Керована активація системи продукування реутерину lactobacillus reuteri
Формула / Реферат
1. Спосіб одержання клітин культур Lactobacillus reuteri, які містять реутерин, що зберігаться всередині клітин, який включає: одержання клітинних культур Lactobacillus reuteri, де одержання включає ферментацію вказаних клітинних культур; додавання 1,2-пропандіолу або гліцерину до реутерин-продукуючих систем клітин Lactobacillus reuteri на початку ферментації, додавання гліцерину до клітинних культур Lactobacillus reuteri під час одержання, таким чином одержуючи клітини Lactobacillus reuteri, де реутерин зберігається всередині клітин; і зберігання клітин Lactobacillus reuteri.
2. Спосіб за п. 1, де ферментація включає додавання гліцерину в кінці процесу ферментації.
3. Спосіб за п. 1, де зберігання клітин Lactobacillus reuteri включає ліофілізацію клітинних культур після ферментації.
4. Спосіб за п. 2, де зберігання клітин Lactobacillus reuteri включає ліофілізацію клітинних культур після ферментації.
5. Спосіб за п. 3, що додатково включає додавання щонайменше одного кріопротектора разом з гліцерином в клітинні культури після стадії ферментації, до ліофілізації.
6. Спосіб за п. 3, де від приблизно 1 до приблизно 500 мМ гліцерину додають після стадії ферментації, але до ліофілізації в процесі одержання.
7. Спосіб за будь-яким з пп. 2-6, де ферментація клітинних культур Lactobacillus reuteri включає додавання до клітинних культур щонайменше одного з наступних: кобальту, вітаміну В12, вітаміну С або їх комбінацій на початку стадії ферментації.
8. Продукт, одержаний способом за будь-яким з пп. 1-7, де продукт містить збережені клітини Lactobacillus reuteri, при цьому реутерин зберігається в клітинах.
9. Продукт за п. 8 для застосування в лікуванні порушень.
10. Продукт за п. 8 для застосування в лікуванні порушень, викликаних патогенами шкірної системи.
11. Фармацевтична композиція, що містить продукт за п. 8.
Текст
Реферат: Винахід належить до контрольованої активації системи продукування реутерину Lactobacillus reuteri шляхом додавання гліцерину і інших речовин при одержанні клітинних культур і зберігання отриманого реутерину в бактеріальній клітині під час накопичення і збереження клітинних культур. UA 100423 C2 (12) UA 100423 C2 UA 100423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Винахід належить до контрольованої активації системи продукування реутерину Lactobacillus reuteri, шляхом додавання гліцерину і інших речовин при отриманні клітинних культур і зберігання отриманого реутерину в бактеріальній клітині під час накопичення і зберігання. Зокрема, даний винахід належить до отримання великих кількостей L.reuteri, навантажених реутерином, і застосування таких навантажених бактерій для таких цілей, як профілактика і лікування захворювань, як харчова добавка і т. п. Рівень техніки Звичайно клітини прокаріот належать до примітивних, хоч деякі з них містять незвичайні оболонки, відомі як мікрокомпартменти (MCS), які, як виявилося, являють собою примітивні органели всередині бактеріальних клітин. Карбоксисома (яка бере участь в фіксації діоксиду вуглецю) протягом майже 30 років була єдиним визнаним мікрокомпартментом в мікробних клітинах. У 2005 році професор Todd О. Yeates і його колеги відкрили перші структурні властивості мікрокомпартментів бактерій. При отриманні перших структур з високою роздільністю бактеріальних білків мікрокомпартментів були виявлені правила збирання, дуже схожі з такими у деяких вірусів. Шість ідентичних білкових підгруп об'єднуються в гексамерну одиницю, яка являє собою елементарну ланку при формуванні оболонки. Ці гексамерні одиниці тісно упаковані одна з одною, утворюючи молекулярний шар, що містить тільки крихітні пори. Така щільна упаковка, мабуть, обмежує переміщення молекул всередину і назовні мікрокомпартментів, за винятком пор. Кластерний аналіз гомологічних речовин мікробних мікрокомпартментів - специфічних білків, показав, що такі оболонки беруть участь не менше ніж в семи різних метаболічних процесах у бактерій різних видів (Thomas А. Bobik. 2007. Bacterial Microcompartments. Microbe. 1:25-31). Елементарні ланки бактеріальних мікрокомпартментів складаються виключно з білків і глікопротеїдів. Електронна мікроскопія (використана для дослідження мікрокомпартментів) показує відсутність ліпідного моно- або бі-шару (як в оболонках еукаріот), який оточує такі мікрокомпартменти, що робить їх єдиними відомими білковими метаболічними органелами в живих клітинах. Ряд бактеріальних родів, включаючи Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Clostridium, Fusobacterium, Shigella, Listeria і Yersinia, містять компоненти, необхідні для розкладання 1,2-пропандіолу (1,2-PD) або етаноламіну, в мікрокомпартментах (1). Іншою властивістю мікрокомпартментів, як передбачається, є їх здатність виконувати функції резервуара для токсичних для бактерій субстратів, як у випадку з антимікробним реутеринів у L.reuteri. Пошук в GenBank, проведений Bobik, по генах оболонки мікрокомпартментів, показав, що приблизно 25 % (85 з 337) бактеріальних геномів містять гомологічні гени оболонки. У більшої частини з цих 25 % бактеріальних геномів, які несуть такі гомологічні гени, гени оболонки формують кластер з іншими генами, що кодують ферменти, зв'язані в мікрокомпартменти. Це показало, що гени, які кодують продукування реутерину, і гени, які кодують структури мікрокомпартментів, є суміжними. У травні 2008 року, Sriramulu et al. (Sriramulu DD, Liang M, Hernandez-Romero D, Raux-Deery Е, Lunsdorf Н, Parsons JB, Warren MJ, Prentice MB: Lactobacillus reuteri DSM 20016 produces cobalamin-dependent diol dehydratase in metabolosomes and metabolizes 1,2-propanediol by disproportionation. J Bacteriol 2008, 190(13):4559-4567) представили перший доказ того, що продукуючий антибактеріальний агент організм Lactobacillus reuteri має можливості для синтезу бактеріального мікрокомпартменту (карбоксисоми або метаболосоми) при вирощуванні в модифікованому MRS середовищі, що містить 65 мМ 1,2-пропандіолу (PD) і малу кількість глюкози. Організм продукував кобаламінзалежний фермент діолдегідратазу, індуковану 1,2-PD. Оперони зв'язаного синтезу кобаламіну і pdu (утилізація пропандіолу) були присутніми в геномній послідовності DSM 20016 L.reuteri, і повний pdu-оперон з лабораторного штаму DSM 20016 L.reuteri був ампліфікований ПЛР, що підтверджує його наявність в пропандіолметаболізуючому організмі. Однак вирощування в модифікованому MRS-середовищі з 65 мМ 1,2-PD і малою кількістю глюкози, не може використовуватися в промисловому масштабі через дуже низьку швидкість зростання бактерій в цьому середовищі. На відміну від даного винаходу, тут не розкривається додавання гліцерину під час отримання клітинних культур, що забезпечує навантаження мікрокомпартментів реутерином. Lactobacillus reuteri являє собою відому бактерію, яка продукує антимікробну речовину 3гідроксипропанальдегід (HPA), який також називається реутерином. Антибактеріальна активність реутерину описана, наприклад, в патентах США No 5439678, 5458875, 5534253, 5837238 і 5849289. Реутерин являє собою низькомолекулярну, нейтральну, водорозчинну 1 UA 100423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 сполуку, здатну інгібувати зростання бактерій всіх родів і видів, досліджених до цього часу, включаючи: Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus і Helicobacter pylori; а також ряду грибів і інших мікроорганізмів. Використовуючи гліцерин як зовнішній акцептор електронів, він конвертується в 1,3-пропандіол, при цьому утворюється реутерин як інтермедіат. Така реакція проходить спільно з ферментацією цуків, таких як глюкоза. Отримання реутерину залежить від складної системи, що включає: фермент гліцерин/діолдегідратазу, каталізуючу реакцію; кобаламін (вітамін В12), кофактор ферменту, який синтезується складним шляхом; фактори, що використовуються для регенерації ферменту; і структур мікрокомпартментів, що мають поперечний розмір більший ніж 100 нм і утворених поліпептидами. Все перераховане закодоване в більше ніж 50 генах, які індукуються у випадку, якщо вони необхідні. Додавання 1,2-PD або гліцерину в середовище для вирощування призводить до створення великої кількості структур мікрокомпартментів. Додавання гліцерину на більш пізній стадії в бактеріальну культуру приводить до отримання реутерину. Реутерин утворюється, нагромаджується і зберігається всередині мікрокомпартментів, доти, поки вони не вивільнять речовину. У відсутності зростання і субстрату (що включає гліцерин), при нанесенні L.reuteri в нормальному стані (без повністю навантажених мікрокомпартментів), наприклад, на шкіру, вивільнення реутерину звичайно не відбувається. Таким чином, несподіваним було те, що активовані L.reuteri з реутерином, накопиченим в мікрокомпартментах, відповідно до винаходу, успішно і швидко вивільняли реутерин в несприятливих середовищах, таких як шкіра людини, харчові продукти або інші подібні місця, а також, звичайно, в більш традиційних місцях для пробіотиків, таких як ШКТ і МВП, рот і ніс тварин, включаючи людей. Зростання шкірних патогенів, таких як Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes або Propionibacterium acnes, або деяких дріжджів, може привести до зараження ран і порушення шкірної системи, або навіть до більш серйозних порушень шкіри або слизових, таким як екзема, кандидоз, дерматити, імпетиго і т. д. Для лікування цих патогенних агентів відома м коштів. Найбільш традиційними є антибіотики або хімічні антибактеріальні компоненти. Як такі, наприклад, можна указати композиції на основі альдегідів і їх похідних. Інше шкірне захворювання, де лікування включає як пероральні, так і місцеві антибіотики, являє собою купероз, що ушкоджує середню частину обличчя, викликаючи стійке почервоніння ділянки особи і носа. Інфекції, викликані стійкими до метициліну Staphylococcus aureus (MRSA), і пов'язаними грампозитивними патогенами, є наростаючою проблемою в медицині. Вони включають MRSA, стійкі до метициліну Staphylococcus epidermidis (MRSE), і стійкі до метициліну коагульовані негативні Staphylococci (MRCNS). Ванкоміцин, глікопептидний антибіотик, в цей час є засобом вибору для боротьби з цими інфекціями. Зі збільшенням використання ванкоміцину, потрібно чекати появи стійких до ванкоміцину штамів Staphylococci (VRSA). Таким чином, існує наростаюча потреба в засобах, ефективних проти таких патогенів (MRSA/VRSA), але які при цьому не надають небажаної побічної дії. S.aureus звичайно колонізується в ніздрях, хоч дихальні шляхи, відкриті рани, внутрішньовенні катетери і сечові шляхи також є потенційними ділянками для інфекції. Здорові індивідууми можуть бути безсимптомними переносниками MRSA протягом періоду від декількох тижнів до багатьох років. Іншим прикладом шкірного порушення, яке важко піддається лікуванню і яке може бути викликане широким рядом причин, є контактний дерматит, який у чутливих суб'єктів може початися при контакті шкіри із зовнішнім подразником/агентом. Застосування Lactobacillus для лікування шкірних порушень вже відоме в даній галузі, наприклад, розкривається в патентній заявці США No 05/201996. Винахід належить до галузі профілактики і/або лікування шкірних порушень, при застосуванні препаратів, що містять пробіотичні бактерії, такі як Lactobacillus fermentum штам VRI-002. Переважним шляхом введення є пероральний. Інші бактеріальні агенти, такі як Bacillus, також можуть бути використані для шкіри або слизових. Більш конкретно, в заявці WO 98/47374, штам Bacillus використаний в композиціях, призначених для профілактики бактеріальних, вірусних або грибкових інфекцій шкіри. Однак, існує проблема, яка виникає при застосуванні молочнокислих бактерій при місцевому застосуванні або в інших несприятливих середовищах з іншими бактеріями, описаними в рівні техніки, яка полягає в короткому терміні життя бактерій, викликаним несприятливим середовищем на шкірі або в іншому місці. Ця проблема вирішується даним винаходом, за допомогою введення L.reuteri з навантаженими мікрокомпартментами, в режимі "stand by" 2 UA 100423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (очікування) для секретування реутерину. Таким чином, L.reuteri здійснює секрецію реутерину до моменту смерті. Короткий опис винаходу Даний винахід належить до способу контрольованої активації системи продукування реутерину L.reuteri, шляхом наповнення системи продукування реутерину 1,2 PD або гліцерином і потім, при отриманні клітинних культур, додавання гліцерину в культуру бактерій в певний момент перед накопиченням. Даний винахід також належить до додавання вітаміну В12, кобальту і вітаміну С в середовище для вирощування для поліпшення умов оптимального зростання і формування мікрокомпартментів і реутерину бактеріями L.reuteri під час отримання. Зокрема, цей винахід належить до отримання великої кількості клітин L.reuteri, які навантажені реутерином, і застосування таких отриманих бактерій в композиціях, наприклад, для профілактики і лікування захворювань і в харчових композиціях. Більш конкретно, такі композиції призначені для введення людям, наприклад, місцево, для профілактики або лікування порушень, викликаних патогенами шкірної системи. Ці композиції можуть також використовуватися для назального застосування для лікування MRSA. Винахід долає проблему зростання і виживання бактерій L.reuteri в несприятливих середовищах. Відповідно, перед розкриттям деяких варіантів виконання винаходу, потрібно врахувати, що винахід не обмежений в цій заявці до тих деталей конструкції і послідовності компонентів, визначених в нижченаведеному описі або показаних на фігурах. Винахід охоплює і інші варіанти виконання і може бути здійснений і виконаний різними способами. Крім того, потрібно розуміти, що фразеологія і термінологія використовується тут для цілей опису і не повинна розглядатися як обмеження. Короткий опис фігур Фіг. 1. Показані гістограми, які ілюструють концентрації реутерину в супернатанті, отриманому від штамів DSM 17938 (незафарбовані прямокутники) і MM4-1 (чорні прямокутники), вирощених до стаціонарної фази в В 12-середовищі в присутності або відсутності вітаміну В12 (вгорі) або кобальту (знизу). Фіг. 2. Показані гістограми, які ілюструють ефекти при концентраціях супернатантів, отриманих від штамів DSM 17938 і MM4-1, вирощених до стаціонарної фази в MRS-середовищі. Фіг. 3a. Показані гістограми, які ілюструють вплив додавання 1,2-PD на концентрацію реутерину в супернатанті і виживаність штаму MM4-1, вирощеного до стаціонарної фази в MRS без додавання кобальту (А, D), вітаміну В12 (В, Е), з додаванням 50 нг/мл кобальту (C, F), 1 мкг/мл вітаміну В12. Чорними прямокутниками показана відсутність додавання 1,2-PD. Білими прямокутниками показане додавання 65 мМ 1,2-PD. Сірими прямокутниками показане додавання 200 мМ 1,2-PD. Виживаність вимірювали до початку (0 год.) і після (2 год.) інкубації клітин в 200 мМ гліцерин/водну розчин. Фіг. 3b. Показані гістограми, які ілюструють вплив додавання 1,2-PD на концентрації реутерину в супернатанті і виживаність штаму DSM 17938, вирощеного до стаціонарної фази в B12-середовищі з додаванням 1 мкг/мл вітаміну В12. Чорними прямокутниками показана відсутність додавання 1,2-PD. Білими прямокутниками показане додавання 65 мМ 1,2-PD. Сірими прямокутниками показане додавання 200 мМ 1,2-PD. Виживаність вимірювали до початку (0 год.) і після (2 год.) інкубації клітин в 200 мМ гліцерин/водну розчин. Фіг. 4. Показане зображення MCS, отримане просвічувальною електронною мікроскопією (TEM). Штами DSM 17938 (А) і MM4-1A (В) вирощували в MRS. Штами DSM 17938 (А) і MM4-1A (В) вирощували в MRS з додаванням вітаміну В12 (1 мкг/мл) і 200 мМ 1,2-PD. Білі стрілки вказують MCS, які утворилися в бактеріях. Фіг. 5a. Показані концентрації реутерину в супернатанті, отриманого від клітин MM4-1A, після впливу 200 мМ гліцеринового водного розчину протягом 45 хв. Бактерії вирощували в В12середовищі (50 нг/мл кобальт) з додаванням 200 мМ 1,2-PD, 200 мМ гліцерину або без додавання цих компонентів. Фіг. 5b. Показані концентрації реутерину (діаграма зверху) в супернатанті, отриманому від клітин MM4-1, після впливу 200 мМ гліцеринового водного розчину протягом 45 хв. Гістограма внизу показує концентрації реутерину в клітинному осаді після впливу 200 мМ гліцеринового водного розчину протягом 45 хв. Бактерії вирощували в MRS (1), в MRS з додаванням 1 мкг/мл вітаміну В12 (2), в MRS з додаванням 1 мкг/мл вітаміну В12 і 200 мМ 1,2-PD (3), в MRS з додаванням 1 мкг/мл вітаміну В12 і 200 мМ гліцерину (4) і в MRS з додаванням 1 мкг/мл вітаміну В12 і 500 мМ гліцерину. Фіг. 6. Показаний знімок MAS-ЯМР (зверху) виявлених речовин, що асоціюються з клітинами MM4-1, після промивання клітин і впливу 200 мМ гліцеринового водного розчину протягом 45 хвилин. Клітини вирощували в MRS з додаванням 1 мкг/мл вітаміну В12 і 200 мМ гліцерину. 3 UA 100423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Стрілка вказує на альдегідну групу в 3-HPA. На зображеннях знизу показані речовини, що асоціюються з отриманням реутерину. Речовини відмічені зірочкою були виявлені MAS-ЯМР. Фіг. 7. На гістограмі показано, що наявність сахарози не впливає на продукування реутерину. Докладний опис винаходу Отримання культур L.reuteri, які будуть використані як пробіотики, проводять без гліцерину і потім ліофілізують. У таких бактеріях система, що використовується для отримання реутерину, не активована, але в сприятливих умовах система може бути активована через 30-60 хвилин після того, як бактерії вступлять в контакт з гліцерином. У несприятливих умовах така активація може зайняти набагато більше часу або взагалі не статися. У випадках, коли потрібний продукт, що містить L.reuteri з швидким продукуванням реутерину, або де умови для зростання L.reuteri несприятливі, культура L.reuteri може бути поліпшена додаванням гліцерину під час отримання культури. Гліцерин (1-500 мМ) може бути доданий під час стадії ферментації, або він може бути доданий разом з кріопротекторами після стадії ферментації і промивання, якщо вона потрібна, але перед ліофілізацією. Система отримання реутерину, що включає формування мікрокомпартментів L.reuteri, може бути поліпшена додаванням в систему продукування реутерину 1,2 PD або гліцерину на початку ферментації. Продукт клітинної культури може бути отриманий декількома способами, які без обмеження включають три різних варіанти, приведені нижче: 1. Ліофілізований продукт, що містить клітини L.reuteri, що конвертують гліцерин в реутерин в кінці ферментаційній стадії способу отримання, але перед стадією ліофілізації. Продукт, отриманий таким чином, буде містити ліофілізовані клітини і реутерин, як всередині, так і навколо клітин. При такому варіанті виконання способу будуть отримані бактерії, навантажені реутерином. 2. Другий варіант, аналогічний 1, але до системи продукування реутерину бактерій додають 1,2 PD або гліцерин і, можливо, кобальт або вітамін В-12 на початку стадії ферментації. У такому варіанті виконання способу, будуть отримані ліофілізовані бактерії, які навантажені реутерином і здатні продукувати і нагромаджувати реутерин. 3. Ліофілізований продукт, що містить клітини L.reuteri, які конвертують гліцерин в реутерин після стадії ферментації і промивання, якщо вона потрібна, при додаванні гліцерину і продукуючий реутерин протягом приблизно 30-45 хвилин при 37ºC до стадії ліофілізації. Гліцерин для продукування реутерину можна, наприклад, додавати разом з кріопротекторами. Система продукування реутерину бактерій заповнюється 1,2 PD або гліцерином на початку стадії ферментації. Переваги 3 варіанту способу отримання в порівнянні з 2, полягають в тому, що 3 варіант більш зручний для ряду промислових виробничих установок і є більш прийнятним для контролю утворення реутерину. Додавання 1,2-PD або гліцерину в середовище для вирощування впливає як на виживання, так і на формування MCS. Ферментний комплекс PduCDE, який відповідає за конверсію 1,2-PD в пропіональдегід, також відповідає за конверсію гліцерину в реутерин, що відкриває таку можливість, що MCS, які утворюються при вирощуванні бактерій в присутності 1,2-PD, можуть також працювати як "фабрики" по отриманню реутерину, при контакті бактерій з гліцерином і відсутності засобів для подальшого метаболізму реутерину (тобто бактерії знаходяться в стаціонарній фазі або піддаються впливу гліцерину у водному розчині). Реутерин, який утворюється в MCS, нагромаджується в клітинах в більшій кількості в порівнянні з клітиною без MCS. Це дозволяє отримати "навантажені" реутерином бактерії, наприклад, до ліофілізації. Спостереження Sriramulu et al для штаму DSM 20016 автори повторили для штамів MM4-IA і DSM 17938. Однак, вирощування в модифікованому MRS-середовищі з 65 мМ 1,2-PD і низькою кількістю глюкози не підходить для промислових масштабів через дуже низьку швидкість зростання бактерій в цьому середовищі. Замість цього автори додавали 200 мМ 1,2-PD і 1 мкг/мл вітаміни В12 в немодифіковане MRS-середовище і досліджували бактерії на предмет продукування видимих MCS після вирощування протягом 24 год. при 37ºC (використовували метод електронної мікроскопії для візуалізації). Як MM4-1A, так і DSM 17938 штами продукували MCS в цих умовах (фіг. 4). Гліцерин, аналогічно 1,2-PD, метаболізується тим же самим ферментним комплексом, який називається PduCDE, таким чином, також можна використовувати гліцерин для індукування формування MCS в бактеріях, аналогічно до того, як це спостерігається для 1,2-PD. Зростання штаму MM4-1A або в 200 мМ гліцерину або в 1,2-PD, призводить до отримання клітин, які поводяться однаково при утворенні реутерину і його зв'язку з осадом бактеріальних клітин, після впливу протягом 1 год. розчину гліцерину на бактерії (Фіг. 5a і 5b) 4 UA 100423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У доповнення до промивання осаду (див. вище, Фіг. 5b) автори також досліджували промитий клітинний осад на вміст реутерину, використовуючи MAS-ЯМР. Потім штам MM4-1 вирощували до стаціонарної фази в MRS-середовищі з додаванням B12 (1 мкг/л) і 200 мМ 1,2PD. Потім вирощені бактерії піддавали впливу 200 мМ гліцерину у водному розчині і інкубували протягом 1 години при 37ºC. Клітини залишали на льоду і промивали 2 рази дейтерієвою водою (D2O), що містить 200 мМ гліцерину. Осад (приблизно 20 мкл по масі сирої речовини), отриманий на кінцевій стадії, розчиняли в 20 мкл D2O без гліцерину і вимірювали вміст реутерину методом MAS-ЯМР. Використовуючи цю методику, автори виявили два з трьох видів реутерину і деякі продукти розкладання реутерину і 1,2-PD (Фіг. 6a і 6b). Показано, що крім гліцерину і 1,2-PD, додавання деяких інших речовин в середовище для вирощування може впливати на виживаність клітин, формування MCS, продукування реутерину і пристосовуваність бактерій, такими речовинами є, наприклад, вітамін В12, кобальт і вітамін С. Щоб показати, що додавання вітаміну В12 або кобальту в середовище для вирощування впливає на пристосовність L.reuteri, досліджували два різних типи середовища для вирощування, MRS (Oxoid) і B12-середовище для дослідження (Fluka), відносно продукування реутерину і пристосовуваності штамів L.reuteri DSM 17938 і MM4-1 А. Головна відмінність між цими двома середовищами для вирощування полягає в тому, що MRS містить невизначений склад вітамінів, доданих у вигляді дріжджового екстракту, тоді як B12-середовище для дослідження (яке далі називається B12-середовище) містить певний склад всіх вітамінів, необхідних для функціонування бактерії, за винятком B12, який відсутній. Інша важлива відмінність в складі вітамінів між цими двома середовищами, полягає в тому, що B12середовище включає вітамін С в кількості 4 г/л, можливо, в декілька разів більше, ніж в MRS. Автори використовували B12-середовище як інструмент для спостереження за реутерином, формуванням мікрокомпартментів (MCS) і пристосовуваністю бактерій при додаванні вітаміну В12 або кобальту. Вітамін В12 є необхідним компонентом ферментного комплексу PduCDE, який відповідає за конверсію гліцерину в реутерин. Для реалізації своєї біологічної функції вітаміну В12 потрібна присутність іона кобальту. Якщо в середовищі присутній кобальт, але відсутній вітамін В12, реутерин може утворюватися тільки у випадку, якщо експресовані гени cob-оперону, оскільки вони є основними для утворення кобальтвмісної молекули B12. Оскільки експресія cob-оперону пов'язана з експресією розташованого раніше pdu-оперону ймовірно за допомогою регулятора PocR (Santos F, Vera JL, van der Heijden R, Valdez G, de Vos WM, Sesma F, Hugenholtz J: The complete coenzyme В 12 biosynthesis gene cluster of Lactobacillus reuteri CRL 1098. Microbiology 2008, 154(Pt 1):81-93; Cheng S, Liu Y, Crowley CS, Yeates TO, Bobik TA: Bacterial microcompartments: their properties and paradoxes. Bioessays 2008, 30(11-12): 10841095), автори досліджували продукування реутерину і пристосовність при додаванні вітаміну В12 або кобальту в MRS або B12-середовище. Показаний значний вплив на обидва штами (DSM 17938 і MM4-1A) відносно продукування реутерину при вирощуванні в B12-середовищі із зміною кількості або вітаміну В12, або кобальту (Фіг. 1). Це логічно, оскільки продукування реутерину не може відбуватися без впливу молекул B12, які або повинні бути додані безпосередньо або синтезуватися бактеріями в присутності іонів кобальту. Середовище MRS, на відміну від B12-середовища, вже містить деяку кількість вітаміну В12, оскільки доданий дріжджовий екстракт містить суміш вітамінів. Виміряне продукування реутерину в MM4-1A і DSM 17938, вирощених на простому MRS-середовищі, співпало з тим, про яку раніше повідомлялося в літературі, але при цьому у MM4-1 А не було досягнуто такого ж рівняпродукування реутерину, як у штаму DSM 17938 (Фіг. 2) (Spinler JK, Taweechotipatr M, Rognerud CL, Ou CN, Tumwasorn S, Versalovic J: Human-derived probiotic Lactobacillus reuteri demonstrate antimicrobial activities targeting diverse enteric bacterial pathogens. Anaerobe 2008, 14(3): 166-171). На відміну від B12-середовища, додавання вітаміну В12 або кобальту в MRS середовище не призвело до переконливих результатів відносно збільшення продукування реутерину MM4-1A і DSM 17938. Однак, при додаванні вітаміну В12 до MRS-середовища виявляється синергетичний ефект з 1,2-пропандіолом (1,2-PD) відносно властивостей пристосовуваності бактерій MM4-1A (Фіг. 3). Посилення пристосовуваності штаму MM4-1A, вирощеного в MRS з додаванням вітамінів В12 і 200 мМ 1,2-PD, корелює із зменшенням виявленого реутерину в середовищах, які оточують бактерії (Фіг. 3). Автори вказують, що такий ефект стався через те, що додавання вітаміну В12 і 1,2-PD до MRS збільшило формування мікрокомпартментів (MCS) в бактеріях. Збільшення сформованих MCS призвело до того, що продукований реутерин нагромаджується в утворених MCS, що знаходяться всередині бактерій. Для оцінки, автори показали, що додавання вітаміну B12 і 1,2-PD в нормальній MRS: 5 UA 100423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Створює видимі MCS як в MM4-1A, так і в DSM 17938 (Фіг. 4). Збільшення стійкості до продукування реутерину при вирощуванні MM4-1A в MRS з додаванням вітаміну В12 (1 мкг/л) і 200 мМ 1,2-PD (Фіг. 3). Збільшення стійкості до продукування реутерину при вирощуванні DSM 17938 в B12-середовищі з додаванням вітаміну В12 (1 мкг/л) і 200 мМ 1,2-PD (Фіг. 3b). Автори також показали, що бактерії MM4-1A, вирощені таким чином (або з додаванням гліцерину замість 1,2-PD), нагромаджують більше реутерину всередині бактеріальної клітини і менше зовні (Фіг. 5b) Додавання вітаміну В12 в MRS з додатковим 1,2-PD впливає тільки на посилення властивостей MM4-1 втримувати ендогенно продукований реутерин. Насичення середовища для вирощування вітаміном В12 сприяє формуванню функціонуючих MCS в бактеріях при вирощуванні в присутності 1,2-PD (Фіг. 3 і 3b). З отриманих L.reuteri, навантажених активованими мікрокомпартментами, які містять реутерин, можуть бути приготовані композиції, які мають різні форми, як правило, в формі кремів, лосьйонів, паст, порошків, капсул, таблеток, мазей, емульсій, назальних спреїв і т. п. Такі препарати можуть бути приготовані відомими методами з використанням фармацевтично прийнятних носіїв допоміжних речовин, розріджувачів або ад'ютантів. Такі методики і інгредієнти відомі і широко описані в керівництві і довідниках. Бактерії за винаходом можуть бути використані для отримання композицій, призначених, наприклад, для профілактики або лікування порушень, пов'язаних з патогенами шкірної системи, такими як Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Propionibacterium acnes або дріжджі. Такі порушення шкіри можуть являти собою, зокрема, акне при атопічному дерматиті, кандидози, імпетиго або екзематозну вторинну інфекцію. Порушення шкіри можуть також мати небактеріальну причину, наприклад, купероз, псоріаз, рани від опікових травм, пролежнів і інших повільно заживаючих ран. Бактерії за винаходом можуть бути використані для отримання композиції для лікування порушень, викликаних патогенами шкірної системи. Зокрема, бактерії можуть бути використані для отримання композиції для профілактики або лікування MRSA. Вищевикладене повинне розглядатися тільки як ілюстративні основи винаходу. Крім того, оскільки численні модифікації і зміни можуть легко бути виконані фахівцем в даній галузі, то не бажано обмежувати винахід конкретним виконанням і послідовністю дій, показаних і описаних, і відповідно, всі можливі модифікації і еквіваленти, що підпадають під об'єм домагань, можуть бути використані. Даний винахід також забезпечує фармацевтичну композицію, що включає продукт, отриманий способом за винаходом, описаним тут. Приклад 1 Отримання ліофілізованого порошку L.reuteri з навантаженими мікрокомпартментами, які містять реутерин, що активуються під час стадії ферментації Композиція ферментаційного середовища Декстрози моногідрат 60 г/л Дріжджовий екстракт KAV 20 г/л Пептон типу PS (свинячий) 20 г/л Діамоній лимоннокислий 5 г/л Натрію ацетат (3 H2O) 4,7 г/л Дикалію гідрофосфат 2 г/л Твін 80 0,5 г/л Силібіон (піногасник) 0,14 г/л Магнію сульфат 0,10 г/л Марганцю сульфат 0,03 г/л Цинку сульфат гептагідрат 0,01 г/л Вода q.s Середовище центрифугування Пептон 0-24 Orthana (свинячий) Кріопротектори Лактоза (коров'яча) 33 % Гідролізат желатину 22 % (коров'ячий) Глутамат натрію 22 % Мальтодекстрин 11 % Аскорбінова кислота 11 % Стадії отримання ліофілізованого порошку Lactobacillus reuteri. 6 UA 100423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Двадцять мл середовища інокулювали 0,6 мл ліофілізованого порошку Lactobacillus reuteri з робочої пробірки з банку клітин. Ферментацію проводили в колбі при 37ºC протягом 18-20 годин без перемішування або контролю pH, тобто статично. Дві колби, кожну з 1 літром середовища, інокулювали 9 мл клітинною суспензією на літр. Ферментацію виконували при 37ºC протягом 20-22 годин без перемішування або контролю pH, тобто статично. Двома літровими клітинними суспензіями зі стадії 2 інокулювали 600-літрову ємність. Ферментацію виконували при 37ºC протягом 13 годин при контролі pH і перемішуванні. На початку ферментації pH становив 6,5. Контроль pH починали, коли pH опускалося нижче 5,4, використовуючи 20 % розчин гідроксиду натрію. Доводили pH до 5,5. Четверту і останню стадію ферментації виконували в 15000-літровій ємності інокуляцією продукту зі стадії 3. Ферментацію виконували при 37ºC протягом 9-12 годин з контролем pH і перемішуванням. На початку ферментації pH становив 6,5. Контроль pH починали, коли pH опускалося нижче 5,4, використовуючи 20 % розчин гідроксиду натрію. Доводили pH до 5,5. 100 мМ гліцерину додавали на останній фазі ферментації, безпосередньо перед тим, як культура досягне стаціонарної фази. Ферментацію завершували після досягнення стаціонарної фази культури, що помітно по зменшенню розчину гідроксиду натрію, який додається. Приблизно 930 літрів розчину гідроксиду натрію було додано до 10200 літрів середовища і 600 літрів інокуляту під час ферментації. Суспензію клітин з останньої стадії ферментації відділяли двічі при 10ºC в безперервній центрифузі від Alfa Laval. Після першого центрифугування об'єм клітинної суспензії скоротився приблизно з 11730 літрів до 1200 літрів. Цей об'єм промивали 1200 літрами розчину пептону (Пептон 0-24, Orthana) в 3000-літровій ємності і знов розділяли перед змішуванням з кріопротекторами. Стадію промивання пептоном виконували, щоб запобігти зниженню температури до точки замерзання при ліофілізації. Після другого центрифугування об'єм клітинної суспензії скоротився до 495 літрів. Цей об'єм змішували з 156 кг розчину кріопротектора, отримуючи приблизно 650 літрів клітинної суспензії. Клітинну суспензію перекачували в 1000-літрову ємність. Потім ємність переміщували на установку для ліофілізації. На установці для ліофілізації наливали на кожну пластину для ліофілізації по 2 літри (точно) клітинної суспензії. Максимальна ємність ліофілізатора становить 600 літрів і залишки клітинної суспензії викидали. Клітинну суспензію Lactobacillus reuteri ліофілізували протягом чотирьох-п'яти днів і вміст сухої речовини становив 18 %. Під час процесу ліофілізації робочий тиск складав між 0,176 мбар і 0,42 мбар. Вакуумний насос запускався, коли тиск досягав 0,42 мбар. PRT (дослідження на герметичність) використовували для визначення закінчення процесу. Якщо PRT або збільшення тиску складало менше 0,02 мбар через 120 с, то процес зупиняли. Приклад 2 Отримання ліофілізованого порошку L.reuteri, з навантаженими мікрокомпартментами, що містять реутерин, які наповнюються і активуються під час стадії ферментації Спосіб отримання такий же, як описано прикладі 1, але з додаванням додаткових 200 мМ 1,2-PD, вітаміну С (4 г/л) і вітаміну В12 (1 мкг/мл) в середовище для вирощування. Приклад 3 Отримання ліофілізованого порошку L.reuteri, з навантаженими мікрокомпартментами, які містять реутерин, що наповнюються під час стадії ферментації і активуються для формування реутерину перед стадією ліофілізації Спосіб отримання такий же, як описано прикладі 1, але з додаванням додаткових 200 мМ 1,2-PD, вітаміну С (4 г/л) і вітаміну В12 (1 мкг/мл) в середовище для вирощування. Але 100 мМ гліцерину додають в клітинну суспензію перед транспортуванням на установку ліофілізації замість ферментаційної фази. Приклад 4 Отримання мазі з L.reuteri, з активованою системою продукування реутерину Мазь готували з наступних компонентів: Ліофілізований порошок L.reuteri, з активованою системою продукування реутерину, отриманий, наприклад, будь-яким з промислових способів, описаних вище. Допоміжні речовини для продукту (безводне масло стабілізоване твердим жиром або воском). Масло, переважно являє собою рослинну олію, наприклад, ріпакову або пальмову олію. Твердий жир, наприклад бджолиний віск. 7 UA 100423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Консерванти і стабілізатори, будь-які відомі в галузі мазей. Спосіб включає плавлення твердих компонентів і змішування з маслом (AkomedPv, AAK) і іншими інгредієнтами. Ліофілізований порошок L.reuteri додавали в суміш при температурі нижче 55ºC. Мазь отримували при перемішуванні суміші до отвердження. Тюбики заповнювали маззю і закупорювали. Приготована мазь містить приблизно 10E+08 КУО отриманої культури L.reuteri на граммазі. Приклад 5 Лікування куперозу людини Жінку з тривалою історією куперозу обробляли ліофілізованими культурами L.reuteri, отриманими відповідно до даного винаходу. Суб'єкт обробляли два рази на день, вранці і на ніч. Кожний раз мазь втирали в шкіру, наносячи тонким шаром. Після 2 тижнів купероз помітно поліпшився без прийому антибіотиків, які були прописані для лікування стану. При скасуванні лікування L.reuteri стан повертався, але був пригнічений при постійному застосування L.reuteri. Приклад 6 Отримання назального спрею Назальний препарат, що включає L.reuteri, навантажені структурами мікрокомпартментів, які готові до продукування реутерину, може бути виконаний в різних формах для введення, наприклад, в формі спрею, крапель, гелю, мазі, крему, порошку або суспензій, використовуючи диспенсер або інший пристрій, якщо необхідно. Різні диспенсери і засоби доставки відомі в даній галузі, включаючи однодозові ампули, розпилювачі, небулайзери, насоси, назальні пластири, назальні спонжі, назальні капсули і т. п. У загальному випадку препарат може мати тверду, напівтверду або рідку форми. У разі твердої форми, компоненти можуть бути з'єднані разом в блендері, в барабанній мішалці, шляхом ліофілізації, випарювання розчинника, спільним розмелюванням, сушінням розпиленням і іншими методами, відомим в даній галузі. Напівтверді препарати, відповідні для назального застосування, можуть мати форму гелю на масляній основі або мазі. У переважному варіанті виконання, назальний препарат має рідку форму, яка може включати масляний розчин, масляну суспензію. Рідкий препарат може вводитися в формі назального спрею або назальних крапель, використовуючи пристрої, відомі в даній галузі, включаючи небулайзери, які можуть доставляти вибрані об'єми препаратів у вигляді аерозолів рідких крапель. Наприклад, комерційний розпилювальний насос з об'ємом, що подається, 50 мкл або 100 мкл доступний, наприклад, від Valois (Congers, N.Y.), з дорослими і дитячими розпилювальними наконечниками. Рідкий препарат може бути отриманий відомими методами. Наприклад, назальний препарат може бути отриманий шляхом змішування L.reuteri, навантажених реутерином, з масловмісною основою, такою як фармацевтично прийнятне масло, таке як оливкова олію, ланолін, силіконове масло, гліцеринові жирні кислоти і т. п. Повинно бути зрозумілим, що допоміжні речовини, необхідні для отримання препарату, стабільності, і/або біодоступності, можуть бути включені в препарат. Типові допоміжні речовини включають цукри (глюкоза, сорбіт, маніт, сахароза), підсилювачі проникнення (хітозан), загусники і агенти, поліпшуючі стабільність (целюлоза, полівінілпіролідон, крохмаль, і т.д.), буфери, консерванти, і/або кислоти і основи для регулювання pH і т. п. Хоч винахід був описаний з посиланнями на конкретні приклади, фахівцеві в даній галузі повинно бути зрозумілим, що винахід може бути здійснений в різних формах. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 55 1. Спосіб одержання клітин культур Lactobacillus reuteri, які містять реутерин, що зберігаться всередині клітин, який включає: одержання клітинних культур Lactobacillus reuteri, де одержання включає ферментацію вказаних клітинних культур; додавання 1,2-пропандіолу або гліцерину до реутерин-продукуючих систем клітин Lactobacillus reuteri на початку ферментації, додавання гліцерину до клітинних культур Lactobacillus reuteri під час одержання, таким чином одержуючи клітини Lactobacillus reuteri, де реутерин зберігається всередині клітин; і зберігання клітин Lactobacillus reuteri. 2. Спосіб за п. 1, де ферментація включає додавання гліцерину в кінці процесу ферментації. 3. Спосіб за п. 1, де зберігання клітин Lactobacillus reuteri включає ліофілізацію клітинних культур після ферментації. 8 UA 100423 C2 5 10 15 4. Спосіб за п. 2, де зберігання клітин Lactobacillus reuteri включає ліофілізацію клітинних культур після ферментації. 5. Спосіб за п. 3, що додатково включає додавання щонайменше одного кріопротектора разом з гліцерином в клітинні культури після стадії ферментації, до ліофілізації. 6. Спосіб за п. 3, де від приблизно 1 до приблизно 500 мМ гліцерину додають після стадії ферментації, але до ліофілізації в процесі одержання. 7. Спосіб за будь-яким з пп. 2-6, де ферментація клітинних культур Lactobacillus reuteri включає додавання до клітинних культур щонайменше одного з наступних: кобальту, вітаміну В12, вітаміну С або їх комбінацій на початку стадії ферментації. 8. Продукт, одержаний способом за будь-яким з пп. 1-7, де продукт містить збережені клітини Lactobacillus reuteri, при цьому реутерин зберігається в клітинах. 9. Продукт за п. 8 для застосування в лікуванні порушень. 10. Продукт за п. 8 для застосування в лікуванні порушень, викликаних патогенами шкірної системи. 11. Фармацевтична композиція, що містить продукт за п. 8. 9 UA 100423 C2 10 UA 100423 C2 11 UA 100423 C2 12 UA 100423 C2 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 13
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюControlled activation of the reuterin-production machinery of lactobacillus reuteri
Автори англійськоюRoos, Stefan
Назва патенту російськоюУправляемая активация системы продуцирования реутерина lactobacillus reuteri
Автори російськоюРоос Стефан
МПК / Мітки
МПК: A01N 63/02, C12R 1/225, A61K 35/74, C12N 1/04, A61P 31/04
Мітки: продукування, активація, lactobacillus, керована, реутерину, reuteri, системі
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/15-100423-kerovana-aktivaciya-sistemi-produkuvannya-reuterinu-lactobacillus-reuteri.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Керована активація системи продукування реутерину lactobacillus reuteri</a>
Попередній патент: Каскадний вихровий млин
Наступний патент: Спосіб ущільнення no-компресора і розширювача залишкового газу в установці для одержання азотної кислоти та установка для одержання азотної кислоти
Випадковий патент: Джерело живлення генератора озону