатки), насіння (включаючи kкат/Км є мірою каталітичної ефективності, яка зародки, ендосперм і насіннєву оболонку) і фрукприймає до уваги і афінність до субстрату, і катати (зрілу зав'язь), рослинну тканину (наприклад, літичну швидкість; цей параметр особливо важваскулярну тканину, покривну тканину і т.п.) і кліливий в ситуації, коли концентрація субстрату, тини (наприклад, замикаючі клітини, яйцеклітини, щонайменше частково, є фактором, обмежуючим трихоми і т.п.) та їх потомство. Клас рослин, які швидкість. Загалом, GAT з вищими параметрами можуть бути використані в способі за винаходом, kкат або kкат/Км є більш ефективним каталізатозагалом включає широкий клас вищих та нижчих ром, ніж інша GAT з нижчими параметрами kкат рослин, піддатливих технологіям трансформації, або kкaт/Км. GAT з нижчим Км є більш ефективним включаючи покритонасінні (односім'ядольні і двокаталізатором, ніж інша GAT з вищим Км. Таким сім'ядольні рослини), голонасінні, папороті і багачином, для визначення ефективності однієї GAT токлітинні водорості. Вираз включає рослини різпорівняно з іншою можна порівняти кінетичні паних рівнів плоїдності, в тому числі анеуплоїдні, раметри для цих двох ферментів. Відносна важполіплоїдні, диплоїдні, гаплоїдні та гемізиготні. ливість kкат, Км і kкат/Км буде змінюватися в залежВираз "гетерологічний" тут описує таке взаєності від очікуваної ситуації, в якій GAT буде мовідношення між двома або більше елементафункціонувати, наприклад, очікуваної ефективної ми, яке показує, що ці елементи звичайно не зуконцентрації гліфосату відносно Км до гліфосату. стрічаються в природі у близькій спорідненості GAT-активність також може бути оцінена на осодин до одного. Так, наприклад, полінуклеотидна нові будь-якої з ряду функціональних характерипослідовність "гетерологічна" організму або друстик, наприклад, стабільності, схильності до інгігій полінуклеотидній послідовності, якщо вона бування або активації іншими молекулами і т.д. походить з іншого виду, або, якщо вона походить Поліпептид гліфосат-N-ацетилтрансферази з того ж виду, то вона є модифікованою порівняВ одному з аспектів винахід стосується новоно з оригінальною формою. Наприклад, вираз го сімейства ізольованих або рекомбінантних "промотор, оперативно зв'язаний з гетерологічполіпептидів, що називаються тут "поліпептидами ною кодуючою послідовністю" стосується кодуюгліфосат-N-ацетилтрансферази" або "GATчої послідовності з виду, відмінного від того, до поліпептидами". GAT-поліпептиди відрізняються якого належить промотор, або, якщо з того ж виїх структурною подібністю до нового сімейства 29 86918 30 GATs. Багато, але не всі GAT-поліпептиди явля540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, ють собою GATs. Відмінність складається в тому, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, що GATs визначаються на основі функції, а GAT640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, поліпептиди визначаються на основі структури. 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, Одна підгрупа GAT-поліпептидів включає ті GAT740, 745, 750, 755 або 760 при використанні матполіпептиди, які мають GAT-активність, переважриці BLOSUM62, штрафу за існування пропусків но на рівні, який забезпечить надання стійкості до 11 і штрафу за розширення пропусків 1. гліфосату трансгенній рослині, яка експресує цей В одному з аспектів винахід стосується GATпротеїн на ефективному рівні. Деякі GATполіпептиду, що включає амінокислотну послідополіпептиди, переважні для надання толерантновність, яка може бути оптимально вирівняна з сті до гліфосату, мають kcat щонайменше 1хв.-1, SEQ ID NO. 445 з отриманням показника подіббільш переважно 10хв.-1, 100хв.-1 або 1000хв.-1. ності щонайменше 430 при використанні матриці Інші GAT-поліпептиди, переважні для надання BLOSUM62, штрафу за існування пропусків 11 і толерантності до гліфосату, мають Км не більше штрафу за розширення пропусків 1. Деякі аспекти ніж 100мМ, більш переважно не більше ніж 10мМ, винаходу стосуються GAT-поліпептидів, що вклю1мМ, or 0,1мМ. Інші GAT-поліпептиди, переважні чають амінокислотну послідовність, яка може для надання толерантності до гліфосату, мають бути оптимально вирівняна з SEQ ID NO. 445 з kcat/Км щонайменше 1мМ-1хв.-1 або більше, пеотриманням показника подібності щонайменше реважно щонайменше 10мМ-1хв.-1, 100мМ-1хв.-1, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 1000мМ-1хв.-1 або 10000мМ-1хв.-1. 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, Зразки GAT-поліпептидів з різних бактеріаль540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, них штамів були ізольовані і описані. Один із зра590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, зків мономерного GAT-поліпептиду, що був ізо640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, льований і описаний, має радіус молекули 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, близько 17кДа. Зразок GAT-ферменту, ізольова740, 745, 750, 755 або 760 при використанні матний зі штаму В. licheniformis, SEQ ID NО:7, покариці BLOSUM62, штрафу за існування пропусків зує Км до гліфосату близько 2,9мМ, а Км до аце11 і штрафу за розширення пропусків 1. тил-СоА - близько 2мкМ, при цьому kcat дорівнює В одному з аспектів винахід стосується GAT6/хвилину. поліпептиду, що включає амінокислотну послідоВираз "GAT-поліпептид" стосується будьвність, яка може бути оптимально вирівняна з якого поліпептиду, що включає амінокислотну SEQ ID NО:300 з отриманням показника подібнопослідовність, яка може бути оптимально вирівсті щонайменше 430 при використанні матриці няна з амінокислотною послідовністю, вибраною BLOSUM62, штрафу за існування пропусків 11 і з групи, що включає SEQ ID NOS: 6-10 і 263-514, штрафу за розширення пропусків 1. Деякі аспекти з отриманням показника подібності щонайменше винаходу стосуються GAT-поліпептидів, що вклю430 при використанні матриці BLOSUM62, штрачають амінокислотну послідовність, яка може фу за існування пропусків 11 і штрафу за розшибути оптимально вирівняна з SEQ ID NО:300 з рення пропусків 1. Деякі аспекти винаходу стосуотриманням показника подібності щонайменше ються GAT-поліпептидів, що включають 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, амінокислотну послідовність, яка може бути оп490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, тимально вирівняна з амінокислотною послідов540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, ністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, NOS: 6-10 і 263-514, з отриманням показника по640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, дібності щонайменше 440, 445, 450, 455, 460, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 740, 745, 750, 755 або 760 при використанні мат515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, риці BLOSUM62, штрафу за існування пропусків 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 11 і штрафу за розширення пропусків 1. 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, Дві послідовності є "оптимально вирівняни665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, ми", якщо вони вирівняні для підрахунку подібно715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755 або 760 сті з використанням вибраної матриці амінокиспри використанні матриці BLOSUM62, штрафу за лотного заміщення (наприклад, BLOSUM62), існування пропусків 11 і штрафу за розширення штрафу за існування пропусків і штрафу за розпропусків 1. ширення пропусків таким чином, щоб досягти В одному з аспектів винахід стосується GATнайвищого показника, можливого для цієї пари поліпептиду, що включає амінокислотну послідопослідовностей. Матриці амінокислотного замівність, яка може бути оптимально вирівняна з щення та їх застосування для кількісної оцінки SEQ ID NO. 457 з отриманням показника подібподібності між двома послідовностями добре ності щонайменше 430 при використанні матриці відомі у відповідній області і описані, наприклад, BLOSUM62, штрафу за існування пропусків 11 і у Dayhoff et al. (1978) "А model of evolutionary штрафу за розширення пропусків 1. Деякі аспекти change in proteins." In "Atlas of Protein Sequence винаходу стосуються GAT-поліпептидів, що вклюand Structure", Vol.5, Suppl. 3 (ed. M.O. Dayhoff), чають амінокислотну послідовність, яка може pp.345-352. Natl. Biomed. Res. Pound., бути оптимально вирівняна з SEQ ID NO. 457 з Washington, DC and Henikoff et al. (1992) Proc. отриманням показника подібності щонайменше Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919. Матрицю 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, BLOSUM62 (Фіг.10) часто використовують у якос490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, ті стандартної матриці заміщення для підрахунку 31 86918 32 в протоколах вирівнювання послідовностей, та60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ких як Gapped BLAST 2.0. Штраф за існування або 99% ідентичності послідовності з амінокислопропусків накладається за введення одного амітною послідовністю, вибраною з групи, що вклюнокислотного пропуску в одну з послідовностей, чає SEQ ID NOS: 6-10 і 263-514. що вирівнюються, а штраф за розширення проОдин з аспектів винаходу стосується GATпусків накладається на кожне додаткове порожнє поліпептиду, що включає амінокислотну послідоамінокислотне положення, введене у вже існуювність, яка має щонайменше 40% ідентичності чий пропуск. Вирівнювання визначається амінопослідовності з SEQ ID NO. 457. Деякі аспекти кислотними положеннями в кожній послідовності, винаходу стосуються GAT-поліпептидів, що в яких вирівнювання починається і закінчується, і, включають амінокислотну послідовність, яка має можливо, ісерцією пропуску або множини пропусщонайменше 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, ків в одній чи обох послідовностях, для того щоб 96%, 97%, 98% або 99% ідентичності послідовнодосягти найвищого можливого показника. Хоча сті з SEQ ID NO. 457. оптимальне вирівнювання і підрахунок можуть Один з аспектів винаходу стосується GATбути виконані вручну, цей процес полегшується поліпептиду, що включає амінокислотну послідошляхом використання компьютерного алгоритму вність, яка має щонайменше 40% ідентичності вирівнювання, наприклад, Gapped BLAST 2.0, послідовності з SEQ ID NO. 445. Деякі аспекти описаного у Altschul et al, (1997) Nucleic Acids винаходу стосуються GAT-поліпептидів, що Res. 25:3389-3402 і доступного на вебсайті Націвключають амінокислотну послідовність, яка має онального центру інформації по біотехнології щонайменше 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Оптимальні вирівню96%, 97%, 98% або 99% ідентичності послідовновання, включаючи множинні вирівнювання, мості з SEQ ID NO. 445. жуть бути отримані з використанням, наприклад, Один з аспектів винаходу стосується GATPSI-BLAST, доступного на поліпептиду, що включає амінокислотну послідоhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov і описаного у Altschul et вність, яка має щонайменше 40% ідентичності al, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. послідовності з SEQ ID NO. 300. Деякі аспекти В амінокислотній послідовності, що є оптивинаходу стосуються GAT-поліпептидів, що мально вирівняною з еталонною послідовністю, включають амінокислотну послідовність, яка має амінокислотний залишок "відповідає" тому полощонайменше 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, женню в еталонній послідовності, з яким залишок 96%, 97%, 98% або 99% ідентичності послідовнопарується при вирівнюванні. "Положення" познасті з SEQ ID NO. 300. чаються номерами, які послідовно ідентифікують Вираз "GAT-поліпептид" також стосується кожну амінокислоту в еталонній послідовності на будь-якого поліпептиду, що включає амінокислооснові її положення відносно N-закінчення. Натну послідовність, яка має щонайменше 40% ідеприклад, в SEQ ID NО:300 положення 1 є М, понтичності послідовності з залишками 1-96 аміноложення 2 є І, положення 3 є Е, і т.д. Коли тестокислотної послідовності, вибраної з групи, що ва послідовність є оптимально вирівняною з SEQ включає SEQ ID NOS: 6-10 і 263-514. Деякі аспекID NО:300, той залишок в тестовій послідовності, ти винаходу стосуються поліпептидів, що вклюякий вирівнюється з Е в положенні 3, називають чають амінокислотну послідовність, яка має що"відповідаючим положенню 3" SEQ ID NО:300. найменше 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, Внаслідок делецій, інсерцій, усічень, злиттів і т.д., 97%, 98% або 99% ідентичності послідовності з які можуть прийматися до уваги при визначенні залишками 1-96 амінокислотної послідовності, оптимального вирівнювання, загалом номер амівибраної з групи, що включає SEQ ID NOS: 6-10 і нокислотного залишку в тестовій послідовності, 263-514. визначений простим підрахунком від NОдин з аспектів винаходу стосується GATзакінчення, не обов'язково буде співпадати з нополіпептиду, що включає амінокислотну послідомером його відповідного положення в еталонній вність, яка має щонайменше 40% ідентичності послідовності. Наприклад, у випадку, коли є депослідовності з залишками 1-96 SEQ ID NO. 457. леція у вирівняній тестовій послідовності, то в ній Деякі аспекти винаходу стосуються GATне буде амінокислоти, що відповідає положенню поліпептидів, що включають амінокислотну пов еталонній послідовності на сайті делеції. Якщо слідовність, яка має щонайменше 60%, 70%, є інсерція у вирівняній тестовій послідовності, ця 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% інсерція не буде відповідати жодному амінокисідентичності послідовності з залишками 1-96 SEQ лотному положенню в еталонній послідовності. У ID NO. 457. випадку усічень або злиттів можуть бути присутні Один з аспектів винаходу стосується GATамінокислотні відрізки в еталонній або тестовій поліпептиду, що включає амінокислотну послідопослідовності, які не відповідають жодній аміновність, яка має щонайменше 40% ідентичності кислоті у відповідній послідовності. послідовності з залишками 1-96 SEQ ID NO. 445. Вираз "GAT-поліпептид" також стосується Деякі аспекти винаходу стосуються GATбудь-якого поліпептиду, що включає амінокислополіпептидів, що включають амінокислотну потну послідовність, яка має щонайменше 40% ідеслідовність, яка має щонайменше 60%, 70%, нтичності послідовності з амінокислотною послі80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% довністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID ідентичності послідовності з залишками 1-96 SEQ NOS: 6-10 і 263-514. Деякі аспекти винаходу стоID NO. 445. суються GAT-поліпептидів, що включають аміноОдин з аспектів винаходу стосується GATкислотну послідовність, яка має щонайменше поліпептиду, що включає амінокислотну послідо 33 86918 34 вність, яка має щонайменше 40% ідентичності ДНК - IUB; вирівнювання за парами з перемиканпослідовності з залишками 1-96 SEQ ID NO. 300. ням "повільне/швидке" - SLOW or FULL Alignment. Деякі аспекти винаходу стосуються GATВ іншому аспекті винахід стосується ізольополіпептидів, що включають амінокислотну пованого або рекомбінантного поліпептиду, що слідовність, яка має щонайменше 60%, 70%, включає щонайменше 20, або, в альтернативі, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% 50, 75, 100, 125 або 140 суміжних амінокислот з ідентичності послідовності з залишками 1-96 SEQ амінокислотної послідовності, вибраної з групи, ID NO. 300. що включає SEQ ID NOS: 6-10 і 263-514. Вираз "GAT-поліпептид" також стосується В наступному аспекті винахід стосується ізобудь-якого поліпептиду, що включає амінокислольованого або рекомбінантного поліпептиду, що тну послідовність, яка має щонайменше 40% ідевключає щонайменше 20, або, в альтернативі, нтичності послідовності з залишками 51-146 амі50, 100 або 140 суміжних амінокислот з SEQ ID нокислотної послідовності, вибраної з групи, що NO: 457. включає SEQ ID NOS: 6-10 і 263-514. Деякі аспекВ наступному аспекті винахід стосується ізоти винаходу стосуються поліпептидів, що вклюльованого або рекомбінантного поліпептиду, що чають амінокислотну послідовність, яка має щовключає щонайменше 20, або, в альтернативі, найменше 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 50, 100 або 140 суміжних амінокислот з SEQ ID 97%, 98% або 99% ідентичності послідовності з NO: 445. залишками 51-146 амінокислотної послідовності, В наступному аспекті винахід стосується ізовибраної з групи, що включає SEQ ID NOS: 6-10 і льованого або рекомбінантного поліпептиду, що 263-514. включає щонайменше 20, або, в альтернативі, Один з аспектів винаходу стосується GAT50, 100 або 140 суміжних амінокислот з SEQ ID поліпептиду, що включає амінокислотну послідоNO: 300. вність, яка має щонайменше 40% ідентичності В наступному аспекті винахід стосується попослідовності з залишками 51-146 SEQ ID NO. ліпептиду, що включає амінокислотну послідов457. Деякі аспекти винаходу стосуються GATність, вибрану з групи, що включає SEQ ID NOS: поліпептидів, що включають амінокислотну по6-10 і 263-514. слідовність, яка має щонайменше 60%, 70%, Деякі переважні GAT-поліпептиди за винахо80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% дом відрізняються таким чином. При оптимальідентичності послідовності з залишками 51-146 ному вирівнюванні з еталонною амінокислотною SEQ ID NO. 457. послідовністю, вибраною з групи, що включає Один з аспектів винаходу стосується GATSEQ ID NOS: 6-10 і 263-514, щонайменше 90% поліпептиду, що включає амінокислотну послідоамінокислотних залишків в поліпептиді, що відповність, яка має щонайменше 40% ідентичності відають вказаним далі положенням, узгоджуютьпослідовності з залишками 51-146 SEQ ID NO. ся з такими обмеженнями: (а) в положеннях 2, 4, 445. Деякі аспекти винаходу стосуються GAT15, 19, 26, 28, 31, 45, 51, 54, 86, 90, 91, 97, 103, поліпептидів, що включають амінокислотну по105, 106, 114, 123, 129, 139 і/або 145 амінокислослідовність, яка має щонайменше 60%, 70%, тний залишок являє собою В1; і (b) в положеннях 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% 3, 5, 8, 10, 11, 14, 17, 18, 24, 27, 32, 37, 38, 47, 48, ідентичності послідовності з залишками 51-146 49, 52, 57, 58, 61, 62, 63, 68, 69, 79, 80, 82, 83, 89, SEQ ID NO. 445. 92, 100, 101, 104, 119, 120, 124, 125, 126, 128, Один з аспектів винаходу стосується GAT131, 143 і/або 144 амінокислотний залишок являє поліпептиду, що включає амінокислотну послідособою В2; при цьому В1 є амінокислотою, вибравність, яка має щонайменше 40% ідентичності ною з групи, що включає А, І, L, М, F, W, Υ і V, а послідовності з залишками 51-146 SEQ ID NO. В2 є амінокислотою, вибраною з групи, що вклю300. Деякі аспекти винаходу стосуються GATчає R, N, D, С, Q, Е, G, Н, К, Р, S і Т. При викориполіпептидів, що включають амінокислотну постанні літер для позначення амінокислоти або слідовність, яка має щонайменше 60%, 70%, амінокислотного залишку однолітерні позначення 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% А, С, D, Е, F, G, Н, І, К, L, Μ, Ν, Р, Q, R, S, Т, V, W ідентичності послідовності з залишками 51-146 і Υ відповідають їх стандартним значенням, що SEQ ID NO. 300. звичайно використовуються у біотехнології і наВираз "ідентичність" або "процентна ідентичведені тут в Таблиці 2. ність" стосовно окремої пари вирівняних амінокиДеякі переважні GAT-поліпептиди за винахослотних послідовностей тут означає процентну дом відрізняються таким чином. При оптимальідентичність амінокислотних послідовностей, ному вирівнюванні з еталонною амінокислотною отриману аналізом ClustalW (версія W 1.8, що послідовністю, вибраною з групи, що включає поставляється European Bioinformatics Institute, SEQ ID NOS: 6-10 і 263-514, щонайменше 80% Cambridge, UK), яка включає підрахунок числа амінокислотних залишків в поліпептиді, що відпоідентичних збігів у вирівнюванні і ділення цього відають вказаним далі положенням, узгоджуютьчисла ідентичних збігів на більшу величину з (і) ся з такими обмеженнями: (а) в положеннях 2, 4, довжини вирівняних послідовностей, і (іі) 96, і 15, 19, 26, 28, 51, 54, 86, 90, 91, 97, 103, 105, 106, використання таких стандартних параметрів 114, 129, 139 і/або 145 амінокислотний залишок ClustalW для досягнення повільних/точних вирівявляє собою Z1; (b) в положеннях 31 і/або 45 амінювань за парами: штраф за відкриття пропуску нокислотний залишок являє собою Z2; (с) в по10; штраф за розширення пропуску - 0,10; матриложеннях 8 і/або 89 амінокислотний залишок явця маси протеїну - серії Gonnet; матриця маси ляє собою Z3; (d) в положеннях 82, 92, 101 і/або 35 86918 36 120 амінокислотний залишок являє собою Z4; (e) кислотою, вибраною з групи, що включає А, І, L, в положеннях 3, 11, 27 і/або 79 амінокислотний М, F, W, Υ і V; а В2 є амінокислотою, вибраною з залишок являє собою Z5; (f) в положенні 123 амігрупи, що включає R, N, D, C, Q, Е, G, Н, К, Р, S і нокислотний залишок являє собою Z1 або Z2; (g) Т. в положеннях 12, 33, 35, 39, 53, 59, 112, 132, 135, Деякі переважні GAT-поліпептиди за винахо140 і/або 146 амінокислотний залишок являє содом відрізняються таким чином. При оптимальбою Z1 або Z3; (h) в положенні 30 амінокислотному вирівнюванні з еталонною амінокислотною ний залишок являє собою Z1 або Z4; (і) в полопослідовністю, вибраною з групи, що включає женні 6 амінокислотний залишок являє собою Z1 SEQ ID NO:6-10 і 263-514, щонайменше 90% аміабо Z6; (j) в положеннях 81 і/або 113 амінокислонокислотних залишків в поліпептиді, що відповітний залишок являє собою Z2 або Z3; (k) в полодають вказаним далі положенням, узгоджуються женнях 138 і/або 142 амінокислотний залишок з такими обмеженнями: (а) в положеннях 1, 7, 9, являє собою Z2 або Z4; (І) в положеннях 5, 17, 20, 36, 42, 50, 64, 72, 75, 76, 78, 94, 98, 110, 121 24, 57, 61, 124 і/або 126 амінокислотний залишок і/або 141 амінокислотний залишок являє собою являє собою Z3 або Z4; (m) в положенні 104 аміZ1; (b) в положеннях 13, 46, 56, 70, 107, 117 і/або нокислотний залишок являє собою Z3 або Z5; (о) 118 амінокислотний залишок являє собою Z2; (с) в положеннях 38, 52, 62 і/або 69 амінокислотний в положеннях 23, 55, 71, 77, 88, і/або 109 амінозалишок являє собою Z3 або Z6; (р) в положенкислотний залишок являє собою Z3; (d) в полонях 14, 119 і/або 144 амінокислотний залишок женнях 16, 21, 41, 73, 85, 99 і/або 111 амінокисявляє собою Z4 або Z5; (q) в положенні 18 амінолотний залишок являє собою Z4; (e) в кислотний залишок являє собою Z4 або Z6; (r) в положеннях 34 і/або 95 амінокислотний залишок положеннях 10, 32, 48, 63, 80 і/або 83 амінокисявляє собою Z5; (f) в положенні 22, 25, 29, 43, 44, лотний залишок являє собою Z5 або Z6; (s) в по66, 74, 87, 102, 108, 116, 122, 127, 133, 134, 136 ложенні 40 амінокислотний залишок являє собою і/або 137 амінокислотний залишок являє собою Z1, Ζ2 або Z3; (t) в положеннях 65 і/або 96 аміноZ6; при цьому Z1 є амінокислотою, вибраною з кислотний залишок являє собою Z1, Ζ3 або Z5; групи, що включає А, І, L, Μ і V; Ζ2 є амінокисло(u) в положеннях 84 і/або 115 амінокислотний тою, вибраною з групи, що включає F, W і Υ; Ζ3 є залишок являє собою Z1, Z3 або Z4; (ν) в полоамінокислотою, вибраною з групи, що включає N, женні 93 амінокислотний залишок являє собою Q, S і Τ; Ζ4 є амінокислотою, вибраною з групи, Ζ2, Ζ3 або Ζ4; (w) в положенні 130 амінокислотщо включає R, Η і Κ; Ζ5 є амінокислотою, вибраний залишок являє собою Z2, Z4 або Z6; (х) в ною з групи, що включає D і Е; і Z6 є амінокислоположеннях 47 і/або 58 амінокислотний залишок тою, вибраною з групи, що включає С, G і Р. являє собою Z3, Z4 або Z6; (у) в положеннях 49, Деякі переважні GAT-поліпептиди за винахо68, 100 і/або 143 амінокислотний залишок являє дом відрізняються таким чином. При оптимальсобою Z3, Z4 або Z5; (z) в положенні 131 аміноному вирівнюванні з еталонною амінокислотною кислотний залишок являє собою Ζ3, Ζ5 або Ζ6; послідовністю, вибраною з групи, що включає (аа) в положеннях 125 і/або 128 амінокислотний SEQ ID NO:6-10 і 263-514, щонайменше 80% амізалишок являє собою Ζ4, Ζ5 або Ζ6; (ab) в полонокислотних залишків в поліпептиді, що відповіженні 67 амінокислотний залишок являє собою дають вказаним далі положенням, узгоджуються Ζ1, Ζ3, Ζ4 або Ζ5; (ас) в положенні 60 амінокисз такими обмеженнями: (а) в положенні 2 амінолотний залишок являє собою Ζ1, Ζ4, Ζ5 або Ζ6; і кислотний залишок являє собою І або L; (Ь) в (ad) в положенні 37 амінокислотний залишок явположенні З амінокислотний залишок являє соляє собою Z3, Z4, Z5 або Z6; при цьому Z1 є амібою Ε або D; (с) в положенні 4 амінокислотний нокислотою, вибраною з групи, що включає А, І, залишок являє собою V, А або І; (d) в положенні 5 L, Μ і V; Z2 є амінокислотою, вибраною з групи, амінокислотний залишок являє собою К, R або N; що включає F, W і Υ; Ζ3 є амінокислотою, вибра(e) в положенні 6 амінокислотний залишок являє ною з групи, що включає N, Q, S і Τ; Ζ4 є амінокисобою Ρ або L; (f) в положенні 8 амінокислотний слотою, вибраною з групи, що включає R, Η і Κ; залишок являє собою N, S або Т; (g) в положенні Ζ5 є амінокислотою, вибраною з групи, що вклю10 амінокислотний залишок являє собою Ε або чає D і Е; і Ζ6 є амінокислотою, вибраною з групи, G; (h) в положенні 11 амінокислотний залишок що включає С, G і Р. являє собою D або Е; (і) в положенні 12 амінокиДеякі переважні GAT-поліпептиди за винахослотний залишок являє собою Τ або A; (j) в подом відрізняються таким чином. При оптимальложенні 14 амінокислотний залишок являє собою ному вирівнюванні з еталонною амінокислотною Ε або К; (k) в положенні 15 амінокислотний залипослідовністю, вибраною з групи, що включає шок являє собою І або L; (І) в положенні 17 аміSEQ ID NO:6-10 і 263-514, щонайменше 90% амінокислотний залишок являє собою Η або Q; (m) в нокислотних залишків в поліпептиді, що відповіположенні 18 амінокислотний залишок являє содають вказаним далі положенням, узгоджуються бою R, С або К; (n) в положенні 19 амінокислотз такими обмеженнями: (а) в положеннях 1, 7, 9, ний залишок являє собою І або V; (о) в положенні 13, 20, 36, 42, 46, 50, 56, 64, 70, 72, 75, 76, 78, 94, 24 амінокислотний залишок являє собою Q або 98, 107, 110, 117, 118, 121 і/або 141 амінокислотR; (р) в положенні 26 амінокислотний залишок ний залишок являє собою В1; і (b) в положеннях являє собою L або І; (q) в положенні 27 амінокис16, 21, 22, 23, 25, 29, 34, 41, 43, 44, 55, 66, 71, 73, лотний залишок являє собою Ε або D; (r) в поло74, 77, 85, 87, 88, 95, 99, 102, 108, 109, 111, 116, женні 28 амінокислотний залишок являє собою А 122, 127, 133, 134, 136 і/або 137 амінокислотний або V; (s) в положенні 30 амінокислотний зализалишок являє собою В2; при цьому В1 є аміношок являє собою Κ, Μ або R; (t) в положенні 31 37 86918 38 амінокислотний залишок являє собою Υ або F; (u) 106 амінокислотний залишок являє собою L або І; в положенні 32 амінокислотний залишок являє (bo) в положенні 112 амінокислотний залишок собою Ε або G; (ν) в положенні 33 амінокислотявляє собою Τ або І; (bр) в положенні 113 аміноний залишок являє собою Т, А або S; (w) в полокислотний залишок являє собою S, Τ або F; (bq) в женні 35 амінокислотний залишок являє собою L, положенні 114 амінокислотний залишок являє S або М; (х) в положенні 37 амінокислотний засобою А або V; (br) в положенні 115 амінокислотлишок являє собою R, G, Ε або Q; (у) в положенні ний залишок являє собою S, R або A; (bs) в по38 амінокислотний залишок являє собою G або ложенні 119 амінокислотний залишок являє соS; (z) в положенні 39 амінокислотний залишок бою Κ, Ε або R; (bt) в положенні 120 являє собою Т, А або S; (аа) в положенні 40 аміамінокислотний залишок являє собою К або R; нокислотний залишок являє собою F, L або S; (bu) в положенні 123 амінокислотний залишок (ab) в положенні 45 амінокислотний залишок явявляє собою F або L; (bv) в положенні 124 аміноляє собою Υ або F; (ас) в положенні 47 амінокискислотний залишок являє собою S або R; (bw) в лотний залишок являє собою R, Q або G; (ad) в положенні 125 амінокислотний залишок являє положенні 48 амінокислотний залишок являє сособою Е, К, G або D; (bх) в положенні 126 амінобою G або D; (ае) в положенні 49 амінокислотний кислотний залишок являє собою Q або Н; (by) в залишок являє собою К, R, Ε або Q; (af) в полоположенні 128 амінокислотний залишок являє женні 51 амінокислотний залишок являє собою І собою Е, G або К; (bz) в положенні 129 амінокисабо V; (аg) в положенні 52 амінокислотний залилотний залишок являє собою V, І або А; (са) в шок являє собою S, С або G; (ah) в положенні 53 положенні 130 амінокислотний залишок являє амінокислотний залишок являє собою І або Т; (аі) собою Y, Н, F або С; (cb) в положенні 131 амінов положенні 54 амінокислотний залишок являє кислотний залишок являє собою D, G, N або Е; собою А або V; (aj) в положенні 57 амінокислот(сс) в положенні 132 амінокислотний залишок ний залишок являє собою Η або Ν; (аk) в полоявляє собою І, Т, А, М, V або L; (cd) в положенні женні 58 амінокислотний залишок являє собою Q, 135 амінокислотний залишок являє собою V, Т, А Κ, Ν або Р; (аі) в положенні 59 амінокислотний або І; (се) в положенні 138 амінокислотний зализалишок являє собою А або S; (am) в положенні шок являє собою Η або Y; (cf) в положенні 139 60 амінокислотний залишок являє собою Е, К, G, амінокислотний залишок являє собою І або V; V або D; (an) в положенні 61 амінокислотний за(eg) в положенні 140 амінокислотний залишок лишок являє собою Η або Q; (ао) в положенні 62 являє собою L або S; (ch) в положенні 142 аміноамінокислотний залишок являє собою Р, S або Т; кислотний залишок являє собою Υ або Н; (сі) в (ар) в положенні 63 амінокислотний залишок явположенні 143 амінокислотний залишок являє ляє собою Е, G або D; (aq) в положенні 65 амінособою Κ, Τ або Е; (cj) в положенні 144 амінокискислотний залишок являє собою Е, D, V або Q; лотний залишок являє собою Κ, Ε або R; (сk) в (аr) в положенні 67 амінокислотний залишок явположенні 145 амінокислотний залишок являє ляє собою Q, Е, R, L, Η або К; (as) в положенні 68 собою L або І; і (сі) в положенні 146 амінокислотамінокислотний залишок являє собою К, R, Ε або ний залишок являє собою Τ або А. N; (at) в положенні 69 амінокислотний залишок Деякі переважні GAT-поліпептиди за винахоявляє собою Q або Р; (аu) в положенні 79 амінодом відрізняються таким чином. При оптималькислотний залишок являє собою Ε або D; (av) в ному вирівнюванні з еталонною амінокислотною положенні 80 амінокислотний залишок являє сопослідовністю, вибраною з групи, що включає бою G або Е; (aw) в положенні 81 амінокислотний SEQ ID NO:6-10 і 263-514, щонайменше 80% амізалишок являє собою Υ, Ν або F; (ах) в положенні нокислотних залишків в поліпептиді, що відпові82 амінокислотний залишок являє собою R або дають вказаним далі положенням, узгоджуються Н; (ау) в положенні 83 амінокислотний залишок з такими обмеженнями: (а) в положенні 9, 76, 94 і являє собою Е, G або D; (az) в положенні 84 амі110 амінокислотний залишок являє собою А; (b) в нокислотний залишок являє собою Q, R або L; положеннях 29 і 108 амінокислотний залишок (bа) в положенні 86 амінокислотний залишок явявляє собою С; (с) в положенні 34 амінокислотляє собою А або V; (bb) в положенні 89 амінокисний залишок являє собою D; (d) в положенні 95 лотний залишок являє собою Τ або S; (be) в поамінокислотний залишок являє собою Е; (e) в ложенні 90 амінокислотний залишок являє собою положенні 56 амінокислотний залишок являє соL або І; (bd) в положенні 91 амінокислотний забою F; (f) в положеннях 43, 44, 66, 74, 87, 102, лишок являє собою І або V; (be) в положенні 92 116, 122, 127 і 136 амінокислотний залишок явамінокислотний залишок являє собою R або К; ляє собою G; (g) в положенні 41 амінокислотний (bf) в положенні 93 амінокислотний залишок явзалишок являє собою Н; (h) в положенні 7 аміноляє собою Η, Υ або Q; (bg) в положенні 96 амінокислотний залишок являє собою І; (і) в положенні кислотний залишок являє собою Е, А або Q; (bh) 85 амінокислотний залишок являє собою К; (j) в в положенні 97 амінокислотний залишок являє положеннях 20, 36, 42, 50, 72, 78, 98 і 121 амінособою L або І; (bі) в положенні 100 амінокислоткислотний залишок являє собою L; (к) в положенний залишок являє собою К, R, N або Е; (bj) в нях 1, 75 і 141 амінокислотний залишок являє положенні 101 амінокислотний залишок являє собою М; (І) в положеннях 23, 64 і 109 амінокиссобою К або R; (bk) в положенні 103 амінокислотлотний залишок являє собою N; (m) в положенний залишок являє собою А або V; (bl) в полонях 22, 25, 133, 134 і 137 амінокислотний залиженні 104 амінокислотний залишок являє собою шок являє собою Ρ; (n) в положенні 71 D або N; (bm) в положенні 105 амінокислотний амінокислотний залишок являє собою Q; (о) в залишок являє собою L або М; (bn) в положенні положеннях 16, 21, 73, 99 і 111 амінокислотний 39 86918 40 залишок являє собою R; (р) в положеннях 55 і 88 Винахід також включає будь-який поліпептид, амінокислотний залишок являє собою S; (q) в що має GAT-активність, який кодується фрагменположенні 77 амінокислотний залишок являє сотом будь-якого з GAT-кодуючих полінуклеотидів, бою Т; (r) в положенні 107 амінокислотний залиописаних тут. шок являє собою W; і (s) в положеннях 13, 46, 70, Винахід також стосується фрагментів GAT117 і 118 амінокислотний залишок являє собою Y. поліпептидів, які можуть бути сплайсовані один з Деякі переважні GAT-поліпептиди за винахоіншим з утворенням функціонального GATдом відрізняються таким чином. При оптимальполіпептиду. Сплайсінг може бути здійснений in ному вирівнюванні з еталонною амінокислотною vitro або in vivo і може включати цис- або транспослідовністю, вибраною з групи, що включає (тобто, внутрішньомолекулярний або міжмолекуSEQ ID NO:6-10 і 263-514, амінокислотний залилярний) сплайсінг. Ці фрагменти самі можуть, шок в поліпептиді, що відповідає положенню 28, але не обов'язково, мати GAT-активність. Наприявляє собою V або А. Валін в положенні 28 загаклад, два або більше сегментів GAT-поліпептиду лом корелює зі зниженим параметром Км, у той можуть бути розділені інтеїнами; видалення інтечас як аланін у цьому положенні загалом корелює їнової послідовності шляхом цис-сплайсінгу приз підвищеним параметром kкат. Інші переважні водить до утворення функціонального GATGAT-поліпептиди відрізняються тим, що вони поліпептиду. В іншому прикладі зашифрований містять І27 (тобто, І в положенні 27), М30, S35, GAT-поліпептид може експресуватися у вигляді R37, S39, G48, К49, N57, Q58, Р62, Q65, Q67, двох або більше окремих фрагментів; трансК68, Е83, S89, А96, Е96, R101, Т112, А114, К119, сплайсінг цих сегментів приводить до відновленК120, Е128, V129, D131, Т131, V134, R144, 1145 ня функціонального GAT-поліпептиду. Різні аспеабо Т146, або будь-яку їх комбінацію. кти цис- і транс-сплайсінгу, кодування генів і ввеДеякі переважні GAT-поліпептиди за винаходення проміжних послідовностей детальніше дом включають амінокислотну послідовність, виописані в патентних заявках США №№09/517,933 брану з групи, що включає SEQ ID NO:6-10 і 263і 09/710,686, обидві з яких повністю включені в цю 514. заявку у вигляді посилання. Винахід також стосується переважних GATЗагалом, винахід включає будь-який поліпепполіпептидів, які відрізняються комбінацією витид, закодований модифікованим GATщезгаданих обмежень у положеннях амінокислополінуклеотидом, отриманим шляхом мутації, тних залишків. рекурсивної рекомбінації послідовностей і/або Крім того, винахід стосується GATдиверсифікації полінуклеотидних послідовностей, полінуклеотидів, що кодують переважні GATописаних тут. В деяких аспектах винаходу GATполіпептиди, описані вище, і їх комплементарні поліпептид є модифікованим шляхом одного або нуклеотидні послідовності. багатьох амінокислотних заміщень, делецій, інДеякі аспекти винаходу окремо стосуються серцій або комбінації одного або більше з цих підгрупи будь-якої з вищеописаних категорій типів модифікацій. Заміщення можуть бути конGAT-поліпептидів, яка має GAT-активність, описервативними або неконсервативними, можуть сану тут. Ці GAT-поліпептиди є переважними, змінювати або не змінювати фукнкцію, а також наприклад, для застосування у якості засобів для можуть додавати нову функцію. Інсерції і делеції надання рослині стійкості до гліфосату. Приклади можуть бути значними, як у випадку усічення знабажаних рівнів GAT-активності описані тут. чного фрагмента послідовності або злиття з доВ одному з аспектів GAT-поліпептиди вклюдатковою послідовністю, всередині або у N- чи Счають амінокислотну послідовність, що кодується закінчення. В деяких варіантах здійснення винарекомбінантною або ізольованою формою приходу GAT-поліпептид є частиною злитого протеїродних нуклеїнових кислот, ізольованих з прирону, що включає функціональний додаток, напридного джерела, наприклад, бактеріального штаклад, сигнал секреції, хлоропласт-транзитний му. Полінуклеотиди дикого типу, що кодують такі пептид, таг для очищення або будь-яку з безлічі GAT-поліпептиди, можуть бути піддані специфічінших функціональних груп, що відомі досвідченому скринінгу за допомогою стандартних метоним фахівцям і детально описані в цьому докудик, відомих в цій області. Наприклад, поліпептименті. ди, визначені послідовностями SEQ ID NO:6 Поліпептиди за винаходом можуть містити SEQ ID NO:10, були відкриті шляхом експресійноодну або більше модифікованих амінокислот. го клонування послідовностей з штамів Bacillus, Присутність модифікованих амінокислот може які проявляють GAT-активність, як детальніше бути сприятливою, наприклад, для (а) підвищенописано нижче. ня полуперіоду існування поліпептиду in vivo, (b) Винахід також включає ізольовані або рекомзниження або підвищення антигенності поліпепбінантні поліпептиди, що кодуються ізольованим тиду, (с) підвищення стабільності зберігання поабо рекомбінантним полінуклеотидом, який вклюліпептиду. Амінокислоти модифікують, напричає нуклеотидну послідовність, яка гібридизуєтьклад, ко-трансляційно або пост-трансляційно під ся в жорстких умовах по суті по всій довжині нукчас рекомбінантного вироблення (наприклад, Nлеотидної послідовності, вибраної з групи, що зчепленої глікозилації в N-X-S/T-мотивах під час включає SEQ ID NOS: 1-5 і 11-262, їх комплеменекспресії в клітинах ссавців) або модифікують ти і нуклеотидні послідовності, які кодують аміносинтетичними способами. кислотну послідовність, вибрану з групи, що Необмежуючі приклади модифікованої аміновключає SEQ ID NOS: 6-10 і 263-514, включаючи кислоти включають глікозильовану амінокислоту, їх комплементи. сульфатовану амінокислоту, пренліатовану (на 41 86918 42 приклад, фарнезільовану, геранілгеранільовану) тися з KD щонайменше ~0,1мкМ, переважно амінокислоту, ацетильовану амінокислоту, ацищонайменше ~0,01мкМ або краще, і найбільш льовану амінокислоту, PEG-ильовану амінокистипово і переважно - щонайменше ~0,001мкМ лоту, біотинильовану амінокислоту, карбоксильоабо краще. вану амінокислоту, фосфорильовану Додаткові деталі методик вироблення і консамінокислоту і т.п. Посилань для отримання довітруювання антитіл можна знайти у Borrebaeck док про модифікацію амінокислот достатньо в (ed) (1995) Antibody Engineering. 2nd Edition літературі. Типові протоколи описані у Walker Freeman and Company, NY (Borrebaeck); (1998) Protein Protocols on CD-ROM Human Press, McCafferty et al. (1996) Antibody Engineering. A Towata, NJ. Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, Рекомбінантні способи вироблення і ізоляції England (McCafferty), and Paul (1995) Antibody поліпептидів за винаходом описані в цьому докуEngineering Protocols Humana Press, Towata, NJ менті. На додаток до рекомбінантного вироблен(Paul). ня поліпептиди можуть вироблятися прямим пепВаріації послідовностей тидним синтезом з використанням твердофазних GAT-поліпептиди за винаходом включають методик (наприклад, Stewart et al. (1969) Solidконсервативно модифіковані варіації послідовноPhase Peptide Synthesis. WH Freeman Co, San стей, описаних тут як SEQ ID NOS: 6-10 і 263-514. Francisco; Merrifield J (1963) J. Am. Chem. Soc. Такі консервативно модифіковані варіації вклю85:2149-2154). Пептидний синтез може виконувачають заміщення, приєднання або делеції, які тися з використанням ручних або автоматизовазмінюють, додають або делетують одну амінокиних методик. Автоматизований синтез може бути слоту або невеликий процент амінокислот (типоздійснений, наприклад, за допомогою Applied во менш ніж ~5%, більш типово менш ніж ~4%, Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin 2% або 1%) в будь-якій з SEQ ID NOS: 6-10 і 263Elmer, Foster City, Calif.) згідно з інструкціями ви514. робника. Наприклад, послідовності можуть бути Наприклад, консервативно модифікована вахімічно синтезовані окремо, а потім з'єднані хіміріація (наприклад, делеція) 146-амінокислотного чними способами з отриманням повного GATполіпептиду, ідентифікованого тут як SEQ ID поліпептиду. Пептиди також можуть бути вибрані NO:6, матиме довжину щонайменше 140 аміноз різноманітних джерел. кислот, переважно щонайменше 141 амінокислоВ іншому аспекті винаходу GAT-поліпептид ту, більш переважно щонайменше 144 амінокисза винаходом застосовують для вироблення анлоти і ще більш переважно - 146 амінокислот, що титіл, наприклад, для діагностичного застосуванвідповідає делеції менш ніж ~5%, 4%, 2% або ня, зокрема, для визначення активності, розподі~1%, або менше, нуклеотидної послідовності. лення і експресії GAT-поліпептидів, наприклад, у Інший приклад консервативно модифікованої різних тканинах трансгенної рослини. варіації (наприклад, "консервативно заміщеної GAT-гомологічні поліпептиди для індукції анваріації") поліпептиду, ідентифікованого тут як титіл не потребують біологічної активності; проте SEQ ID NO:6, матиме "консервативні заміщення", поліпептид або олігопептид повинен бути антивідповідні до шести груп заміщення, представлегенним. Пептиди, що використовуються для індуних в Табл.2 (нижче), в загальній кількості до ~7 кції специфічних антитіл, можуть мати амінокисзалишків (тобто, менше 5%) 146-амінокислотного лотну послідовність, яка включає щонайменше 10 поліпептиду. амінокислот, переважно щонайменше 15 або 20 Гомологи GAT-поліпептидної послідовності амінокислот. Короткі відрізки GAT-поліпептиду за винаходом, включаючи консервативно заміможуть бути злиті з іншим протеїном типа keyhole щені послідовності, можуть бути присутні у виlimpet hemocyanin (протеїн гемоцианіну молюсків) гляді частини більших поліпептидних послідовноі антитілом, що виробляється проти химерної стей, як це зустрічається в GAT-поліпептиді, в молекули. GAT-злитті з сигнальною послідовністю, наприСпособи вироблення поліклональних і моноклад, таргетинг-послідовністю хлоропластів, або клональних антитіл відомі фахівцям, і багато анпісля додання одного або більше доменів для титіл випускаються серійно. Див., наприклад, очищення протеїну (наприклад, полі-гісColigan (1991) Current Protocols in Immunology сегментів, FLAG-таг-сегментів і т.д.). В останньоWiley/Green, NY; and Harlow and Lane (1989) му випадку додаткові функціональні домени Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor майже або зовсім не впливають на активність Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical GAT-частини протеїну, так же як у випадку, коли Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, додаткові домени можуть бути видалені за допоLos Altos, CA, і посилання, наведені там; Goding могою етапів пост-синтезу, таких як обробка про(1986) Monoclonal Antibodies: Principles and теазою. Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY; Визначення поліпептидів за імунореактивнісand Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497. тю Інші придатні методики для отримання антитіл Оскільки поліпептиди за винаходом утворювключають селекцію бібліотек рекомбінантних ють новий клас ферментів з визначеною активніантитіл в фагових або подібних векторах. Див. стю, тобто, активністю ацетилювання гліфосату, Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; and ці поліпептиди також забезпечують нові структуWard, et al. (1989) Nature 341: 544-546. Специфічрні особливості, які можуть розпізнаватися, нані моноклональні і поліклональні антитіла і антиприклад, методами імунологічного аналізу. Виросироватка у більшості випадків будуть зв'язуваблення антисироватки, яка специфічно 43 86918 44 зв'язується з поліпептидами за винаходом, а таПоліклональні сироватки збирають і титрують кож поліпептидів, що зв'язуються цією антисиропроти імуногенного поліпептиду в імуноаналізі, ваткою, є рисою цього винаходу. наприклад, твердофазному імуноаналізі з одним Винахід включає GAT-поліпептиди, які спеабо більше імуногенних поліпептидів, імобілізоцифічно зв'язуються або є специфічно імунореакваних на твердій підкладці. Поліклональні антитивними з антитілом або антисироваткою, виробсироватки з титром 106 або більше збирають, леною проти імуногена, що включає об'єднують і віднімають спорідненими протеїнаамінокислотну послідовність, вибрану з однієї ми, наприклад, ідентифікованими в GenBank, як або більше з SEQ ID NO:6 - SEQ ID NO:10. Для описано вище, для отримання віднятих об'єднаусунення крос-реактивності з іншими GATних титрованих поліклональних антисироваток. гомологами антитіло або антисироватку віднімаВідняті об'єднані титровані поліклональні анють доступними спорідненими протеїнами, такитисироватки тестують на крос-реактивність зі ми як протеїни або пептиди, що відповідають спорідненими поліпептидами. Переважно щоінвентарним номерам GenBank, існуючим на монайменше два з імуногенних GATs використовумент реєстрації цієї заявки, наприклад, ють в цьому досліді, переважно в поєднанні з САА70664, Z99109 і Y09476. У випадку, коли інщонайменше двома спорідненими поліпептидавентарний номер відповідає нуклеїновій кислоті, ми, для ідентифікації антитіл, які специфічно виробляється поліпептид, що кодується цією нукзв'язуються імуногенним протеїном (протеїнами). леїновою кислотою, який використовується для В цьому порівняльному аналізі визначалися віднімання антитіла/антисироватки. Фіг.3 показує умови вибіркового зв'язування для віднятих титвідносну ідентичність між типовими GATрованих поліклональних антисироваток, що заполіпептидами і найбільш спорідненою послідовбезпечують щонайменше в ~5-10 вище відноністю з GenBank, Yitl. Функція нативної Yitl ще шення сигнал/шум для зв'язування титрованих має бути визначена, але з'ясовано, що цей ферполіклональних антисироваток з імуногенними мент має помітну GAT-активність. поліпептидами, ніж для зв'язування зі споріднеВ одному з типових форматів іммуноаналіз ними поліпептидами. Тобто, точність реакції зв'явикористовує поліклональну антисироватку, що зування регулюється доданням неспецифічних була отримана проти одного або більше поліпепконкурентів, таких як альбумін або нежирне сухе тидів, які включають одну або більше послідовмолоко, або шляхом регулювання сольових умов, ностей, відповідаючих одній або більше з SEQ ID температури і т.п. Ці умови зв'язування викорисNOS: 6-10 і 263-514, або її значній частині (тобто, товуються в наступних аналізах для визначення, щонайменше ~30% повної довжини послідовносчи буде тестовий поліпептид специфічно зв'язуті). Повний набір потенціальних поліпептидних ватися об'єднаними віднятими поліклональними імуногенів, виведених з SEQ ID NOS: 6-10 і 263антисироватками. Зокрема, тестові поліпептиди, 514, нижче називаються "імуногенними поліпепщо показують щонайменше в ~2-5 вище віднотидами". Результуюча антисироватка може бути шення сигнал/шум, ніж контрольні поліпептиди в вибрана таким чином, щоб вона мала низьку умовах вибіркового зв'язування, і щонайменше крос-реактивність проти інших споріднених посліполовинне відношення сигнал/шум порівняно з довностей, і будь-яка така крос-реактивність усуімуногенним поліпептидом (поліпептидами), мавається шляхом імуноабсорбції однією або більють значну структурну подібність з імуногенним ше спорідненими послідовностями перед поліпептидом порівняно з відомим GAT, і тому є використанням поліклональної антисироватки в поліпептидами за винаходом. імуноаналізі. В іншому прикладі імуноаналізи в форматі Для отримання антисироватки для викорисконкурентного зв'язування використовуються для тання її в імуноаналізі один або більше імуногенвиявлення тестового поліпептиду. Наприклад, як них поліпептидів отримують і очищують, як опибуло зазначено вище, крос-реактивні антитіла сано тут. Наприклад, може бути отриманий видаляють з об'єднаної суміші антисироваток рекомбінантний протеїн в бактеріальній клітинній шляхом імуноабсорбції контрольними GATлінії. Штам мишей, виведений від близьких родиполіпептидами. Потім імуногенний поліпептид чів (використаний в цьому аналізі тому, що ре(поліпептиди) імобілізують на твердій основі, яку зультати є більш відтворюваними завдяки фактипіддають дії віднятої об'єднаної антисироватки. чній генетичній ідентичності мишей), імунізували Тестові протеїни додають в аналітичну суміш для імуногенним протеїном (протеїнами) в комбінації конкурентного зв'язування з об'єднаною віднятою зі стандартним ад'ювантом, таким як ад'ювант антисироваткою. Здатність тестового протеїну Фреунда, відповідно до стандартного протоколу (протеїнів) зв'язуватися з об'єднаною віднятою імунізації мишей (див., наприклад, в Harlow and антисироваткою порівняно з імобілізованим проLane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold теїном (протеїнами) порівнюють зі здатністю імуSpring Harbor Publications, New York, стандартний ногенного поліпептиду (поліпептидів), що додаопис вироблення антитіл, формати імуноаналізу і ються в аналітичну суміш, конкурентно умови, які можуть використовуватися для визназв'язуватися (імуногенні поліпептиди ефективно чення специфічної імунореактивності). В альтерконкурують з імунізованими імуногенними поліпенативі один або більше синтетичних або рекомбіптидами за зв'язування з об'єднаною антисиронантних поліпептидів, отриманих з ваткою). Процентну крос-реактивність для тестопослідовностей, описаних тут, кон'югують з прових протеїнів розраховують з використанням теїном-носієм і використовують у якості імуногестандартних розрахунків. ну. 45 86918 46 В паралельному аналізі здатність контрольприродних нуклеїнових кислот, ізольованих з орних протеїнів конкурувати за зв'язування з об'єдганізму, наприклад, бактеріального штаму. Типові наною віднятою антисироваткою можна визначаGAT-полінуклеотиди, наприклад, SEQ ID NO:1 ти порівняно зі здатністю імуногенного SEQ ID NO:5, були відкриті шляхом експресійного поліпептиду (поліпептидів) конкурувати за зв'язуклонування послідовностей з штамів Bacillus, що вання з антисироваткою. Процентну кроспоказують GAT-активність. У короткому викладі, реактивність для контрольних поліпептидів розколекцію близько 500 штамів Bacillus і раховують з використанням стандартних розраPseudomonas піддали скринінгу на нативну здатхунків. Якщо процентна крос-реактивність для ність N-ацетилювати гліфосат. Штами вирощуватестових поліпептидів щонайменше в 5-10 разів ли в LB протягом ночі, зібрали шляхом центрифувище, кажуть, що тестові поліпептиди специфічно гування, пермеабілізували в розведеному зв'язуються з об'єднаною віднятою антисироваттолуолі, а потім промили і пересуспендували в кою. реакційній суміші, що містила буфер, 5мМ гліфоЗагалом, імуноабсорбована і об'єднана антисату і 200мкМ ацетил-СоА. Клітини інкубували в сироватка може бути використана в імуноаналізі цій реакційній суміші від 1 до 48 годин, додавши на конкурентне зв'язування, як описано тут, для за цей час в реакцію рівний об'єм метанолу. Попорівняння будь-якого тестового поліпептиду з тім клітини пелетизували шляхом центрифугуімуногенним поліпептидом (поліпептидами). Щоб вання і відфільтрували супернатант для провездійснити це порівняння, два поліпептиди аналідення аналізу методом мас-спектроскопії зують окремо в широкому діапазоні концентрацій, батьківських іонів. Продукт реакції був позитивно і кількість кожного поліпептиду, необхідну для ідентифікований як N-ацетилгліфосат шляхом інгібування 50% зв'язування віднятої антисировапорівняння профілю мас-спектроскопії реакційної тки з імобілізованим протеїном, визначають за суміші з еталоном N-ацетилгліфосату, як показадопомогою стандартних методик. Якщо необхідно на Фіг.2. На виявлення продукту могло вплина кількість тестового поліпептиду менше подвійвати включення обох субстратів (ацетилної необхідної кількості імуногенного поліпептиду, коферменту А та гліфосату), що було усунено тоді кажуть, що тестовий поліпептид специфічно шляхом теплової денатурації бактеріальних клізв'язується з антитілом, виробленим до імуногентин. ного протеїну, за умови, що ця кількість щонайПотім окремі GAT-полінуклеотиди клонували менше в 5-10 разів вище, ніж для контрольного з ідентифікованих штамів шляхом функціональполіпептиду. ного скринінгу. Отримали геномну ДНК і частково У якості остаточного визначення специфічнорозщепили ферментом Sau3A1. Фрагменти ~4Kb сті (необов'язкового) відняту антисироватку поклонували в вектор експресії Е.соlі і трансформувністю імуносорбують імуногенним поліпептидом вали в електрокомпетентні Е.соlі. Окремі клони, (поліпептидами) (але не контрольними поліпепщо показували GAT-активність, ідентифікували тидами), доки зв'язування результуючої імуномас-спектроскопією після реакції, описаної вище, генної поліпептидної віднятої об'єднаної антисиза тим винятком, що толуол замінили пермеабіліроватки з імуногенним поліпептидом зацією в PMBS. Геномні фрагменти секвенували і (поліпептидами), використовуваним в імуносорбідентифікували очікувану GAT-поліпептидції, майже або зовсім не буде виявлятися. Тоді кодуючу відкриту рамку зчитування. Ідентичність цю повністю імуносорбовану антисироватку тесGAT-гена підтвердили експресією відкритої рамки тують на реактивність з тестовим поліпептидом. зчитування в Е. соїі і виявленням високих рівнів Якщо спостерігається мінімум або відсутність N-ацетилгліфосату, вироблених в реакційних реактивності (тобто, не більше подвійного відносумішах. шення сигнал/шум порівняно з отриманим при В іншому аспекті винаходу GATзв'язуванні повністю імуносорбованої антисирополінуклеотиди виробляються шляхом диверсиватки з імуногенним поліпептидом), це означає, фікації, наприклад, рекомбінації і/або мутації одщо тестовий поліпептид специфічно зв'язується ного або більше природних, ізольованих або реантисироваткою, витягнутою імуногенним поліпекомбінантних GAT-полінуклеотидів. Як детально птидом. описано в цьому документі, часто буває можливо Полінуклеотиди гліфосат-Nгенерувати диверсифіковані GATацетилтрансферази полінуклеотиди, що кодують GAT-поліпептиди з В одному з аспектів винахід стосується нововисокими функціональними показниками, наприго сімейства ізольованих або рекомбінантних клад, з підвищеною каталітичною функцією, підполінуклеотидів, що називаються тут "полінуклевищеною стабільністю, більш високим рівнем отидами гліфосат-N-ацетилтрансферази" або еспресії, ніж GAT-полінуклеотид, що використо"GAT-полінуклеотидами". GAT-полінуклеотидні вується у якості субстрату або предка в процесі послідовності відрізняються здатністю кодувати диверсифікації. GAT-поліпептид. Загалом, винахід включає будьПолінуклеотиди за винаходом мають численяку нуклеотидну послідовність, яка кодує будьні призначення, наприклад, для рекомбінантного який з нових GAT-поліпептидів, описаних тут. В виробництва (тобто, експресії) GATдеяких аспектах винаходу переважним є GATполіпептидівГза винаходом; у якості трансгенів полінуклеотид, який кодує GAT-поліпептид з (наприклад, для надання стійкості до гербіцидів GAT-активністю. трансгенним рослинам); у якості маркерів, що В одному з аспектів GAT-полінуклеотиди селектуються, для трансформації і підтримання включають рекомбінантні або ізольовані форми плазмід; у якості імуногенів; у якості діагностич 47 86918 48 них зондів на присутність комплементарних або як бактеріальні або рослинні клітини. Внаслідок частково комплементарних нуклеїнових кислот (у властивої їм дегенерації генетичного коду, інші тому числі для виявлення природних GATнуклеїновокислотні послідовності, що кодують по кодуючих нуклеїнових кислот); у якості субстратів суті ту саму або функціонально еквівалентну амідля подальшого вироблення різноманітності, нокислотну послідовність, також можуть бути наприклад, рекомбінаційних реакцій або мутаційвикористані для клонування і експресії GATних реакцій для отримання нових і/або покращеполінуклеотидів. них GAT-гомологів і т.п. Винахід стосується GAT-полінуклеотидів, коСлід зазначити, що деякі специфічні, суттєві дуючих продукти транскрипції і/або трансляції, з та надійні корисності GAT-полінуклеотидів не яких шляхом сплайсінгу зрештою отримують фупотребують, щоб полінуклеотид кодував поліпепнкціональні GAT-поліпептиди. Сплайсінг може тид зі значною GAT-активністю. Наприклад, GATвиконуватися in vitro або in vivo і може включати полінуклеотиди, які не кодують активних ферменцис- або транс-сплайсінг. Субстратом для сплайтів, можуть бути цінними джерелами батьківських сінгу можуть бути полінуклеотиди (наприклад, полінуклеотидів для використання в диверсифіРНК-транскрипти) або поліпептиди. Прикладом каційних процедурах для отримання варіантів цис-сплайсінгу полінуклеотиду є випадок, коли GAT-полінуклеотидів, або нe-GATінтрон, вставлений в кодуючу послідовність, виполінуклеотидів, з бажаними функціональними даляють, а дві фланкуючі екзонні області піддавластивостями (наприклад, високими kкат або ють сплайсінгу з отриманням GAT-поліпептидkкат/Км, низькими Км, високою стабільністю при дії кодуючої послідовності. Прикладом транстепла або інших навколишніх факторів, високими сплайсінгу полінуклеотиду є випадок, коли GATшвидкостями транскрипції або трансляції, стійкісполінуклеотид кодують шляхом розділення кодутю до протеолітичного розщеплення, зниженою ючої послідовності на два або більше фрагменантигенністю і т.д.). Наприклад, нуклеотидні потів, які можуть бути окремо транскрибовані і потім слідовності, що кодують варіанти протеаз з мініпіддані сплайсінгу з утворенням повної GATмумом або відсутністю помітної активності, були кодуючої послідовності. Використання сплайсінгзастосовані у якості батьківських полінуклеотидів енхансерної послідовності (яка може бути введев дослідах з ДНК-шафлінгом для вироблення на в конструкцію за винаходом) може полегшити потомства, кодуючого високоактивні протеази цис- або транс-сплайсінг. Цис- і транс-сплайсінг (Ness et al. (1999) Nature Biotechnology 17:893поліпептидів детально описаний в цьому докуме96). нті. Більш детальний опис цис- і транс-сплайсінгу Полінуклеотидні послідовності, вироблені можна знайти в патентних заявках США способами генерації різноманітності або спосо№№09/517,933 і 09/710,686. бами рекурсивної рекомбінації послідовностей Таким чином, деякі з GAT-полінуклеотидів ("RSR") (наприклад, ДНК-шафлінгом), є рисою безпосередньо не кодують повний GATцього винаходу. Способи мутації і рекомбінації з поліпептид, але кодують фрагмент або фрагменвикористанням нуклеїнових кислот, описаних тут, ти GAT-поліпептиду. Ці GAT-полінуклеотиди моє рисою цього винаходу. Наприклад, один із спожуть бути використані для експресії функціонасобів за винаходом включає рекурсивну рекомбільного GAT-поліпептиду за допомогою націю однієї або більше нуклеотидних послідовмеханізму, що включає сплайсінг, при цьому ностей за винаходом, описаних вище або нижче, сплайсінг може відбуватися на рівні полінуклеоз одним або більше додатковими нуклеотидами. тиду (наприклад, інтрона/екзона) і/або поліпептиЕтапи рекомбінації можуть виконуватися in vivo, ду (інтеїну/екстеїну). Це може бути корисно, наex vivo, in silico або in vitro. Вищезгадана генераприклад, для контролю експресії GAT-активності, ція різноманітності або рекурсивна рекомбінація оскільки функціональний GAT-поліпептид буде послідовностей виробляє щонайменше одну бібекспресуватися, тільки якщо всі потрібні фрагмеліотеку рекомбінантних модифікованих GATнти будуть експресуватися в навколишньому сеполінуклеотидів. Поліпептиди, що кодуються члередовищі, дозволяючи процеси сплайсінгу для нами цієї бібліотеки, включені у винахід. вироблення функціонального продукту. В іншому Винахід також включає застосування полінуприкладі введення однієї або більше інсерційних клеотидів, також званих тут олігонуклеотидами, послідовностей в GAT-полінуклеотид може полеякі звичайно мають щонайменше 12 основ, перегшити рекомбінацію з низькогомологічним полінуважно щонайменше 15, більш переважно щонайклеотидом; застосування інтрона або інтеїна для менше 20, 30 або 50 або більше основ, які гібриінсерційної послідовності полегшує видалення дизуються в жорстких або високо жорстких проміжної послідовності для відновлення функції умовах з послідовністю GAT-полінуклеотиду. Ці закодованого варіанту. полінуклеотиди можуть бути використані у якості Досвідченому фахівцеві буде зрозуміло, що зондів, праймерів, смислових і антисмислових може бути сприятливою модифікація кодуючої агентів і т.п., відповідно до способів, згаданих тут. послідовності для посилення її експресії в конкЗа винаходом, GAT-полінуклеотиди, включаретному хазяїні. Генетичний код, який має 64 ючи нуклеотидні послідовності, що кодують GATможливі кодони, є надлишковим, і більшість орполіпептиди, фрагменти GAT-поліпептидів, споганізмів переважно використовує певну підмноріднені злиті протеїни або їх функціональні еквіжину цих кодонів. Кодони, що використовуються валенти, використовуються в рекомбінантних кожним видом найчастіше, називаються оптимамолекулах ДНК, які направляють експресію GATльними кодонами, а ті, що не дуже часто викориполіпептидів у відповідних клітинах-хазяях, таких стовуються, класифікуються як рідкі кодони або 49 86918 50 кодони низького застосування (див., наприклад, елементами, такими як промотор, енхансер, терZhang SP et al. (1991) Gene 105:61-72). Кодони мінуючий елемент, або 5'і/або 3'можуть бути заміщені для відображення переванетрансльованими областями, ефективними для жного застосування кодонів хазяїном; цей процес експресії кодуючої послідовності в придатному іноді називають "оптимізацією кодонів" або "контхазяїні, і/або (iv) у середовищі вектора або хазяїролем зміщення кодонів даного виду". на, в якому GAT-полінуклеотид є гетерологічним Оптимізована кодуюча послідовність, що місгеном. Послідовності можуть також знаходитися у тить кодони, переважні для конкретного прокаріокомбінації з типовими композиціями нуклеїнових тичного або еукаріотичного хазяїна (див. також кислот, що включають, наприклад, носії, буфери, Murray, E. et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17:477ад'юванти, наповнювачі і т.п. 508), може бути отримана, наприклад, для збільПолінуклеотиди і олігонуклеотиди за винахошення швидкості трансляції або для вироблення дом можуть бути отримані за стандартними тверрекомбінантних транскриптів РНК, що мають бадофазними методиками, відповідно до відомих жані властивості, такі як довший напівперіод існуспособів синтезу. Звичайно синтезують окремі вання порівняно з транскриптами, отриманими з фрагменти розміром до -100 основ, потім їх з'єднеоптимізованої послідовності. Трансляційні нують (наприклад, способами ферментативного стоп-кодони також можуть бути модифіковані для або хімічного лігування, або полімеразавідображення переважних кодонів хазяїна. Наопосередненими способами) з утворенням по суті приклад, переважними стоп-кодонами для S. будь-якої бажаної безперервної послідовності. cerevisiae і ссавців є UAA і UGA, відповідно. ПеНаприклад, полінуклеотиди і олігонуклеотиди за реважним стоп-кодоном для односім'ядольних винаходом можуть бути отримані хімічним синтерослин є UGA, у той час як комахи і Е.соlі віддазом з використанням класичного фосфорамідитють перевагу застосуванню UAA у якості стопного способу, описаного Beaucage et al. (1981) кодона (Dalphin ME et al. (1996) Nuc. Acids Res. Tetrahedron Letters 22:1859-69, або способу, опи24: 216-218). Методика оптимізації нуклеотидної саного Matthes et al. (1984) ЕМВО J. 3: 801-05, послідовності для експресії в рослині описана, наприклад, як це звичайно використовується в наприклад, в патенті США №6,015,891 і посиланавтоматизованих способах синтезу. Відповідно нях, наведених там. до фосфорамідитного способу, олігонуклеотиди Один з варіантів здійснення винаходу вклюсинтезують, наприклад, в автоматичному ДНКчає GAT-полінуклеотид, що містить оптимальні синтезаторі, очищають, відпалюють, лігують і кодони для експресії у відповідному хазяїні, наклонують у відповідні вектори. приклад, трансгенному рослинному хазяїні. Це Крім того, по суті будь-яку нуклеїнову кислоту особливо бажано, коли GAT-полінуклеотид бакможна замовити в одному з багатьох комерційних теріального походження вводять в трансгенну джерел, таких як The Midland Certified Reagent рослину, наприклад, для надання рослині стійкоCompany (mcrc@oligos.com), The Great American сті до гліфосату. Gene Company (http://www.genco.com), Полінуклеотидні послідовності за винаходом ExpressGen Inc. (www.expressgen.com), Operon можуть конструюватися таким чином, щоб зміниTechnologies Inc. (Alameda, CA) та інших. Подібти GAT-полінуклеотид для різних цілей, включаним чином, пептиди і антитіла можуть бути замоючи, але не обмежуючись, зміни, які модифікують влені в будь-якому з багатьох джерел, таких як клонування, обробку і/або експресію генного проPeptidoGenic (pkim@ccnet.com), НТІ Bio-products, дукту. Наприклад, зміни можуть бути введені з Inc. (http://www.htibio.com), ВМА Biomedicals Ltd використанням технологій, добре відомих в біо(U.K.), Bio.Synthesis, Inc., та інших. технолопї, таких як сайт-направлений мутагенез, Полінуклеотиди також можуть бути синтезодля вставлення нових рестрикційних сайтів, зміни вані за відомими технологіями, описаними в техшаблонів глікозилації, зміни переважних кодонів, нічній літературі. Див. наприклад, Carruthers et al. введення сайтів сплайсінгу і т.д. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418 Як детально описано в цьому документі, по(1982), and Adams et al., J. Am. Chem. Soc. лінуклеотиди за винаходом включають послідов105:661 (1983). Тоді двоспірапьні фрагменти ДНК ності, які кодують нові GAT-поліпептиди і посліможуть бути отримані синтезом комплементарної довності, комплементарні до кодуючих спіралі і спільного відпалу спіралей у відповідних послідовностей, і нові фрагменти кодуючої посліумовах, або шляхом приєднання комплементардовності і їх комплементи. Полінуклеотиди моної спіралі з використанням ДНК-полімерази з жуть мати форму РНК або ДНК і включають відповідною праймерною послідовністю. мРНК, кРНК, синтетичні РНК і ДНК, геномні ДНК ї Основні документи, що описують молекуляркДНК. Полінуклеотиди можуть бути двоспірально-біологічні технології, корисні для цього винаними або односпіральними, і у випадку односпіходу, в тому числі мутагенез, включають Berger ральних молекул можуть являти собою кодуючу and Kimmel, Guide to Molecular Cloning спіраль або некодуючу (антисмислову, комплеTechniques. Methods in Enzvmoloav. volume 152 ментарну) спіраль. Полінуклеотиди можуть вклюAcademic Press, Inc., San Diego, CA ("Berger"); чати кодуючу послідовність GAT-поліпептиду (і) в Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory ізоляци, (іі) в комбінації з додатковою кодуючою Manual (2nd Ed.), volumes 1-3, Cold Spring Harbor послідовністю, так щоб кодувати, наприклад, злиLaboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 тий протеїн, препротеїн, препро-протеїн і т.п., (ііі) ("Sambrook"); and Current Protocols in Molecular в комбінації з некодуючими послідовностями, Biology. F.M. Ausubel et al., eds. Current Protocols, такими як інтрони або інтеїни, контрольними a joint venture between Greene Publishing 51 86918 52 Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., Biotechnology 13:563-564. Вдосконалені способи (supplemented through 2000) ("Ausubel")). Приклаклонування in vitro ампліфікованих нуклеїнових ди технологій, достатні для створення уяви про кислот описані в Wallace ef al., патент США способи ампліфікації in vitro, що включають полі№5,426,039. Вдосконалені способи ампліфікації меразну ланцюгову реакцію (ПЛР), лігазну ланвеликих нуклеїнових кислот шляхом ПЛР описані цюгову реакцію (ЛЛР), Qβ-репліказну ампліфікав Cheng ef al. (1994) Nature 369:684-685 і наведецію та інші технології, опосереднені РНКних там посиланнях, де отримують ПЛРполімеразою (наприклад, NASBA), можуть бути реплікони розміром до 40kb. Фахівцеві буде зрознайдені в Berger, Sambrook, and Ausubel, а тазуміло, що по суті будь-яка РНК може бути перекож Mullis et al., (1987) U.S. Patent No. 4,683,202; творена в двоспіральну ДНК, придатну для рестPCR Protocols A Guide to Methods and Applications рикційної ферментації, ПЛР-розширення і (Innis et al., eds.) Academic Press Inc. San Diego, секвенування з використанням зворотної трансCA (1990); Amheim & Levinson (October 1, 1990) криптази і полімерази. Див. Ausbel, Sambrook and Chemical and Engineering News 36-47; The Journal Berger, усі вище. Of NIH Research (1991) 3:81-94; Kwoh et al. (1989) Варіації послідовностей Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173; Guatelli et al. Фахівцям буде зрозуміло, що завдяки деге(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874; Lomell нерації генетичного коду може вироблятися безef al. (1989) J.CIin. Chem. 35:1826: Landegren et ліч нуклеотидних послідовностей, що кодують al., (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt GAT-поліпептиди за винаходом, деякі з яких ма(1990) Biotechnology 8:291-294; Wu and Wallace, ють суттєву ідентичність з нуклеїновокислотними (1989) Gene 4:560; Bardnger et al. (1990) Gene послідовностями, детально описаними тут. 89:117, and Sooknanan and Malek (1995) Наприклад, таблиця кодонів (Табл.1) показує, що всі кодони AGA, AGG, CGA, CGC, CGG і CGU кодують амінокислоту аргінін. Таким чином, у кожному положенні в нуклеїнових кислотах за винаходом, де кодоном визначається аргінін, цей кодон може бути змінений на будь-який з відповідних кодонів, описаних вище, без зміни закодованого поліпептиду. Зрозуміло, що U в РНКпослідовності відповідає Τ в ДНК-послідовності. При використанні, у якості прикладу, нуклеїновокислотної послідовності, що відповідає нуклеотидам 1-15 з SEQ ID NO:1, ATG ATT GAA GTC AAA, німа варіація цієї послідовності включає AGT АТС GAG GTG AAG, при цьому обидві послідовності кодують амінокислотну послідов ність MD5VK, що відповідає амінокислотам 1-5 SEQ ID NO:6. Такі "німі варіації" належать до одного виду "консервативно модифікованих варіацій", описаних нижче. Фахівцеві буде зрозуміло, що кожний кодон в нуклеїновій кислоті (крім AUG, який звичайно є єдиним кодоном для метіоніну) може бути модифікований за стандартними методиками, так щоб кодувати функціонально ідентичний поліпептид. Відповідним чином, кожна німа варіація нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, є можливою у будь-якій описаної послідовності. Винахід стосується кожної можливої варіації нуклеїновокислотної послідовності, що кодує поліпептид за винаходом, який може бути отриманий шляхом вибору комбінацій на основі можливих 53 86918 54 варіантів кодонів. Ці комбінації здійснюються у тидній послідовності синонімічним кодоном, який відповідності до стандартного триплетного генепереважно використовується в бажаному органітичного коду (наприклад, як вказано в Табл.1), змі-хазяїні, наприклад, рослині, порівняно з батьзастосованого до нуклеїновокислотної послідовківським кодоном. ності, яка кодує GAT-гомологічний поліпептид за Вираз "консервативно модифіковані варіації" винаходом. Всі такі варіації кожної нуклеїнової або просто "консервативні варіації" конкретної кислоти специфічно передбачені і описані тут нуклеїновокислотної послідовності стосується тих шляхом розгляду послідовності в комбінації з нуклеїнових кислот, які кодують ідентичні або по генетичним кодом. Будь-який варіант може бути суті ідентичні амінокислотні послідовності, або, вироблений як зазначено тут. якщо нуклеїнова кислота не кодує амінокислотної Група з двох або більше різних кодонів, які послідовності, стосується по суті ідентичних попри трансляції в одному й тому самому контексті слідовностей. Фахівцеві буде зрозуміло, що індикодують одну й ту саму амінокислоту, тут називідуальні заміщення, делеції або приєднання, які ваються "синонімічними кодонами." Як описано змінюють, додають або делетують одну амінокитут, в деяких аспектах винаходу GATслоту або малий процент амінокислот (звичайно полінуклеотид є сконструйованим для оптимізоменше 5%, більш звичайно менше 4%, 2% або ваного застосування кодонів в бажаному організ1%, або менше) в послідовність, що кодується, є мі-хазяїні, наприклад, рослинному хазяїні. Вираз "консервативно модифікованими варіаціями", при "оптимізований" або "оптимальний" не обмежуцьому зміни складаються в делеції амінокислоти, ється найкращою можливою комбінацію кодонів, приєднанні амінокислоти або заміщенні амінокиа просто показує, що кодуюча послідовність в слоти хімічно подібною амінокислотою. цілому має покращене застосування кодонів поТаблиці консервативних заміщень, які вклюрівняно з полінуклеотидом-попередником, з якого чають функціонально подібні амінокислоти, добвона була виведена. Таким чином, в одному з ре відомі у біотехнології. Таблиця 2 показує шість аспектів винахід стосується способу вироблення груп, що включають амінокислоти, які є "консерваріанту GAT-полінуклеотиду шляхом заміни щовативними заміщеннями" одна до одної. найменше одного батьківського кодона в нуклео Таким чином, "консервативно заміщені варіації" перелічених поліпептидних послідовностей за винаходом включають заміщення малого процента, звичайно менше 5%, більш звичайно менше 2% і часто менше 1% амінокислот поліпептидної послідовності консервативно вибраними амінокислотами тієї самої групи консервативного заміщення. Наприклад, консервативно заміщена варіація поліпептиду, ідентифікованого тут як SEQ ID NO:6, буде містити "консервативні заміщення", відповідні до шести груп, визначених вище, в загальній кількості до 7 залишків (тобто, менше 5% амінокислот) 146-амінокислотного поліпептиду. В іншому прикладі, якщо чотири консервативні заміщення були локалізовані в області, що відповідає амінокислотам 21-30 SEQ ID NO:6, приклади консервативно заміщених варіацій цієї області, RPN QPL ЕАС М, включають: KPQ QPV ЕSС M і KPN NPL DAC V і т.п., відповідно до консервативних заміщень, перелічених в Табл.2 (у наведеному вище прикладі консервативні заміщення підкреслені). Перелік протеїнових послідовностей, у поєднанні з наведеною вище таблицею заміщень, надає тут експрес-перелік всіх консервативно заміщених протеїнів. Нарешті, приєднання послідовностей, які не змінюють закодованої активності молекули нуклеїнової кислоти, наприклад, приєднання нефункціональної або некодуючої послідовності, є консервативною варіацією базової нуклеїнової кислоти. Фахівцеві буде зрозуміло, що численні консервативні варіації нуклеїновокислотних конструкцій, описаних тут, в результаті утворюють функціонально ідентичну конструцію. Наприклад, як описано вище, завдяки дегенерації генетичного коду, "німі заміщення" (тобто, заміщення в нуклеїновокислотній послідовності, які не приводять до змін в закодованому поліпептиді) є властивою рисою кожної нуклеїновокислотної послідовності, яка кодує амінокислоту. Подібним чином, "консервативні амінокислотні заміщення" в одній або декількох амінокислотах в амінокислотній послідовності, що заміщені іншими амінокислотами з високо подібними властивостями, також легко ідентифікуються як високо подібні до конструкції, що описується. Такі консервативні варіації кожної описаної тут послідовності є рисою цього винаходу. Неконсервативними модифікаціями конкретної нуклеїнової кислоти є такі заміщення будьякої амінокислоти, які не характеризуються як 55 86918 56 консервативні заміщення. Наприклад, це будькористанням вищої концентрації солі і нижчої яке заміщення, яке перетинає межі шести груп, температури) підвищують чутливість, але можуть зазначених в Табл.2. Вони включають заміщення сприяти виробленню сигналів неспецифічної гібосновних або кислотних амінокислот на нейтраридизації і високих фонових сигналів. Умови льні амінокислоти (наприклад, Asp, Glu, Asn або більш високої жорсткості (тобто, з використанням Gin на Val, lle, Leu або Met), ароматичних амінонижчої концентрації солі і вищої температури, кислот на основні або кислотні амінокислоти (наближчої до температури гібридизації) знижують приклад, Phe, Туr або Тrр на Asp, Asn, Glu або фоновий сигнал, звичайно залишаючи лише спеGin) або будь-яке інше заміщення, яке не замінює цифічний сигнал. Див. публікацію Rapley, R. and амінокислоту подібною амінокислотою. Walker, J.M. eds., Molecular Biomethods Handbook Гібридизація нуклеїнових кислот (Humana Press, Inc. 1998) (тут далі "Rapley and Нуклеїнові кислоти "гібридизуються", коли Walker"), що включена в цю заявку у вигляді повони асоціюються, звичайно в розчині. Нуклеїнові силання у всій її повноті для всіх призначень. кислоти гібридизуються завдяки різноманітним, Тm ДНК-ДНК-дуплекса може бути оцінена за докладно описаним фізико-хімічним силам, таким допомогою рівняння 1 таким чином: як водневі зв'язки, виключення розчинника, наТт (°С) = 81,5°С +16,6 (Іоg10М) + 0,41 (%G+С) кладення основ і т.п. Детальну інформацію сто- 0,72 (%f) - 500/n, совно гібридизації нуклеїнових кислот можна де Μ - молярність моновалентних катіонів знайти в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in (звичайно Na+), (%G+С) - процент нуклеотидів Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization гуанозину (G) і цистозину (С), (%f) - процент фоwith Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2, рмаліну і n - кількість нуклеотидних основ (тобто, "Overview of principles of hybridization and the довжина) гібриду. Див. Rapley and Walker, вище. strategy of nucleic acid probe assays", (Elsevier, Tm РНК-ДНК-дуплексу може бути оцінена за New York), а також в Ausubel, вище, Hames and допомогою рівняння 2 таким чином: Higgins (1995) Gene Probes 1, IRL Press at Oxford Тm (°С) = 79,8°С +18,5 (Іоg10М) + 0,58 (%G+С) University Press, Oxford, England (Hames and - 11,8 (%G+С)2 - 0,56 (%f) - 820/n, Higgins 1) and Hames and Higgins (1995) Gene де Μ - молярність моновалентних катіонів Probes 2, IRL Press at Oxford University Press, (звичайно Na+), (%G+С) -процент нуклеотидів Oxford, England (Hames and Higgins 2), де надагуанозину (G) і цистозину (С), (%f) - процент фоний детальний опис синтезу, введення міток, вирмаміду і n - кількість нуклеотидних основ (тобто, явлення і кількісної оцінки ДНК і РНК, включаючи довжина) гібриду. Там же. олігонуклеотиди. Рівняння 1 і 2 звичайно точні лише для гібри"Жорсткі умови гібридизації-промивки" в кондних дуплексів, довших ніж 100-200 нуклеотидів. тексті дослідів з гібридизацією нуклеїнових кисТам же. лот, таких як саузерн- і нозерн-гібридизація, є Тm нуклеїновокислотних послідовностей, копослідовність-залежними і є різними при різних ротших ніж 50 нуклеотидів, може бути розрахопараметрах навколишнього середовища. Детавана таким чином: льну інформацію стосовно гібридизації нуклеїноTm (°C) = 4(G+C) + 2(A+T), вих кислот можна знайти в Tijssen (1993), вище, і де А (аденін), С, Т (тимін) і G є числами відв Hames and Higgins 1 and Hames and Higgins 2, повідних нуклеотидів. вище. Приклад жорстких гібридизаційних умов для Загалом, у цьому винаході "високо жорсткі" гібридизації комплементарних нуклеїнових кисумови гібридизації і промивки вибирають приблилот, що містять більше ніж 100 комплементарних зно на